KR20200115389A - 타우 단백질 집적 억제용 조성물 및 집적억제 방법 - Google Patents
타우 단백질 집적 억제용 조성물 및 집적억제 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물 및 집적억제 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 타우 단백질의 집적으로 인해 발병하는 뇌신경질환의 예방 또는 치료에 활용할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 타우 단백질의 집적으로 인해 발병하는 뇌신경질환의 예방 또는 치료에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 타우 단백질 집적 억제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자를 도입하여 발현을 유도함으로써 타우 단백질 집적(Tau protein accumulation/aggregation/plaque)을 억제하는 기술에 관한 것이다.
알츠하이머병 (Alzheimer's disease)은 기억력 감퇴, 언어 및 인지 장애, 감정 컨트롤 부족 등을 증상으로 하는 만성 신경퇴행성 질환이다.
알츠하이머병은 신경병리학적으로 뇌세포, 신경조직 및 혈관 내 침착물 (plaque)의 존재, 신경섬유 농축제 (neurofibrillary tangles, NFT), 타우 단백질 집적물(Tau protein accumulation/aggregation/plaque)의 존재, 아밀로이드 플라크를 형성하는 아밀로이드베타 (amyloid β) 펩타이드의 존재, 시냅스 손상 등을 특징으로 한다. 알츠하이머병의 원인은 완전히 알려져 있지 않으며, 그 치유법도 현재까지는 존재하지 않는다. 알츠하이머병은 치매의 통상적인 형태이며, 심혈관계 질환 및 암과 함께 주요한 사망 원인이다. 인간의 평균 수명이 증가함에 따라, 알츠하이머병의 빈도 역시 증가할 것으로 예상된다.
또한 알츠하이머병을 관리하고 치료하는데 막대한 비용이 발생하며, 환자의 정신적 고통 또한 상당하다. 그러므로 효과적인 알츠하이머병의 예방 및 치료 방법이 필요한 상황이다.
최근 알츠하이머병과 관련하여 Tau 단백질에 많은 연구의 초점이 모아지고 있다. 실제로 뇌척수액의 tau는 알츠하이머병의 전구 기간(prodromal stage)에 증가하기 시작하여 발병 후 병이 진행되는 동안 증가한 양이 안정적으로 유지된다. 과인산화된(hyperphosphorylated) 타우 단백질이 엉켜 축적된(aggregated) NFT는 발병 초기부터 발견되며 그 양이 병의 진행과 함께 점차적으로 증가한다. 즉 타우 단백질로 인한 신경세포 손상과 기능이상(Tau-mediated neuronal injury and dysfunction)은 알츠하이머병 증세가 나타나는 대부분 환자에서 동반되는 병리적 소견이다. 또한, NFT는 AD 이외에도 전두측두 치매(Frototemporal dimentia FTD), 진행성 핵상 마비(Progressive cupranuclear palsy, PSP), 픽씨병(Pick’s disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE) 등 다른 타우병증(tauopathy) 신경 질환에서도 나타나고 이들 질병에 대한 치료제 또한 개발되지 않은 실정이다.
본 발명자들은 이에, 전사인자 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1이 도입되어 뇌세포에 발현될 때 타우 단백질의 집적을 억제하는 것을 실험적으로 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 특히, Nurr1 발현 단독 효과 뿐 만 아니라 보조 활성제(coactivator)인 Foxa2가 병합 발현되었을 때 시너지 효과를 통한 강력한 타우 단백질 집적 억제 효과가 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 타우 병증의 주요 원인으로 알려진 타우 단백질의 집적 억제를 위한 방법에 대하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 Nurr1 및 Foxa2 유전자, 또는 Nurr1 유전자를 도입하여 발현된 경우에 타우 단백질 집적 억제효과, 타우 단백질 인산화 억제 효과가 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 또는 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 타우 병증은 타우 양성 알츠하이머병 (Tau-positive Alzheimer's disease), 루이소체 치매 (Dementia with Lewy Bodies), 전두측두 치매 (Frototemporal dementia, FTD), 다발성경색 치매 (Multi-Infarct Dementia, MID), 전두 측두엽 변성증 (frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 진행성 핵상 마비 (Progressive cupranuclear palsy, PSP), 픽씨병 (Pick’s disease), 만성 외상성 뇌병증 (Chronic traumatic encephalopathy, CTE), 피질기조퇴행 (Corticobasal degeneration, CBD), 구상 신경교 타우병증 (Globular glial tauopathy), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 신경절 교세포종 (ganglioglioma), 신경절 세포종 (gangliocytoma), 일차 연령 관련 타우병 (primary age-related tauopathy: PART), 호은성의 입자병 (argyrophilic grain disease), 연독성뇌증 (lead encephalopathy), 지방갈색소증 (lipofuscinosis), 리티고-보딕병(Lytico-Bodig disease), 수막혈관종증 (meningioangiomatosis)으로 이루어지는 군에서 선택된 질환인 것이며 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 Nurr1 유전자와 더불어 Foxa2 유전자를 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 예방 및 치료에 사용할 수 있다. Nurr1 및 Foxa2의 도입, 또는 Nurr1의 도입을 통한 발현은 (1) 타우 단백질 축적, (2) 베타아밀로이드 축적, (3) 뇌세포 노화, (4) 시냅스 손실, (5) 말초 면역세포 축적과 같은 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 병리적 증상을 완화시킨다. 또한 Nurr1 및 Fox2, 또는 Nurr1의 발현은 뇌세포를 신경 영양화하여 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
한편, 본 발명의 방법에서 "Nurr1 및 Foxa2를 도입(형질도입)한다"는 것은 두 유전자를 암호화하는 핵산을 뇌세포로 함께 도입하는 것을 말한다. 두 유전자는 각각 별도로 또는 동시에 도입될 수 있다.
본 발명의 방법에서 "Nurr1 도입(형질도입)한다"는 것은 Nurr1 유전자를 암호화하는 핵산을 뇌세포로 도입하는 것을 말한다.
