ES2326101T3 - Vector de virus arn cadena (-) para celulas nerviosas. - Google Patents
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-
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-
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Abstract
Un método para transferir ácido nucleico a células nerviosas in vitro, que consiste en un paso de poner en contacto las células nerviosas con un vector viral de ARN de sentido negativo que está formado por un gen externo en su genoma o poner en contacto las células nerviosas que están formadas por dicho vector, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.
Description
Vector de virus ARN cadena (-) para células
nerviosas.
La presente invención hace referencia a un
método in vitro para transferir un gen para terapia de genes
de células nerviosas usando un vector virus, más específicamente,
un vector virus ARN de sentido negativo y materias
relacionadas.
Es un objeto extremadamente importante en la
terapia de genes para humanos y animales desarrollar un sistema a
través del cual se transfiera un gen a órganos objetivos y células
objetivas con una elevada eficiencia. Los métodos para transferir
un gen incluyen el método de fosfato de calcio, el método
DEAE-dextrano, el método con liposoma catiónico, el
método de electroporación, etc., y especialmente métodos para
transferir un gen in vivo incluyen un método que usa un
virus o liposoma, o un método de transferencia directa. Entre
ellos, la trasferencia de gen llevada a cabo usando "un vector
virus" obtenido por recombinación de gen viral es extremadamente
útil para la transferencia de un gen a células, por ejemplo, para
terapia de genes debido al procedimiento fácil de transferencia y a
su elevada eficacia de transferencia.
Los vectores de virus comúnmente empleados en el
presente en terapia de genes incluyen vectores de retrovirus,
vector del virus herpes simplex (VHS), vector de adenovirus, y
vector de virus asociado a adeno (AAV), etc. En particular, junto
con los progresos recientes en análisis de funciones cerebrales
usando MRI y PET, existe una gran demanda de vectores capaces de
infectar de manera eficiente células nerviosas no divisoras y
mediar una expresión de transgen con elevado nivel en las células
infectadas. Por lo tanto, el vector adenoviral, el vector del virus
herpes simples, AAV, VIH, etc., han recibido considerable
atención.
A pesar de que se ha comprobado que VHS es capaz
de transferir un gen a los ganglios en el sistema nervioso
periférico, aún queda el problema de la cantidad de su expresión
(Gene Therapy, 1995, 2:209-217). La infección de
VIH de células nerviosas también ha sido confirmada (Nature
Biotechnology, 1997, 15:871-875). Debido a que la
posición cromosomal en la cual el genoma de VIH se inserta es
prácticamente impredecible, hay posibilidades de dañar un gen
normal, activar un gen cancerígeno, e inducir expresión excesiva o
nula de un gen deseado.
AAV se ha empleado para el tratamiento del
cerebro en enfermedad de Parkinson (Exp. Neurol., 1997, 144:
147-156) y mucopolisacaridosis del tipo Vil
(Reunión ASGT, 1998, Artículo Nº 692). Sin embargo, se ha
demostrado una transferencia incompleta del gen introducido en la
sustancia negra en la enfermedad de Parkinson y su expresión
insuficiente en el cerebro en mucopolisacaridosis del tipo VII.
El adenovirus ha sido el más empleado en el
presente, y ha demostrado ser capaz de transferir un gen a la capa
celular piramidal del hipocampo (Nature Medicine, 1997, 3:
997-1004). Sin embargo, el adenovirus presenta
inconvenientes, como citotoxicidad y elevada inmunogenicidad.
Por otra parte, debido a que los virus de ARN de
sentido negativo, como virus Sendai, no se integran en cromosomas,
no activan genes cancerígenos. Además, ya que el virus Sendai es un
virus de ARN, tiene ventajas, como su expresión proteica en un
breve periodo de tiempo tras la infección y una expresión con nivel
extremadamente alto del producto transgen en comparación con el
Adenovirus.
En Biosis Abstract PREV 199799322964 los
oligonucleótidos hechos un complejo con virus de hemaglutina de
Japón (HUJ) se enviaron a células de CNS.
Es un objetivo de esta invención proporcionar un
método in vitro para transferir ácido nucleico usando un
vector viral de ARN de sentido negativo, útil para terapia de genes
de células nerviosas.
La presente invención primero preparó virus
recombinantes que transportan varios genes externos, usando virus
Sendai, un virus típico de ARN de sentido negativo y útil como
vector para terapia de genes debido a su seguridad y conveniencia.
Posteriormente, virus recombinantes se emplearon para transferir
los genes externos a las células nerviosas, tejidos del cerebro,
etc. Como resultado, los inventores descubrieron que el uso de estos
recombinantes permitió una eficiente transferencia de genes
externos a células nerviosas y tejidos del cerebro. Además,
descubrieron que el uso de vectores virales de esta invención
provocó una expresión de elevado nivel de genes externos
introducidos.
introducidos.
Además, los vectores virales de esta invención
transferidos al cerebro mostraron la proliferación limitada. En
otras palabras, la expresión de los vectores se redujo tras un
cierto periodo de tiempo de la expresión de gen externo. Además, la
terapia de genes que usó un vector viral de esta invención se
aplicó al cerebro de un ratón deficiente de
\beta-glucoronidasa, que mejoró los síntomas de
dicho ratón. Por lo tanto, los presentes inventores descubrieron
que los vectores virales preparados podrían funcionar de modo
eficiente en la terapia de genes de neuropatía donde la terapia
requiere regulación de expresión del transgén.
La administración intraventricular de un vector
viral de esta invención que transporta un gen FGF a jerbos o
ratones resultó en la infección del vector de células ependimales y
el descenso de la toma de comida y peso corporal en los animales.
Las células ependimales forman una capa celular que separa el
cerebro de los ventrículos, y en el tercer ventrículo el fluido
cerebroespinal y los núcleos hipotalámicos interactúan de manera
íntima. Debido a que los vectores de esta invención pueden infectar
eficientemente las células ependimales, pueden emplearse para
expresar una proteína segregadora en el ventrículo para que la
proteína pueda actuar sobre los núcleos hipotalámicos (centro de
alimentación, centro de saciedad, etc.). Además, en un modelo
isquémico usando jerbos, se ha revelado que la lesión celular se
reduce de manera significativa introduciendo un vector viral para
una expresión de factor de crecimiento en las células parenquimales
del hipocampo, indicando una utilidad del vector de esta invención
para prevenir la muerte celular debido a la exfoliación celular en
isquemia cerebral. Estos hechos han indicado que los vectores de
esta invención son útiles como vectores para transferir un gen al
cerebro en varios tratamientos médicos.
La presente invención hace referencia a:
- 1.
- Un método para transferir ácido nucleico a células nerviosas in vitro, que consiste en un paso de poner en contacto las células nerviosas con un vector viral de ARN de sentido negativo que está formado por un gen externo en su genoma o poner en contacto las células nerviosas que están formadas por dicho vector, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae;
- 2.
- Uso de un vector viral de ARN de sentido negativo para la fabricación de un medicamento para controlar el comportamiento alimenticio de animales, donde dicho vector está formado por un gen externo que codifica el factor de crecimiento para fibroblasto (FGF)-1 o FGF-5 en su genoma, y dicho virus ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae;
- 3.
- Uso de un vector viral de ARN de sentido negativo para la fabricación de un medicamento para terapia de genes enfocada a células nerviosas, donde dicho vector está formado por un gen externo en su genoma, y dicho virus ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae;
- 4.
- Uso de 3, donde dichas células nerviosas son las células del sistema nervioso central;
- 5.
- Uso de 4, donde dichas células del sistema nervioso central son células ependimales ventriculares;
- 6.
- Uso de 4, donde dichas células del sistema nervioso central son células del hipocampo;
- 7.
- Uso de cualquiera 2 a 6, que además permite expresar de manera pasajera dicho gen externo;
- 8.
- Uso de cualquiera 2 a 7, donde dicho gen externo codifica una proteína segregadora;
- 9.
- Uso de 8, donde dicha proteína actúa sobre los núcleos hipotalámicos;
- 10.
