KR100958291B1 - Ｔ―타입 칼슘채널을 억제하여 불안 장애를 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 불안장애 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)에 투여하여 불안장애를 예방 및 치료하는 방법에 관한 것으로, Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제인 미베프라딜(mibefradil)을 MD에서 많이 발현되는 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4, PLCβ4)의 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 마우스의 MD에 투여하면 상기 마우스에서 저하되었던 기억 소멸 능력이 정상적으로 돌아오며, 미베프라딜 및 에포니디핀(efonidipine)을 정상 마우스의 MD에 투여하면 상기 마우스에서 공포 기억이 빨리 소멸하고 상기 소멸한 기억의 회상 능력이 감소하는 것을 확인함으로써, Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제는 불안장애 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제, 미베프라딜, 에포니디핀, 불안장애

Description

Ｔ―타입 칼슘채널을 억제하여 불안 장애를 치료하는 방법{A Method for treatment of anxiety disorder by regulating T―type calcium channel}

본 발명은 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 불안장애 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)에 투여하여 불안장애를 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

칼슘채널(calcium channel)은 골격, 혈관, 심장의 근육세포에서 나타나는 흥분-수축 연결 메커니즘과 중추·말초 신경계 내에서의 신경전달물질 분비 조절 등에 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 칼슘채널은 생리학적 및 분자생물학적 특징에 따라 고전압 의존성 L-타입 칼슘채널과 저전압 의존성 T-타입 칼슘채널으로 분류된다. L-타입 칼슘채널(L-type calcium channel)은 혈관근, 골격근, 평활근 등의 세포막을 통과하는 칼슘이온의 운반에 가장 큰 역할을 하여 이러한 근육들의 수축을 조절하고, 내분비선, 신경조직으로부터의 신경전달물질 분비에도 관여한다. 그리고, T-타입 칼슘채널(Ttype calcium channel)은 중추 근육 세포, 부신의 내분 비선, 동방결절 같은 심장세포에 많이 존재하여 L-타입의 역할 뿐 아니라, 심장세포에 존재하는 T-타입 채널은 심장 박동을 만들어내는데 중요한 역할을 하고 있고, 작은 전위 차에 의한 근육세포로의 칼슘이온 유입에도 관여한다고 알려져 있다. 이러한 칼슘채널의 길항제를 이용하여 섬유세포의 증식, 혈압, 비정상적 신경물질 분비 등을 조절할 수 있으리라 예상하고, 심장질환, 광범위한 정신운동성 장애 치료를 목적으로 하는 약물 개발에 있어서 칼슘채널 길항제가 많은 연구대상이 되어왔다.

불안장애에는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 신체형 장애(somatoform disorder), 해리성장애(dissociative disorder) 또는 인위성장애(factitious disorder) 등이 있다. 공포장애는 특정 대상이나 상황에서 불합리한 공포를 느끼고 이 때문에 지속적으로 그 대상이나 상황을 회피하는 장애를 말하며, 사회공포증(social phobia), 고소공포증(acrophogia), 협소공포증(claustrophobia) 또는 예기불안(expectation anxiety) 등의 그 대상에 따라 수 많은 유형이 있다. 범불안장애는 일상적인 상황에서 광범위하고 지속적인 불안을 느끼는 경우를 말하며, 강박장애는 자신의 의지와 무관하게 어떤 특정한 생각이나 행동을 계속 반복하게 되는 경우, 정상적으로도 어느 정도의 강박적인 생각이나 행동이 있을 수 있으나 강박증상 때문에 생활에 방해를 받거나 심신이 괴로운 정도면 강박장애로 진단한다. 대개 정확성, 완벽성, 원칙주의 등 강박적인 인격의 특징을 같이 보인다. 외상 후 스트레스 장애는 보통 사람들이 살면서 겪을 수 없는 극히 충격적인 사건(전쟁, 비행기 사고, 강간, 삼풍백화점 사고 등)을 경험한 다음 그러한 끔찍한 사고에 대한 생각이 되풀이되어 떠오르든지 꿈에 나타나는 등 재경험을 하게 되고, 외부에 대하여 무감각해지며 자율신경계 증상을 동반하는 장애를 말한다. 신체형 장애는 신체질환을 의심하게 하는 신체증상을 보이나 실제로는 신체이상은 없고 심리적 갈등이나 요인에 의하여 신체증상을 보이는 경우이다. 심리적 갈등이나 요인에 의하여 실제 신체적 증상이나 질병이 생기는 경우도 많이 있는데 이것은 정신신체질환(psycho- physiological disorders)이라고 한다. 심리적 갈등이 신체적 증상으로 표현되는 것은 대개 무의식적인 수준에서 이루어진다고 생각된다. 즉 환자가 의식하여 일부러 신체적 증상으로 표현하는 꾀병(malingering)과는 다르다. 해리성장애(dissociative disorder)는 '지킬 박사와 하이드'의 경우에서처럼 갑자기 정신기능의 일부분이 기능을 일시적으로 상실하는 장애로 드물게 나타난다.