뇌세포에 Nurr1 및/또는 Foxa2를 코딩하는 유전자를 도입하기 위해 DNA-칼슘 침전법, 리포좀을 이용하는 방법, 폴리아민 계열을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 레트로바이러스를 이용하는 방법, 아데노바이러스를 이용하는 방법, 아데노 관련 바이러스(AAV) 등을 이용하는 방법 등 당분야에 공지된 유전자의 세포내 도입기술 방법이 사용될 수 있다.
Nurr1 및/또는 Foxa2를 탑재할 때 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터를 사용할 수 있으며, 바이러스성 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로 바이러스, 및/또는 렌티 바이러스 등이 있고, 비바이러스성 벡터는 RNA분자, 플라스미드, 리포좀 복합체, 분자결합체(molecular conjugates), 및/또는 유전자 가위 단백질 (CRISPR, 예: Cas9) 등이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Nurr1 및/또는 Foxa2 도입은, 일 구체예로서 Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 핵산을 각각 별개의 발현 벡터 또는 하나의 발현벡터에 삽입시킨 후, 이를 뇌세포에 도입하는 것을 포함한다.
Nurr1 및/또는 Foxa2를 탑재할 때 유전자 편집 기술을 사용할 수 있으며, 유전자 편집기술이란 생명체의 유전정보를 자유롭게 교정하여 목적하는 유전 형질을 나타내도록 하는 것으로, 유전자 편집 기술에 사용할 수 있는 시스템으로 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (TALEN) 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문 구조의 반복 서열 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISR 관련 시스템 (CRISPR/Cas9) 등이 있다.
본 발명에서 용어 “가이드 뉴클레아제”는 목적하는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제로서, 특히 가이드 RNA에 의해 표적 특이성을 갖는 뉴클레아제를 말한다. 상기 RNA-가이드 뉴클레아제는 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 Cas 단백질일 수 있고, 더 구체적으로 Cas9 (CRISPR-Associated Protein 9) 뉴클레아제 (nuclease) 및 이의 변이체인 Cas9 니케이즈 (nickase)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있는 단백질이다. 상기 Cas 단백질은 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다
상기 Cas9 뉴클레아제는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킨다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 만드는 것을 모두 포함한다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선되는데 이 과정에 연구자가 원하는 변이를 표적 장소에 도입할 수 있다. 상기 RNA-가이드 뉴클레아제는 인공적인, 혹은 조작된 비자연적으로 발생된 (non-naturally occurring)것일 수 있다.
상기 Cas9 니케이즈는 Cas9 뉴클레아제의 촉매적 도메인들 중 1 개에 돌연변이 1 개 이상을 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이 1 개 이상은 RuvC 도메인 내 D10A, E762A 및 D986A로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 상기 돌연변이 1 개 이상은 HNH 도메인 내 H840A, N854A 및 N863A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 Cas9 니케이즈는 Cas9 뉴클레아제와는 달리 단일가닥절단 (single strand break)을 일으킨다. 따라서, Cas9 니케이즈가 작동하기 위해서는 두 개의 가이드 RNA를 필요로 하며, 쌍 (pair)으로서 기능한다. 상기 두 개의 가이드 RNA는 각각의 표적 서열에 대해 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하고, 각 표적 서열 근처의 DNA 듀플렉스의 한 가닥의 절단을 지시하여, 서로 다른 DNA 가닥에 두 개의 틈(nick)을 유도할 수 있다.
Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다. 또한, 상기 Cas 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 속 (Campylobacter) 속 유래의 Cas 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로 스타필로코커스 속 Cas9 단백질일 수 있 다. 그러나, 상기 기술된 예에 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 Cas 단백질은 재조합 단백질 일 수 있다
상기 Nurr1 및/또는 Foxa2를 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 Nurr1 및/또는 Foxa2의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 Nurr1 및/또는 Foxa2의 아미노산서열과 적어도 60％ 이상, 바람 직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 60％, 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％,70％, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 기능적 동등물은 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과로 생성될 것일 수 있다. 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다.
또한, 상기 Nurr1 및/또는 Foxa2를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술이 있다.
상기 Nurr1 및/또는 Foxa2를 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 이들을 통틀어 'Nurr1 및/또는 Foxa2를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물'이라고 표현할 수도 있다.
'발현 벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 렌티바이러스를 이용하는 방법이 바람직하다.
상기 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 특정 세포에 바이러스를 만들 수 있는 재료들을 도입하여 제작된 것이고, 렌티 바이러스 벡터 또한 특정 세포주에 바이러스를 생산할 수 있게 여러 단계를 거쳐 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 렌티바이러스 벡터의 주요 장점은 효율성과 안전성이다.
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 뇌세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, Nurr1 및/또는 Foxa2를 AAV 또는 렌티바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장(packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 AAV 또는 렌티바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 뇌세포, 신경세포 및/또는 신경전구세포를 감염시킴으로써 뇌세포에 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 도입할 수 있다. 이어서, 상기 AAV 또는 렌티바이러스 벡터에 포함된 선별마커를 이용하여 Nurr1 및/또는 Foxa2를 단독 발현 또는 동시 발현하는 것을 확인 후 원하는 뇌세포를 수득할 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 Nurr1 및 Foxa2를 도입되어 발현되는 뇌세포는 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다:
(a) Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 Nurr1 및 Foxa2 발현 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 Nurr1 및 Foxa2 발현 재조합 바이러스로 뇌세포를 감염시키는 단계.
먼저, Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)에 대해서는 위에서 설명한 바와 같다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 Nurr1이 도입되어 발현되는 뇌세포는 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다:
(a) Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 Nurr1을 발현하는 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 Nurr1을 발현하는 재조합 바이러스로 뇌세포를 감염시키는 단계.
먼저, Nurr1 및/또는 Foxa2를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)에 대해서는 위에서 설명한 바와 같다.