- Uso de 8, donde dicha proteína es capaz de proteger el cerebro frente a isquemia;
- 11.
- Uso de cualquiera 2 a 10, donde dicho virus que pertenece a la familia Paramixoviridae es el virus Sendai; y
- 12.
- Un vector viral de ARN de sentido negativo para terapia de genes in vivo de células nerviosas, estando formado dicho vector por un gen externo que codifica una proteína segregadora en su genoma, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta invención, "vectores virales de ARN de
sentido negativo" incluyen un complejo que se deriva de un virus
de ARN de sentido negativo y que tiene Infectividad. Aquí,
"infectividad" significa la "capacidad de un complejo para
transferir su ácido nucleico u otras sustancias en el interior del
mismo a una célula a través de su habilidad para adherirse o
fusionarse con la membrana celular".
En esta invención, el vector viral de ARN de
sentido negativo puede prepararse usando, por ejemplo, un virus de
ARN de sentido negativo como un material de inicio. Los virus
empleados como materiales de inicio son virus que pertenecen a la
familia Paramixoviridae como virus Sendai, virus de enfermedad de
Newcastle, virus de las paperas, virus del sarampión, virus RS
(virus sincitial respiratorio), virus de la peste bovina y virus
del moquillo.
Cuando se emplea el virus Senai, un grupo de
proteínas codificada por los tres genes, NP, P/C y L, que se cree
que son esenciales para su réplica autónoma, no son estrictamente
necesarias para codificarse por el vector viral de esta invención.
Por ejemplo, el vector de esta invención puede producirse en las
células huésped que transportan los genes codificadores de este
grupo de proteínas para que las células huésped puedan proporcionar
estas proteínas. Además, las secuencias de aminoácidos de estas
proteínas no son necesariamente idénticas a las nativas del virus.
Puede introducirse cualquier mutación o pueden emplearse
sustituciones de genes homólogos de otros virus siempre y cuando
las actividades transferidas por su ácido nucleico sean iguales o
superiores a las de las proteínas que ocurren de manera natural.
Además, cuando se emplea el virus Sendai, un
grupo de proteínas codificadas por los genes M, F y HN, que se cree
que son esenciales para la capacidad de diseminación del virus, no
son estrictamente necesarias para codificarse por el vector viral
de esta invención. Por ejemplo, el vector de esta invención puede
producirse en las células huésped que transportan los genes
codificadores de este grupo de proteínas para que las células
huésped puedan proporcionar estas proteínas. Además, las secuencias
de aminoácidos de estas proteínas no son necesariamente idénticas a
las nativas del virus. Puede introducirse cualquier mutación o
pueden emplearse sustituciones de genes homólogos de otros virus
siempre y cuando las actividades transferidas por su ácido nucleico
sean iguales o superiores a las de las proteínas que ocurren de
manera natural.
Para transferir un gen externo a células
nerviosas, puede prepararse y usarse un complejo formado por un
genoma recombinante viral en el que se inserta un gen externo. El
complejo constituido por un genoma recombinante viral puede
obtenerse por medio de transcripción in vitro o in
vivo de un cADN modificado derivado de cualquiera de los virus
anteriormente mencionados o un virus recombinante de los mismos
seguido por reconstrucción del virus. Un método para reconstituir
un virus ya se ha desarrollado (ver WO 97/16539).
Además, en lugar del genoma del virus completo
Sendai, también pueden emplearse virus incompletos como partículas
interferentes defectuosas (partículas DI) (J. Virol. 68,
8413-8417, 1994), oligonucleótidos sintéticos,
etc., como componentes para constituir el complejo.
Cuando se emplea el virus Sendai como material,
un complejo puede contener los tres genes, M, F, y HF, que se
encuentran implicados en la capacidad de diseminación del virus.
Sin embargo, en general, a pesar de que un complejo que incluye
todos los genes M, F y HN se transfiere al cerebro, el complejo
presumiblemente falla en la demostración de su capacidad de
diseminación tras la formación de partículas virales, debido a la
ausencia de proteasa para partir la proteína F, una proteína
esencial para la capacidad de diseminación del virus Sendai. Aquí,
"capacidad de diseminación" significa "la habilidad del ácido
nucleico, que se transfiere a la célula por infección o empleando
una técnica artificial, para replicar y dirigir la formación de
partículas infecciosas o sus complejos equivalentes que pueden
diseminar el ácido nucleico a otras células". En cambio, para
incrementar la seguridad, los genes involucrados en la capacidad de
diseminación de los virus se eliminan preferentemente o se
inactivan funcionalmente en el genoma viral en el complejo. En el
caso de virus Sendai, los genes involucrados en la capacidad de
diseminación del virus son los genes M, F y/o HN. Se ha
desarrollado un sistema de reconstitución de dichos complejos (WO
97/165538). Por ejemplo, para el virus Sendai, un vector viral que
está formado por un genoma desde el que los genes F y/o HN se
borran puede prepararse a partir del genoma contenido en el
complejo reconstituido. Dichos vectores también se incluyen en los
vectores de esta invención para transferir ácido nucleico a células
nerviosas.
El complejo puede contener en su superficie de
envoltura un factor que es capaz de adherirse a una célula
específica, como un factor de adhesión, ligando, receptor, etc. Por
ejemplo, partes de los genes del virus recombinante de ADN de
sentido negativo pueden modificarse para inactivar los genes
relacionados con la inmunogenicidad o para aumentar la eficiencia
de transcripción y réplica de ARN.
El ARN contenido en el complejo puede
incorporarse a un gen externo en su lugar apropiado. Para expresar
una proteína deseada, un gen externo codificador de la proteína se
incorpora al ARN. Para el ARN del virus Sendai, una secuencia de
nucleótido consistente en nucleótidos en múltiples de seis se
inserta de manera preferente entre las secuencias R1 y R2 (Journal
of Virology, 1993, Vol. 67, No. 8, pp. 4822-4830).
La expresión del gen externo insertada en el ARN puede regularse
por medio del punto de inserción del gen o de la secuencia de ARN
en la vecindad del gen insertado. Por ejemplo, en el caso de ARN
viral de Sendai, se sabe que cuanto más cerca al gen NP se
encuentre la posición de inserción de ARN, más alto será el nivel
de expresión del gen insertado.
Un gen externo codificado por el ARN contenido
en el complejo puede expresarse por células infecciosas con el
complejo. Tal y como se muestra en los ejemplos a continuación, se
ha demostrado que el complejo preparado como una realización de
esta invención usando el sistema de reconstitución de virus Sendai
permite una transferencia eficiente de un gen externo a varias cepas
de células nerviosas. Tal y como se muestra en el Ejemplo 5,
también se ha revelado que otra realización del complejo de esta
invención en la que se emplea gen
\beta-glucoronidasa como gen externo muestra una
expresión significativamente más elevada que los vectores
retrovirales. Debido a estas características, el complejo de esta
invención puede emplearse para transferir genes a células
nerviosas. Por ello, una realización del complejo de esta invención
mostrado en el Ejemplo 6 disminuye su expresión aproximadamente una
semana tras la administración intraventricular, y es útil en una
terapia tal como la de genes que requiere la expresión de gen
solamente durante un periodo limitado de tiempo.
El ácido nucleico de otros compuestos contenidos
en el complejo preparado puede introducirse a las células nerviosas
poniendo en contacto el complejo con las células nerviosas o
directamente poniendo en contacto las células productoras de vector
viral con las células nerviosas. Cuando se administra el complejo al
cerebro, la administración puede llevarse a cabo, por ejemplo,
abriendo un agujero en el hueso craneal tras craniotomía bajo
anestesia, seguido de inyección del complejo usando una aguja de
cristal o un material similar. El complejo puede contener genes
externos. Los genes externos pueden incluir cualquier tipo de gen,
como gen específico de células nerviosas, gen supresor de
apoptosis, u otros genes para tratar varios tipos de enfermedades,
etc. Dichos genes pueden tomar las formas de ADN antisentido y
ribozima de modo que inhiben la función de un gen específico.
