【発明の詳細な説明】
ＣＮＳ障害に対して保護するための成長因子を用いた予備治療
発明の分野
本発明は、患者の中心神経系へ因子を提供することによって外傷、神経変性疾
患の変遷、毒の傷害、機能不全又は老化の結果として生じる、障害及び死滅に対
する神経細胞を保護するための方法に関する。
発明の背景
パーキンソン病、アルツハマー病、ハンチントン病、多発性筋萎縮外硬化症、
発作、精神分裂病、てんかん、糖尿病性抹消神経障害等の神経変性疾患は、数１
００万の人々に影響を与えている病気又は障害である。それは、異なる神経性傷
害のそれぞれに特有な行動的な欠陥、肉体的な欠陥を引き起こす正常な神経機能
の損失による。慢性や急性の神経変性的障害に加えて、両方の中心神経系への老
化過程及び物理的な外傷は、共に神経細胞の欠如を生じ、その後、行動的な欠陥
、肉体的な欠陥を生ずる。近年において、神経性障害に対して最もリスクが高い
老年者の人口が拡大しているために、重要な関心事となっている。
最近、試験管内及び生体内における研究によって、神経性傷害が発生する前に
所要の薬剤を投与することで、保護効果を発揮することができ、その結果神経細
胞欠損を減少させることが示された。1996年５月21日に発行された米国特許第5,
519,035号は、大脳の虚血の結果として神経細胞が死滅するのを防止するために
タンパク質キナーゼＣ阻害剤を用いて発作の危険性のある患者を治療する方法を
提供する。十分な量のタンパク質キナーゼＣ阻害剤を一日当たりの基準で投与す
ることによって、万一、虚血傷害を起こした場合に、その薬剤のレベルが、虚血
発生された際に酸化窒素による神経毒の影響を打ち消すのに十分高いかどうかを
確認する。
黒質線状体経路におけるドーバミンニューロン欠損によって特徴付けられるパ
ーキンソン病は、比較的にありふれた神経性障害である。ドーパミン作用性の神
経羞、１メチル−４−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(ＭＰＴＰ)が
人
間に投与されたときパーキンソン病の症状を引き起こし、ＭＰＴＰはしばしばパ
ーキンソン病の動物モデルにおいてパーキンソン症候群を引き起こすために使用
される。トーマック(Tomac)等(1995年、Nature 373 pp 335−339)は、神経膠細
胞線由来の神経栄養性因子(GDNF)を、MPTPの投与前に24時間マウス脳に注入した
とき、該因子がドーパミン作用性のニューロンに保護的な効果を持つことを報告
している。同様の結果が脳青斑においてニューロンに対するGNDFの神経保護効果
について報告された。別のドーパミン作用性の神経毒、６−ヒドロキシドーパミ
ン(6−OHDA)の投与する24時間前に、青斑の中に高レベルのGDNFを発現する遺伝
子的に処理された繊維芽細胞を移植することによって、その領域においてノルア
ドレナリン作用ニューロンの６−OHDA誘発変性を８０％以上抑えた(アレナス(Ar
enas)等、Neurons 15：1465−1473(1995年))。塩基性の繊維芽細胞成長因子(bFG
F又はFGF-2)は、MPTP又はメチルピリジニウムミオン(MPP)に露出された黒質線状
体の細胞に対して保護的な役割を持つ(Park & Mytilineou Brain Res.599：83−
97(1992))；Chadi等Exp．Brain Res．97:145−158(1993)；Otto及びUnsicker J
．Neurosci．Res．34：382−393(1993)。試験管内及び生体内での研究からの結
果は、FGF−２を神経毒にさらす４日前までの期間投与し、かつ毒にさらした後
数日間の投与し、毒によって損傷を受けたドーパミン作用性の神経の数をかなり
減少させた。培養された細胞についてEGFを用いた場合にも、類似の結果が報告
された(Park & Mytilineou、supra)。加えて、FGF-2は海馬状隆起における神経
保護効果を有することが示された。Koketsu等(Ann．Neurol．35：451−457(1994
))は、焦点となる脳の虚血前３日間及び虚血後１日に連続脳内脳室Icv(intracer
broventricular)注入によって投与されたFGF-2が、虚血攻撃により引き起こされ
た梗塞の大きさを減少させたことを報告した。Koketsu等は、観測された保護効
果が、神経膠及び血管に対する栄養に関する影響のためか、“細胞死”プログラ
ムを拮抗する神経遺伝子の発現工程を経由したニューロンに対するFGF−２の直
接的に栄養に関する作用のためであると結論づけた。しかしながら、神経膠細胞
増殖に対する形跡が観察されていなかった。Liu等、Brain Res.626：335−338(1
993)は、発作誘発する神経毒カイニン酸を腹膜内に注入する前２日間、及び注入
後５日間の脳内脳室に移送す
るFGF−２が毒への行動的な応答に影響を与えないが、海馬状隆起における神経
細胞の欠損を防止した。Koketsu等は、ニューロンに対する成長因子の保護効果
は、カイニン酸投与に応答して通常起こる神経細胞内でカルシウムレベルが増大
し、FGF-2が防止するためであると提案した。
1995年８月１日に発行された米国特許5,438,121号は、脳由来の神経栄養性の
因子(BDNF)に関するもので、神経毒により引き起こされる細胞の損傷度を減少さ
せるために、神経毒MPP及び６−OHDAにさらす24時間前に細胞培地にBDNFを加え
ることができることを開示している。1996年９月10日に発行された米国特許5,55
4,601号は、卵巣が切除された動物における神経栄養性の成長因子の産出を刺激
することを通して細胞死からの中枢神経系における細胞を保護する方法を開示し
ている。この方法は、血液脳障害を横切ることを可能とする特有の構造を有する