상기 DNA 구조물을 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터에 작동 가능하게 연결하고 당업계에 공지된 바이러스 벡터에 삽입시켜 재조합 바이러스 벡터를 제조한다. 이후, Nurr1 및/또는 Foxa2를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 도입하여 Nurr1 및/또는 Foxa2를 발현하는 재조합 바이러스를 제조한다. 상기 바이러스 생산 세포주는 사용한 바이러스 벡터에 해당하는 바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있다. 그리고 나서, Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1을 발현하는 재조합 AAV 또는 렌티바이러스를 뇌세포에 감염시킨다. 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 Nurr1 및/또는 Foxa2을 발현하는 뇌세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
본 발명의 뇌세포는 목적 세포 타입의 생존 또는 증식을 도와주는 배양액 내에서 배양된다. 종종 혈청 대신 자유 아미노산으로 영양을 공급하는 배양액을 사용하는 것이 바람직하다. 뇌세포의 지속적인 배양을 위해 개발된 첨가제를 배양액에 보충하는 것이 바람직하다. 예컨대, Gibco 사에서 시판되는 N2 배지 및 B27 첨가제, 소혈청 등이 있다. 배양 시 배지와 세포의 상태를 관찰하면서 배지를 교환해주는 것이 바람직하다. 이때, 뇌세포가 계속 증식하여 서로 뭉쳐서 신경구(neurospheres)를 형성하면 계대배양을 실시하는 것이 바람직하다. 계대배양은 상황에 따라 약 7-8일 마다 실시할 수 있다.
한편, Nurr1 및/또는 Foxa2가 뇌세포에 도입되어 발현되면 (1) 베타아밀로이드 축적, (2) 타우 단백질 축적, (3) 뇌세포 노화, (4) 시냅스 손실, (5) 말초 면역 세포 축적과 같은 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 병리적 증상을 완화시키고, 또한 뇌세포를 신경영양화 하여 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 예방 및 치료에 도움을 준다. Nurr1과 Foxa2가, 또는 Nurr1이 발현될 때 뇌세포에서 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 병리적 증상을 완화시키고 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 Nurr1 및 Foxa2가 도입된 뇌세포의 타우 병증의 치료를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 Nurr1이 도입된 뇌세포의 타우 병증의 치료를 위한 용도를 제공한다.
예를 들면, 이들 세포는 치료하고자 하는 질환 또는 상태에 따라서 중뇌흑질 부위로 Foxa2 및 Nurr1, 또는 Nurr1이 도입된 뇌세포를 직접 도입함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 또한, Foxa2 및 Nurr1, 또는 Nurr1이 도입된 뇌세포를 치료학적 유효량으로 함유하는 조성물의 형태로 투여 또는 이식함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명은 타우 병증의 치료 방법도 포함한다.
본 발명의 일 태양으로 Foxa2 및 Nurr1, 또는 Nurr1이 도입된 뇌세포를 유효성분으로 함유하는 타우 단백질 집적으로 인하여 발병하는 질환 (예를 들어, 알츠하이머병 등) 예방 또는 치료용 조성물, 유전자치료제 또는 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 유전자치료제 또는 세포치료제는 타우 단백질 및/또는 베타 아밀로이드 축적을 막아주고, 신경세포 및 교질세포를 포함하는 뇌세포를 손상으로부터 보호해주어, 기억관련 신경세포가 보충(재생)되거나 다시 구축(복원)되게 한다.
"재생(regeneration)"이란 형성된 기관 또는 개체의 일부가 상실되었을 때 그 부분이 보충되는 현상이고, "복원"이란 "재구성(reconstitution)"이라고도 할 수 있는데, 이는 조직의 재구축을 의미하는 것으로 일단 해리된 세포나 조직으로부터 조직이나 기관을 다시 구축하는 것을 말한다.
본 발명의 조성물 또는 세포치료제는 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 타우 병증을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 대상체 또는 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 뇌 내 투여, 뇌실 내 투여, 척추강 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 세포가 소화될 수 있으므로 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형화하는 것이 바람직하다.
또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정위고정기(Stereotactic System)를 이용한 뇌 해마체 주사제, 뇌실 주사제, 뇌척수액 주사제, 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 타우 병증을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 대상체(환자)의 연령, 체중, 건강, 성별, 대상체(환자)의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 태양으로, 앞서 설명한 Foxa2 및 Nurr1, 또는 Nurr1이 도입된 뇌세포를 함유하는 조성물의 형태로 치료학적 유효량으로 병변 부위에 직접 이식하는 것을 포함하는 타우 단백질 집적으로 인하여 발명하는 질환 (예를 들어, 알츠하이머병 등) 치료 방법에 관한 것이다. 이식 및 세포 배양의 방법은 당업자에게 널리 알려진 공지의 방법을 사용할 수 있다.
상기 세포의 "치료학적 유효량"은 타우 병증에 의해 유발되는 대상체 또는 환자의 생리학적 효과를 중지 또는 경감시키기에 충분한 양이다. 사용된 세포의 치료학적 유효량은 대상체(환자)의 필요성, 대상체(환자)의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직의 크기 및 면적, 병변의 정도 및 선택된 전달 경로에 의존할 것이다. 또한, 세포는 저 세포 투여량의 다중 소형 이식편으로 소정의 표적 조직 내 1 이상의 부위에 투여할 수 있다. 본 발명의 세포는 이식 전에 완전히 분리되어, 예컨대 단일 세포의 현탁액을 형성하거나, 또는 이식 전에 거의 완전히 분리되어, 예컨대 세포의 소형 응집물을 형성할 수 있다. 세포는 이들을 소정의 조직 부위로 이식 또는 이동시키고, 기능적으로 결핍된 영역을 재구성 또는 재생하는 방식으로 투여할 수 있다.