Por ejemplo, se ha revelado que la muerte de
células del cerebro en tejidos isquémico no ocurre justo después de
la isquemia, sino varios días después (Neurosci. Left. 1998, 240:
69-72). Para evitar la muerte de células del cerebro
en tal caso, puede usarse un complejo de esta invención que está
formado por un gen responsable de la supresión de la muerte
celular, como bcl-2, etc. De hecho, durante la
investigación sobre si la administración del vector de esta
invención pudiese prevenir o no la exfoliación retrasada de células
nerviosas frágiles debido a la reducción de nutrientes causada por
isquemia, se reveló que la administración de un vector de expresión
FGF-1 podía prevenir de manera significativa la
exfoliación celular (Ejemplo 10). Además, tal y como se demuestra
en los Ejemplos 6 y 8, el complejo de esta invención puede
transferir un gen externo a células ependimales y células presentes
a lo largo del ventrículo a través de administración
intraventricular. El uso de un gen que expresa una proteína
segregadora como gen externo puede esparcir la proteína a través
del fluido espinal al cerebro incluyendo el área del hipocampo. Tal
y como se muestra en el Ejemplo 7, una realización del complejo de
esta invención se expresó en células nerviosas incluso 13 días
después de la administración del complejo al cerebro. La
transferencia del complejo no causó ninguna muerte celular. Estos
resultados indican la utilidad del complejo de esta invención para
la terapia de genes de nervios centrales. Por ejemplo, en el
Ejemplo 9, se demostró que la administración intraventricular de un
vector de expresión FGF podía controlar de manera exitosa la
cantidad de ingesta de comida y reducir el peso corporal. La
pérdida de peso corporal atribuida a FGF-2 (Denton,
D. A., et al. (1995) Physiol. Beba. 57 (4):
747-752) y la reducción del nivel de azúcar en
sangre acompañada de la pérdida de peso corporal (Stephens, T. W.
et al. (1995) Nature 377 (6549): 430-532) ya
fueron demostradas, lo que coincide con los resultados obtenidos en
la presente invención donde el nivel de azúcar en sangre se redujo
en asociación con la pérdida de peso corporal.
Por lo tanto, los vectores de esta invención
proporcionan un modo nuevo de administración de vectores enfocados
a células ependimales. Además de las células ependimales, las
células objetivo incluyen, aunque no se limitan a células presentes
a lo largo de los ventrículos, células en la región del hipocampo,
especialmente células piramidales del hipocampo, células de la raíz
neural, células de la cresta neural derivadas de embriones de
mamíferos, etc. Los genes que pueden introducirse incluyen, pero no
se limitan a, aquellos para factores de crecimiento de fibroblasto,
factores de crecimiento de nervios, inhibidores de apoptosis,
proteínas de impacto de calor, peroxidasa, etc. Los ejemplos
específicos de dichos genes incluyen aquellos para
FGF-1 (J. Biol. Chem. 271 (47):
30263-30271, 1996), FGF-5 (Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (20): 8022-8026, 1990),
NGF (Nature, 302 (2): 538-540, 1983), CNTF (Nature,
357 (6): 502-504, 1992), BDNF (EMBO J., 9 (8):
2459-2464, 1990; Genomics, 10 (3):
558-568, 1991), GDNF (J. Neurosci. Res. 41 (2):
279-290, 1995), p35 (J. Virol. 61 (7):
2264-2272, 1987), CrmA (Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 83: 7698-7702, 1986), ILP (EMBO J., 15 (11):
2685-2694, 1996), bcl-2 (Oncogene.,
4 (11): 1331-6, 1989), ORP 150 (Biochem. Biophys.
Res. Commun. 230 (1): 94-99, 1997), etc. Los
vectores de esta invención son útiles no solamente para buscar
genes usando chips de ADN y selecciones de ADN, sino también para
preparar de manera conveniente ratones modelo así como para
desarrollar medicinas.
Los animales en los que el complejo de esta
invención puede introducirse incluyen todos los tipos de mamíferos
como humanos, jerbos, ratones, ganado, monos, etc.
La Figura 1 muestra de modo esquemático un
método para construir el virus Sendai competente de réplica (SeV)
que está formado por un gen externo, como GFP o
\beta-glucoronidasa. Usando el imprimador 1, que
tiene un lugar NotI, y un imprimador 2, que está constituido por
una señal de terminación para transcripción (R2), una secuencia
interventora (Ig), una secuencia de iniciación para transcripción
(R1) y un punto NotI, el ORF de un gen externo se amplifica por PCR
y se inserta en el lugar NotI de pUC18/T7HVRJzADN (+18).
La Figura 2 es una vista en sección frontal del
cerebro del ratón que muestra la expresión de GFG en un ratón
infectado por el virus Sendai que está formado por el gen GFP
(GFP-SeV).
La Figura 3 es una vista en sección del
ventrículo lateral que muestra la expresión de
\beta-glucoronidasa en un ratón deficiente de
\beta-glucoronidasa 3 días después de la infección
con virus Sendai que transporta el gen
\beta-glucoronidasa.
La Figura 4A muestra una vista en sección
transversal del ventrículo lateral que muestra la expresión
\beta-glucoronidasa (áreas enmarcadas) en el
ventrículo de un ratón deficiente de
\beta-glucoronidasa 12 días después de la
infección con virus Sendai que transporta el gen
\beta-glucoronidasa. La Figura 4B muestra la
sección adyacente a la de la Figura 4A teñida por el método
Lorbacher.
La Figura 5 es un gráfico que muestra los
cambios en el peso corporal de jerbos tras la administración
intraventricular de virus Sendai que expresa FGF-1,
FGF-5 y GFP.
La Figura 6 es un gráfico que muestra los
cambios en el peso corporal de ratones tras la administración
intraventricular de virus Sendai que expresa FGF-1,
FGF-5 y GFP.
La Figura 7 es un gráfico que muestra los
cambios en la cantidad de ingesta de comida de ratones tras la
administración intraventricular de virus Sendai que expresan
FGF-1, FGF-5 y GFP.
La Figura 8 son micrográficos que muestran la
exfoliación retrasada de células piramidales en el área CA1 del
hipocampo de un jerbo 5 días después de isquemia.
La Figura 9 son micrográficos que muestran la
prevención de exfoliación retrasada de células piramidales en la
región CA1 del hipocampo tras la administración de un vector viral
Sendai que expresa FGF-1.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicará con mayor
detalle con referencia a los ejemplos a continuación, pero no debe
entenderse como limitada a ellos.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento NotI que está formado por un gen
externo que va a ser transferido, señales de iniciación de
transcripción (R1) y terminación (R2), y secuencia interventora
(IG) (Fig. 1) se amplificó por PCR y se insertó en el lugar de
división NotI de unidad de transcripción SeV pUC18/T7HVRJzADN
(+18).(Genes Cells, 1996, 1: 569-579) (Fig. 1). De
acuerdo con un método establecido (Genes Cells, 1996, 1:
569-579) usando células LLCMK2 y huevos de pollos
embrionados, el virus que contiene los genes anteriormente
descritos fue reconstituido, dando como resultado la recuperación
del virus que contiene el gen deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
Como líneas celulares establecidas se emplearon
células de fenocromocitoma de rata (PC12), neuroblastoma humano
(IMR-32) y células de glioblastoma humano) (A172).
Las células PC12 se cultivaron en un medio DMEM complementado con
suero de caballo y suero de ternero hasta una concentración final
de 5% de cada suero. Para provocar el brote de neurita, se añadió
un factor de crecimiento de nervio (NGF7S) al medio hasta una
concentración final de 50 ng/ml. Un medio MEM que contenía 10%
suero de ternero complementado con una solución MEM de piruvato de
sodio y solución MEM de aminoácido no esencial hasta una
concentración final de 1 mM y 0.1 mM, respectivamente, se empleó
para el cultivo de células de neuroblastoma humano
(IMR-32). Las células de glioblastoma humano (A172)
se cultivaron en un medio MEM (medio con alta glucosa) que contenía
10% suero de ternero.