発情ホルモン混合物の長期間に渡っての投与を利用し、神経成長因子(NGF)及びB
DNF等の神経栄養性成長因子タンパク質の産出を刺激することによる。発情ホル
モン化合物の効果は、低血糖症及び刺激性のアミノ酸に対する保護作用や、卵巣
が切除された動物における神経栄養性の成長因子の産出を化合物が刺激すること
によるものと信じられていた。保護効果が神経組織に対するステロイドの細胞分
裂促進性の影響のためではないことは留意された。
国際出願番号ＷＯ 95/13364は、生体内で神経組織へ成長因子の投与が、患者
の幹細胞を分裂することを誘発し、病気の結果として損傷を受けた細胞を取りか
えることを開示している。
発明の要約
方法は、障害又は外傷から又は、神経性疾患又は障害の発生又は老化過程から
哺乳類の神経組織を保護するための方法を提供する。この方法は、神経組織に対
して保護効果を生ずる多能性の神経幹細胞の増殖を誘発するために１以上の効果
的な量の成長因子を哺乳動物に投与することからなる。成長因子治療は、治療の
中止後最後の週と数カ月間の間延長された保護効果を提供するためにまだ神経細
胞が健全である間に終了することができる。
EGF、アンフィレグリン、繊維芽細胞成長因子、転移成長因子α等の成長因子
及びそれらの組み合わせは、例えば、哺乳動物の１以上のCNS脳室など、哺乳
動物に外因的に投与することができる。あるいは、成長因子を生産するように哺
乳類の神経組織の細胞に対して遺伝的に変性していることによって投与されるこ
とができる。
細胞死又は細胞の機能不全につながる連続的な細胞障害から神経細胞集団を保
護するために十分な量で、かつ、外傷の開始又は病気の発現や老化を生じる前の
時期に成長因子を投与する。
本発明は、神経性疾患又は神経変性疾患や障害、神経学的な外傷、及び／又は
神経組織の老化を予防治療するための薬剤の製造において成長因子の使用又は複
数の成長因子の組み合わせにも向けられる。
図の説明
図１Ａ−１Ｆは、コントロール(前治療なく、虚血のないもの：１Ａ、１Ｂ)又
は媒介物(１Ｃ及び１Ｄ)又は虚血外傷よりｔ月間前EGF(１Ｅ及び１Ｆ)をi.c.v注
入したどちらかを受けた虚血した１週間後のラット(１Ｃから２Ｆ)のニシル着色
された頭頂の部分(10μｍ、ブレグマ3.3mm)の写真を示す。CAlニューロンは、虚
血のないコントロール(１Ａ及び１Ｂ)及びEGF予備治療した虚血動物(１E及び１
Ｆ)に存在したが、媒介物治療した虚血動物(１Ｃ及び１Ｄ)には存在せず、EGFで
予備治療によって海馬状隆起のCAl領域において虚血誘発される細胞死に対して
保護することができることを証明した。
発明の詳細な記述
本発明は、老化、外傷、毒物による傷害、神経性疾患又は障害の影響から神経
組織を保護するための方法を提供する。ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細
胞に分化可能な子孫細胞を増殖させ、発生させるための多能性神経幹細胞及び神
経幹細胞子孫を誘発するために、外傷の開始又は神経性疾患若しくは老化の発症
より前の時期に神経組織に成長因子を投与する。特に星状細胞は、脳における援
助的又は保護的な役割を付与することが示されている。これらの細胞は、ニュー
ロンの周りの環境でバッファーとして働きニューロンの生存と機能を高める因子
を分泌する。通常、CNSにおける星状細胞の再構成は、限界がありそして機能不
全の星状細胞の大規模な取り替えることは、報告されていない。
“多能性神経幹細胞”は、それ自身大量に再生できる能力を持つ、即ち、長期
間の間を通して細胞分裂の間それ自身を置き換える能力のあり、かつ、それが位
置する組織の主要な細胞型(即ち、神経、神経膠、星状細胞及び乏突起神経膠細
胞)を発生させる能力を持つ未分化神経細胞である。神経幹細胞の非幹細胞子孫
は、先祖細胞と名づけれられている。試験管内又は生体内の神経幹細胞を増殖す
る方法は、以前に述べられている(例えば、WO93/01275号、WO94/10292号及び米
国特許出願第08/486,648号参照)。
ここで使用される“神経先祖細胞”の語は、神経幹細胞から由来の、それ自身
は幹細胞ではない未分化細胞を意味する。先祖細胞の顕著な特徴は、幹細胞に非
類似で、限られた増殖能力を持ち、それゆえ自己維持を示さない。それは、特別
な分化経路に引き渡され、適当な条件の下で、結局、神経膠(星状細胞又は乏突
起神経膠細胞)又はニューロンのどちらかに分化し、そしてそれゆえに多能性で
ない。ここで使用される“前駆細胞”の語は、神経幹細胞の子孫を意味し、それ
ゆえ先祖細胞及び娘細胞神経幹細胞の両方を含む。
大多数の神経幹細胞を、大人の哺乳動物のCNS脳室(上衣下腫を含む)にライニ
ングしている組織において発見することができる。脳室の語は、脳のスピネル液
体が流れるＣＮＳ内におけるいかなる空洞又は通路を意味し、脳室系のいかなる
つぶれた部分も含まれる。それゆえ、この語は、側面、第３及び第４の脳室を包
含するばかりでなく、中心管、脳の水管及び他のＣＮＳ空洞及びつぶれたＣＮＳ
空洞も包含する。
１以上の成長因子を、生体内における多能性神経幹細胞及び／又はそれらの子
孫の増殖、移動及び／又は分化を誘発するために使用することができる。ここで
使用したように、“成長因子”の語は、神経幹細胞及び／又は神経幹細胞子孫で
成長、増殖、分化又は屈性の効果を持つタンパク質、ペプチド又は他の分子を意
味する。増殖を誘発するために使用することができる成長因子は、神経幹細胞及
び前駆細胞が増殖するのを可能とするどのような因子をも含み、屈性又は細胞に
対する成長誘発効果を発揮させるために神経幹細胞の表面のレセプターに結合す
るいずれの分子を含み、タンパク質、アミノ酸、ビタミン、炭水化物、又は他の