시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)은 변연계(limbic system)의 한 부분으로 정서에 관련된 전전두엽과 편도체 그리고 해마와 서로 연결되어 있다. 그러나 MD가 정서라는 행동에 관여하는 기전은 잘 알려져 있지 않다. 한편, 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4, PLCβ4)는 MD에서 많이 발현 되지만, 공포 소멸에 중요한 전전두엽이나 편도체에 거의 발현 되지 않는다. 본 발명자들은 MD에서 많이 발현되는 PLCβ4의 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 마우스를 제조하였고, 상기 PLCβ4 녹-아웃(knock-out) 마우스는 기억소멸 능력의 심각한 결여를 나타내어 불안장애 동물모델로 이용될 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 MD에 대표적인 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제인 미베프라딜(mibefradil)을 투여하면 상기 마우스에서 결여되었던 기억소멸 능력이 정상으로 돌아오며, 미베프라딜 및 에포니디핀(efonidipine)을 정상 마우스의 MD에 투여하면 공포 기억이 빨리 소멸하고 상기 소멸한 공포 기억에 대한 회상 능력이 감소하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 불안장애 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 불안장애를 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 불안장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 불안장애를 가지는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 불안장애 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 불안장애 예방방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 불안장애의 예방 및 치료를 위한 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 조성물을 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)에 투여하면 공포 기억이 빨리 소멸시키고, 공포 기억소멸에 대한 회상 능력을 감소시킴으로써 불안장애 예방 및 치료에 유용하게 이 용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 불안장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 명세서에서 "T-타입 칼슘 채널 억제제"란 T-타입 칼슘 이온 통로의 기능을 선택적으로 억제하는 물질을 의미하는 것으로, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.

상기와 같은 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제의 바람직한 예로는 미베프라딜(mibefradil), 테트라메쓰린(tetramethrin, Sumitomo, Japan), 에토숙시마이 드(ethosuximide, Sigma, USA), SUN-N8075(Daiichi Suntory Biomedical Research Co Ltd, Japan), 에포니디핀(efonidipine, Masumiya et al., Life Sci., 2000, 68(3):345-51), 니켈의 2가 이온(Ni^{2 +})과 Y^{3 +}(yttrium의 3가 이온), La^{3 +}(lanthanum의 3가 이온), Ce^{3 +}(cerium의 3가 이온), Nd^{3 +}(neodymium의 3가 이온), Gd^{3 +}(gadolinium의 3가 이온), Ho^{3 +}(holmium의 3가 이온), Er^{3 +}(erbium의 3가 이온) 및 Yb³⁺(ytterbium의 3가 이온) 등의 3가 금속 이온(Mlinar et al., J. Physiol., 1993, 469:639-52), U-92032(7-[[4-[bis(4-fluorophenyl)methyl]-1-piperazinyl]methyl]-2-[(2-hydroxyethyl)amino]4-(1-methylethyl)-2,4,6-cycloheptatrien-1-one, Xu and Lee, J. Pharmacol . Exp . Ther., 1994, 268: 1135-1142), 펜플루리돌(penfluridol)과 플루스피릴렌(fluspirilene, Enyeart et al., Mol. Pharmacol., 1992, 42(2):364-72), 발프로에이트(valproate, Macdonald and Kelly, Epilepsia , 1994, 35 Suppl 4: S41-50) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제는 다른 칼슘 채널의 서브-타입(sub-type)과 교차반응(cross-reactivity)이 있을 수 있으나, 다른 서브 타입에 대한 반응성 없이 Ｔ-타입 칼슘 채널만 선택적으로 저해할 수 있는 물질인 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제는 상기 열거된 화합물 이외에 당업계에 공지된 방법으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 그러한 방법의 예로는 Song 등(Br . J. Pharmacol ., 129(5):893-900, 2000), 대한민국 공개특허 제 2006-94776호 또는 대한민국 공개특허 제 2006-128148호에 기재된 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 불안장애 예방 및 치료용 조성물은 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 목초액을 함유하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구가 가능하며, 상기 비경구 투여는 전신 또는 국소로 투여, 특히 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)내로의 투여되는 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 생약복합재 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 주사제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 불안장애 예방 및 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누 어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 상기 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 조성물들은 뇌혈관 장벽(blood-brain barrier: BBB)을 통과할 수 있는 화합물인 것이 바람직하며, 상기 화합물 자체가 뇌혈관 장벽을 통과할 수 없는 화합물이라면, 담체를 이용하여 뇌혈관 장벽을 통과하도록 할 수 있다.

상기 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있는 화합물로는 1, 4-디히드로피리딘(dihydropyridine)이 있으며, 상기 1, 4-디히드로피리딘 유도체를 제조하여 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제에 특이적으로 결합하는 특정 유도체를 상술한 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제의 스크리닝 방법을 이용하여 스크리닝하는 것이 가능하다.

한편, 자체적으로 뇌혈관 장벽을 통과하지 못할 경우에는 상기 조성물은 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있는 담체를 이용하면 MD에 전달될 수 있다. 그러한 담체의 예는 WO 2002/89776 및 WO 2004/1050062에 개시되어 있다. 그러나, 상기 특정 담체로 본 발명의 담체가 한정되는 것은 아니다.

상기 불안장애는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 신체형 장애(somatoform disorder), 해리성장애(dissociative disorder) 및 인위성장애(factitious disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하지만, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)에서 많이 발현되는 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4, PLCβ4)의 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 마우스는 학습 능력, 장기 기억력 및 활동 능력은 정상이지만, 기억소멸 능력은 상당히 저하되어 있음을 확인하였다. 이는 PLCβ4 녹-아웃 마우스가 불안장애 동물모델로 이용될 수 있음을 의미한다.

본 발명자들은 PLCβ4 녹-아웃 마우스를 제조하기 위하여, 우선 PLCβ4 유전자가 결손된 벡터를 제조하여 마우스의 배아간세포에 도입하였다. 다음에 PLCβ4 유전자 결손이 확인된 배아간세포 클론을 배양한 후, 포배아의 포배강에 주입하여, 정관 수술한 수컷과 교배시켜 대리모 마우스의 자궁에 이식함으로써 키메라 마우스의 발생을 유도하였다. 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 PLCβ4 +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 마우스를 수득하였고, 다시 상기 이형접합체 마우스의 암컷과 수컷을 교배시킴으로써 PLCβ4-/- 유전자형을 갖는 유전자변이 마우스(PLCβ4 녹-아웃 마우스)를 제조하였다. 본 발명에서는 상기와 같이 제조한 PLCβ4 녹-아웃 마우스를 불안장애 동물모델로 이용하였으며, PLCβ4 녹-아웃 마우스의 수정란을 2007년 12월 6일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11247BP).