Se emplataron 10^{5} células en un plato de 6
cm que contenía NGF en el medio, se incubaron durante 3 días para
producir el brote de neurita y a continuación se emplearon para
experimento de infección de célula PC12. Tras retirar el medio, las
células se lavaron una vez con PBS. Se diluyó SeV en el cual se
introduce el gen GFP (a partir de ahora referido como
GFP-SeV) con 500 \mul de PBS complementado con 1%
albúmina de suero bovino en placas 10^{6} que forman unidad
(p.f.u.), y se añadió a las células para infectar
GFP-SeV durante 20 minutos bajo las condiciones
donde las células se protegieron de secado. Tras la infección el
medio (5 ml) se añadió a las placas, y las células se cultivaron
durante 2 días. Tras el cultivo, las células se examinaron para
fluorescencia GFP bajo un microscopio estereoscópico fluorescente en
el interior de las células. La emisión de fluorescencia no se pudo
observar con las células de control infectadas con SeV
transportando ningún gen GFP y con células no infectadas.
Las células IMR-32 (3 x 10^{5}
células) se emplataron en una placa de 10 cm que contenía un medio
predeterminado, y se cultivaron durante la noche. En base a que se
estimó que el número de células era 6 x 10^{5} tras el cultivo,
se diluyó GFP-SeV a m.o.i (multiplicidad de
infección) de 10 con 1000 \mul de PBS que contenía 1% albúmina
de suero bovino. Después de que las células fueron infectadas con
el virus durante 20 min, se cultivaron en un medio predeterminado
durante 12 o 36 horas, y a continuación se examinaron para
fluorescencia GFP bajo un microscopio estereoscópico fluorescente.
Tras el cultivo de 12 horas, se observó fluorescencia en el cuerpo
celular de células infectadas con GFP-SeV. Después
del cultivo de 36 horas se observó fluorescencia GFP en la porción
neurita además de en el cuerpo celular. No se observó fluorescencia
en las células de control infectadas con SeV transportando ningún
gen GFP y con células no infectadas.
Las células A172 también se infectaron con el
virus de manera similar a la empleada con las células
IMR-32. Se observó fluorescencia en el cuerpo
celular de células infectadas por GFP-SeV, pero no
en las células de control infectadas con SeV transportando ningún
gen GFP y en células no infectadas.
GFP-SeV infectó todas las cepas
establecidas de células nerviosas en el presente estudio, y tuvo
éxito en la expresión de GFP a partir del gen GFP en el interior de
células. Estos resultados indicaron una posibilidad de la infección
SeV del cultivo primario de células del cerebro por administración
in vivo del virus.
Una rata SD de 18 días de embarazo fue
profundamente anestesiada con éter de dietilo, y fue sometida a
eutanasia por la exanguinación de la arteria axilar. Después de
desinfectar la región abdominal con etanol 95%, se sometió a
laparotomía para retirar los fetos junto con el óvulo. Los
siguientes procedimientos se llevaron a cabo bajo condición libre de
gérmenes en hielo, o en solución fría con hielo a menos que se
establezca lo contrario. Los fetos se retiraron del útero empleando
tijeras y fórceps de cabeza redondeada, y se transfirieron a una
placa que contenía 20 ml de una solución para operación (50% DMEM y
50% PBS). Después de colocar los fetos en una almohadilla con gasa
esterilizada, se realizó una incisión en el cuero cabelludo y en el
esqueleto a lo largo de la línea central usando dos pares de
fórceps INOX#4. A continuación, se insertó un par de fórceps INOX#7
a lo largo de la superficie inferior del tejido del cerebro para
sacar el tejido cerebral como un todo cortando la médula oblongata,
y el tejido se cortó y colocó en la solución para operación. Bajo
un microscopio estereoscópico, el cerebro en la solución para
operación se fileteó en tres partes usando dos escalpelos para
separar la raíz cerebral, y dos piezas de los hemisferios
cerebrales que contenían el hipocampo y el cuerpo estriado se
transfirieron a otra solución de operación con fórceps con cabeza
redondeada. Bajo un microscopio estereoscópico, se retiró
completamente la meninge de la superficie del tejido cerebral
usando dos pares de fórceps INOX#7 y se transfirió a otra solución
de operación usando fórceps con extremos redondeados para lavado.
Se colocaron seis piezas de hemisferios cerebrales en una solución
de preservación (90% DMEM (que contenía 5% suero de caballo y 5% de
suero de ternero), y 10% DMSO) con fórceps de extremos redondeados,
y a continuación se cortaron en pequeños trozos de rodajas menores
de 1 mm usando un escalpelo. Por lo tanto, las piezas del tejido
cortados se colocaron en aproximadamente 1.5 ml de la solución de
preservación en un tubo pre-enfriado, que se
almacenó en un contenedor enfriador, se congelaron de manera lenta
durante un periodo de 3 horas, y a continuación se almacenaron en
nitrógeno líquido. Las piezas del tejido de 6 hemisferios
cerebrales se sacaron del nitrógeno líquido, se descongelaron a
32ºC, se lavaron dos veces en 8 ml de la solución de operación, y
se dejaron reposar durante 30 segundos para después retirar el
sobrenadante. A las piezas del tejido se añadieron 5 ml de una
solución de enzima de papaya enfriada con hielo (papaína 1.5 U,
cisteína 0.2 mg, albúmina de suero bovino 0.2 mg, glucosa 5 mg, y
Dnasa 0.2 mg/mkl) que había sido filtrado y esterilizado. La mezcla
se calentó a 32ºC durante 15 min. Y se mezcló invirtiendo el tubo
cada 5 minutos. Se separó el sobrenadante y se añadieron 5 ml de la
solución que contenía 20% del suero de ternero. Se añadió una
solución de papaína (5 ml) precalentada a 32ºC a la fracción del
precipitado, y la mezcla resultante se calentó además durante 15
minutos. La mezcla se mezcló invirtiendo el tubo cada 5 minutos.
Tras una buena turbiedad del sobrenadante así como la confirmación
de la traslucidez de las piezas del tejido, las piezas del tejido
se partieron por pipeteo. La primera fracción de sobrenadante
precalentada a 32ºC se añadió a esta solución muestra, y la mezcla
resultante se centrífugo en un centrifugado precalentado a 32ºC (a
1200 rpm durante 5 minutos). Tras la retirada del sobrenadante, se
añadieron 5 ml de DMEM (que contenía 5% de suero de caballo y 5% de
suero de ternero) y se mezcló con el residuo para dividir las
células, y a continuación tuvo lugar una centrifugación bajo las
condiciones anteriormente descritas. Tras la retirada del
sobrenadante, se añadieron 2 ml de DMEM (que contenía 5% de suero
de caballo y 5% de suero de ternero) al residuo y la mezcla
resultante se agitó. Como resultado del conteo celular, el número
de células resultó ser 5 x 10^{6} células/ml. Por lo tanto, el
principal cultivo de células del cerebro obtenido se plantó en una
placa cubierta con imina de polietileno y se cultivó.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo primario de células del cerebro
obtenidas en el Ejemplo 3 se cultivó en una placa de 10 cm durante
3 días. Tras la retirada del sobrenadante, se añadió una solución
de muestra preparada diluyendo GFP-SeV en 100
\mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino al
cultivo para infectar el virus durante 20 minutos. Tras la
infección, se añadieron 10 ml de DMEM (que contenía 5% de suero de
caballo y 5% de suero de ternero), y las células se cultivaron
durante 2 días. A continuación, las células se examinaron para
fluorescencia de GFP bajo un microscopio estereoscópico
fluorescente. Casi todas las células mostraron fluorescencia. Es
decir, se confirmó que SeV infecta incluso el cultivo primario de
células del cerebro.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la mejora de esta invención, se emplearon
las células de fibroblasto humano deficientes del gen
\beta-glucuronidasa (de aquí en adelante
abreviado como \beta-glu-célula
deficiente) y células de fibroblasto normal.
La mucopolisacaridosis del tipo VII, un tipo de
mucopolisacaridosis, es provocada por la deficiencia de
\beta-glucuronidasa, y muestra una variedad de
síntomas que van desde un caso leve a un caso severo de hidropesía
fetal. Hay muchos casos que muestran varios síntomas desarrollados
durante el periodo infantil, que incluyen la característica facial,
esplenohepatomegalia, retardo psicomotriz, deformación ósea,
etc.