分子若しくは原子を含む。好ましい増殖誘発成長因子は、ＥＧＦ、アンフィレグ
リン、酸性の繊維芽細胞成長因子(aFGF又はFGF−1)、塩基性の繊維芽細胞成長
因子(bFGF又はFGF−2)、転移成長因子α(TGFα)、EGFレセプター及びFGFレセプ
ターに結合する増殖誘発リガンド及びそれらの組み合わせを含む。複数の増殖誘
発成長因子の好ましい組み合わせは、FGF−１又はFGF−２を用いたEGF又はTGFα
である。生体内に投与されたとき、特定の成長因子が増殖効果を有するかどうか
を決定するために、神経幹細胞増殖の試験管内における成長因子の効果を当該技
術で既に知られており、かつ、WO93/01275、WO94/10292及び米国特許第08/486,6
48に記載されている方法を使用することにより試験することができる。試験管内
で神経幹細胞増殖を誘発する成長因子は、生体内でも増殖効果を有することも見
出された。
実験結果は、成長因子を投与することにより生体内で増殖を誘発された神経幹
細胞子孫が、治療領域に有益である細胞型に分化することを示している。同様な
機構は、神経細胞子孫に影響を与え、神経細胞子孫が必要とされた細胞型に神経
細胞子孫を分化させる外来性の信号に応答することである。分化した神経幹細胞
の子孫は、ニューロン、星状細胞(型１又は型２)及び乏突起神経膠細胞を含む。
神経幹細胞子孫の分化経路は、発生した特定の細胞型の数を増加する外因成長因
子の添加により影響を受けることができる。外因的に加えることができる分化影
響成長因子は、WO94/10292号及び米国特許第08/486,648号に記載されている。前
駆細胞の分化に影響を与えるために使用することができる成長因子及び他の分子
は、FGF-1、LFGF-2、細毛状の神経毒因子(CNTF)、NGF、BDNF、ニュートロフィン
３、ニュートロフィン４、インターロイキン、白血球阻害因子(LIF)、サイクリ
ックアデノシンリン酸、フォルスコリン、高レベルカリウム、アンフィレグリン
、TGF-α、TGF-β、インスリン等の成長因子、デキサメタゾン(グルココルチコ
イドホルモン)、イソブチル３−メチルキサンチン、ソマトスタチン、成長ホル
モン、レチン酸、及びPDGF、又はこれらの成長因子に対するレセプターに結合す
るリガンドである。
分化に対する様々な成長因子の効果を、デュアルラベル免疫細胞化学の様々の
神経−神経膠特異的抗原を使用することによって試験することができ、かつ、多
能性の神経幹細胞の培地での試験管内で試験することができ、細胞の分化に対す
る外因成長因子の効果を決定することができる。神経膠細胞に分化した型Ｉ星状
細胞は、A2B5ではなくGFAPに対するそれらの免疫反応力によって同定することが
できる。星状の隆起挙動形態学を示す分化した神経膠細胞に型II星状細胞を、そ
れらの表現型GFAP(＋)、A2B5(＋)表現型により免疫細胞化学を使用して同定する
ことができる。
成長因子を、患者に単独又は組み合わせて投与することができる。成長因子は
、経時的に連続して(例えば、最初の成長因子をさらすことによって、第２の成
長因子レセプターの発現に影響を与える。ニューロン４：189−201(1990))投与
することもできる。成長因子を、製剤学的に許容可能な補形薬に調合することが
できる。成長因子の投与は、注入カニューレ、CNSへの注入、末梢注入、望まし
い位置に物質を投与することを可能とする経時放出装置、口経投与などのいずれ
かの方法によって行うことができる。成長因子が脳血管障壁をバイパスするか突
き抜けて通り抜けることができる方法を使用して成長因子を投与することができ
る。成長因子が血管障壁を通り過ぎることを可能とする方法には、成長因子の大
きさを最小にしたり、より容易に通過することができる因子を疎水性とすること
を含む。例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)などは、投与することができ、血
管障壁を可逆的に開口し、静脈内(i.v)、腹膜組織内の(i.p)又は、口経的に投与
し、成長因子をCNS内へ通過を可能とする。マウスにおけるDMSOの投与量は、静
脈内投与で約0.25mlの体積中にDMSOが2〜30％までであり、好ましくは10〜15％
である。DMSO及び成長因子の腹膜組織内の投与は10〜30％のDMSOを要求するだろ
う。ボーラデプション(Boradeption)(Science 217:166(1982)を使用することが
できる。別の可能性としては、脳血管障壁を横切って成長因子を移送することが
できるトランスフェリンに成長因子を結合させることでしよう。
実際には、CNSの１以上の脳室に直接的に成長因子を投与することが好ましい
。大多数の神経幹細胞が成熟脳の脳室に内部を覆われた組織に位置しているとい
う事実は、生体内でこれらの細胞の変性及び操作する場合にいくらかの利点が得
られる。したがって、所望の領域近傍にある脳室を囲んでいる幹細胞が、ここで
述べた方法を使用して生体内で操作又は変性されるために、治療は調整すること
ができる。脳室系はほとんどすべての脳領域で見出され、それゆえ所望の領域へ
容易にアクセスすることができる。もし成長因子又はウイルス性のベクターから
な
る組成物に幹細胞をさらすことにより生体内の幹細胞を変性させたいなら、組成
物を脳室そしてそれゆえ神経幹細胞に投与する装置に埋め込むことは相対的に容
易である。例えば、組成物の移送のために浸透性ポンプに取り付けられたカニュ
ーレを使用することができる。あるいは、組成物を、直接脳室の中に注入するこ
とができる。神経幹細胞子孫は、傷害、病気又は老化の結果として損害を被るか
もしれない領域に移動することができる。
さらに、多くの脳領域に脳室が近接していることは、分泌した神経学の薬剤が