본 발명자들은 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)에 케뉼러 주입 수술을 한 후, 무작위로 두 군을 나누어 특정 소리에 대한 얼어붙음(freezing) 반응을 통하여 두 군의 학습 능력에 차이가 있는지 조사하였다. 그 결과, 첫 번째 시도에서는 반응이 거의 없었지만 조건화가 되어가면서 두 번째 및 세 번째 시도에서는 특정 소리에 대한 반응이 점점 증가하는 경향이 두 군 마우스 모두에서 유사하게 나타났다(도 1 참조). 따라서, 미베프라딜(mibefradil)과 식염수를 투여할 두 군이 투여 전날 공포기억학습에 서로 차이가 없다는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제가 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 학습 능력에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 케눌러를 통해서 T-타입 칼슘 채널 억제제인 미베프라딜 투여군 및 대조군(식염수 투여)에서 상기와 같은 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응을 조사하였다. 그 결과, 미베프라딜 투여군은 대조군에 비해 기억력이 점차 소멸됨을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 이는 미베프라딜이 기억력 소멸 저하를 정상적으로 되돌릴 수 있음을 의미한다. 따라서, Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 MD에 투여하면 기억소멸 능력을 유의하게 회복시킴으로서 불안장애를 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 정상 마우스에서도 상기와 같은 방법으로 미베프라딜의 효능을 조사하였다. 정상 마우스를 무작위로 두 군을 나누어 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응을 통하여 두 군의 학습 능력에 차이가 있는지 조사하였다. 그 결과, PLCβ4 녹-아웃 마우스에서와 마찬가지로, 두 군의 정상 마우스 모두에서 유사하게 나타났다(도 4 참조). 따라서, 미베프라딜과 식염수를 투여할 두 군이 투여 전날 공포기억학습에 서로 차이가 없다는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 대표적인 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제가 정상 마우스의 학습 능력에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기와 같은 방법으로 케눌러를 통해서 미베프라딜 투여군 및 대조군(식염수 투여)에서 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응을 조사하였다. 그 결과, 미베프라딜 투여군 및 대조군 모두에서 특정 소리에 대한 기억력이 소멸하였으나, 미베프라딜 투여군에서 더 빠르게 소멸됨을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조). 따라서 T-타입 칼슘 채널 억제제는 기억소멸 능력을 증가시키고 상기 소멸된 기억의 회복 능력을 감소시킴으로써 불안장애를 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 정상 마우스를 무작위로 두 군으로 나누어 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응을 통하여 두 군의 학습 능력에 차이가 있는지 조사하였다. 그 결과, 두 군의 정상 마우스 모두에서 유사하게 나타났다(도 5 참조). 따라서, 에포니디핀과 50% DMSO를 투여할 두 군이 투여 전날 공포기억학습에 서로 차이가 없음을 확인하였다.

본 발명자들은 상기 기억소멸 효과가 다른 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제에도 적용되는지 알아보기 위해, 상기와 같은 방법으로 케눌러를 통해서 T-타입 칼슘 채널 억제제인 에포니디핀 투여군 및 대조군(50% DMSO 투여)에서 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응을 조사하였다. 그 결과, 상기 미베프라딜과 유사하게, 에포니디핀 투여군이 대조군에 비해 더 빠르게 소멸됨을 확인하였다(도 8 및 도 9 참조). 따라서 다양한 T-타입 칼슘 채널 억제제가 불안장애 예방 또는 치료용 조성물에 이용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 불안장애 예방 및 치료방법, 및 불안장애의 예방 및 치료를 위한 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 의약 제조로의 용도를 제공한다.

상기 치료적 유효량이란, 상기 불안장애의 증상을 경감시키며, 또는 진행을 방지하는 양이며, 바람직하게는, 불안장애의 발증을 예방, 또는 치유하는 양이다. 또한, 투여에 의한 이익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 마우스, 랫트, 개 또는 돼지 등의 동물모델에 대한 시험에 의해 적당히 결정할 수 있으며 이러한 시험법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 명세서에서 "대상"이란 용어는 임의의 생물 개체를 의미하며, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람의 개체를 의미한다. 상기 대상은 불안 장애를 갖고 있거나, 불안 장애의 리스크를 갖는 대상을 의미한다.

상기에서 살펴보았듯이, 본 발명의 조성물은 기억소멸 능력을 유의하게 회복시키므로, 불안장애의 예방 및 치료를 위한 의약 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명을 한정하 지는 않는다.

< 실시예 1> 포스포리파제 β4( Phospholipase β4) 유전자 녹-아웃( knock - out ) 마우스( PLCβ4 녹-아웃 마우스)의 제조

<1-1> PLC β4 유전자 결손 벡터의 제조

마우스 게놈으로부터 PLCβ4 유전자를 분리하기 위하여, PLCβ4 유전자의 cDNA(서열번호 1)의 시작 코돈으로 부터 226 - 369부분에 해당하는 부위를 RT-PCR로 분리해 내고 이를 탐침(probe)으로 사용하여 129/svJae 마우스 게놈 DNA 라이브러리(LamdaFixII, Stratagene Inc., USA)에 혼성화 반응을 수행하였다. 이로부터, PLCβ4 유전자를 가진 게놈 클론 파지를 선별한 후 제한 효소 지도, 서던 블럿 분석 및 염기서열 결정 등에 의하여 상기 파지 클론이 PLCβ4 유전자인 것을 확인하였다.