Se ha indicado que, para el transporte
intracelular de \beta-glucuronidasa a lisosoma, la
adición de cadena de azúcar a la molécula de enzima y la
fosforilización de la posición 6 de la molécula de manosa a la
enzima son necesarias. A la llegada al lisosoma, la terminal C de
la enzima sufre proteólisis.
Antes de la mejora de esta invención, se examinó
\beta-glu-SeV para 1) su
infección en células de fibroblasto humano, 2) su cantidad de
expresión, y 3) la presencia de sus especies moleculares para ser
transportadas a lisosoma.
- 1)
- Se prepararon células de fibroblasto deficientes de \beta-glu de modo que se colocaron 10^{5} células/pozo en una placa con 6 pozos. \beta-glu-SeV se diluyó en 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino par que la multiplicidad del cultivo (m.o.i) fuera 5, y las células deficientes de \beta-glu cultivadas durante la noche se infectaron durante una hora. Las células se cultivaron en un medio MEM libre de suero durante 24 horas. Por consiguiente, las células se fijaron a una mezcla de formalina y acetona (1:7, v/v). Con naftol AS-B1 glucuronida como un sustrato, la reacción se llevó a cabo en búfer de acetato, pH 5.0 a 37ºC, y la descomposición del sustrato se controló por la coloración roja. Como resultado, el citoplasma de células deficientes de \beta-glu incubadas con "\beta-glu-SeV" se tiñó de rojo, indicando que las células deficientes de \beta-glu se infectaron con \beta-glu-SeV' para expresar el gen transferido.
- 2)
- Se prepararon células de fibroblasto deficientes de \beta-glu de modo que se colocaron 10^{5} células/pozo en una placa con 6 pozos. \beta-glu-SeV se diluyó en 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino para que la multiplicidad del cultivo (m.o.i) fuera 0.1 y 1.0 y se incubaron durante la noche durante 24 o 48 horas. Tras la incubación durante el periodo predeterminado, las células se recuperaron y se sometieron a ultrasonido para preparar las facciones intracelulares. Con 4-metilumbeliferil- \beta-D-glucuronida como un sustrato, la cantidad de 4-metilumbeliferona (MU), el producto de reacción enzimática, se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia con un fluoro-espectrofotómetro. Los resultados se muestran en la Tabla 1. En esta tabla, la cantidad de expresión está representada por la cantidad de 4-metilumbeliferona (MU) producida por 1 mg de proteína en la fracción intracelular en una hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se muestra en la Tabla 1, la cantidad
de expresión oscila entre 15,900 y 32,300 (nmol MU/proteína
total/h) y 276 para células de fibroblasto normal y 911 para la
células que expresa \beta-glucuronidasa con un
retrovirus \beta-glu-retro),
indicando que SeV fuertemente expresa un transgen en las células
infectadas con SeV.
3) Las fracciones obtenidas en 2) se emplearon
como la fracción intracelular de células de fibroblasto deficientes
de \beta-glucuronidasa infectadas por
"\beta-glu-SeV". Al igual que
la fracción sobrenadante del cultivo, las proteínas contenidas en
el sobrenadante del cultivo se recuperaron por precipitación con
acetona fría. Por lo tanto, las muestras del test obtenidas se
sometieron al análisis Western Blot usando un anticuerpo
\beta-glucuronidasa anti-humano.
Como resultado, en la fracción intracelular de células de
fibroblasto deficientes de \beta-glucuronidasa
infectadas por
"\beta-glu-SeV", se
identificaron dos tipos de proteínas: una tiene un elevado peso
molecular y otra tiene un bajo peso molecular, y ambas son
reactivas con el anticuerpo \beta-glucuronidasa
anti-humano. La banda de la proteína de bajo peso
molecular corresponde con la proteína reactiva con el anticuerpo
\beta-glucuronidasa anti-humano en
células de fibroblasto normal, lo que indica que es una especie
molecular de \beta-glucuronidasa cuya terminal C
ha sufrido proteólisis tras ser transportada al lisosoma. La
proteína de elevado peso molecular no se observó en la célula de
fibroblasto normal, pero estuvo presente en las fracciones
intracelular y sobrenadantes de células de fibroblasto deficientes
de \beta-glucuronidasa infectadas por
"\beta-glu-SeV". La fracción
sobrenadante solamente contuvo la proteína de elevado peso
molecular. Esto puede deberse a la una expresión demasiado elevada
de \beta-glucuronidasa provocada por la infección
de \beta-glu-SeV, en la cual el
transporte de especies de proteína de elevado peso molecular a
lisosoma falló en alcanzar dicha elevada expresión de enzima, dando
como resultado la segregación de la proteína en microsoma o espacio
extracelular. De manera alternativa, juzgando su peso molecular, la
proteína de elevado peso molecular puede ser una especie molecular
con una cadena de azúcar unida pero sin la posición 6 de molécula
de manosa siendo fosforilizada de modo que no puede transportarse a
un lisosoma.
Por lo tanto, la
\beta-glucuronidasa humana, que se asume que se
transporta a lisosoma, fue capaz de expresarse en la fracción
intracelular de células de fibroblasto deficientes de
\beta-glucuronidasa infectadas por
"\beta-glu-SeV".
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones de 8-10 semanas fueron
anestesiados con 200 \mul de Nembutal diluido 10 veces. Tras
craniotomía, se perforó un agujero de 1 mm de diámetro en el
esqueleto en la posición 1.0 mm desde el bregma y 1.5 mm a la
derecha de la línea central con una taladradora dental. Tras la
retirada de la dura, se administró GFP-SeV en la
posición 1.3 mm de profundidad usando una aguja de jeringuilla 27
G. La dosis de GFP-SeV fue de 20 a 30 \mul, y el
número de virus contenidos en la solución de muestra se estimó que
fue 1 x 10^{7} p.f.0 a 1.5 x 10^{7} p.f.u.. A los ratones de
control se les administró PVS o SeV que no transportaba ningún gen
GFP. La autopsia se realizó 3, 5, 7 y 10 días después de la
administración. Se retiró todo el cerebro, se realizó una sección
transversal frontal. Bajo un microscópico estereoscópico
fluorescente, se observó fluorescencia GFP. En el cerebro
diseccionado sometido a autopsia 3 días después de la
administración de GFP-SeV, se observó una evidente
fluorescencia GFP. En el punto a lo largo del ventrículo de la
sección transversal frontal, se observó fluorescencia distinta de
GFP (Fig. 2). Tal y como se describe en el Ejemplo 8 a
continuación, se pensó que las células infectadas por SeV que
emitieron GFP eran células ependimales. Las células a lo largo del
ventrículo lateral también se volvieron fluorescentes 5 y 7 días
después de la infección. Sin embargo, la intensidad de la
fluorescencia disminuyó de manera significativa en las células 7
días después de la infección y no se observaron células
fluorescentes en el cerebro 10 días después. No se pudo observar
fluorescencia en los cerebros de los ratones de control a los
cuales se les había administrado PBS o SeV sin gen GFP como
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar la infección SeV de células
nerviosas, especialmente células piramidales y del hipocampo, que
es el principal objeto de esta invención, precisamente se requiere
la administración dirigida de SeV a la vecindad del hipocampo. Por
lo tanto, se llevó a cabo un estereotaxia para introducir SeV en el
cerebro parenquimal y las células parénquimas del cerebro se
examinaron en busca de infección. Se emplearon 1) ratones y 2)
ratas como animales experimentales.