치료학적으로 유효하게 달성하도록 투여할 수 있는 세포의 적당한 범위는 당업자의 통상의 지식 내에서 대상체 또는 환자에 맞추어 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어 약 1,000 내지 1000,000,000 세포, 혹은 그 이상 일수도 있으나, 저용량이면 효과가 없거나 고용량이면 부작용의 발현 가능성을 배제할 수 없으므로 100,000 내지 50,000,000 정도가 바람직할 수 있다.
그러나, 투여량은 이에 한정되지 않고, 제형의 종류, 투여 방법, 대상체(환자)의 연령이나 체중, 환자의 증상 등을 고려하여 최종적으로는 의사의 판단에 의해 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상체(환자)의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 103~ 1 × 1013 vg/㎕의 바이러스 벡터, 또는 바이러스 유전자를 포함하며, 통상적으로 1 × 106 ~ 3 × 1015 vg/dose를 환자에 1회~5회 주사하며, 효과의 지속을 위해 수개월 또는 수년 후에 다시 유사한 방법으로 주사할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 상술된 의약품 제제의 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에서 "유전자치료제"는 질병 치료 등을 목적으로 유전물질 또는 유전물질을 이입한 운반체를 인체에 투여하는 의약품을 의미한다.
유전자치료제로서 적용될 수 있는 본 발명의 조성물에 대해 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
상기 조성물은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1을 발현하는 뇌세포가 아닌 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1을 발현하는 벡터를 직접 사용하는 것 외에는 전술한 내용을 적용 또는 준용시킬 수 있다.
본 발명은 또한, Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1이 도입된 뇌세포를 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 대상체에 투여하는 것을 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(a) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (nerous) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적 억제용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공한다.
(d) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 인산화 억제용 조성물을 제공한다.
(e) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(f) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (nerous) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(g) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(h) 본 발명은 Nurr1 및 Foxa2, 또는 Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(i) 본 발명의 억제제, 조성물을 이용하는 경우, 알츠하이머병과 같은 타우 단백질의 집적으로 인해 발병하는 뇌신경질환의 예방 또는 치료에 활용할 수 있다.
도 1은 AAV9 바이러스를 이용한 유전자 전달 테스트 실험 과정을 나타낸다.
도 2는 AAV9 바이러스를 이용한 유전자 전달 테스트 실험 결과(해마체와 뇌실에서의 GFP 발현 정도)를 보여준다.
도 3은 뇌 세포에 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 도입한 마우스의 해마 부위에서의 베타아밀로이드와 타우(tau) 단백질의 형광을 면역염색방법을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 뇌 세포에 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 도입한 마우스의 해마 부위에서의 타우(tau) 단백질 및 인산화 타우(phosphor-tau, pTau) 단백질의 형광을 면역염색방법을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 5는 Water Maze 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표를 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 Y Maze 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표를 비교한 결과를 보여준다.
도 7는 Water Maze Test 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표(이동 양상 기록)를 비교한 결과를 보여준다.
도 8은 Water Maze Test 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표(목표까지의 이동 거리)를 비교한 결과를 보여준다.
도 9는 Water Maze Test 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표(평균 속도)를 비교한 결과를 보여준다.
도 10은 3xFAD 형질전환(Transgenic, Tg) 쥐에서 PBS 투여 대조군, Nurr1 단독 투여군, 또는 Nurr1 및 Foxa2 동시 투여군의 인산화된 타우 단백질 (p-tau)과 Tuj1으로 면역염색방법을 실시한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 3xFAD Tg 쥐에서 PBS 투여 대조군, Nurr1 단독 투여군, 또는 Nurr1 및 Foxa2 동시 투여군의 인산화된 타우 단백질 (p-tau)과 Tuj1으로 면역염색방법을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 AAV9 바이러스를 이용한 유전자 전달 테스트 실험 결과(해마체와 뇌실에서의 GFP 발현 정도)를 보여준다.
도 3은 뇌 세포에 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 도입한 마우스의 해마 부위에서의 베타아밀로이드와 타우(tau) 단백질의 형광을 면역염색방법을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 뇌 세포에 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 도입한 마우스의 해마 부위에서의 타우(tau) 단백질 및 인산화 타우(phosphor-tau, pTau) 단백질의 형광을 면역염색방법을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 5는 Water Maze 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표를 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 Y Maze 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표를 비교한 결과를 보여준다.
도 7는 Water Maze Test 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표(이동 양상 기록)를 비교한 결과를 보여준다.
도 8은 Water Maze Test 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표(목표까지의 이동 거리)를 비교한 결과를 보여준다.
도 9는 Water Maze Test 실험을 통해, Nurr1 및 Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표(평균 속도)를 비교한 결과를 보여준다.
도 10은 3xFAD 형질전환(Transgenic, Tg) 쥐에서 PBS 투여 대조군, Nurr1 단독 투여군, 또는 Nurr1 및 Foxa2 동시 투여군의 인산화된 타우 단백질 (p-tau)과 Tuj1으로 면역염색방법을 실시한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 3xFAD Tg 쥐에서 PBS 투여 대조군, Nurr1 단독 투여군, 또는 Nurr1 및 Foxa2 동시 투여군의 인산화된 타우 단백질 (p-tau)과 Tuj1으로 면역염색방법을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"뇌세포(brain cells)"는 뇌에 위치한 세포를 의미하고, 신경세포(neurons, neuron cells) 및 교질세포 (glia, glial cells) 등으로 구성되어 있다.
"신경세포"는 신경계의 세포이고, 용어 "뉴런" 또는 "뉴런 세포"로 서로 바꾸어 사용할 수 있다.
"교질세포"는 뇌에 존재하는 세포 중 가장 많은 부분을 차지하는 세포로서, 성상세포(astrocyte) 또는 미세교질(microglia) 세포를 포함한다.
상기 성상세포는 신경세포의 보호 및 영양공급, 염증에 관여하며, 상기 미세교질세포는 뇌에서 염증을 담당하는 세포로서 알츠하이머병과 같은 뇌질환에서 중요한 역할을 하는 세포군으로 알려져 있다.