適当な領域への幹細胞又はそれらの子孫によって拡散を許すだろう。
前駆細胞に成長因子を外因的に投与することに加えて、あるいはそれに代えて
、前駆細胞を、成長因子又はホルモン発現ベクターを用いてトランスフェクショ
ンにより前駆細胞を遺伝子学的に生体内で変性することによって、神経細胞は、
神経性障害、外傷及び老化の影響を防止することに役立つ様々な生物学的な試薬
を発現することができる。多能性神経幹細胞及びそれらの子孫を遺伝子的に変性
する方法が公開された国際出願番号ＷＯ94/16718号に開示されている。成長因子
を発現させるために細胞を遺伝子的に変性することに加えて、細胞を例えば神経
伝達物質などの他の型の神経性剤を発現するために変性させることができる。
好ましくは、遺伝子的な変性を行うには、組み換えレトロウイルスを用いて脳
室の領域の内部に覆われた細胞に感染させるか、又はCaPO4トランスフェクショ
ン、DEAEデキストラン トランスフェクション、ポリブレン トランスフェクショ
ン含む知られた技術を使用したトランスフェクションのどちらかによって、ある
いは、プロトプラスト溶解、エレクトロポーション、リポフェクション等(Mania
tis等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)、２nd Ed.、Cold Sprin
g Harbor、N.Y.参照)による。現在知られているか又はこれから開発される遺伝
子的に変性させるいずれの方法も使用することができる。直接的なDNAトランス
フェクションを用いて、粒子ボンバートメント、レセプターによる仲介移送、陽
イオンのリポソームによって細胞を変性することができる。キメラ遺伝子組立を
使用したとき、それらは、遺伝的にウイルス、例えば、レトロウイルスの長末端
反復体(LTR)、サルウイルス40(SV40)、サイトメガロウイルス(CMV)、又は例えば
、TH、DBH、フェニルエタノールアミン Ｎ メチルトランスヘラーゼ、
ChAT、GFAP、NSE、望ましいタンパク質を暗号化する構造遺伝子の発現を支配す
るNFタンパク質(NF-L、NF-M、NF-H等)などの哺乳類の細胞特異的プロモーターを
含むだろう。
細胞の中で活性であるプロモーター、適当な末端及びポリアデニル化信号を持
っている限り、当該技術で知られているどのような発現ベクターも成長因子を発
現するために使用することができる。これらの発現ベクターは、pSCllを含む組
み換え痘疹ウイルスベクター、又はサルウイルス40(SV40、例えば、pSV2-dhfr、
pSV2neo、pko-neo、、pSV2gpt、pSVT7及びpBABY)由来、ラウス肉腫(RSV、例えば
pRSVneo)由来、マウス乳腫瘍ウイルス(HSV、例えばpTK2及びpHyg)由来、アデノ
ウイルス(pMT2)由来、ヘルペス単一ウイルス(HSV、例えば、pTK及びpHyg)、ウシ
乳頭種ウイルス(BPV、例えばpdBPV及びpBV−1MTHA)、エプスタインバーウイルス
(EBV、例えばp205及びpHEBo)由来の様々なウイルスから引き出されたベクター又
は従来技術で知られた他のどのような真核発現ベクターを含む。
もし正常な静止した幹細胞を遺伝的に変性するためにレトロウイルス構造物を
使用するなら、そのときここで述べた方法を使用してこれらの細胞の増殖を誘発
することが好ましい。例えば、浸透性の注入ポンプを、レトロウイルスの注入前
に数日間中央管に成長因子を移送するために使用することができる。これは、レ
トロウイルスを用いて注入にさらされ分裂している神経幹細胞を活発にするであ
ろうことを確実にする。
本発明によると、病気、外傷、老化又はこれらの因子が組み合わされることに
より引き起こされる神経性障害を受けて通常生じる行動、認識、記憶、及び他の
行動の兆候の欠陥を、多能性の神経幹細胞及び／又は神経幹細胞の子孫の増殖を
刺激する能力のある一ないし複数の成長因子を予防的に投与することにより減少
させる。成長因子による予備治療法は、長期の保護効果を達成でき、それによっ
て、外因的に投与された成長因子が外傷、病気又は障害の時期に存在する必要性
をなくすことができる。“保護効果”の語は、成長因子による治療によって成長
因子で予備治療することない場合と比較した場合よりもかなり多くの正常に機能
している神経幹細胞を生じることを意味する。成長因子は、老化又は神経性障害
や
病気が発症するより前でかつ、予期される神経性外傷又は、例えば脳外科中に起
こるかもしれない障害等より１週間から数週間前に現行基準又は規則的に間を開
けて投与することができる。ここで使用するように、“発症”の語は、神経性疾
患又は障害又は老化過程の外的な兆候を意味する。例えば、臨床上の記憶喪失は
、アルツハイマー病の外的な兆候であり、かつ老化の過程の外的な兆候の可能性
があるということができる。対照的に、結局細胞死、傷害又は例えば、ある遺伝
子生産物の過剰又は過小発現中の機能不全につながるある種の生物学的な過程は
、老化過程、神経性疾患及び／又は障害の外的な兆候の開始より以前に始まる初
期の出来事であるかもしれない。これら細胞学的な過程や老化過程の他の前兆、
神経性疾患及び／又は障害の原因分析についで適切な成長因子治療が、老化過程
、神経性疾患、障害の発症を防止又は減少させることができる。例えば、遺伝的
なスクリーニングを障害の発症の開始前に、例えば、ハンチントン病などのある
種の神経学的な障害を前もって処理した患者を診断するのに使用することができ
る。神経性疾患又は障害に対して危険性のあると判断された患者を、成長因子で
治療し、それによって病気の進行を防止又は減少することができる。
老化又は病気過程の発症又は外傷が開始する前に成長因子を神経幹細胞の増殖
を生じさせるのに十分な濃度で投与する(又は成長因子を発現するために神経細