1) Se perforaron 2 agujeros de 1 mm de diámetro
a través del esqueleto en la posición 2 mm a la izquierda y a la
derecha de la línea media y 3 mm anterior al bregma usando una
perforadora dental. Se administró GFP-SeV (1.5
\mul cada uno) a las porciones parenquimales, 3.5 mm de
profundidad sobre el costado derecho y 2.5 mm de profundidad sobre
el costado izquierdo, usando un tubo capilar de cristal. Se cerró
el esqueleto, y mediante cirugía se abrió 3 días después para
examinar la expresión GFP, que se observó en la porción
parenquimal. Tras la fijación con etanol, se prepararon los trozos
de tejido. A pesar de que la fluorescencia de GFP se redujo de
manera significativa en los trozos congelados tras la fijación con
etanol debido a la fuga de cromóforos, aún se observaron puntos
fluorescentes. En la materia blanca junto a la cápsula interna, se
observó fluorescencia GFP sobre el axón desde el cual la proteína
mielina se eluyó con etanol. Además, la fluorescencia GFP también
se observó en el axón en el área que presuntamente era el cuerpo
estriado.
Estos resultados demostraron que
GFP-SeV fue capaz de infectar células nerviosas del
cerebro de un ratón.
2) Debido a que ya se había realizado un
espectrógrafo preciso para rata, puede administrarse de manera
precisa GFP-SeV a la vecindad de células
piramidales en el área del hipocampo CA1. Una rata que pesaba
aproximadamente 170 gramos fue anestesiada, y tras craniotomía, se
perforaron dos agujeros de 1 mm de diámetro a través del esqueleto
en la posición 2 mm a la izquierda y derecha de la línea media y
4.5 mm anterior al sigma interno con una perforadora dental. Se
administró GFP-SeV (1.5 \mul cada uno) a las
porciones parenquimales, 3.5 mm de profundidad sobre el costado
derecho y 2.5 mm de profundidad sobre el costado izquierdo, usando
un tubo capilar de cristal. Se cerró el esqueleto, y mediante
cirugía se abrió 3 días después para examinar la expresión GFP.
Como resultado, la expresión GFP se observó en el área celular
piramidal del hipocampo CA1, donde se administró
GFP-SeV en 2.5 mm de profundidad. Una visión
aumentada de la región adyacente al hipocampo a través de un
microscopio fluorescente reveló la fluorescencia marcada en los
cuerpos celulares de las células piramidales del hipocampo CA1 y
dendríticas. La expresión GFP se observó incluso en las células
piramidales 13 días después de la administración. Incluso 13 días
después de la administración de GFP-SeV, la
expresión GFP se observó en los cuerpos celulares y dendríticos de
las células piramidales. Estos resultados demuestran que la
infección de SeV no provoca la muerte celular incluso 13 días
después de la infección, lo que sugiere de manera clara la utilidad
de SeV como un vector para la terapia de genes dirigida a la
prevención de muerte de células exfoliadas tras isquemia
cerebral.
Los resultados del Ejemplo 6 indican que las
células ependimales están infectadas por SeV por administración
intraventricular. Por lo tanto, los inventores llevaron a cabo un
experimento en el que se administró
\beta-glu-SeV a ratones
deficientes de \beta-glucuronidasa usando
\beta-glu-SeV (J. Clin. Invest.,
1989, 83: 1258-1266) para inducir secreción de
\beta-glucuronidasa a partir de las células
infectadas en el fluido cerebroespinal y a continuación absorberse
por las células objetivo para que los síntomas mejoren.
Los ratones homocigotos se seleccionaron de
ratones obtenidos por reproducción de ratones heterocigotos en base
a la actividad \beta-glucuronidasa en sangre de
la vena de la cola de los ratones y en base a la presencia del
punto de división Nlal IV en los fragmentos de amplificación PCR
del lugar deficiente de gen \beta-glucuronidasa en
los cromosomas de ratones, y se emplearon en el presente
experimento.
La administración de
\beta-glu-SeV se llevó a cabo de
acuerdo con el método descrito en el ejemplo 6. Se extirpó el
cerebro de 3 a 12 días después de la administración para preparar
láminas congeladas de tejido. La actividad de
\beta-glucuronidasa en el tejido fue examinada
usando una modificación del método descrito en el Ejemplo 5, 1).
Tal y como se muestra en la Figura 3, los puntos en los que se
expresó \beta-glucuronidasa se tintaron
fuertemente de rojo a lo largo de los ventrículos. Cuando se
agrandaron en el microscopio, las células ependimales del
ventrículo lateral verificaron que expresaban claramente
\beta-glucuronidasa, que a continuación se
segregó de las células. En la lámina de tejido preparada 12 días
después de la administración (Figura 4), la
\beta-glucuronidasa que había sido expresada y a
continuación segregada de las células ependimales del ventrículo
lateral demostró estar difusa en el ventrículo con la migración del
fluido espinal hasta alcanzar la vecindad del hipocampo. Las
capacidades físicas de los ratones homocigotos mejoraron
aparentemente, aunque ligeramente, por medio de esta
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
Jerbos (de peso entre 60 y 80 g) fueron
anestesiados con Nembutal, fijados a un instrumento estereotáctico,
depilados, y a continuación se les realizó una incisión en el cuero
cabelludo a lo largo de la línea media. Se perforó un agujero en el
esqueleto en la posición 1.0 mm desde el bregma y 1.5 mm a la
derecha de la línea media usando una perforadora dental con cuidado
de no evitar dañar los vasos sanguíneos bajo el hueso craneal. Tras
perforar el agujero, se retiraron la dura y otros con pinzas.
FGF-1-SeV de ratones (5 x 10^{6}
pfu), FGF-5-SeV de humanos (5 x
10^{7} pfu) y GPF-SeV (5 x 10^{6} pfu) se
inyectaron 1.0 mm de profundidad en el ventrículo lateral derecho
(n = 2) con una aguja con jeringuilla 30G. Los virus recombinantes
se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Los cambios en el peso
corporal se controlaron midiendo el peso, y se observó un descenso
del peso corporal a partir del siguiente día de la administración
(Figura 5). En el grupo al que se le administró
FGF-1, el peso corporal comenzó a descender a partir
del siguiente día de la administración, y continuó descendiendo
aproximadamente un 5% todos los días hasta 5 días más tarde, dando
como resultado un 29.5% de descenso 6 días más tarde, y el máximo
descenso de 29.8% se observó 7 días más tarde. A continuación, el
peso corporal comenzó a aumentar, y se recuperó hasta un 3.5% del
descenso 20 días después de la administración. En el grupo al que
se le administró FGF-5, el peso corporal comenzó a
descender a partir del siguiente día, alcanzó el máximo de 21.7% de
descenso días después de la administración, y después volvió a
aumentar, recuperándose hasta un 8.0% del descenso 20 días más
tarde. En el grupo al que se le administró FGF-9,
se observó un descenso similar en el peso corporal a partir del
siguiente día, y mostró un máximo de 22.9% 5 días después de la
administración, y a continuación volvió a aumentar, alcanzando la
recuperación hasta un 6.40% del descenso 20 días después. En el
grupo de control al que se le administró GFP-SeV,
se observó un máximo de un descenso del 5.8% en el peso corporal,
lo que fue provocado presumiblemente por la propia administración.
Sin embargo, el índice de pérdida de peso corporal fue
relativamente pequeño en comparación con los grupos a los que se
les administró FGF, lo que claramente indica que FGF afecta a la
pérdida de peso corporal.
Dado que el descenso de peso corporal debido a
la administración de FGF-1-SeV y
FGF-5-SeV se observó en jerbos, se
llevó a cabo un estudio más detallado usando ratones
B-6 (de peso oscilante entre 20 y 22 gramos). Se
seleccionó el ventrículo derecho lateral como punto de
administración, y se perforó un orificio de 1.0 mm de diámetro en
el esqueleto en la posición 1.0 mm desde el bregma y 1.5 mm a la
derecha de la línea media con una perforadora dental. Tras la
retirada de la dura, se administró una muestra al animal en el
orificio a una profundidad de 1.3 mm con una aguja de jeringuilla
27G. Las soluciones de muestra se prepararon añadiendo 9 \mul, 8
\mul y 9 \mu de PBS a soluciones de 1 \mul de
FGF-1-SeV (1 x 10^{6} pfu), 2
\mul de FGF-5-SeV (2 x 10^{6}
pfu), y 1 \mul de control GPF-SeV (1 x 10^{6}
pfu), respectivamente. El peso corporal y la ingesta de comida se
controlaron durante 2 semanas tras la administración viral.