PLCβ4 유전자가 결실된 벡터를 제조하기 위하여, 상기 PLCβ4 유전자 클론에서 PLCβ4 단백질의 X 도메인의 일부분을 제거하여 PSK-플라스미드 벡터(Stratagene Inc., USA)에 클로닝하였다. 상기 PLCβ4 유전자의 일부가 결실된 것을 포함하는 적중벡터의 3' 상동절편 말단에는 유전자의 적중 효율을 높이기 위하여 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트 및 음성선별 마커(negative selection marker)를 삽입하였다.

<1-2> 세포 배양

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 적중벡터를 형질도입시키기 위한 세포주로 J1 배아간세포(embroinic liver cells)를 사용하였다. J1 배아간세포(미국 매사추세츠공과대학(MIT)의 R. Jeanisch로부터 분양받음)를 DMEM 배지(Gibco Co., USA)에 15% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Hyclone Co., USA), 1×페니실린-스트렙토마이신(phenicillin-streptomycin), 1×비-필수 아미노산(Gibco Co., USA), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)이 첨가된 ES 배지에 접종한 후 37℃에서 2 내지 3 일 동안 배양하였다. 상기 배양으로부터 얻은 배세포군에 0.25% 트립신이 포함된 1 mM EDTA 용액을 처리하여 단일세포들로 분리하였다.

<1-3> 세포로의 PLC β4 유전자 결손 벡터 도입

상기 실시예 <1-2>에서 단일세포로 분리된 배아간세포에 실시예 <1-1>에서 제조한 적중벡터를 트랜스펙션(transfection)하기 위하여 일렉트로포레이션 (electroporation)을 수행하였다. 구체적으로, 2×10⁷ 세포/㎖의 농도로 희석된 배아간세포에 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 적중벡터 DNA 25 ㎍를 첨가하여 혼합한 후, 270 V/500 μF 조건으로 전기충격을 가하였다. 상기 배아간세포를 0.3 mg/㎖ G418 및 2 μM의 간사이클로버가 포함된 ES 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 동형재조합(homologous recombination) 방법에 의해 배아간세포 내 PLCβ4 유전자가 적중벡터에 의해 정확하게 적중된 배아간세포 클론을 서던 블럿으로 선별·유지하였다.

<1-4> PLC β4+/- 마우스의 제조

PLCβ4 +/-의 유전자형을 갖는 키메라 마우스를 제조하기 위하여, 수정된 포배아 세포에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 미세주입하였다.

구체적으로, C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratory, USA) 암컷과 수컷을 교배시킨 후, 3.5일(3.5 p.c.)된 암컷을 경부탈구법으로 희생시켰다. 희생된 암컷으로부터 자궁을 적출하여 자궁 말단부를 가위로 절제한 후, 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20 mM HEPES, 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사 용액 1 ㎖을 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세 유리관을 사용하여 상기 자궁조직으로부터 포배아를 분리하였으며, 분리한 포배아를 35 mm 페트리디쉬 위에 미리 떨어뜨려 놓은 주사 용액 방울에 옮긴 후 하기의 도입과정에 사용하였다.

상기와 같이 분리한 포배아에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 도입하기 위하여, 미세주입기(Zeiss Inc., USA)를 이용하여 홀딩(holding) 피펫으로 포배아의 내부세포괴(inner cell mass) 방향을 음압으로 잡은 상태에서 10 내지 15 개의 배아간세포 클론을 흡입한 주사 피펫을 포배아의 포배강내로 삽입한 후 양압을 주어 배아간세포 클론을 포배아의 포배강내로 주입하였다. 상기 클론이 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후, 2.5 p.c.된 가임신 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 배아간세포 클론(J1) 및 C57BL/6J 마우스의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 마우스의 발생을 유도하였다. 이때, 자궁이식은 애버틴(avertine, 체중당 1 ㎎/㎏)으로 마취된 대리모의 복부를 1 ㎝ 정도 절제하고; 자궁 상부를 핀셋으로 집어 2 cm 정도 체외로 잡아당기고; 주사 바늘로 자궁에 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 상기의 포배아를 미세유리관으로 주입하고; 내부 복강막을 봉합사로 두 바늘 꿰멘 다음 겉가죽을 내과용 클립으로 봉입하는 방법을 사용하였다. 상기와 같이 배아간세포가 주입된 포배아를 대리모 마우스의 자궁으로 이식하여 약 19 일 동안 배양함으로써 배아간세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 융합되어 게놈 내 PLCβ4 +/-의 유전자형을 가지는 키메라 마우스를 확보하였다.

<1-5> PLC β4 녹-아웃 마우스의 제조

키메라 마우스를 각각 C57BL/6J 및 129sv 마우스와 20 차례 이상 교배하면서 유지하였고, 이로부터 생성된 C57BL/6J-PLCβ4+/- 및 129sv-PLCβ4+/- 마우스를 교배하여 F1 단계에서 PLCβ4+/+ 및 PLCβ4-/- 마우스를 제조하였으며, 이들을 하기의 행동실험에 사용하였다. 유전자 형 확인은 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 사용하였다. 프라이머는 K1(5'-CTCCACACTCTGCAACCTAC-3'; 서열번호 2), K9(5'-AGTTACTTCTGGATTTTCAGCC-3'; 서열번호 3) 및 PGK22(5'-CTGACTAGGGGAGGAGTAGAAG-3'; 서열번호 4)를 이용하여 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40회 반응시켰다. 상기 프라이머 K1 및 K9은 정상 마우스의 유전자 형을 확인하기 위한 프라이머 쌍으로, 프라이머 K1 및 PFK22는 돌연변이 마우스의 유전자 형을 확인하기 위한 프라이머 쌍으로 사용하였다. 이렇게 하여 수득한 PCR 산물은 1.5% EtBr/아가로스 겔에서 각각의 밴드를 확인하였다.(PLCβ4+/+: 190 bp, PLCβ4+/-: 250/190 bp 및 PLCβ4-/-: 250 bp)