胞を遺伝的に変性する)。成長因子治療により付与された保護効果は、長期間で
あり、通常治療が終了後少なくとも１週間継続する。保護的な効果は治療の中止
後少なくとも２週間で維持され、多くの場合には、保護効果は、１から２か月ま
で又はそれ以上の間維持される。
ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び主に前脳に影響する
他の神経学的な障害の発症することを予防又は減少するために、成長因子又は他
の神経性剤が前脳の脳室に移送され、生体内で幹細胞の増殖に影響を与えるだろ
う。あるいは、CNSを通して循環するために成長因子及び他の神経性剤を腰部槽
に容易に投与することができる。様々な神経性疾患、障害及び外傷について動物
モデルを、適切な投薬量と治療の方法を確立するために成長因子投与の保護効果
を評価するために使用する。行動性試験も、成長因子により治療された動物の能
力と未治療のコントロール動物とを比較するために行う。そのような行動性試験
としては、モーリス水迷路及び放射状アーム迷路等の学習と記憶の試験を含む。
特にげっし動物、イヌ科動物、霊長類などの受け入れられた哺乳動物モデルから
得られたデータを外挿し、人の成長因子治療のための適切なプロトコールを決定
する。一般に、約１日から10日間までの期間で１時間当たり約100〜約1000ng成
長因子の投与／体重kgが多能性の神経幹細胞増殖を誘発するのに十分である。
実施例２以下は、生理学的に効果的な投与量でicvを投与した表皮成長因子(EG
F)が、虚血外傷後の正常な神経の応答が退行するのを妨げて、生体内での海馬状
隆起ニューロンに影響を与える細胞保護効果が発揮されることを証明するもので
ある。理論によって制限されることは望まないが、この反応は、新しい神経細胞
の生産で生じる成長因子の有糸分裂促進効果の結果のためであるように見え、お
そらく、細胞鎮静期の神経幹及び先祖細胞の増殖移動及び／又は分化の結果とし
て、それが物質を分泌したり環境を変えたりする新しい神経膠及び／又は神経細
胞の産出につながり、それによって外因的に投与された成長因子がもはや存在し
なくなった後でさえ、ニューロンへの長期間の保護効果を与える。成長因子注入
する際に大量のトリチウム化チミジン投与量又は他の細胞分裂阻止試薬の投与が
神経細胞の増殖を封鎖し、それから、虚血外傷後に観察される保護効果を妨害す
ると予期される。これは、成長因子治療後に観察される保護効果がその領域へ新
しい細胞を添加することから生じることを示している。
成長因子を用いた治療が細胞保護効果が選られるという発見は、予想されたCN
S外傷の重症度の機会を減少させ又は重症度を減らすために有利に使用される。
例えば、脳手術を予定された患者を成長因子で治療することにより、神経学的な
外傷を防止することができる。手術前に成長因子が、外科手術の間に影響を与え
そうな脳領域に投与されるだろう。成長因子は、予定されたCNS外傷より少なく
とも一週間前投与される。好ましくは、成長因子を、予期される外傷のの少なく
とも２週間以上前、好ましく４週間以上前で投与し、有益な数の新しい神経幹細
胞子孫が分化し、増殖するための時間的猶予を与える。成長因子による予備治療
の保護効果が、治療の中止後長期間に渡って観察されるので、所望により、成長
因子予備治療は、手術に先立って数週間で完成することができる。ある種のプロ
運動選手、例えば、ボクサーもまた、神経性外傷に対する危険が高いので、
神経保護効果を達成するために成長因子で治療することができる。加えて、発作
の危険性の高い患者を成長因子で治療することができ、万一発作を生じても神経
性障害の量は減少する。
以下の実施例３は、非常に高齢の動物において、活性化した本質的に増殖する
先祖細胞(CPC)集団を発生する能力が傷つけられていることを証明している。神
経前駆集団は、おそらく年齢と共に減少することを示し、幹細胞サイクル時間を
遅くする。これは、有毒な外傷及び虚血を被る可能性が増加され、そして高齢の
動物においてしばしばみられる認識障害の頻度が増加され、脳の形態学における
退化上の変化を順番に誘導するかもしれない。実施例３に示されるように、例え
ば、健康なCNSに対してEGF、FGF等の成長因子の投与することにより、老化して
いる脳においてより健全で若い細胞の存在を結果として生じる。“健全なCNS組
織”の語句によって、一般に幹細胞サイクル時間及び神経組織が、同じ種及び同
じ年齢群の哺乳動物に対して正常であることを意味する。好ましくは、成長因子
治療の少なくとも２週間後、治療された動物の、同じ種の年齢の一致する哺乳動
物に対する平均CPC数と比較してCPCの数は、少なくとも５％増加およびより好ま
しくは１０％増加が維持される。成長因子による治療を停止後長期間に渡ってCP
C数の増加状態は、好ましくは少なくとも１から２か月間、より好ましくは、少
なくとも４か月間維持される。
実施例１ 側面の脳室の神経幹細胞の生体内における増殖
βガラクトシターゼ遺伝子を含んでいる複製不全レトロウイルス(Walsh and C
epko)、Science 241：1342(1988)に記載されているような)を、(チャールズ川由
来の25−30ｇの)CD1成熟オスのマウスの前脳側脳室の中に注入した。注入したレ
トロウイルスをワルシャ及びセプコ(上の)の方法によるBAG細胞株(ATCCCRL−956
0)から収穫した。マウスを、ペントバービタルナトリウム65mg/kgを使用して腹
膜腔内に麻酔した。片側のみの定位注入で0.2-1.0μｌのレトロウイルスを、１
μlのハミルトンシリンジを使用して側脳室の中に注入した。注入の座標は、ラ
ムダへ前方AP＋4.2mmであり、硬膜の下でＬ±0.7mm及びDV-2.3mmであり、マウス