A los ratones de control a los que se les
administró GFP-SeV no mostraron ningún descenso en
el peso corporal, pero mostraron un incremento del 7.5% en
comparación con el peso medido antes de la administración (Figura
6). La cantidad de ingesta de comida no cambió de manera
significativa (Figura 7). En el grupo al que se le administró
FGF-SeV, se observó una media de un descenso de
30.5% en peso corporal 6 días después de la administración (Figura
6). Después, el peso corporal volvió a aumentar, dando como
resultado un incremento corporal del 13.5% 2 semanas más tarde. El
cambio en la ingesta de comida debido a la administración de
FGF-1 fue tan drástico que prácticamente no se
observó ingesta de comida desde el día 2 hasta el día 6,
especialmente desde el día 3 hasta el día 6 tras la administración
(Figura 7). En el grupo al que se le administró
FGF-5-SeV, a pesar de que se observó
un descenso del peso corporal, el índice de descenso fue menor en
comparación con el grupo al que se le administró
FGF-1-SeV, y el máximo fue un 17.9%
(Figura 6). El efecto en el descenso del peso corporal fue de
alguna manera similar al obtenido en el sistema experimental con
jerbos. A pesar de que el efecto de la administración de
FGF-5-SeV sobre el descenso del
peso corporal fue menor que el de la administración de
FGF-1-SeV, se observó claramente un
descenso en la ingesta de comida (Figura 7).
Tal y como se muestra en los resultados del
ejemplo, le efecto de la expresión intraventricular de FGF inducido
por SeV en el descenso del peso corporal fue un descenso del 30% en
el punto máximo. Teniendo en consideración que el efecto de la
inyección intraventricular de FGF en la forma de proteína
purificada sobre el descenso del peso corporal fue de 7 a 8% como
máximo, la cifra de 30% conseguida en la presente invención
demostró ser extremadamente elevada. Las diferencias en estos
efectos pueden deberse a la diferencia en la acumulación
intraventricular de FGP dependiendo de los métodos de
administración, pero existe otra posibilidad de que la diferencia
se deba a una acción directa de FGF sobre las células nerviosas a
través de la infección de SeV a las células ependimales. Al igual
que el control alimenticio en el cerebro, solo se observó el
control del hipotálamo por los núcleos nerviosos. A la vista de
esto, se infiere que SeV infecta de manera eficiente las células
ependimales para segregar una proteína funcional al fluido
cerebroespinal en el ventrículo, y que dicha proteína segregadora
actúa de modo eficiente sobre los núcleos del nervio hipotalámico
para ejercer el control alimenticio. Esta conclusión estaría
apoyada por los hechos de que una parte del tejido del nervio
hipotalámico tiene una construcción nerviosa con las uniones
ajustadas de la barrera sangre-cerebro perdidas y
contiene neuronas para recibir factores líquidos en la circulación
periférica y fluido cerebroespinal.
Entre los núcleos hipotalámicos, las neuronas
quimiosensibles se encuentran presentes en el hipotálamo
ventromedio (VMH) y en el área lateral hipotalámica (LHA), que se
cree que son los centros de alimentación y saciedad, y la actividad
neuronal se altera en respuesta a los productos metabólicos y las
hormonas contenidas en sangre y fluido cerebroespinal. Estas
neuronas VMH y LHA que responden a la glucosa, y ciertas citoquinas
y factores del crecimiento también son conocidos por actuar como
reguladores del apetito. Además, se ha demostrado que, a partir del
experimento de disrupción, el núcleo paraventricular (PVN) es
también responsable de la supresión de ingesta de comida. Este
núcleo tiene neuronas que producen una hormona que libera
corticotropina (CRH) y muestra la depresión en la comida y la
actividad receptiva del nervio. Además, el núcleo arqueado (ARC) es
el punto para producir NPY, un estimulador de ingesta de comida,
que se sugiere que va dirigido a PVN. Los resultados del
experimento sobre el control de comportamiento alimenticio aquí
descritos sugieren que FGF actuó sobre los núcleos nerviosos.
Debería prestarse atención a la relación con leptina, que se
expresa en adipocitos maduros que tienen gotas de lípido que se ha
estudiado de modo extenso en relación con los comportamientos
alimenticios así como NPY, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
El área expuesta a isquemia cerebral sufre
lesión celular, y además se deja que tenga lugar una muerte celular
a medida que la isquemia progresa. La extensión de la muerte
celular depende del grado y duración de isquemia. En el caso de
isquemia severa, no solamente las células nerviosas sino también
las células constitutivas en el área isquémica mantienen lesiones
irreversibles en un breve periodo de tiempo, dando como resultado
la formación de focos de infracción cerebrales provocados por
necrosis. Sin embargo, en el caso de fuerza isquémica severa de
corta duración, o en el caso de isquemia leve de larga duración,
las células en la región isquémica se vuelven frágiles dependiendo
de la severidad de la isquemia. Las células más frágiles son las
células nerviosas, y a continuación le siguen los oligodendrocitos.
Las células de astroglia, microglia, y endoteliales vasculares han
demostrado ser más resistentes a la tensión isquémica. A partir del
examen empleando un modelo difuso de isquemia en cerebro, se ha
sabido que hay diferencias en la resistencia a la tensión isquémica
entre células nerviosas. Las células más frágiles conocidas
incluyen células nerviosas del hipocampo CA1, aquellas del hilo de
giro dentado, y aquellas de los núcleos vestibulares en la región
occipital de la cabeza, que muestran una muerte celular retardada.
La muerte retardada de las células nerviosas es un buen modelo de
muerte celular nerviosa selectiva con elevada reproducibilidad
independiente de la insuficiencia energética, lo que contribuye en
gran medida a la elucidación de mecanismos moleculares de muerte
celular isquémica. Ha habido muchos informes sobre experimentos que
han empleado estos sistemas de modelos para examinar, por ejemplo,
qué cascada deben atravesar las células nerviosas hasta llegar a su
muerte, qué paso de la cascada es crítico para proteger la célula,
en qué tipo de muerte celular se clasifica la muerte retardada de
célula nerviosa, etc.
Al igual que en el modelo experimental, animales
tales como ratas, jerbos y ratones se emplean con frecuencia. Estos
animales se usan para estudiar y tratar los cambios patológicos en
las porciones vulnerables a la isquemia, como hipocampo, cuerpo
estriado etc., inducidos por isquemia pasajera en todo el cerebro de
los modelos de isquemia durante varios minutos. Un modelo de rata
con oclusión de cuatro vaso, un modelo de rata con oclusión de
arteria carótida común bilateral hipotensa, un modelo de jerbos con
oclusión de arteria carótida común bilateral, etc., se emplean con
frecuencia como modelo de isquemia. Los presentes inventores
llevaron a cabo un experimento de isquemia usando un modelo de
jerbo con oclusión de arteria carótida común bilateral. Se ha
conocido que en jerbos la muerte celular ocurre principalmente en la
mayor parte de las células piramidales en el área del hipocampo
CA1 cuando los animales se someten a una isquemia durante un breve
periodo de tiempo (5 min.). Por lo tanto, los presentes inventores
realizaron un experimento con el objetivo de prevenir la
exfoliación celular tras isquemia introduciendo en SeV un gen capaz
de prevenir la muerte celular y administrando el complejo
resultante al hipocampo de jerbos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo con un
modelo de jerbo (especio de jerbo) con oclusión de arteria carótida
común bilateral (5 min). Cerrando (5 min) la arteria carótida común
bilateral de un jerbo, las células piramidales del hipocampo se
exfolian de manera selectiva 3-5 días después de la
oclusión. Sin embargo, debido a que este fenómeno no se observa
comúnmente entre los jerbos, es necesario proyectar jerbos
excelentes como modelos animales de los obtenidos a partir de una
fuente comercial. Los jerbos seleccionados por la proyección
(obtenidos del instructor Doctor Maeda, Departamento 1 de Anatomía,
Universidad Municipal de Osaka) se usaron para este
experimento.