< 실시예 2> 마우스의 사육 및 구성

상기 마우스들은 12 시간 밝은 조명, 12 시간 어두운 조명 일주기하에서 물과 사료가 자유롭게 주어지며 온도 22℃, 습도 55 %가 유지 되는 SPF(specific pathogen free) 환경에서 사육되었다. 실험에 사용된 마우스는 모두 수컷이며 6마리~18마리가 사용되었으며, T-test와 repeated two-way ANOVA를 사용하여 통계 테스트를 실시하였다.

상기 정상 마우스 및 PLCβ4 녹-아웃 마우스 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)에 약물을 미세 주입할 수 있는 케뉼러를 심어 놓았다. 수술은 Kopf(small animal stereotaxic frame)에서 이루어졌다. 마우스를 2% 아버타인(avertine, 몸무게 1 g당 20 ㎕)을 주사하여 마취한 후, 정위고정기(stereotaxic)에 고정하였다. 그 후, 마우스의 정위고정 좌표(stereotaxic map)를 이용하여 정한 MD(mediodorsal thalamus)의 좌표(AP -1.7 ㎜, lateral 0.2 ㎜, depth 3.0 ㎜)에 마우스의 두개골에 구멍을 뚫었다. 케뉼라 가이드(guide cannula, Plastics One Inc., C315G, tubing length: 3 ㎜)를 상기 구멍에 주입하고, 치과용 시멘트를 이용하여 두개골에 고정하였다. 수술한 마우스는 격리 케이지(cage)로 옮겨 회복을 시켰으며, 최소 1주일간 회복을 한 후, 하기 실험예에 이용하였다.

< 실험예 1> PLC β4 녹-아웃 마우스에서 공포기억학습능력 조사

본 발명자들은 상기 <실시예 2>의 수술에 대한 회복 후, 무작위로 두 군을 나누어 두 군의 학습 능력에 차이가 있는지 조사하기 위하여, 얼어붙음(freezing) 반응을 측정하였다. PLCβ4 녹-아웃 마우스의 MD에 케뉼러를 주입한 일주일 후, 상기 마우스를 10 ~ 13 마리씩 무작위로 두 개의 군으로 나누었다. 상기 두 군의 각각의 마우스들을 외부 소리가 차단된 특정한 상자(conditioning chamber)에서 평소 들을 수 없는 특정한 소리(2900 Hz, 100 db)를 30초 동안 들려주고, 얼어붙음(freezing) 반응의 원인이 되는 발바닥 전기 자극(0.5 mA)을 1초 동안 주되 특정 소리와 동시에 끝나도록 하는 자극을 120초 간격으로 3회 수행하였다.

그 결과, 상기와 같은 학습을 통하여 첫 번째 시도에서는 얼어붙음(freezing) 반응이 거의 0 %이었지만 조건화가 되어가면서 두 번째 및 세 번째 시도에서는 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응이 점점 증가하는 경향이 두 군 마우스 모두에서 유사하게 나타났다(도 1). 따라서, 하기 <실험예 2>의 미베프라딜(mibefradil)을 투여할 군과 식염수를 투여할 군은 전날 공포기억학습이 서로 차이가 없다는 것을 알 수 있다.

< 실험예 2> PLC β4 녹-아웃 마우스에서 기억 소멸 능력 조사

본 발명자들은 상기 <실험예 1>의 두 개의 군에서, 하나의 군(11 마리)에는 미베프라딜(10 nmol, 0.5 ㎕)을 케눌러를 통하여 MD에 투여하였고, 다른 하나의 군(8마리)에는 대조군으로서 식염수(0.9% NaCl, 0.5 ㎕)를 케눌러를 통하여 MD에 투여하였다. 상기 미베프라딜 및 식염수 투여 1시간 후, <실험예 1>과 같이 마우스들에게 특정 소리를 조건화한 후, 24 시간이 경과한 뒤에 특정 소리 기억력 테스트 상자에서 특정 소리(30초)를 20회 들려주었다(extinction day1). 특정 소리와 특정 소리 간격은 5초로 하였다. 그 후 24 시간이 지난 후에 다시 특정 소리를 6회에 결쳐 들려 주었다(extinction day2).

그 결과, MD에 식염수를 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스(하기에 "대조군"이라 칭함)에서는 20회의 시도로 소리에 대한 공포 기억이 사라지지 않은 반면, MD에 미베프라딜을 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스(하기에 "실험군"이라 칭함)에서는 공포 기억이 유의하게 소멸되었다(도 2). 따라서, PLCβ4 녹-아웃 마우스에서 미베프라딜은 공포 기억을 더욱 빨리 소멸시키는 것을 알 수 있다.

또한, 특정 소리를 조건화한 지 48 시간이 지난 후, 대조군에서는 6회의 시도로 특정 소리에 대한 공포 기억이 사라지지 않은 반면, 미베프라딜 투여군에서는 얼어붙음 반응이 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(도 3). 따라서, PLCβ4 녹-아웃 마우스에서 미베프라딜은 공포 기억소멸에 대한 회상 능력을 더욱 감소시키는 것을 알 수 있다.