"형질도입(transduction)" 박테리오파지를 매개로 유전적 형질이 한 세포에서 다른 세포로 옮아가 유전형질이 도입되는 현상으로, 박테리오파지가 어떤 형(型)의 세균에 감염되면 파지 DNA가 숙주 DNA와 결합하고, 용균현상으로 파지가 나올 때 자신의 DNA를 일부 잃는 대신 숙주 DNA의 일부를 갖고 나오는 경우가 있다. 이러한 파지가 다른 세균에 감염되면, 전 숙주의 유전자를 새롭게 도입하는 게 되어 새로운 형질이 나타나게 된다. 생물학적 연구에서 "형질도입"이라는 용어는 일반적으로 바이러스 벡터를 사용하여 표적 세포에서의 특정 외인성 유전자를 도입하여 발현하는 것을 의미한다.
"집적 억제"는 타우 단백질 및/또는 아밀로이드베타 (amyloid β의 생성을 억제하여 집적(accumulation/aggregation/plaque)을 억제하는 경우와 이미 생성된 타우 단백질 및/또는 아밀로이드 베타를 분해하여 집적을 억제하는 경우를 모두 포함하는 개념이다.
"대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 척추동물, 바람직하게는 포유 동물, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 염소, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아 피그, 인간 등일 수 있다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상체 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
"유전자치료제"는 질병 치료 등을 목적으로 유전물질 또는 유전물질을 이입한 운반체를 인체에 투여하는 의약품을 의미한다.
"세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다.
치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 가축 및 동물원, 스포츠 혹은 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등의 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 어떠한 동물도 가리킨다. 바람직하게는 상기 포유류는 인간이다.
"투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상체 또는 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
"유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 대상체 또는 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 대상체(환자)의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
실시예 1. Nurr1 및 Foxa2 유전자 도입을 통한 타우 병증
(tauopathy) 치료효과 및 인지결손증(학습과 기억력) 개선 확인
재료 및 방법
(1)
동물 관리 및 실험
3xFAD 동물 모델 실험에 관한 모든 절차는 승인번호 2018-0047A 하에 한양의학전문대학원 동물실험윤리의원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받았다. 또한 3xFAD 동물 모델 실험에 관한 모든 절차는 한양대학교 실험동물 사용에 관한 가이드라인에 따라 이루어졌다. 동물들을 12시간 빛/어둠 사이클을 이용한 특정한 무균 장벽 시설에 수용하였고 표준 음식 (5053 PicoLabR Rodent Diet 20)을 제공하였다. 본 실험을 위한 동물의 크기는 본 실험의 생체 외 분석 및 예비 시험에 의해, 사전 통계적 연산 없이 결정되었다. 실험들은 NIH 가이드라인에 따라 실시되었다. 편향을 최소화하기 위해, 거동적 분석은 대부분 두 명의 실험자들에 의해 맹검 방식으로 실시되었다. 18개월 및 15개월 알츠하이머병 transgenic (3xTg-AD) 쥐 (Jackson Laboratory, Maine, USA)가 실험에 사용되었다.
(2)
알츠하이머병 모델 생쥐들에 대한 정위방법의 AAV 주사
18개월 (18m) 및 15개월 (15m) 알츠하이머병 transgenic (3xTg-AD) 쥐 (Jackson Laboratory, Maine, USA)에, Nurr1-AAV9 (1μl) + Foxa2-AAV9 (1μl) (total 2μl, 1012 vg/μl, Nurr1+Foxa2군) 또는 대조군-AAV9 (2μl, 1012vg/μl, 대조군으로만 구성)를 Rompum (93.28μg/kg)과 혼합된 Zoletil50(0.1mg/kg)에 의해 유도된 마취 상태에서 10분에 걸쳐 해마(Hippocampus) (bregma에서 뒤로 1.5 mm; midline에서 측면으로 ± 1 mm; dura에서 앞쪽으로 -2 mm)및 뇌실 (Intracerebroventricle, ICV) (bregma에서 뒤로 0.9 mm; midline에서 측면으로 ± 1.7 mm; dura에서 앞쪽으로 -2.2 mm)에 주사하였다. 매 주사 완료 후 바늘 (26 gauge)은 주사 부위에 꽂힌 상태로 5 내지 10분간 남겨두었다가 천천히 제거하였다. 해마 (Hippocampus)및 뇌실 (Intracerebroventricle, ICV)부위에서의 주사에 오류가 있었던 것으로 판명되는 경우, 해당 생쥐들은 분석에서 제외되었다.
(3)
바이러스 생성
CMV 촉진유전자(promoter)의 통제하에 Nurr1 또는 Foxa2을 발현하는 렌티바이러스성 벡터들을 각각의 cDNA를 pCDH(System Biosciences사, Mountain View, CA)의 다중클로닝 부위에 삽입함으로써 생성하였다. pGIPZ-shNurr1과 pGIPZ-shFoxa2 렌티바이러스성 벡터들을 Open Biosystems사(Rockford, IL)로부터 구입하였다. 공(empty) 백본 벡터들(pCDH 또는 pGIPZ)이 음성제어로서 사용되었다. 렌티 바이러스들을 앞서 설명하였듯이 생체 외 배양들을 형질 도입하기 위해 제조하여 사용하였다(Yi SH, He XB, Rhee YH, Park CH, Takizawa T, Nakashima K, Lee SH (2014) Foxa2 acts as a co-activator potentiating expression of the Nurr1-induced DA phenotype via epigenetic regulation. Development 141: 761-772). 렌티바이러스들의 역가는 QuickTiterTM HIV 렌티바이러스 정량 키트(Cell Biolabs사, San Diego, CA)를 이용하여 측정되었고, 106개의 형질 도입 유닛(transducing unit, TU)/ml(60 내지 70ng/ml)을 포함한 200μl/well(24 well 접시) 또는 2ml/6cm 접시가 각각의 형질 도입 반응에 사용되었다. 정위방법의(stereotaxic) 주사에 의해 생체 내 발현을 유도하기 위해, CMV 촉진자의 통제하에 Nurr1 또는 Foxa2[적혈구응집소(hemagglutinin, HA)로 태그됨]를 발현하는 AAV들을 각각의 cDNA들을 pAAV-MCS 벡터(Addgene사, Cambridge, MA)로 서브클로닝함으로써 생성하였다. 전이 유전자 발현의 효율을 평가하기 위하여, GFP를 발현하는 AAV들도 생성하였다. AAV들(혈청형 9 또는 2)의 포장 및 생성은 한국 과학기술연구원(대한민국 서울)에서 수행하였다. AAV 역가는 QuickTiterTM AAV 정량 키트(Cell Biolabs사)로 측정되었다. 공동 발현 연구는 개별 바이러스 제제의 혼합물(1:1, v:v)로 세포를 감염시켜 수행되었다.