バーを用いて両耳間結線下−2mmとした。
レトロウイルス注入後１日又は６日、3.3〜330μg/mlのEGFで満たされた0.5
μl/時間のALZET浸透性ミニポンプに取り付けた注入カニューレを、上で述べた
ような同一の定位座標で側脳室に外科的に注入した。注入カニューレキットを、
ALZAから得た。注入カニューレを台の下で2.7mmにカットした。ポンプをアクリ
ルセメント及び脳天ネジの使用によって、注入部位への反対側及び尾側にマウス
の脳天を固定した。浸透性のミニポンプは、皮下の下及び左足前部の足の窪みに
位置し、ポリエチレン管によって注入カニューレに接続した。
動物にEGF注入開始後６日間、ペントバーニアルナトリウムを過量投与して殺
した。マウスは、２％で緩衝されたパラフォルムアルデヒドで灌流され、そして
、脳は興奮させられ、そして緩衝された２％パラフォルムアルデヒドの中で２０
％サッカロースで一晩後で固定した。頭頂のスライスを、30μｍで摂氏-20℃の
低温保持切断して調整した。Morsyead and Van der Kooy(上と同じ)によって、
スライスは、β−ガル組織化学のために展開した。
これらの状況下で、レトロウイルス注入後の日いかんにかかわらず、EGFを注
入することによって、脳当たり平均20細胞から脳当たり平均150細胞までβ−ガ
ルで標識した細胞の集団が増大し、これらの細胞は側脳室のライニングから離れ
た。33μg/mlでFGF−２注入したところ、β−ガルで標識した細胞の数が増加し
、この増加は、いかなる追加移動も伴わなかった。EGFとFGFとの両方の注入は、
脳当たり20細胞から脳当たり平均350細胞までβ−ガル標識された細胞の一層多
く増大した。EGF及びFGFを共に注入したとき、β−ガラクトシダーゼの細胞数が
共同的に増加したが、それは比較的、無活動幹細胞と本質的に増殖している祖先
細胞との間の直接的な関わりを持つことを反映する。
この実験は、変更することができ、他のCNS脳室における成長因子を注入し、
他のCNS領域における細胞数を同様に拡張することもできる。
実施例２ 神経性障害前の成長因子の注入
表皮成長因子(EGF)(Chiron Corp)を、1mg/mlのラットアルブミン(Calbiochem、C
at．No．126722)を無菌性の生理食塩水において調整した。EGF調整液を、９日間
１μl/hrの速度で浸透性ミニポンプ(Alza、Model 2001)に連結した30ゲージカニ
ューレを経由して重さ250〜350gの成熟オスウィスターラットくちばし状の側脳
室(前頂＋0.7mm)に注入した。毎時体重kg当たり416ngのEGFでそれ
ぞれの動物に提供するような濃度でEGFを調整した。
前駆細胞標識
動物は、最終３日間の間、１日当たり３回BrdU(50mg/kg)腹膜腔内に成長因子注
入を受けた。
虚血障害
使用されたモデルは、出血性低血圧を有する両側総頸動脈閉塞を組み合わせた一
時包括的な虚血に対して通常使用されるげっし動物モデルを組み合わせであった
(Smith et al Act.Neurol.Scand 69:385-401(1984)。Mudrick及びBanimbridge，
Exp'l Brain Res．86:233-247(1991)。このモデルは、海馬状隆起のCA1領域(100
％の動物)及びCA2とCA3領域(60％の動物)において共に神経障害を生じた。EGFで
治療２か月後、動物はペントビタールナトリウム(60mg/kg i.p.)で麻酔をかけら
れ、呼吸器の分泌物を減少するためアトロピン(0.2mg/kg i.p.)で処理された。
ある温度で調製されたヒートパッドに結合した直腸温度プローブを使用して動物
の体温35℃に保つために使用した。総頚動脈及び大腿動脈を短太針解剖法を用い
て単離し、それぞれの血管の周りに3-0シルクを輪にして後の利用に供した。大
腿動脈は、それからカニューレを挿入され、そして凝固を防止するためにヘパリ
ン(150ユニット)を投与した。ベースライン平均動脈圧がトランスデューサを経
由して取られ(〜120/80mmHg)、チャートレコーダーに記録された。動物は、平均
動脈値が30-40mmHg(血液の約7-10mlの除去)に落ちるまで吐血した。総頸動脈は
、20分間の間非外傷性の動脈クランプで急速に閉鎖された。血液の更なる吐血又
は再注入のどちらかにより虚血の継続している間中、平均動脈圧を30-40mmHgで
維持した。血流の回復は、動脈クランプの除去、及び吐血した血液の再注入によ
り行った。硫化プロタミン(1.5mg/動物)を、大腿部のカニューレを経由して投与
し、ヘパリンを不活性化し、後の外科的手術での出血を防止した。平均動脈圧は
、初めの虚血レベル又はわずかに高いレベルに戻されるべきである。動物は分泌
された5mlのリンガー液を与えられ、暖熱ランプ下で放置し回復できる。動物は
、単一の部屋に収容して次の48時間注意深くモニターできた。
組織調整
動物を放置し、組織調整前でかつ虚血外傷後１週間生存した。ペントバービタル
ナトリウム65mg/kgで動物を深く麻酔をし、アイスで冷却した食塩水(〜350ml)で
灌流し、ついでpH7.4(〜500ml)の0.1Ｍリン酸緩衝液において４％アイス冷凍し
たパラフォルムアルデヒド(PFA)で灌流した。脳が取り出されそして後に4℃で４
％PFA夜通しして固定した。脳を、それから4℃で10％〜30％サッカロースに連続
夜通しのインキュベーションをして凍結防止し、それから2:1の30％サッカロー
ス:OCTで2〜24時間の間インキュベートした。それから脳をドライアイスで冷凍
し、10μｍの連続的に切り出した断片を低温保持装置でカットした。
神経細胞死の組織学評価
組織形態の研究のために処理された組織を、ヒストクリア(Histoclear)(Diamed
，Cat.No.HS-200)において脂肪を除き、一連のアルコールを降下して再水和し、
蒸留水で増水し、チオニンで着色した(0.5％)。それから、組織を一連のアルコ
ールにより脱水し、ヒストクリアで清浄し、DPXでカバーグラスをかぶせた(Aldr
ich、Cat．No．31761-1)。チオニンは、神経細胞の細胞質内でニスル(Nissl)物
質で着色する(Cajal、1995年)。細胞層内の特徴的な巨大細胞形態を有する細胞
の欠乏は、虚血誘導された細胞死のために海馬状隆起巨大ニューロンが失われた
ことを暗示する。一時の包括的な虚血に応じてCA1巨大細胞に観察される遅延し
た細胞死の独特の特性のために(shigeno等、Neurosci.11:2914-2919(1991);Ordy
等、Exp'lNeurol.119:128-139(1993))、１週間後の虚血生存時間を選択し、これ
によって、選択したCA1巨大細胞は、外科的手術後３日間までは虚血により影響
されないと思われる。加えて、最大の神経膠反応が起こり、興奮毒状態がこの時
点までに静まった。
結果
虚血外傷の８週間前に行ったEGF予備処理(9日間のEGFのicv注入)により、CA1
領域における誘発された神経細胞死を虚血性により７動物のうち３動物の完全に
保護した。EGF処理した動物のニシルにより着色したことは、CA1、CA2及びCA3の
細胞が、海馬状隆起のすみからすみまで形態学上優れた効果を示した(図1)。加
えて、海馬状隆起内に観察された神経膠細胞の数が増加していた。BrdU標識が海
馬状隆起内に観察された。
実施例３ 老化現象の進行した開始前の成長因子投与
様々な年齢のげっし動物における前駆細胞の評価
成熟サブ脳室領域(ＳＶＺ)は、分裂細胞の少なくとも２つの集団、即ち、緩慢循
環幹細胞集団及び急速循環性細胞集団、本質的に増殖する祖先細胞(ＣＰＣ)集団
からなり、それら細胞の周期時間における相違により区別することができる。こ
の研究の目的は、マウスとラットにおける加齢とこれらの細胞型の数と分布及び
細胞数の成長因子の注入したことによる影響を測定することである。
様々な年齢(2か月と18か月の間)のマウスに対してBrdU(約67mg/kg)を４週間(3
-5回/日)注射し、さらに８週間の間安静にした。この範例は、サブ脳室領域の緩
慢循環幹細胞を標識した。動物を４％パラフォルムアルデヒドで灌流し、脳は取
り出され、凍結防止された。冷凍した断片を、30μｍでカットした。BrdUを免疫
細胞化学的に検出した(ラット抗BrdU、Sera lab、ついで、ロバ抗ラットCY3又は
FITC、Jackson Immunoresearch)。脳のすみずみまで標識された細胞を定量し、
細胞数の変化又は加齢に伴う分布を分析した。加えて、BrdU免疫反応の分布、脳
における後の有糸分裂細胞子孫を定量し年齢間で比較した。
同じ組織を、増殖細胞核抗原(PCNA)への抗体でダブル標識し、細胞サイクルの
Ｓ相の近傍に上方調整される。予備的な結果は、PCNAが、本質的に増殖細胞集団
を特徴づけることを示している。PCNA-IR細胞の数と分布を測定し、年齢間で比
較した。
結果
有糸分裂性の活性幹細胞(BrdU-IR)の数は、幹細胞の濃度がより高い場合に、
特に幹細胞“ポケット”において年齢と共に減少した。くちばし状の幹細胞ポケ
ット(ブレグマ0.7)で、７か月加齢のグループと13か月加齢の動物に対する数は
、２か月値のそれぞれ65％と53％であった。同様に、尾部の幹細胞ポケット(プ
ラグマ-4.3)で、７か月加齢と13か月加齢のグループは、２か月値のそれぞれ53
％と38％であった。
CPC集団(PCNA-IR)もまた年齢と共に減少した。CPC分析のために殺傷時間での
動物の年齢は、5、10及び16か月であった。データを比較するときの混同を避け
るために、(殺傷時の年齢を用いたのではなく)幹細胞標識開始時での年齢
(即ち、2、7及び13か月)を、上記動物の分類を同定するために使用した。以前に
同定したCPCピークのブレグマ0.7での、７か月グループの数は２か月の値の62％
だけであり、一方、13か月の動物は、２か月値の30％だけであった。このデータ
は、クーン(Kuhn等、J.Neuro Sci 16:2027-2033(1996)のデータと矛盾し、クー
ン等は、BrdU注入１日後に分析したとき、ラット側脳室の制限領域において年齢
と共にBrdU-IR細胞の数は変化しないことを見出した。
海馬状隆起の歯状の脳におけるBrdU-IR細胞の数も年齢と共に減少した。
げっし動物の老化過程の際の成長因子の影響
EGFを６日の期間の間実施例２に述べた方法を使用して、２か月の成熟CD1マウス
(n＝3)の側脳室に注入した。コントロールマウス(n=3)も媒体を注入した。動物
は、４か月後命を落とした。次のブレグマ、即ち、2.7,2.2,1.7,1.2,0.7,0.2,-0
.3，-0.8からの10μｍの断片において、上で述べた方法を使用して、側脳室の近
傍のPCNA-IRの数を測定した。これらブレグマが、CPCのピーク細胞分布に相当し
、加齢と共にPCNA-IR細胞のかなりの欠損が見られる部位である。EGFは老化して
いる動物におけるCPCに保護効果を有し、EGFによる処理を受けた３匹の動物のう
ち２匹が、媒体コントロールよりかなり高いPCNA数(およそ30％より高い)を有し
ていたことにより証明された。
更に研究を行い、ＥＧＦ処理された動物を、老化させ、様々な記憶及び他の行
動試験を与えて、ＥＧＦ処理されていない同じ年の動物と比較した。処理しない
動物と比較してＥＧＦ処理された動物の機能を改善することにより、成長因子を
用いて予備処理することによって、認識機能における老化に関連の衰退の予防又
は減少することができることを証明した。
実施例４ 神経性疾患の開始前の成長因子の投与
パーキンソン病モデル
動物は、６日間(マウス)又は９日間(ラット)の間実施例２に述べたようなＥＧＦ
注入処理を受ける。ＥＧＦ処理後、様々な時間点(１週間、２週間、１か月、２
か月、４か月、８か月)後に動物に対してパーキンソン病にするために障害を与
える。ラットの場合において、脳中心から線条体までを突出しているドーパミン
作用性の繊維をナイフカットすることにより、又は、線条体、細胞核側座の若し
くは脳
の黒質の中に直接的に８μｇの６ヒドロキシドーパミンを１回注入することによ
り障害を起こす。マウスにおいて、0.9％食塩水の0.5mlの体積で50mgのMPTP/Kg
の16時間おいて皮下に２回注入の投与により障害を起こす。動物の一部は障害後
１日から８日間生存させ、それから殺傷する。生存しているドーパミン性の細胞
の数を、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)免疫細胞化学により定量し、成長因子処
理を受けていないが殺傷する前に障害を与えたコントロール動物と比較した。残
りの動物については、長期間に渡り生存させ、行動性試験を受け、モデル動物と
同じ年齢である障害を与えたコントロール動物(成長因子処理のないもの)又は通
常の動物と比較した。
アルツハイマー病モデル
メスウィスターラット(180〜200g)を、このモデルに使用した。動物は、９日間
の間実施例２に述べたようなEGF注入処理を与える。EGF処理後の様々な時間経過
(１週間、２週間、１か月、２か月、４か月及び８か月)後、動物は、アルツハイ
マー病にするために障害を起こす。格納式のワイヤーナイフ(スカータンナイフ(
Scouten Knife)を使用して、ひだ状の突起脳弓経路を部分的に障害を起こさせる
。動物は障害後様々な時間(1日〜8週間)で殺され、生存している細胞の数を隔膜
においてニセル染色によって分析する。コントロール、障害し及び処理した動物
が比較される。動物の一分類は、行動試験のために延長した期間の間生存するこ
とが可能で、コントロール動物と比較された。
ハンチントン病モデル
実施例１で述べたように成長因子を投与して予備処理に次いで、リバイバー(Lev
ivier)等(1995年)Neurosci.69(1):43-50に述べた方法を用いて線の組織において
キノリン酸障害を誘発するために使用した。線条体におけるニューロンの数を、
コントロール、障害された動物、処理された動物との間で比較された。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年５月２５日（１９９９．５．２５）
【補正内容】
請求の範囲
１．哺乳動物における哺乳類の神経組織の本質的に増殖する神経の先祖細胞集団
の減少を妨げる薬剤組成物であって、前記薬剤組成物が有効的な量の一以上の成
長因子からなり、多能性の神経幹細胞増殖を誘発し、そこで前記哺乳類の神経組
織において本質的に増殖する神経のより多くの先祖細胞集団を提供することを特
徴とする薬剤組成物。
２．前記神経組織が健全である請求項１記載の薬剤組成物。
３．前記１以上の成長因子が、EGF、アンフィレグリン、酸性繊維芽細胞成長因
子(aFGF又はFGF−１)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF又はFGF−２)、トランス
フォーミング成長因子α(TGFα)、EGFとFGFレセプターとに結合している増殖誘
発リガンド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１記載の
薬剤組成物。
４．神経性傷害又は外傷に対して哺乳類の神経組織を保護するための薬剤組成物
であって、前記薬剤組成物が、有効的な量の１以上の成長因子からなり、多能性
の神経幹細胞の増殖を誘発し、神経性傷害又は外傷が生じる前の時期に前記神経
組織に保護効果を与えることを特徴とする薬剤組成物。
５．前記神経性傷害又は外傷が生じる前の時期が、前記傷害又は外傷の少なくと
も１週間前である請求項４記載の薬剤組成物。
６．前記予期される神経学的な傷害又は外傷が、前記哺乳動物の脳に行われた外
科手術由来である請求項４記載の薬剤組成物。
７．前記１以上の成長因子が、EGF、アンフィレグリン、酸性繊維芽成長因子(aF
GF又はFGF−１)、塩基性繊維芽成長因子(bFGF又はFGF−2)、転移成長因子α(TGF
α)、EGFレセプターとFGFレセプターに結合している増殖誘発するリガンド、及
びこれらの組み合わせとからなる群から選択される請求項４記載の薬剤組成物。
８．哺乳動物における神経病又は障害の発症を妨げ又は減少させる薬剤組成物で
あって、前記薬剤組成物が、前記発症の出現より前の時期に多能性の神経幹細胞
増殖を誘発するために有効的な量の１以上の成長因子からなることを特徴とする
薬剤組成物。
９．前記発症の出現より前の時期が、前記発症より少なくとも１週間前である請
求項８記載の薬剤組成物。
１０．前記１以上の成長因子が、EGF、アンフィレグリン、酸性繊維芽細胞成長
因子(aFGF又はFGF-１)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF又はFGF−2)、転移成長
因子α(TGFα)、EGFレセプターとFGFレセプターと結合する増殖誘発リガンド、
及びそれらの組み合わせとからなる群から選択される請求項８記載の薬剤組成物
。
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フロントページの続き
(72)発明者 ポウリン ポウル
カナダ国 アルバータ ティー２エヌ ３
ゼット２ カルガリー アクスブリッジ
ドライヴ ノース ウェスト 1932