< 실험예 3> 정상 마우스에서 공포기억학습능력 조사

본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 제조된 정상 마우스의 MD에 케뉼러를 주입한 일주일 후, 상기 <실험예 1>과 같이 하여 정상 마우스의 학습 능력을 조사하였다.

그 결과, 정상 마우스군은 PLCβ4 녹-아웃 마우스군과 비슷한 양상으로 첫 번째 시도에서는 얼어붙음(freezing) 반응이 거의 0 %이었지만 조건화가 되어가면서 두 번째 및 세 번째 시도에서는 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응이 점점 증가하는 경향이 두 군 마우스 모두에서 유사하게 나타났다(도 4 및 도 5). 따라서, 하기 <실험예 4>에서 미베프라딜과 식염수를 투여할 두 군이 전날 공포 기억학습이 서로 차이가 없다는 것을 알 수 있다.

< 실험예 4> 정상 마우스에서 기억소멸 능력 조사

<4-1> 미베프라딜의 기억소멸 능력

본 발명자들은 상기 <실험예 2>와 같은 방법으로 MD에 케뉼러가 주입된 정상 마우스의 공포 기억소멸 능력 및 공포 기억소멸의 회상 능력을 조사하였다.

공포 기억소멸 능력 조사 결과, MD에 식염수를 투여한 정상 마우스 및 미베프라딜을 투여한 정상 마우스 모두에서 공포 기억이 소멸되었고, 미베프라딜을 투여한 정상 마우스에서 소멸 속도가 더 빠름을 확인할 수 있었다(도 6). 따라서, 정상 마우스에서 미베프라딜은 공포 기억을 더욱 빨리 소멸시키는 것을 알 수 있다.

또한, 공포 기억소멸의 회상 능력 조사 결과, 대조군에서는 6회의 시도로 특정 소리에 대한 공포 기억이 사라지지 않은 반면, 미베프라딜 투여군에서는 얼어붙음 반응이 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(도 7). 따라서, 정상 마우스에서 미베프라딜은 공포 기억소멸에 대한 회상 능력을 더욱 감소시키는 것을 알 수 있 다.

<4-2> 에포니디핀의 기억소멸 능력

본 발명자들은 하나의 군(7 마리)에는 에포니디핀(efonidipine)(10 nmol, 0.5 ㎕)을 케눌러를 통하여 MD에 투여하였고, 다른 하나의 군(6 마리)에는 대조군으로서 50% DMSO(dimethyl sulfoxide)(0.9% NaCl, 0.5 ㎕)를 케눌러를 통하여 MD에 투여하였다. 상기 에포니디핀 및 50% DMSO를 투여하는 것을 제외하고 <실험예 2>와 같은 방법으로 MD에 케뉼러가 주입된 정상 마우스의 공포 기억소멸 능력 및 공포 기억소멸의 회상 능력을 조사하였다.

공포 기억소멸 능력 조사 결과, MD에 식염수를 투여한 정상 마우스 및 에포니디핀을 투여한 정상 마우스 모두에서 공포 기억이 소멸되었고, 에포니디핀을 투여한 정상 마우스에서 소멸 속도가 더 빠름을 확인할 수 있었다(도 8). 따라서, 정상 마우스에서 에포니디핀은 공포 기억을 더욱 빨리 소멸시키는 것을 알 수 있다.

또한, 공포 기억소멸의 회상 능력 조사 결과, 대조군에서는 6회의 시도로 특정 소리에 대한 공포 기억이 사라지지 않은 반면, 에포니디핀 투여군에서는 얼어붙음 반응이 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(도 9). 따라서, 정상 마우스에서 에포니디핀은 공포 기억소멸에 대한 회상 능력을 더욱 감소시키는 것을 알 수 있다.

도 1은 T-타입 칼슘 채널 억제제인 미베프라딜(mibefradil) 및 식염수를 MD에 투여할 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 학습 능력을 비교하여 나타내는 그래프이다:

-/- 식염수: MD에 식염수를 투여할 PLCβ4 녹-아웃 마우스; 및

-/- 미베프라딜: MD에 미베프라딜을 투여할 PLCβ4 녹-아웃 마우스.

도 2는 조건화 후, 24 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대해서 미베프라딜을 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 공포기억소멸학습 능력을 나타낸 그래프이다:

-/- 식염수: MD에 식염수를 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스;

-/- 미베프라딜: MD에 미베프라딜을 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스; 및

1 시간: 투여된 시점이며 투여한 후, 한 시간이 지나서 소리 자극을 가함.

도 3은 공포기억소멸학습 후, 24 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대해서 미베프라딜을 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 공포기억소멸회상 능력을 나타낸 그래프이다:

-/- 식염수: MD에 식염수를 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스;

-/- 미베프라딜: MD에 미베프라딜을 투여한 PLCβ4 녹-아웃 마우스; 및

1 시간: 투여된 시점이며 투여한 후, 한 시간이 지나서 소리 자극을 가함.

도 4는 T-타입 칼슘 채널 억제제인 미베프라딜 및 식염수를 MD에 투여할 정 상 마우스의 학습 능력을 비교하여 나타내는 그래프이다:

+/+ 식염수: MD에 식염수를 투여할 정상 마우스; 및

+/+ 미베프라딜: MD에 미베프라딜을 투여할 정상 마우스.

도 5는 T-타입 칼슘 채널 억제제인 에포니디핀(efonidipine) 및 50% DMSO를 MD에 투여할 정상 마우스의 학습 능력을 비교하여 나타내는 그래프이다:

+/+ 50% DMSO: MD에 50% DMSO를 투여할 정상 마우스; 및

+/+ 에포니디핀: MD에 에포니디핀을 투여할 정상 마우스.