(4)
면역염색
배양된 세포들 및 저온 절단된 뇌 조각들을 다음과 같은 일차 항체들로 염색하였다: Nurr1(1:500, 토끼, 배아일 20일차, Santa Cruz Biotechnology사, Dallas, TX 및 1:1,000, 생쥐, R&D Systems사); Foxa2(1:500, 염소, Santa Cruz Biotechnology사); GFP(1:2,000, 토끼, Life Technologies사); GFAP(1:200, 생쥐, MP Biomedicals사, Santa Ana, CA); Iba-1(1:200, 토끼, Wako사), NeuN (1:100, 생쥐, EMD Milipore사); TAU (1:500, 마우스, Santa Cruz Biotechnology); pTAU (1:500, 토끼, ABcam)
배양된 세포들은 PBS 용액의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 의해 고정되었고, 0.3% Triton X-100 및 1% BSA에 의해 40분 동안 block되었다. 그리고 4°C에서 오버나이트로 일차 항체들과 함께 배양되었다. 시각화를 위한 2차 항체들은 다음과 같다. Cy3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories사) 또는 Alexa Fluor 488 (1:200, Life Technologies사). 염색된 세포는 VECTASHIELD 와 DAPI mounting solution (Vector Laboratories사)와 함께 마운트되었고, 사진은 epifluorescence 현미경 (Leica사) 및 공초점 현미경 (Leica PCS SP5)에 의해 얻어졌다.
(5)
거동검사
(5)-1. Water Maze 법
Water Maze 법은 모리스 워터 미로라고도 불리우며, 공간 기억과 학습을 연구하는 데 널리 사용된다. 동물들은 가루로 된 무지방 우유나 무독성 페인트로 불투명하게 물들인 물웅덩이에 놓이게 되는데, 여기서 그들은 숨겨진 탈출 플랫폼까지 헤엄쳐 가야 한다. 그들은 불투명한 물속에 있기 때문에, 동물들은 플랫폼을 볼 수 없고, 탈출로를 찾기 위해 냄새에 의존할 수 없다. 대신, 그들은 외부 혹은 미로 바깥의 단서에 의존해야 한다. 동물들이 그 일에 더 익숙해짐에 따라, 그들은 그 플랫폼을 더 빨리 찾을 수 있다. 1984년 리처드 G. 모리스에 의해 개발된 이 패러다임은 행동 신경과학의 "골드 스탠더드" 중 하나가 되었다.
(5)-2. Y 미로(Y-Maze) 법
Y 미로(Y-Maze) 법은 공간학습과 기억을 연구하기 위한 사전임상연구에서 행동을 평가하는데 널리 사용된다. 동물들은 Y 미로법에서 Y 모양으로 생긴 미로에서 세 개의 팔 (arm) 중 한 쪽 팔 끝에 놓이게 되는데, 여기서 그들은 갈림길에서 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동할 지 결정하게 된다. 이러한 테스트는 한 동물에게 여러 번 반복될 수 있다. 관찰자는 Y-미로 안에서 동물들의 일련의 선택(예: 특정 팔을 방문한 횟수, 3개의 팔을 방문한 총 횟수, 동물 기준으로 왼쪽 팔을 선택한 횟수, 동물 기준으로 오른쪽 팔을 선택한 횟수)을 기록하게 된다. Y 미로 테스트의 사용은 자발적 교대 테스트(spontaneous alternation test)와 인식 기억력 테스트를 포함한다. 자발적 교대 테스트에서 관찰자는 동물들이 최근에 방문하지 않았던 팔에 방문하는 경향을 보이는지 관찰하고 기록한다 (예: 자발적 교대 숫자를 측정). 이러한 검사들은 해마 손상, 유전자 조작, 그리고 기억 상실 약물에 민감한 것으로 밝혀졌다.
(6)
세포 수 집계 및 통계 분석
면역 염색 및 DAPI-염색된 세포는 200배 또는 400배 배율로 아이피스 그리드(eyepiece grid)를 사용하여 각 배양 커버슬립 내의 군데의 무작위영역에서 계산되었다. 모든 수치에 대해 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며 통계 테스트는 적절하게 입증된다. 통계학적 비교는 Student 's t-test (unpaired), 2-tailed 또는 one-way ANOVA, SPSS (Statistics 21; IBM Inc. Bentonville, AR, USA)를 이용한 Bonferroni post hoc 분석을 사용하여 이루어졌다. n, p- 값 및 통계 분석 방법은 도면 범례에 표시되어 있다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다.
결과
(1) Nurr1 및 Foxa2 유전자 도입이 타우 병증(tauopathy)에 미치는 영향
사람에서 면역원성이 없는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 이용, 뇌에서 신경세포 및 교질세포에 주로 감염되는 성향이 있는 AAV9 serotype을 이용하여 뇌세포에 특이적으로 타겟팅하는 Nurr1 및 Foxa2 유전자 전달 시스템을 구축하였다. Nurr1 및 Foxa2 유전자 발현을 위해 CMV 또는 GFAP 프로모터가 사용되었다. Nurr1+Foxa2-AAV9 바이러스가 주입된 병변은 타우 병증의 일종인 알츠하이머병 병변 부위인 해마체 (Hippocampus)와 뇌실 (Intracerebroventricle, ICV)였다.