Tras anestesiarlos con quetamina, los animales
fueron sometidos a toracotomía para encontrar las arterias
carótidas en el lado izquierdo y derecho de la tráquea, y se eliminó
la grasa adherida a la arteria carótida. Tras la retirada de la
grasa, las arterias carótidas se ocluyeron durante 5 minutos con
clips. Durante este procedimiento, debido a que la velocidad de
muerte celular se reduce de manera significativa cuando las
temperaturas del cerebro y el cuerpo son bajas, los animales se
mantuvieron calientes para mantener la temperatura corporal a
37.5ºC estando controlados con un termómetro insertado en el ano.
Los clips se retiraron 5 minutos más tarde, y la sangre se inyectó
de nuevo. Cinco días más tarde, los jerbos fueron sacrificados, y,
tras la craniotomía, el cerebro se extirpó para preparar láminas de
tejido en parafina. Las condiciones de las células nerviosas se
confirmaron por tinte con toluidina. Tal y como se esperaba, la
exfoliación de las células piramidales se observó en el área del
hipocampo CA1 (Figura 8). Por consiguiente, se ha preparado el
modelo de jerbo con muerte celular isquémica.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector SeV preparado anteriormente se emplea
para examinar si el vector SeV es efectivo para la prevención de
célula nerviosa del siguiente modo: El día antes de la isquemia, se
introduce el virus solamente en el cerebro derecho de los jerbos.
Se aplica isquemia el siguiente día, y los animales se sacrifican
5-6 días más tarde para observar las células
piramidales del hipocampo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron jerbos de peso entre 60 y 80
gramos y se emplearon en este experimento. Tras ser anestesiados
con Nembutal, los animales se fijaron a un instrumento
estereotáctico. A continuación, el cerebro se depiló y el cuero
cabelludo se cortó y abrió a lo largo de la línea media del
cerebro. Se perforó un orificio a través del esqueleto en la
posición 5 mm desde el bregma y 2 mm a la derecha de la línea media
usando una perforadora dental con cuidado de no dañar los vasos
sanguíneos bajo el hueso craneal. Tras perforar el orificio, la
dura y otros se retiraron con pinzas. Se insertó una aguja de
cristal para administración en la posición a una profundidad de 1.4
mm, y se dejó que los animales reposaran durante 2 minutos. A través
de la aguja de cristal, se inyectó 0.5 a 1.0 \mul de una solución
de virus FGF-Sendai (virus de 1.0 x 10^{6} pfu a
2.0 x 10^{6} pfu) a la posición durante un periodo de 12 min, y se
dejó que el animal reposara 10 minutos adicionales. Se retiró la
aguja, y la incisión se cosió. En este procedimiento, el virus se
administró solamente al cerebro derecho, y la exfoliación de las
células nerviosas tras isquemia se determinó comparando los
cerebros derecho e izquierdo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras ser anestesiados con quetamina, los
animales fueron sometidos a toracotomía para encontrar las arterias
carótidas en el lado izquierdo y derecho de la tráquea, y se
eliminó la grasa adherida a las arterias carótidas. Tras la
retirada de la grasa, las arterias carótidas se ocluyeron durante 5
minutos con clips. Durante este procedimiento, debido a que la
velocidad de muerte celular se reduce de manera significativa
cuando las temperaturas del cerebro y el cuerpo son bajas, los
animales se mantuvieron calientes para mantener la temperatura
corporal a 37.5ºC estando controlados con un termómetro insertado
en el ano. Los clips se retiraron 5 minutos más tarde, y la sangre
se inyectó de nuevo. De cinco a seis días más tarde, los animales
fueron sacrificados.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras sacrificar el animal, las secciones
transversales frontales del romboencéfalo se realizaron en láminas
gruesas de 300-500 \mum, se dejaron en remojo en
4% de formaldehído durante la noche, y se unieron a parafina con un
aparato automático para fijación y unión. Las secciones (5 \mum
de grosor) se prepararon, se les eliminó la parafina, y se
sometieron a tinte inmunohistoquímico y a otros tintes.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secciones del cerebro a las que se les
administró FGF-1 se prepararon para examinar la
reactividad a un anticuerpo contra el virus, a un anticuerpo
anti-tubulina (para determinar el efecto de
operación isquémica), a un anticuerpo anti-GFAP
(para examinar el movimiento de astrosito), y a un anticuerpo
apoptag (para examinar la presencia de apoptosis). Los resultados
se resumen brevemente a continuación (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
En las células piramidales de la región del
hipocampo CA-1, el tinte HE no reveló ningún cambio
en las células nerviosas en la muestra de control, que no sufrió
isquemia. Muchas células en un lado del cerebro que sufrieron
isquemia pero a las que no se les administró el virus fueron
células nerviosas atróficas que mostraron condensación nuclear en
el núcleo y cambio eosinofílico en el citoplasma, los llamados
cambios isquémicos. Sin embargo, en el otro lado del cerebro, que
sufrió isquemia y al que se le administró el virus, se observó que
un pequeño número de células nerviosas deformadas estaban
dispersas, pero una mayor parte de las células nerviosas
mantuvieron la morfología original. En el lado en el que el virus
fue administrado, se observó una región que fue positiva para el
anticuerpo contra el virus. En las células nerviosas que sufrieron
isquemia pero donde el virus no fue administrado, la mayor parte de
las células que mostraron deformación fueron positivas para el tinte
apoptag. En cambio, en las células que sufrieron isquemia y donde
se administró el virus, solamente una pocas células que se tintaron
con HE y mostraron cambio morfológico fueron positivas para tinte
apotag, lo que indica que apoptosis fue suprimida en la mayoría de
las células en este lado (Figura 9).
La presente invención ha proporcionado un método
in vitro para transferir un gen a células nerviosas en los
tejidos que incluyen el tejido nervioso central, en los que la
transferencia de un gen había sido difícil hasta ahora. También se
proporciona la materia relacionada con el método. La invención
permite una transferencia eficiente de un gen deseado a las células
en terapia de genes.
Claims (12)
1. Un método para transferir ácido nucleico a
células nerviosas in vitro, que consiste en un paso de poner
en contacto las células nerviosas con un vector viral de ARN de
sentido negativo que está formado por un gen externo en su genoma o
poner en contacto las células nerviosas que están formadas por
dicho vector, donde dicho virus de ARN de sentido negativo
pertenece a la familia Paramixoviridae.
2. Uso de un vector viral de ARN de sentido
negativo para la fabricación de un medicamento para controlar el
comportamiento alimenticio de animales, donde dicho vector está
formado por un gen externo que codifica el factor de crecimiento
para fibroblasto (FGF)-1 o FGF-5 en
su genoma, y dicho virus ARN de sentido negativo pertenece a la
familia Paramixoviridae.
3. Uso de un vector viral de ARN de sentido
negativo para la fabricación de un medicamento para terapia de
genes enfocada a células nerviosas, donde dicho vector está formado
por un gen externo en su genoma, y dicho virus ARN de sentido
negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.
4. Uso de la reivindicación 3, donde dichas
células nerviosas son las células del sistema nervioso central.
5. Uso de la reivindicación 4, donde dichas
células del sistema nervioso central son células ependimales
ventriculares.
6. Uso de la reivindicación 4, donde dichas
células del sistema nervioso central son células del hipocampo.
7. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 2
a 6, que además permite expresar de manera pasajera dicho gen
externo.
8. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 2
a 7, donde dicho gen externo codifica una proteína segregadora.
9. Uso de la reivindicación 8, donde dicha
proteína actúa sobre los núcleos hipotalámicos.
10. Uso de la reivindicación 8, donde dicha
proteína es capaz de proteger el cerebro frente a isquemia.
11. Uso de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, donde dicho virus que pertenece a la
familia Paramixoviridae es el virus Sendai.
12. Un vector viral de ARN de sentido negativo
para terapia de genes in vivo de células nerviosas, estando
formado dicho vector por un gen externo que codifica una proteína
segregadora en su genoma, donde dicho virus de ARN de sentido
negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.
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