도 6은 조건화 후, 24 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대해서 미베프라딜을 투여한 정상 마우스의 공포기억소멸 학습 능력을 나타낸 그래프이다:

+/+ 식염수: MD에 식염수를 투여한 정상 마우스; 및

+/+ 미베프라딜: MD에 미베프라딜을 투여한 정상 마우스.

도 7은 공포기억소멸 학습 후, 24 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대해서 미베프라딜을 투여한 정상 마우스의 공포기억소멸 회상 능력을 나타낸 그래프이다:

+/+ 식염수: MD에 식염수를 투여한 정상 마우스; 및

+/+ 미베프라딜: MD에 미베프라딜을 투여한 정상 마우스.

도 8은 조건화 후, 24 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대해서 에포니디핀을 투여한 정상 마우스의 공포기억소멸 학습 능력을 나타낸 그래프이다:

+/+ 50% DMSO: MD에 50% DMSO를 투여한 정상 마우스; 및

+/+ 에포니디핀: MD에 에포니디핀을 투여한 정상 마우스.

도 9는 공포기억소멸 학습 후, 24 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대해서 에포니디핀을 투여한 정상 마우스의 공포기억소멸 회상 능력을 나타낸 그래프이다:

+/+ 50% DMSO: MD에 50% DMSO를 투여한 정상 마우스; 및

+/+ 에포니디핀: MD에 에포니디핀을 투여한 정상 마우스.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A Method for treatment of anxiety disorder by regulating T-type calcium channel <130> 8p-04-02 <150> KR1020080007203 <151> 2008-01-23 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3528 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggccaaac cttacgaatt taactggcag aaggaagtgc cctctttctt gcaagaagga 60 gcagtttttg acagatacga agaggaatct tttgtgtttg agcccaactg cctcttcaaa 120 gtagatgaat tcggcttctt cctgacgtgg aagagtgaag gcaaggaagg acaagtgcta 180 gaatgttccc tcatcaacag tattcgccaa gcagccatac caaaggatcc caaaatcctg 240 gctgctctcg aagctgttgg aaaatctgaa aatgatctgg aagggcggat attgtgtgtc 300 tgcagcggca cggatctggt gaatatcggc ttcacttaca tggtggctga aaatccagaa 360 gtaactaagc aatgggtaga aggcctgaga tcgatcattc acaacttcag ggcaaacaac 420 gtcagtccga tgacatgcct caagaaacac tggatgaaac tggcctttct gaccaacaca 480 actggtaaaa tcccagtgag gagtatcact agaaccttcg catcagggaa aacagaaaag 540 gtgatctttc aagccctcaa ggaactaggt cttcccagtg gaaagaatga tgaaattgaa 600 cctgctgcat ttacttatga aaagttctat gaactgacac aaaagatttg tcctcggaca 660 gatatagaag atctttttaa aaaaatcaat ggagacaaaa ctgattattt aacggtagac 720 caattagtga gctttctaaa cgaacatcag cgagatcctc ggctgaatga aattttattc 780 ccattttatg atgctaaaag agcaatgcag atcattgaaa tgtatgagcc tgatgaagag 840 ctgaagaaaa aaggcctcat atccagtgat ggattctgca gatatctgat gtcagatgaa 900 aatgcccctg tcttcttaga tcgcttagaa ctttaccagg agatggacca cccgctggct 960 cattacttca tcagttcctc ccacaacacc tatctcactg gccggcaatt tggaggaaag 1020 tcttcagtgg aaatgtacag acaagttctc ctggctggtt gcaggtgtgt tgaacttgac 1080 tgttgggatg gaaaaggtga agatcaggaa ccgataataa ctcacggaaa agcaatgtgt 1140 acagacatcc tttttaagga tgtaatccag gccatcaagg aaacggcgtt tgtcacatca 1200 gaataccctg tcattctctc cttcgaaaac cactgcagca aatatcaaca gtacaagatg 1260 tccaagtatt gtgaagatct atttggggat ctcctgttga aacaagcact tgagtcgcat 1320 ccacttgaac caggaaggcc cttgccgtct cctaatgacc tcaaaagaaa aatactcatc 1380 aagaataaga ggctgaagcc tgaagttgaa aagaaacagc ttgaagcttt gaaaagcatg 1440 atggaagctg gagagtcagc cgccccagct agcatcttgg aagacgacaa tgaagaggaa 1500 atagaaagtg ctgatcaaga ggaagaagcc caccctgaat acaaatttgg aaatgaactt 1560 tctgccgatg actacagtca caaggaagcg gttgcaaaca gcgtcaagaa gggcctggtc 1620 accgtagagg atgagcaagc atggatggca tcttataaat acgtaggtgc taccacgaac 1680 atccatccgt acttgtccac gatgatcaac tatgcccagc ccgtgaagtt tcaaggtttc 1740 cacgtggctg aagagcgcaa tattcactat aacatgtctt cttttaacga gtcggttggc 1800 cttggctact tgaagacgca cgcgattgag tttgtaaatt acaataagcg acaaatgagc 1860 cgcatttacc ccaagggagg ccgagttgat tccagtaatt acatgcctca gattttctgg 1920 aacgctggtt gccagatggt ttcactgaac tatcaaaccc cagatttagc gatgcaattg 1980 aatcaaggaa aatttgagta taatggatca tgcgggtacc ttctcaagcc agatttcatg 2040 aggcggcctg atcggacatt tgaccccttc tctgaaaccc ctgtggacgg ggttattgca 2100 gccacgtgct cagtgcaggt tatatcaggg cagttcctct cagataagaa gatcgggaca 2160 tacgtggaag tcgatatgta cgggctgccc accgacacca tacggaaaga gttccgaacc 2220 cgcatggtta tgaacaatgg actcaaccca gtgtataatg aagaatcgtt tgtgtttcga 2280 aaggtgatcc tgcctgacct agctgtcctg agaatcgcag tctacgatga caacaacaag 2340 ctaattggcc agaggatcct tcctttggat ggtctccaag caggctaccg acacatctcc 2400 ctgagaaacg agggaaacaa accattatca ctgccaacaa ttttctgcaa tattgttctt 2460 aaaacatacg tgcctgatgg atttggagat attgtggatg ctttatccga tccaaagaaa 2520 tttctttcaa tcacagagaa gagagcagac caaatgagag caatgggcat tgaaactagt 2580 gacatagcag atgtgcccag tgacacttcc aaaaatgaca agaaaggcaa ggccaaccca 2640 gccaaagcga acgtgacccc tcagagcagc tctgagctca gaccaaccac cacagccgcc 2700 ctgggctctg gccaggaagc caagaaaggt attgaactta tccctcaagt gaggatagaa 2760 gatttaaagc aaatgaaggc ttacttgaag catttaaaga aacaacagaa ggagttaaac 2820 tctttaaaga agaaacatgc aaaggagcac agtaccatgc agaagttaca ctgcacacaa 2880 gttgacaaaa tcgtggccca gtatgacaaa gagaagtcga ctcatgagaa aatcctagag 2940 aaggcgatga agaagaaggg gggaagtaat tgtcttgaaa taaaaaaaga aacagaaatt 3000 aaaattcaga ccctgacaac ggatcacaaa tctaaggtca aagagattgt ggcccagcac 3060 acaaaggagt ggtcagaaat gatcaacact cacagtgcgg aggagcagga aatccgggat 3120 ctgcacctga gccagcagtg tgagctgctg agaaagctgc tcatcaatgc tcatgagcag 3180 cagacccagc agctgaaact ctcccatgac agggaaagca aggagatgag agcccatcag 3240 gctaagattt ctatggaaaa tagcaaggcc atcagtcaag ataaatctat caagaacaag 3300 gcagaacggg aaaggcgagt cagggagttg aacagcagca acactaagaa gttcctagaa 3360 gaaagaaaga gactggcgat gaagcagtca aaagaaatgg atcagttgaa aaaagtccag 3420 ctggagcacc tagaattcct agagaaacag aacgagcagg cgaaggagat gcagcagatg 3480 gtgaaattgg aagccgagat ggaccgcaga ccagcaacag tagtatga 3528 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer k1 <400> 2 ctccacactc tgcaacctac 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer k9 <400> 3 agttacttct ggattttcag cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PFK22 <400> 4 ctgactaggg gaggagtaga ag 22

Claims (12)

1. 미베프라딜(mibefradil), 테트라메쓰린(tetramethrin), 에토숙시마이드(ethosuximide), 에포니디핀(efonidipine)과 Y³⁺, La³⁺, Ce³⁺, Nd³⁺, Gd³⁺, Ho³⁺, Er³⁺ 및 Yb³⁺로 구성되는 군으로부터 선택되는 3가 금속 이온, Ni²⁺, U-92032(7-[[4-[bis(4-fluorophenyl)methyl]-1-piperazinyl]methyl]-2-[(2-hydroxyethyl)amino]4-(1-methylethyl)-2,4,6-cycloheptatrien-1-one), 펜플루리돌(penfluridol), 플루스피릴렌(fluspirilene) 및 발프로에이트(valproate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 함유하는 외상후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder) 예방 및 치료용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 조성물은 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있는 담체를 추가적으로 함유하는 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제는 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 경구 또는 비경구로 투여가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 비경구 투여는 전신 또는 국소 투여인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 국소 투여는 시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)내로의 투여인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 1항에 있어서, 기억소멸 능력을 유의하게 회복시킴으로서 외상후 스트레스 장애 예방 및 치료를 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 약학적으로 유효한 양의 미베프라딜(mibefradil), 테트라메쓰린(tetramethrin), 에토숙시마이드(ethosuximide), 에포니디핀(efonidipine)과 Y³⁺, La³⁺, Ce³⁺, Nd³⁺, Gd³⁺, Ho³⁺, Er³⁺ 및 Yb³⁺로 구성되는 군으로부터 선택되는 3가 금속 이온, Ni²⁺, U-92032(7-[[4-[bis(4-fluorophenyl)methyl]-1-piperazinyl]methyl]-2-[(2-hydroxyethyl)amino]4-(1-methylethyl)-2,4,6-cycloheptatrien-1-one), 펜플루리돌(penfluridol), 플루스피릴렌(fluspirilene) 및 발프로에이트(valproate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 외상후 스트레스 장애에 걸린 인간을 제외한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 외상후 스트레스 장애 치료방법.
11. 약학적으로 유효한 양의 미베프라딜(mibefradil), 테트라메쓰린(tetramethrin), 에토숙시마이드(ethosuximide), 에포니디핀(efonidipine)과 Y³⁺, La³⁺, Ce³⁺, Nd³⁺, Gd³⁺, Ho³⁺, Er³⁺ 및 Yb³⁺로 구성되는 군으로부터 선택되는 3가 금속 이온, Ni²⁺, U-92032(7-[[4-[bis(4-fluorophenyl)methyl]-1-piperazinyl]methyl]-2-[(2-hydroxyethyl)amino]4-(1-methylethyl)-2,4,6-cycloheptatrien-1-one), 펜플루리돌(penfluridol), 플루스피릴렌(fluspirilene) 및 발프로에이트(valproate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 Ｔ-타입 칼슘 채널 억제제를 인간을 제외한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 외상후 스트레스 장애 예방방법.
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