AAV9 바이러스를 이용한 유전자 전달 테스트를 수행하기 위해서 성상세포 (astrocytes)에 특이적인 GFAP 프로모터 하에서 green fluorescent protein (GFP)을 발현하는 AAV9 바이러스를 쥐의 해마체와 뇌실 (ICV)에 주입하였다. GFP-AAV9 바이러스 주입 후 3주 후에 GFP 발현을 측정하였다 (도 1). GFP-AAV9를 해마체와 뇌실에 주입한 결과, GFP가 해마체 영역 전체에 발현이 되었고, GFAP+ 성상세포에 특이적으로 발현이 되었다 (도 2). GFAP는 성상 세포 마커, NeuN은 mature neuron marker, Iba1은 microglia marker로써 GFAP와 GFP는 co-expression되고 NeuN과 Iba1은 GFP와 co-expression 되지 않는 것으로 보아 바이러스가 발현되는 세포가 성상 세포에서 특이적으로 발현되는 것을 알 수 있다.
타우(Tau) 단백질은 정상적인 신경세포의 axon에 존재하는 microtubule-associated protein(MAP) 중의 하나이다. 뇌에서 타우 단백질의 집적(aggregation)이 발생하면 신경세포의 손상과 기능 이상(Tau-mediated neuronal injury and dysfunction)이 생기며, 이는 알츠하이머병 대표적 병인과 증세인 것으로 교과서와 여러 문헌에 기술되어 있다.
사람 환자와 유사하게 뇌 속에 tau단백질이 집적되는 알츠하이머병 질환동물모델 3xFAD 쥐에게 15, 18개월 나이에 해마 및 뇌실에 존재하는 교질 세포에 특이적으로 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 도입하였다. 유전자 도입 2개월 후, 해마부위에서 면역염색방법을 통해 타우(tau) 단백질의 양을 형광으로 확인하였다.
도 3A는 Nurr1 및 Foxa2-AAV9가 주입된 3xFAD 마우스와 Control-AAV9가 주입된 3xFAD 마우스의 해마 구역에 존재하는 타우-특이적인 (tau-specific) 플라크 (plaques)가 현저히 줄어들었음을 보여준다. 도 3B는 Tau+ 플라크 숫자를 계량화한 자료를 보여준다.
타우 단백질은 정상 상태에서도 존재하는 단백질이지만 비정상적인 타우 단백질은 신경 퇴행성 질환의 원인으로 알려져 있으며, 타우 단백질의 과도한 인산화는 비정상적인 타우의 특징이다.
15, 18개월 나이의 3xFAD 쥐의 해마 및 뇌실에 존재하는 교질 세포에 특이적으로 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 도입하였다. 유전자 도입 2개월 후, 해마부위에서 면역염색방법을 통해 인산화된 타우(phosphor-tau, pTau) 단백질의 양을 형광으로 확인하였다.
그 결과, AAV9-pGFAP-Nurr1+Foxa2가 주입된 3xFAD 쥐는 컨트롤 AAV9이 주입된 쥐에 비해서 면역염색방법 (immunohistochemistry, IHC) 하의 phosphor-tau 레벨이 감소하였다 (도 4).
상기 결과는 Nurr1 및 Foxa2의 발현을 통해 타우 플라크가 생성되는 절대량을 줄이거나, 인산화된 타우의 양을 감소시킬 수 있으며, 결과적으로 타우 병증의 치료에 Nurr1 및 Foxa2의 발현이 효과가 있음을 나타낸다.
(2) Water Maze와 Y Maze 행동실험을 통한 알츠하이머병(AD) 마우스 모델에서 Nurr1과 Foxa2 유전자 전달로 인지결손증(학습과 기억력) 개선 확인
타우 병증의 일종인 알츠하이머병에서 교질세포에 Nurr1 및 Foxa2 발현에 의한 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 치료효과를 알아보기 위해 3가지 유전자인 APP, PS1, 및 tau에 돌연변이를 시켜 알츠하이머병을 유발한 15-18개월 나이의 3xFAD 쥐의 해마 및 뇌실의 교질세포에 특이적으로 Nurr1 및 Foxa2 발현을 일으켰다. 15-18개월 나이는 쥐의 평균 수명이 약 24개월인 것을 감안했을 때, 상당한 연령이다. 알츠하이머병 모델 쥐에 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 전달하였고, 유전자 전달 후 3개월이 지났을 때 해당 쥐의 인지능력분석을 실시하였다.
타우 병증의 일종인 알츠하이머병은 환자의 기억력 및 인지력 저하가 서서히 진행되는 퇴행성 뇌신경계질환으로써 이를 대변하기 위한 동물실험으로 Water Maze와 Y Maze test를 진행하였다. Water Maze와 Y Maze 실험은 기억력 및 인지력에 대한 효능 실험의 대표적인 공인 실험방법으로써 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 진행 및 치료효과를 판단하기 위한 행동실험 지표로 사용된다.
15-18개월 나이의 쥐에 Nurr1 + Foxa2-AAV9 바이러스 주입 후 약 2주 후부터 2주간격으로 2개월동안 Water Maze와 Y Maze 행동실험을 진행하였고 Nurr1 + Foxa2-AAV9 바이러스를 주입한 마우스의 행동지표와 Control 바이러스 (GFP-AAV9)를 주입한 마우스의 행동지표를 비교하였다. 실험 결과, Nurr1 및 Foxa2가 발현된 쥐는 대조군 쥐에 비해 더 나은 행동지표와 더 빠른 반응 속도를 보여주었다. 이를 통해 교질세포에 Nurr1 및 Foxa2의 발현이 학습 및 기억 부분의 인지활동의 유의한 개선을 가져오고, 이를 통해 타우 병증의 일종인 알츠하이머병 치료 효과를 가져옴을 동물모델에서 행동학적으로 확인하였다. 즉, 뇌세포에서의 Nurr1 및 Foxa2의 발현을 통한 타우 병증의 일종인 알츠하이머병의 임상 유전자 치료 효과를 확인하였다 (도 5, 도 6, 도 7, 도 8, 도 9).
실시예 2: Nurr1 및 Foxa2 유전자 도입을 통한 p-tau 단백질 (인산화된 타우 단백질) 형성 억제 확인
Nurr1 및 Foxa2 유전자 도입을 통해 인산화된 타우 단백질의 형성을 억제할 수 있음을 추가적으로 확인하였다.
APP, PS1, tau에 돌연변이를 유도한 18개월 및 15개월 알츠하이머병 transgenic (3xTg-AD) 쥐 (Jackson Laboratory, Maine, USA)에 Nurr1-AAV9 (1μl) + Foxa2-AAV9 (1μl) (total 2μl, 1012 vg/μl, Nurr1+Foxa2군), Nurr1-AAV9 (1μl) 단독, 또는 식염수(PBS)를 정위 미세 주입 방법으로 마취된 쥐의 뇌실 및 해마에 투여하였다. 투여 2개월 후, 알츠하이머병 transgenic 쥐를 희생시켜 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 후, 1% BSA/PBS 용액에 0.6% Triton X-100을 추가하여 1시간 동안 블로킹하였다. 이후, 동일한 용액에 1차 항체(p-tau, Tuj1)를 붙여 4℃ overnight으로 조직 염색을 실시하였다. 그리고, 시각화를 위한 2차 항체로 Cy3(1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories사), Alexa Fluor 488(1:200, Life Technologies사)로 2차 염색하였다. 염색된 세포를 VECTASHIELD, DAPI mounting solution(Vector Laboratories사)과 함께 마운트하고, 공초점 현미경(Leica PCS SP5)을 통해 내후각뇌피질 영역 (entorhinal cortex region)을 촬영하였고 촬영된 사진을 도 10에 나타내었으며, 이를 정량화한 결과를 도 11 및 표 1에 나타내었다.
| PBS 투여 대조군 | Nurr1 단독 투여군 | Nurr1 + Foxa2 투여군 | |
| Tuj1/p-tau 공동 발현 세포 평균 개수 | 252 | 141 | 64 |
실험결과, 도 10 및 11에서 확인할 수 있듯이, 3xFAD Tg 쥐의 뇌 뉴런에서 발현되는 인산화된 타우 단백질 레벨이 Nurr1 및 Foxa2를 도입 발현시켰을 때 현저히 감소하였고, Nurr1 단독 도입 발현하였을 때도 유의하게 감소되는 현상을 확인하였다.
상기 실험 결과는, 알츠하이머병 모델 쥐인 3xFAD Tg 쥐에 전사인자 Nurr1 및 Foxa2를 같이 또는 Nurr1 단독으로 발현시켰을 때, 대조군에 비해 뉴런에서 인산화된 타우 단백질이 감소됨을 보여준다. 또한, 인산화된 타우 단백질은 알츠하이머병의 주요한 특징인 신경섬유 덩어리 (Neurofibrillary tangle)을 구성하는 물질로, 뉴런에 축적되어 뉴런의 cell death를 야기하고 결국 기억력 감퇴에 이르게 하는 점을 고려하면, 본 발명에 따른 Nurr1 및 Foxa2 공동으로 또는 Nurr1 단독으로 도입하여 타우병증 및 알츠하이머병의 치료에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (29)
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인 것인, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인 것인, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 교질세포 (glia)는 성상세포 (astrocyte) 또는 미세교질세포 (microglia)인 것인, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 교질세포 (glia)는 성상세포 (astrocyte) 또는 미세교질세포 (microglia)인 것인, 타우 단백질 집적 억제용 조성물.
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인 것인, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인 것인, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 교질세포 (glia)는 성상세포 (astrocyte) 또는 미세교질세포 (microglia)인 것인, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 교질세포 (glia)는 성상세포 (astrocyte) 또는 미세교질세포 (microglia)인 것인, 타우 단백질 인산화 억제용 조성물.
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제17항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인 것인, 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인 것인, 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제21항에 있어서,
상기 교질세포 (glia)는 성상세포 (astrocyte) 또는 미세교질세포 (microglia)인 것인, 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- Nurr1 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제23항에 있어서,
상기 교질세포 (glia)는 성상세포 (astrocyte) 또는 미세교질세포 (microglia)인 것인, 타우 단백질 집적으로 인해 발병하는 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons) 또는 교질세포 (glia)를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- Nurr1 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 타우 병증은 타우 양성 알츠하이머병(Tau-positive Alzheimer's disease), 루이소체 치매(Dementia with Lewy Bodies), 전두측두 치매(Frototemporal dementia, FTD), 다발성경색 치매(Multi-Infarct Dementia, MID), 전두측두엽변성증(frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 진행성 핵상 마비(Progressive cupranuclear palsy, PSP), 픽씨병(Pick's disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration, CBD), 구상 신경교 타우병증(Globular glial tauopathy), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 신경절 교세포종 (ganglioglioma), 신경절세포종 (gangliocytoma), 일차 연령 관련 타우병 (primary age-related tauopathy: PART), 호은성의 입자병 (argyrophilic grain disease), 연독성뇌증 (lead encephalopathy), 지방갈색소증 (lipofuscinosis), 리티고-보딕병(Lytico-Bodig disease), 수막혈관종증 (meningioangiomatosis)으로 이루어지는 군에서 선택된 질환인 것인, 타우 병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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| AMND | Amendment | ||
| X601 | Decision of rejection after re-examination | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision |