KR101544398B1 - ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포로 효과적으로 분화(differention)시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신경전구세포에서 FoxA2 및 Nurr1를 동시발현시킴으로써, 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로 효과적으로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법{A Method of Differentiating into Midbrain Dopamine Neurons using co-introducing ＦｏｘＡ2 and Ｎｕｒｒ1}

본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포로 효과적으로 분화(differention)시키는 방법에 관한 것이다.

도파민 신경세포는 중간 뇌의 배쪽 및 복외측에 존재하며, 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다. 이들 신경세포는 전뇌 중의 다수의 구조를 자극하며 저산소증 및 허혈증으로 인한 뇌손상, 파킨슨 질환, 정신분열증, 및 약물 중독 등이 이들의 퇴행 또는 기능이상과 연관되어 있다 (Hynes 등, 1995, Cell 80:95-101).

인간을 비롯한 동물의 뇌에 있어서 도파민의 결핍은 다양하고 심각한 장애를 일으킨다. 그 중 운동장애가 특히 심각한데 이는 파킨슨씨병 등의 환자에서 잘 밝혀져 있다.

파킨슨씨병은 50대 이후에 주로 발병하며 중뇌의 흑질에서 도파민성 신경세포의 사멸로 인하여 선조체에서 도파민의 결핍을 초래하며 akinesis, bradykinesia, 경직, 떨림, 불안한 자세 등의 운동장애를 일으킨다. 이러한 운동장애는 6-히드록시도파민(OHDA)으로 처리한 실험동물에서도 거의 그대로 나타난다.

난치병으로 알려진 파킨슨씨병은 중뇌의 흑색질 부위의 도파민을 분비하는 신경세포의 소멸에 의해 야기되는 병으로 발병빈도가 높고 운동장애가 만성적으로 서서히 진행되는 치명적인 노인성 질환으로 치료방법의 개발이 시급하다. 현재까지 알려진 치료법으로는 몇 가지 유사약물을 이용한 약물치료와 심부자극기 설치 등의 수술적요법 등이 있으나 약물치료의 경우 단기적이며 지속적인 투여에 의한 부작용으로 적용이 쉽지 않고 수술적 요법 또한 신체적, 경제적 부담이 많아 대체치료법이 절대적으로 필요하다.

이러한 신경 퇴행성 장애 및 신경계 질환에서 소실된 신경세포를 대체할 수 있는 치료방법은 유전자 요법 또는 세포 이식이 있지만, 뇌신경조직은 손상시 스스로의 재건이 상당히 제한되어 있으므로 현재까지 이들 질환에 대한 효과적인 치료법은 없는 실정이다.

와그너 등은 Nurr1을 이용하여 신경 줄기세포주(신경 도파민성 신경세포주)를 도파민성 신경세포로 분화시키는데 성공하였지만, 이러한 분화에는 타입 I 중뇌 별아교세포로부터 유도된 보조인자를 필요로 할 뿐만아니라 상기에서는 신경 줄기세포주를 사용하였기 때문에 파킨슨씨병을 위한 세포 이식치료에는 부적합하였다(Wagner, et al., Nature Biotechnology, 1999, 17:653-659).

또한, 한국등록특허 880948호에서는 Nurr1 및 Mash1으로 도파민 신경세포를 제조하고 있으나, 실제로 체내에서 도파민 신경세포로 기능하기 위해서는 중뇌 특성을 나타내야 하는데 그렇지 못해, 마찬가지로 파킨슨씨병을 위한 치료에는 비효율적인 문제가 있다.

이에 본 발명자는 신경전구세포에서 FoxA2 및 Nurr1를 동시발현시킴으로써, 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포로의 분화가 효과적으로 일어남을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하는 중뇌 특성 도파민 신경세포로의 분화방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 질환 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법을 제공한다.

특히, 상기 도파민 신경세포는 중뇌 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는데, 이는 중뇌 발달관련 유전자인 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌와 중뇌흑질 (A9) 도파민 신경세포 특이유전자인 Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2 등의 발현이 나타나는 것을 의미한다.

상기 신경전구세포는 배아 또는 성체 줄기세포로부터 분화시켜 수득할 수도 있고, 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 분리하여 수득할 수도 있다.

신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는데 있어서, 상기 도입은 바이러스 벡터를 이용하여 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용한다.

한편, 상기 FoxA2는 티로신 수산화 효소(TH)를 코딩하는 유전자 발현용 프로모터에 직접 결합됨으로써 도파민 신경세포로의 분화유도를 촉진하는데 이 때, 상기 FoxA2의 TH 프로모터에의 결합율은 Nurr1이 함께 발현될 때 더욱 증가한다. 또한, FoxA2는 세포분열 억제인자인 p15, p16, p21, p27 발현을 증가시켜 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식이 현저히 억제시킨다. 뿐만 아니라, FoxA2는 도파민 신경세포 생존인자인 BDNF, GDNF, NT-3 및 SHH로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현을 증가시킨다.

그리고 분화된 상기 도파민 신경세포는, 성숙한 형태적 기능적 도파민 신경세포임을 알 수 있는 마커 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, 및 DAT 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현한다.

한편, 본 발명은 상기 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 질환 치료용 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 뇌신경계 질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매,우울증, 디스키네시아, 알츠하이머 질환, 루이제 치매, 헌팅톤 질환, 뚜렛 증후군, 불안, 기억 손상 또는 퇴행성 신경질환 등일 수 있는데, 특히 파킨슨 병에 효과적이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라서 FoxA2 및 Nurr1가 동시에 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포로부터 분화된 도파민성 신경세포는 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포인바, 파킨슨씨병, 알쯔하이머, 뇌졸증, 국소빈혈 등의 뇌신경계 질환 등을 치료하기 위한 세포 대체 요법과 유전자 치료 요법에 이용되거나 신약개발에 있어 약물효과 검정 또는 각종 연구를 위한 재료로 폭넓게 이용될 수 있다.

도 1은 Nurr1 및/또는 Foxa2 발현에 의한 TH(Tyrosine Hydroxylase) 유전자 발현 기전에 대한 면역조직화학분석 결과, mRNA 분석결과 및 크로마틴-면역침전 분석결과들을 나타낸 것이다.
도 2는 배양된 신경줄기세포에서 Foxa2를 발현시켰을때 중뇌 발달관련 유전자 (wnt-3a, corin, lmx1b)와 중뇌 및 중뇌흑질 (A9) 도파민신경세포특이유전자 (Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2) 들의 RT-PCR분석 결과 및 면역화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Foxa2의 중뇌 도파민 신경세포 성숙과정에서의 역할 규명하기 위해, 도파민 신경세포 마커인 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, DAT가 발현을 관찰한 면역조직화학분석 결과 및 도파민 신경전달물질 분비능 및 재흡수능 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Foxa2의 세포주기 및 신경분화에의 관련성을 알아보기 위해, cell c세포수 증가패턴 분석결과, 뉴로스피어 형성분석결과, 증식 특이 단백질(Ki67, BrdU, pHH3)의 면역화학분석결과 및 유세포 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Foxa2 과발현에 따른 신경세포 분화 유도능을 확인하기 위한, 신경세포 분화인자 Ngn2, NeuroD의 발현여부를 확인한 RT-PCR 분석 결과 및 신경세포 마커의 면역조직화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Foxa2의 의한 도파민성 신경세포 생존능 향상을 알아보기 위한 TH+도파민 세포에 대한 면역조직화학 분석 결과 및 세포 생존능에 대한 MTT 분석 결과, 그리고 세포생존인자로 알려진 BDNF, GDNF, NT-3, SHH유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 마우스대뇌피질 유래 신경줄기세포, 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포 및 사람 배아줄기세포 유래 신경줄기세포에서의 도파민 신경세포 분화정도를 비교한 면역조직화학분석 결과이다.
도 8은 Nurr1+Foxa2 과발현된 신경줄기세포를 파킨슨 모델쥐의 선조체에 이식하고 세포 치료효과를 관찰한 결과로서, 암페타민-유도된 회전 불균형 실험 결과 및; 이식체 부피, 생존한 세포수, TH+ 도파민 신경세포의 수 확인을 위한 면역조직화학분석 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

"분화 시약"은 신경 계통 (전구세포 및 말단 분화된 세포를 포함)의 분화 세포를 생산하기 위해 본 발명의 배양 시스템에 사용된 화합물의 집합 및 생물학적 인자들의 집합을 말한다. 분화 시약은 표현형의 변화를 유도하거나 돕고, 특정 표현형을 가진 세포의 성장을 촉진시키거나 다른 것의 성장을 지연시키거나, 미지의 기작을 통해 다른 물질과 함께 작용함으로써 분화 과정을 도울 수 있다.

세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식 또는 성장으로 보는 것이 정당하다. 본 발명에서는 상기 두 용어가 혼용되어 쓰이고 있다.

"성장억제제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 성장억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에)차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 억제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다.

"줄기세포(stem cell)"란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아와 성체 줄기 세포로 나눌 수 있다.

"신경세포"는 신경 체계의 세포이고, 용어 "뉴런" 또는 "뉴런 세포"로 서로 바꾸어 사용할 수 있다.

"신경 질환"은 운동 및 감각에 관여하는 신경이 손상되어 운동 및 감각을 포함하는 행동기능에 이상이 있는 질환을 의미하며, 이러한 질환으로서 뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 척추 손상 질환(spinal cord injury disease)을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"형질도입(transduction)" 박테리오파지를 매개로 유전적 형질이 한 세포에서 다른 세포로 옮아가 유전형질이 변화하는 현상으로, 박테리오파지가 어떤 형(型)의 세균에 감염되면 파지 DNA가 숙주 DNA와 결합하고, 용균현상으로 파지가 나올 때 자신의 DNA를 일부 잃는 대신 숙주 DNA의 일부를 갖고 나오는 경우가 있다. 이러한 파지가 다른 세균에 감염되면, 전 숙주의 유전자를 새롭게 도입하는 게 되어 새로운 형질이 나타나게 된다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방 의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다.

치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 가축 및 동물원, 스포츠 혹은 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등의 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 어떠한 동물도 가리킨다. 바람직하게는 상기 포유류는 인간이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 중뇌 특성을 갖는 도파민 신경세포로의 분화방법에 관한 것이다.

"도파민(DA) 신경세포"는 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase, TH)을 발현하는 신경세포를 말한다. 본 발명에서는 "도파민성 신경세포", "도파민 뉴런", "DA" 등으로 혼용하여 사용한다. 도파민 신경세포은 중간 뇌 흑색질에 특이적으로 위치하고, 생체 내에서 선조체, 변연계 및 신피질을 자극하여 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다.

특히, 실제로 체내에서 도파민성 신경세포로 기능하기 위해서는 중뇌 특성을 나타내야만 한다.

파킨슨병과 같은 많은 뇌 신경질환들은 중간뇌 흑색질 중 도파민 신경세포의 손상을 특징으로 하고 있기 때문에, 상기 흑질 치밀부의 손상된 도파민 신경세포들을 대체(replacement)할 수 있는 치료로써, 실제 중뇌 특성을 가지는 도파민성 신경세포의 분화 및 증식이 필요하다.

실제로 태아의 중뇌세포를 파킨슨 증후군 환자의 뇌에 이식하였을 때에, 혹은 파킨슨 증후군의 동물 모델등에 이식하였을 때에 이들 이식세포가 기능을 가진 도파민성 신경세포의 역할을 보이며 또한 운동기능도 향상된다는 보고는 여러 연구팀에 의해 이미 수년 전부터 발표되었었다.

본 발명은 일 관점에서 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 FoxA2 및 Nurr1를 동시발현시키는 것에 의해 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로 효과적인 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 세포는 신경줄기세포 또는 신경전구세포이다. 바람직하게는 영장류의, 가장 바람직하게는 인간 유래 신경전구세포이다.

"신경줄기세포(Neural stem cells)" 는 20-30회 이상 세포 분열을 수행할 수 있고, 뉴런 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능(potency)을 유지하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다.

신경줄기세포는 대칭적으로, 또는 비대칭적으로 분열할 수 있다. 대칭적으로 분열할 때, 신경줄기세포는 분열하여 두 개의 딸 신경줄기세포 또는 두 개의 수임 전구세포를 형성할 수 있고, 달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 대칭적 분열은 대칭적 자가-분열(self-renewal)을 의미하고; 비대칭적으로 분열할 때, 신경줄기세포는 분열하여 하나의 딸 신경줄기세포 및 하나의 수임 전구세포(예를 들면, 뉴런 전구세포)를 형성한다.

본 발명의 신경줄기세포는 다분화능(multipotent)으로 정의되고, 즉, 다수의 신경세포 유형들(예를 들면, 뉴런/신경아교세포)로 분화할 수 있다.

다양한 출처로부터 본 발명의 신경줄기세포를 수득하는 것이 가능하다. 특히, 인간, 영장류, 설치류, 및 조류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 신경줄기세포는 포유류, 특히, 마우스, 랫트 및 인간으로부터 유래된다. 예를 들면, 신경줄기세포는 배아, 성체 조직, 태아조직, 배아줄기(ES) 세포(야생형 ES 세포 또는 유전적으로 변형된 ES 세포)로부터 유래될 수 있다.

바람직하게는 인간 태아의 뇌로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 뇌는 종뇌, 간뇌, 중뇌, 소뇌, 연수, 뇌교 및 척수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 중뇌로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 인간의 신경줄기세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 바람직하게는 인간 태아의 뇌 조직으로부터 얻은 세포를 신경줄기세포 성장인자가 첨가된 배지에서 배양하여 제조할수 있다. 신경줄기세포 성장인자는 bFGF(fibroblast growth factor-basic), LIF(leukemia inhibitory factor) 및 헤파린(heparin)을 사용할 수 있다.

일 구체예서, 본 발명의 신경줄기세포는 마우스 ES 세포 또는 인간 ES 세포로부터 유래된다.

또한, 본 발명은 바람직하게는 신경전구세포를 사용할 수 있다. '신경전구세포'는 성숙한 뉴런(신경세포)인 자손을 생성할 수 있는 세포이다.

상기 신경전구세포는 배아 혹은 성체 줄기세포나 신경줄기세포로부터 분화시켜 사용할 수도 있고, 또는 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 직접 분리하여 사용할 수 있다.

당업계에 알려져 있는 통상적인 방법 등에 의해 줄기세포 또는 신경줄기세포를 신경전구세포로 분화시킬 수 있다. 상기 분화방법의 구체적인 예로서, 이하와 같은 방법들이 있다.

신경 전구세포와 같은 외배엽성 세포로 분화시키기 위해 가용성 인자 및 성장 인자와 같은 생화학적 분화 유도물질을 함유하는 배지에서 배양함으로써 수행할 수 있다. 이 때, 상기 "성장 인자"는 세포 증식 및 분화 활성의 1차 결과로 세포 표면 상에서 수용체에 결합하는 단백질을 의미하고, 가용성 인자로는, 예를 들어, 뉴로트로핀, 미토겐, 줄기 세포 인자, 성장 인자, 분화 인자(예를 들면, TGF-β 상과), TGF-β 상과 아고니스트, 향신경성 인자, 산화제, 신경전달물질 및 생존 인자 등이 있다. 많은 가용성 인자는 수많은 상이한 세포 유형에서 세포 분할을 자극하는 반면에, 다른 것은 특정 세포 유형에 특이적이다. 신경세포 유형의 분화를 특이적으로 조장하는 통상의 분화제로는, 프로게스테론, 푸트레신, 라미닌, 인슐린, 아셀렌산나트륨, 트랜스페린, 뉴르투린, 소닉 헤지호그(SHH), 노긴, 폴리스타틴, 상피성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들면 FGF-4, FGF-8, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 성장 및 분화 인자 5(GDF-5), 뉴로트로핀 3(NT-3), 뉴로트로핀 4(NT-4), 뇌 유도 향신경성 인자(BDNF)), 형질전환 성장 인자 α(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타-3(TGF β3), 혈소판 유도 성장 인자(PDGF-AA), 인슐린양 성장 인자(IGF-1), 골형태형성 단백질(BMP-2, BMP-4), 신경아교 세포 유도향신경성 인자(GDNF), 레티노산(RA), 미드카인, 아스코르브산, 디부티릴 cAMP, 도파민 및 gp130과 착화하는 수용체에 대한 리간드(예컨대, LIF, CNTF, SCF, IL-11 및 IL-6) 등이 있다.

본 발명의 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로의 분화방법은 상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1를 도입하여 발현시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Nurr1은 중뇌 도파민성 신경세포에서 발현되는 스테로이드/방패샘(steroid/thyroid) 호르몬 수용체에 속하는 전사인자로서(Law, et al., Mol. Endocrinol., 1992,6:2129), 도파민성 신경세포에서 발현되어(Zetterstrom, et al., Mol. Brain Res., 1996, 41:111) 중뇌 도파민성 신경세포의 발생에 역할을 할 것이라 여겨지고 있다. 그러나, Nurr1의 단독발현으로 인한 도파민성 신경세포로의 분화 상승효과는 5% 미만이다(실시예 참조).

FoxA2는 중추 신경계에서 발현되는 전사인자로서, 중뇌 도파민성 신경세포 발달과의 연관성은 거의 알려진 바가 없다.

그러나, 본 발명에서는 상기 두 유전자를 신경전구세포에서 동시 발현시킴으로써 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화가 현저히 증가시키는 것을 특징으로 한다.각각의 유전자 단독발현과 비교하여 도파민 신경세포로의 분화효율이 약 10배 이상 증가한다.

특히, 본 발명은 Nurr1 유전자와 더불어 "FoxA2" 유전자를 도파민성 신경세포로의 분화유도에 사용함을 주요한 일 특징으로 하고 있으며, 이하와 같은 FoxA2 유전자의 기능을 규명하였다(실험예 1 참조).

(1) FoxA2는 티로신 수산화 효소(TH)를 코딩하는 유전자 발현에 있어서, TH 프로모터에 직접 결합함으로써 TH 발현증가 효과를 가져온다. 즉, 도파민 신경세포로의 분화유도를 촉진한다. 이 때, 상기 FoxA2의 TH 프로모터에의 결합율은 Nurr1이 함께 발현될 때 더욱 증가한다. 상기 FoxA2의 TH 프로모터 결합서열은 다음과 같다:CAATATTTGT.

(2) Foxa2를 발현시켰을 때, 중뇌 발달관련 유전자인 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌와 중뇌흑질 (A9) 도파민 신경세포 특이유전자인 Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2등의 발현도 더욱 증가한다.

(3) Nurr1 단독 발현에 의해 유도된 도파민 신경세포가 신경세포로서의 분화 및 성숙이 미진함과는 달리, Nurr1과 Foxa2를 함께 발현시키는 경우 생성된 도파민 신경세포가 형태학적으로 성숙한 신경세포로서의 모양을 보인다.

특히, 두 유전자에 의해 분화된 대부분 (>90%)의 TH발현 도파민 세포들은 성숙된 신경세포로, 도파민 신경세포 마커인 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, DAT가 발현하고, 현저히 증가된 도파민 신경세포기능, 예를 들어 도파민 신경전달물질 분비능 및 재흡수능 등이 증가한다. 즉, Foxa2는 도파민 신경세포의 형태학적·기능적 성숙을 유발시킨다.

(4) Foxa2 과발현시, 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식이 현저히 억제된다. 이는 Foxa2에 의해 세포분열 억제인자(예를 들어, p15, p16, p21, p27) 발현이 증가되고, 이로 인해 세포분열억제현상이 나타나게 된다.

(5) 신경줄기세포 분열(증식)억제는 일반적으로 세포분화를 동반하는데, Foxa2 과발현시에도 마찬가지로 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 분열억제와 동반하여 신경세포쪽으로 분화가 유도된다. 이러한 Foxa2에 의한 신경세포로의 분화유도는 신경세포 분화인자인 Ngn2, NeuroD 등의 발현 유도에 의해 확인가능하다.

(6) Nurr1 단독 발현에 의해 분화된 TH+도파민 세포는 분화기간 동안 그 수가 현저히 감소하였으나 Nurr1과 Foxa2 동시발현에 의해 유도된 TH+도파민 세포수는 매우 잘 유지된다. 이는 Foxa2가 분화중인 또는 분화된 도파민 신경세포의 세포사멸을 억제하여 생존을 촉진하기 때문이다. 또한 Foxa2는 파킨슨독소인 H₂O₂ 및 MPP+에 의해 유도되는 세포사멸도 억제한다. 이러한 세포 생존능 증가는 Foxa2이 신경줄기세포 및 신경세포의 세포생존인자로 알려진 BDNF, GDNF, NT-3, SHH 유전자 발현을 유도하기 때문이다.

이처럼, 본 발명에서 중뇌 특성의 도파민 신경세포로의 분화효율을 현저히 상승시킬 수 있는 것은 Nurr1 유전자와 더불어 상기 기능을 발휘하는 "FoxA2" 유전자를 사용하는 구성을 취하기 때문이다.

한편, 본 발명의 방법에서 "FoxA2 및 Nurr1를 도입(형질도입)한다"는 것은 두 유전자를 암호화하는 핵산을 신경줄기세포 또는 신경전구세포로 도입하는 것을 말한다. 두 유전자는 각각 별도로 또는 동시에 도입될 수 있다.

신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1를 코딩하는 유전자를 도입하기 위해 DNA-칼슘 침전법,리포좀을 이용하는 방법, 폴리아민 계열을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 레트로바이러스를 이용하는 방법, 아데노바이러스를 이용하는 방법 등 당분야에 공지된 유전자의 세포내 도입기술 방법이 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 FoxA2 및 Nurr1 도입은, 일 구체예로서 FoxA2 및 Nurr1를 암호화하는 핵산을 각각 별개의 발현 벡터 또는 하나의 발현벡터에 삽입시킨 후, 이를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 도입하는 것을 포함한다.

상기 FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 FoxA2 및 Nurr1를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

또한 상기 핵산은 FoxA2 및 Nurr1의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는80％,보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 본 발명의 FoxA2 및 Nurr1과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.

상기에서 '동등한 생리활성'이란 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 중뇌 특성의 도파민성 신경세포로의 분화를 유도하는 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물이란 FoxA2 및 Nurr1의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％,71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％,88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 기능적 동등물은 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다.

또한 상기 FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다(Sambrook, Fritsch and Maniatis, 'Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술이 있다.

상기 FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 이들을 통틀어 'FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물'이라고 표현할 수도 있다.

'발현 벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.

상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 레트로바이러스를 이용하는 방법이 바람직하다.

상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 신경줄기세포 또는 신경전구세포 내로 도입할 수 있다.

예를 들어, FoxA2 및 Nurr1를 레트로바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장(packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 레트로바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 신경전구세포를 감염시킴으로써 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1 유전자를 도입할 수 있다. 이어서, 상기 레트로바이러스 벡터에 포함된 선별마커를 이용하여 FoxA2 및 Nurr1를 동시 발현하는 신경전구세포를 수득할 수 있다.

일 구체예로서, 본 발명에 따른 FoxA2 및 Nurr1을 발현 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다:

(a) FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 FoxA2 및 Nurr1 발현 재조합 바이러스를 제조하는단계; 및

(c) 상기 FoxA2 및 Nurr1 발현 재조합 바이러스로 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 감염시키는 단계.

먼저, FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)에 대해서는 위에서 설명한 바와 같다. 상기 DNA 구조물을 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터에 작동가능하게 연결하고 당업계에 공지된 바이러스 벡터에 삽입시켜 재조합 바이러스 벡터를 제조한다.

이후, FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 도입하여 FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 재조합 바이러스를 제조한다. 상기 바이러스 생산 세포주는 사용한 바이러스 벡터에 해당하는 바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있다.

그리고 나서, FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 재조합 레트로바이러스를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 감염시킨다. 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.

본 발명의 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 목적 세포 타입의 생존 또는 증식을 뒷받침하는 배양액 내에서 배양된다. 종종 혈청 대신 자유 아미노산으로 영양을 공급하는 배양액을 사용하는 것이 바람직하다. 신경세포의 지속적인 배양을 위해 개발된 첨가제를 배양액에 보충하는 것이 바람직하다. 예컨대, Gibco 사에서 시판되는 N2 및 B27 첨가제가 있다. 배양시 배지와 세포의 상태를 관찰하면서 배지를 교환해 주는 것이 바람직하다. 이 때, 신경줄기세포가 계속 증식하여 서로 뭉쳐서 신경구(neurospheres)를 형성하면 계대배양을 실시하는 것이 바람직하다. 계대배양은 약 7-8일 마다 실시할 수 있다.

한편, 본 발명의 FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로 분화한다.

중뇌 특성의 도파민 신경세포라 함은, 중뇌 흑질부에서 생성되는 도파민 신경세포의 표식 인자를 가지며 배지 내로 도파민을 분비하고 동물모델에 이식했을 때 기능회복을 보이는 세포를 말한다. 예를 들어, 중뇌 발달관련 유전자인 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌와 중뇌 흑질 도파민 신경세포 특이유전자인 Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2등의 발현이 나타난다.

일반적으로 분화(differentiation)는 세포배지에 신경줄기세포 증식유발 사이토카인은 첨가하지 않고 적절한 기질 또는 분화 시약이 첨가되는 영양 배양액을 함유하는 배양 환경에서 실행한다. 적절한 기질은, 양전하로 코팅된 고체 표면, 예를 들면 폴리-L-라이신 및 폴리오르니틴이 적합하다. 기질은 세포외 매트릭스 성분, 일례로 피브로넥틴 및 라미닌으로 코팅 가능하다. 기타 허용되는 세포외 매트릭스는 매트리겔(Matrigel)을 포함한다. 기타 적절한 것은, 폴리-L-라이신을 피브로넥틴, 라미닌, 또는 이들의 혼합물과 혼합한 조합 기질이다.

적당한 분화 시약은 다양한 종류의 성장 인자, 예를 들면, 표피 성장 인자(EGF), 전환성장인자 α(TGF-α), 임의의 형태의 섬유아세포 성장인자(FGF-4, FGF-8 및 bFGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1 등), 고농도의 인슐린, 골형성 단백질(특히, BMP-2 및 BMP-4), 레틴산(RA) 및 gp130과 복합하는 수용체에 대한 리간드 (예: LIF, CNTF 및 IL-6)이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 뇌신경계질환 회복을 위한 용도를 제공한다. 특히, 도파민 신경세포의 손상에 의해 야기되는 신경계 질환에 대한 치료적 용도를 제공한다.

예를 들면, 이들 세포는 치료하고자 하는 질환 또는 상태에 따라서 중뇌이 흑질 등의 부위로 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 직접 이식함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 또한, FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 치료학적 유효량으로 함유하는 조성물의 형태로 투여 또는 이식함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명은 도파민 신경세포의 변성 또는 변형을 특징으로 하는 신경변성 장애 또는 신경병의 치료 방법도 포함한다.

상기 뇌신경계 질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매,우울증, 디스키네시아, 알츠하이머 질환, 루이제 치매, 헌팅톤 질환, 뚜렛 증후군, 불안, 학습 및 기억 손상,퇴행성신경질환 등의 신경계의 기능 감소 또는 이상으로 인하여 뇌 또는 신경계에 나타나는 질환을 말한다. 바람직하게는 파킨슨 병의 치료에 유용하다.

"치료" 또는 "치료하다"는 치료학적 처치 및 예방 또는 방지 수단이다. 그러므로, 치료가 필요한 자들은 이미 신경변성 장애 또는 신경병을 가진 자, 뿐만 아니라 신경변성 장애 또는 신경병을 예방하고자 하는 자들을 포함한다. 본 발명의 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 영장류 및 가축, 사육,애완용 또는 스포츠 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 치료가 필요한 임의의 포유동물을 치료하는 데 사용할 수 있다. "장애"는 신경 원시세포, 분화된 신경세포 또는 본 발명의 세포의 두 가지 유형으로 치료하여 이익이 되는 임의의 상태이다.

상기 치료적 용도로서, 본 발명의 일 태양으로 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 질환 치료용 조성물 또는 세포치료제에 관한 것이다.

본 발명의 세포 치료제는 손상된 도파민성 신경세포를 보충(재생)하거나 다시 구축(복원)한다. "재생(regeneration)"이란 형성된 기관 또는 개체의 일부가 상실되었을 때 그부분이 보충되는 현상이고, "복원"이란 "재구성(reconstitution)"이라고도 할 수 있는데, 이는 조직의 재구축을 의미하는 것으로 일단 해리된 세포나 조직으로부터 조직이나 기관을 다시 구축하는 것을 말한다.

본 발명의 치료용 조성물 또는 세포치료제는 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다.

예를 들어, 경구 투여시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 뇌 또는 신경계 질환을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 세포가 소화될 수 있으므로 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형화하는 것이 바람직하다.

또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류 (예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 뇌 또는 신경계 질환을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 태양으로, 앞서 설명한 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 중뇌 특성의 도파민 신경세포; 또는 이를 함유하는 조성물의 형태로 치료학적 유효량으로 병변 부위에 직접 이식하는 것을 포함하는 뇌신경계질환 치료방법에 관한 것이다. 이식 및 세포 배양의 방법은 당업자에게 널리 알려진 공지의 방법을 사용할 수 있다.

상기 세포의 "치료학적 유효량"은 도파민성 신경세포의 손실, 손상 또는 변성에 의해 유발되는 환자의 생리학적 효과를 중지 또는 경감시키기에 충분한 양이다.

사용된 세포의 치료학적 유효량은 환자의 필요성, 환자의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직의 크기 및 면적, 병변의 정도 및 선택된 전달 경로에 의존할 것이다. 예를 들면, 뇌의 더 큰 영역에 영향을 주는 장애의 치료는 보다 작은 표적 영역과 비교하였을 때 치료 효과를 달성하기 위하여 보다 다수의 세포를 요할 수 있다. 또한, 세포는 저 세포 투여량의 다중 소형 이식편으로 소정의 표적 조직내 1 이상의 부위에 투여할 수 있다. 본 발명의 세포는 이식 전에 완전히 분리되어, 예컨대 단일 세포의 현탁액을 형성하거나, 또는 이식 전에 거의 완전히 분리되어, 예컨대 세포의 소형 응집물을 형성할 수 있다. 세포는 이들을 소정의 조직 부위로 이식 또는 이동시키고, 기능적으로 결핍된 영역을 재구성 또는 재생하는 방식으로 투여할 수 있다.

치료학적으로 유효하게 달성하도록 투여할 수 있는 세포의 적당한 범위는 당업자의 통상의 지식 내에서 환자에 맞추어 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어 약 1,000 내지 10,000,000 세포, 혹은 그 이상 일수도 있으나, 고용량이 되면 암세포로 변할 가능성을 완전히 배제할 수 없으므로 2,000,000 내지 4,000,000 정도가 바람직할 수 있다.

그러나, 투여량은 이에 한정되지 않고, 제형의 종류, 투여 방법, 환자의 연령이나 체중, 환자의 증상 등을 고려하여 최종적으로는 의사의 판단에 의해 적절히 결정할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

각 세포배양 실험에서, 세포 계수는 8-40 현미경 필드 조건의 무작위 선택에 의해 수행하였으며, 얻어진 데이터는 3 내지 5의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표시하였다.

통계 비교는 2이상의 그룹이 포함될 때 Student’s t-test 또는 one-wayANOVA with a post hoc analysis (SPSS 16.0; SPSS Inc., Chicago,IL, http://www.spss.com)으로 수행하여 비교하였다.

도파민(DA) 방출 및 흡수를 평가하였다. 표준 프로토콜로서 RT-PCR, 면역형광 및 웨스턴 블럿 분석이 적용되었다. 총 RNA 제조, cDNA 합성 및 RT-PCT 반응을 통상 알려진 방법대로 수행하였다. 루시퍼라아제 리포터 및 ChIP 분석방법을 이용하였다.

실시예 1 : 신경전구세포( NPC ) 배양 및 형질도입

12일째 마우스(ICR) 배아(E12)의 뇌 영역 및 E 14 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트 배아의 대뇌피질(Cortex)로부터 분리한 신경전구세포(NPC)를 배양하였다. 그리고, 인간 배아줄기세포(hES) in vitro 분화 프로토콜에 의하여, 인간 배아줄기세포(HSF-6; University of California,San Francisco)로부터 신경전구세포를 수득하였다.

세포들을 커버슬립(계대되지 않은 (P0) 배양용, 12mm 직경, Carolina Biological Supply Company,Burlington, NC) 또는 10 ㎝ 조직배양접시 (계대된 (P1) 배양용, Corning, NY, 폴리오르니틴/피브로넥틴으로 미리 코팅시킴)에 20,000cells/cm²으로 배양시켰다. 20 ng/㎖의 bFGF(basic fibroblast growth factors)(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 포함된 무혈청 N2 배지하에서 상기 신경 전구세포를 증식시켰다.

바닥의 60-80%를 덮은(전형적으로 시험관내(in vitro) bFGF-증식에 3-4일 소요됨) 전구체를 1시간 동안 CMF-HBSS하에서 배양한 다음 물리적으로 떼어내고 N2+bFGF(P1 단세포물)내 미리 코팅된 커버 슬립상에 배양시켰다.

몇몇 실험용으로, CMF-HBSS에 1시간 배양된 전구체를 cell lifter (Corning)를 이용하여 떼어내고 추가 분쇄없이 폴리오르니틴/피브로넥틴 코팅된 커버 슬립상에서 직접 배양시켰다(P1 클러스터).

바닥의 50-60%를 덮을때(전형적으로 세포 재치후 1-2일 소요됨) P1 혹은 P0 세포에 레트로바이러스성 형질 도입을 수행하였다. 증식하는 신경전구세포들을 Nurr1 (Flag-tagged), Small Heterodimer Partner-1 (SHP), DAX-1, estrogen related receptor-c (ERRc), RXRa, Foxa1, 및 Foxa2 (hemagglutinin (HA)-tagged)를 발현하는 레트로바이러스로 형질도입하였다.

본 연구에 사용된 발현 벡터는 대한민국 특허 344090을 기반으로 하여 레트로바이러스성 벡터 pIRES-LacZ 혹은 pIRES-GFP에 기초하여 만들었다. 상기 레트로바이러스성 벡터는 293gpg 패키징 세포(Lipofectamine, Invitrogen)내로 유전자전이하였고 바이러스성 분획(VSV-G pseudotyped 재조합 레트로바이러스)을 포함하는 상청액을 접종 72시간후 얻었다. 바이러스성 적정기로 5x10⁶ particles/ml로 조정하였다. 신경전구체를 폴리브렌(1mg/ml) 존재하에 2시간동안 바이러스성 상청액과 함께 배양하였다. 공동 발현 연구는 세포를 각각의 바이러스성 제조물(1:1, v:v)의 bi-/tri-cistronic 벡터 혹은 그 혼합물로 감염시켜 수행하였다.

바이러스 도입 후 1일째 분화를 유도하였다. 세포 분화는 200mM 아스코르브산(AA, Sigma, St Louis, MO)이 포함된 무혈청 N2 배지 내에서 bFGF 투여중지에 의해 유도하였다. 5% CO² 배양기에서 37℃ 배양을 유지하고, 이틀에 한번씩 배지를 갈아주었으며, bFGF는 분화 전까지 매일 넣어주었다.

실험 결과를 도 1에 나타내었다.

우선, TH(Tyrosine Hydroxylase) 유전자 발현 기전을 확인하였다.

신경전구세포에 Nurr1 (N), Foxa2 (F), Nurr1+Foxa2 (N+F) 또는 LacZ (control; C)를 형질도입한 결과, 마우스 태아 대뇌 피질 (cortex)유래의 신경줄기세포에서 Nurr1 전사인자 발현시 소수 (<5%)의 세포만이 도파민 신경세포 마커인 TH(tyrosine hydroxylase)를 발현하였고(도 1 b), Foxa2의 발현에 의해서도 비슷한 정도의 도파민 신경세포 분화가 일어났다(도 1 c). 그러나, Nurr1과 Foxa2를 동시에 발현시 도파민 신경세포 분화가 10배 이상 증가하였다(도 1 d). 그리고 이러한 수치를 도 1의 e에서 그래프로 표시하였다. .

즉, Foxa2 및 Nurr1 의 동시 발현이 신경전구세포로부터 TH+ 세포로의 분화를 매우 현저하게 향상시킴을 확인할 수 있었다.

이와 같은 Nurr1과 Foxa2에 의한 도파민 신경세포 분화의 synergism현상은 in vitro 분화 3일 후에 RT-PCR을 이용하여 수행한 TH mRNA정량분석 (도 1 f)과 TH 프로모터 분석(도 1 g)에서도 입증되었다.

그리고, TH promoter에 consensus Foxa2 binding site (도 1 i)를 제거한 mutant TH promoter를 제작하고 luciferase assay를 수행하였다. 그 결과를 도 1 j와 h에 나타내었다.

즉, 변이 프로모터에서는 루시퍼라아제 활성이 급격히 감소하여(도1 j), Foxa2에 의한 TH 유전자 발현 증가 효과는 Foxa2 단백이 직접적으로 TH 프로모터에 결합하여 일어남을 알 수 있었다.

또한, Foxa2 유전자의 TH promoter 결합은 Nurr1이 Foxa2와 함께 발현될 때 현저히 증가함을 Chromatin immuno-precipitation assay를 통해 입증하였다 (도 1 k).

실험예 2 : Foxa2 발현에 의한 기능 확인

(1) 다양한 중뇌 도파민 신경세포 발생과정에서의 전사인자의 발현 조절

LacZ (C) 및 Foxa2(F)를 형질도입시킨 E12 마우스 대뇌피질 세포로부터 RNA를 준비하여, semi-quantitative 및 real-time PCR 분석기를 이용하여 mRNA 발현을 관찰하였다.

중뇌 DA 뉴런-특이적 마커의 mRNA 발현에 대한 결과를 도 2 a에 나타냈다. 또한 오른쪽 그래프는 real-time PCR에 의해 측정된 각각의 대조군에 상대적인 mRNA 값을 나타낸 것이다(n=3). 각 막대에는 평균 발현량을 나타낸다.

도 2 a로부터 알 수 있는 바와 같이, 배양된 신경줄기세포에서 Foxa2를 발현시켰을 때 중뇌 발달관련 유전자 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌 및 중뇌흑질 (A9) 도파민 신경세포 특이유전자 (Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2 등이 RT-PCR 분석상 증가하였다. P <0.001에서 각각의 대조군에 비해 현저히 증가한 값을 나타냈다.

그리고, Nurr1 또는 Ptx3 발현에 있어서 Foxa2-매개 유도 효과를 알아보았다(b 내지 j).

도 2의 b 및 c는 Nurr1-면역반응성 세포의 대표적인 이미지를 나타낸 것이다. TH/Nurr1-염색된 세포를 작게 함께 표시하였다. 그래프 E는 전체 세포로부터 % Nurr1+ 세포를 표시한 것이고, HA-Foxa2-형질도입된 배양에서 Foxa2/Nurr1-colabeled (HA+/Nurr1+) 세포를 d에 나타냈다.

도 2의 f 내지 o에서는 Foxa2-유도된 Ptx3 발현에 대해 나타내고 있다. 도 2 f~i 및 k~n은 각각 배지에서 분화 3일 후의 Ptx3+ 세포 및 Ptx3+/TH+ 세포들의 대표적인 이미지이다. 외생성(Exogenous) Foxa2(HA)/Ptx3-염색된 현미경 필드의 이미지를 작게 함께 표시하였다(g 및 i). 그리고 화살표로 세포의 고-확대 사진을 m 및 n에 나타냈다(Scale bars: 40μm). 전체 DAPI+ 세포로부터% Ptx3+ 세포를 도 2의 j 그래프에 나타냈고, 전체 TH+ 세포로부터 % Ptx3+,TH+ 이중 양성 세포 (Ptx3을 발현하는 TH+ 세포)를 도 2 o에 나타내었다.

즉, 면역화학검사법을 통해 Foxa2을 형질도입한 경우 Nurr1과 Ptx3 발현 세포수가 증가함을 알 수 있었다.

(2) Foxa2 의 중뇌 도파민 신경세포 성숙과정에서의 역할 규명

Nurr1 단독 발현에 의해 유도된 도파민 신경세포는 신경세포로서의 분화 및 성숙이 미진한 문제가 있었다. 이에 Nurr1과 Foxa2를 같이 발현유도시 생성된 도파민 신경세포의 성숙성 여부를 확인코자 하였다. 모든 면역세포화학적 기능적 분석은 in vitro 분화 후 15 일되는 E12 마우스 대뇌피질 신경전구세포 배양체를 이용하여 수행하였다.

Nurr1+Foxa2 과발현에 의해 유도된 TH+ 세포에서 TuJ1(a), MAP2 (b), HuC/D (c) 및 성숙 DA 뉴런 VMAT2 (d)에 대해 특이적인 단백질의 동일 위치화를 도 3 a~d에 도시하였다. 화살표로 함께 표지된 세포들을 확대하여 나타내었다(Scale bar, 50 μm). 그래프 도 3e는 총 TH+ 세포 중 이러한 신경세포 마커 단백질을 공동 발현하고 있는 TH+ 세포 %를 나타낸 것이다. 도 3f에서 LacZ (c), Nurr1 (N), Foxa2 (F), Nurr1+Foxa2 (N+F)로 형질도입시킨 경우의 DA 뉴런 항상성 유전자 DAT (왼쪽) 및 VMAT2 (오른쪽)에 대한 Real-time PCR 결과를 나타냈다. 발현 평균값을 막대로 나타냈다. 알 수 있는 바와 같이, 대조군에 비해 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우 현저히 증가하였다(P <0.01, n=6).

즉, 두 유전자에 의해 분화된 대부분 (>90%)의 TH발현 도파민 세포는 성숙된 신경세포, 도파민 신경세포 마커인 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, DAT가 발현됨이 확인되었다(도3 a-f).

그리고, DA 방출에 대한 HPLC 결과를 도 3g에 도시하였다. 24시간 동안 조건화된 배지상에서의 DA 수준을 왼쪽 그래프에 나타냈고(24hr CM), 15분 동안 KCl-유도된 탈분극(depolarization)에 의해 유발시킨 경우를 오른쪽에 나타냈다(KCl evoked). KCL-유발된 방출 수준은 같은 시간 동안 56mM KCl을 보충한 동일 배지로부터 15분 동안 조건화된 배지에서의 DA 수준을 제외시켜 결정하였다. 역시 대조군에 비해 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우가 DA 방출 수준이 훨씬 높았다.

그리고 도 3h에 DAT-매개된 특이적 DA 흡수를 전체 흡수량으로부터 나노특이적 흡수(nomifensine 이용)를 제외하여 계산하였다. 마찬가지로 대조군에 비해 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우가 DA 흡수 수준이 훨씬 높았다. (P <0.01, Student’s t-test, n=4 for DA uptake 및 n=6 for DA release assays)

이처럼, 도파민 신경전달물질 분비능 및 재흡수능 분석에서 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우가 현저히 증가된 도파민신경세포기능이 나타났다.

이와 같은 결과들은 Foxa2가 도파민 신경세포의 형태학적 기능적 성숙을 유발함을 보여주는 결과이다.

(3) Foxa2 의 세포주기와 신경 분화에 관한 연구

형질도입 후 세포분화를 3일 동안 유도하였다. LacZ- (control) 및 Foxa2-형질도입된 세포 성장 프로파일을 형질도입 후 처음 4일 동안 살아있는 전체 세포수를 계수하였다. 세포수 증가 패턴을 분석하여 도 4a에 도시하였다. Foxa2-형질도입된 세포수가 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있다.

그리고, 뉴로스피어 형성 분석을 수행하였다. 1674(Foxa2) 및 1530(control) 뉴로스피어의 직경들을 3개의 독립적인 실험으로부터 측정하였다. 도 3c의 그래프는 뉴로스피어 직경의 범위내에서 스피어의 수를 표시한 것이다. 알 수 있는 바와 같이, Foxa2 형질도입은 대체로 작은 뉴로스피어(<100 μm)를 형성, 즉 뉴로스피어의 사이즈를 현저히 감소시켰다. 이는 도 3의 b에서도 확인할 수 있다.

또한, 증식특이 단백질 Ki67, BrdU, pHH3에 대하여 면역화학분석을 수행하였다. 감염 후 2일 째, Ki67에 대한 양성세포(d, e, j), BrdU에 대한 양성세포 (f, g, k) 및 pHH3에 대한 양성세포 (h, i, l)를 나타내고, i에는 화살표로 pHH3에 대한 면역반응성을 보이는 HA-양성 (Foxa2-발현) 세포가 없음을 함께 표시하였다. (Scale bar, 50 μm). P <0.001 에서 대조군과 현저한 차이를 보였다(Student’s t-test, n=3 독립적 배양)

또한, 유세포 분석결과를 도 4의 m 및 n에 도시하였다. 형질도입 후 2일째, LacZ-형질도입된 대조군의 세포주기 상태 결정을 위한 유세포 분석 결과(도 4m) 및 Foxa2-형질도입된 경우의 결과(도 4n)에 나타냈다. 그래프 상의 숫자는 4개의 독립적 분석으로부터 세포주기 단계에서 축적된 세포 %의 평균을 나타낸다.

상기 결과들로부터 Foxa2가 신경줄기세포에서 과발현시, 신경줄기세포의 증식을 현저히 억제한다는 사실을 알 수 있었다.

더욱이 Real-time PCR 분석결과(도 4o) 및 웨스턴 블랏 분석결과(도 4p)도 CDK 억제자의 iFoxa2-매개된 상향-조절을 보여주었다. 특히, P <0.01, n=3 에서 대조군과 비교해서 현저히 증가하였다. 즉, Foxa2에 의한 세포분열 억제현상이 세포분열억제인자인 p15, p16, p21, p27유전자 및 단백 발현을 증가 (도 4o-p)시킴으로 발생함을 알 수 있었다.

(4) 신경세포로의 분화

신경줄기세포 분열(증식)억제는 일반적으로 세포분화를 동반하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서도 Foxa2 과발현시 신경줄기세포의 분열억제와 동반하여 신경세포쪽으로 분화가 유도되는지를 확인하고자 하였다.

이를 위해 뉴런 특이적인 마커들, 전-뉴런 및 항-뉴런 bHLH 전사인자에 대하여 semi-quantitative 및 real-time RT-PCR 분석을 수행하였다. in vitro 분화 후 3일 째, mRNA 발현을 확인하였다.

그 결과를 도 5의 a에 나타내었다[semi-quantitative (위쪽) 및 real-time(아래쪽) RT-PCR]. 그래프 상의 숫자는 3회 real-time PCR 분석으로부터 각 대조군에 상대적인 mRNA 발현의 평균값을 의미한다.

Foxa2 과발현시 대조군에 비해 현저히 증가된 mRNA 발현을 확인할 수 있다(P <0.01, n=3).

그리고, in vitro 분화 3일 후, Foxa2-형질도입된 세포에서 Ngn2-면역반응성 세포의 현저한 증가(도 5 d, e, i) 및 신경 마커 TuJ1 (b-f), MAP2 (도5 g) 및 HuC/D (도5 h)들에 대해 양성을 나타내는 신경세포 군집들의 증가현상을 면역조직화학 분석 데이터 결과, 확인할 수 있었다(도 5 b-i). (Student’s t-test, n=3 독립적 배양). 도 5 c에서는 HA-Foxa2로 형질도입된 세포들 중 TuJ1+/HA+ 세포들의 대표적인 이미지를 함께 나타내었다(Scale bar,80um). 도 5 f~i의 그래프는 전체 DAPI+ 세포의 면역반응성 세포 %를 나타낸 것이다.

이러한 실험결과를 통해, Foxa2 과발현시 상기 (3)에서의 신경줄기세포의 분열억제와 동반하여 신경세포 쪽으로 분화가 유도됨을 알 수 있었고, 이러한 분화유도는 신경세포 분화인자인 Ngn2, NeuroD등의 발현 유도에 의함을 확인할 수 있었다.

(5) Foxa2 의 사람 중뇌도파민성 신경세포 발생과정에서의 역할 관찰

지금까지 마우스 신경줄기세포에서 관찰된 Nurr1과 Foxa2 과발현에 의한 도파민 신경세포 분화가 종 (species)에 관계없이 관찰되는지를 알아보았다.

이를 위해, 마우스 대뇌피질 유래 신경줄기세포, 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포 및 사람 배아줄기세포 유래 신경줄기세포를 이용하여 비교관찰하였다.

그 결과, 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 마우스대뇌피질 유래 신경줄기세포에서와 같이 (도7 a-b), Nurr1과 Foxa2가 과발현된 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포 (도7 c-d) 및 사람 배아줄기세포 유래 신경줄기세포 (도7 e-f)에도 도파민 신경세포 분화가 원활이 일어남이 관찰되었다.

따라서, 이러한 결과는 본 발명에 따른 유전자 조작 방법이 인간의 뇌신경계 질환, 특히, 파킨슨 환자치료에 이용될 수 있음을 시사한다.

실시예 2 : 세포 증식 및 생존능 확인

5-브로모-2-데옥시우리딘(BrdU, Roche, Indianapolis, IN, http://www.roche.com)-통합(incorporation), 뉴로스피어 형성 분석 및 유세포 분석기에 의한 세포주기 분석을 이용하여 세포 증식을 확인하였다.

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드, 테트라졸(MTT; Sigma,St. Louis, MO, http://www.sigmaaldrich.com) 테스트 및 H₂O₂ (25-200 lM; Sigma)의 존재하에서 사멸세포에 의해 ; 그리고 1-메틸-4-페닐피니디니움 아이오다이드(MPP+; 5-500 lM; Sigma)를 처리한 배양에서의 TH+ 세포수에 의해 세포 생존능을 평가하였다.

Foxa2 의 의한 도파민성 신경세포 생존 능력 향상 여부 확인

E14 랫트 대뇌피질 NPC를 Nurr1 (12.5 MOI)로 형질도입하면서, Foxa2 없이(a,c) 또는 함께(12.5 MOI, b, d) 형질도입하였다. 그리고, TH+ 세포 수를 분화 후 3일 및 15일에 측정하였다

그 결과, 도6 a-e로부터 알 수 있는 바와 같이, Nurr1단독발현에 의해 분화된 TH+ 도파민 세포는 분화기간 동안 그 수가 현저히 감소하였으나 Nurr1과 Foxa2동시발현에 의해 유도된 TH+도파민 세포수는 매우 잘 유도 및 유지되었다 (도6 a-e). 즉, Foxa2-발현은 TH+ 세포 수의 감소를 억제함을 알 수 있었다.

그리고, 생육가능한 세포의 총수를 위상차현미경하에 관찰하였다. 분해되고 응집된 아폽토시스 핵를 갖는 세포는 DAPI 염색으로 육안 관찰하였다. 세포 생존능력을 활성화된 캐스페이즈 3 (activatedcaspase 3) 검정 및 면역독성화학법을 사용하여 결정하였다.

분화 15일 째, 세포사멸성 핵을 가진 세포에 의해 사멸 세포(apoptotic cells)를 측정하고, 케스파제(caspase) 3+ 세포들을 분리해냈다(Scale bar, 20 μm) (도6 f-k). 알 수 있는 바와 같이, Nurr1 (e) or LacZ (j, k)-형질도입된 대조군과 현저한 차이를 보였다(P <0.05, Student’s t-test)

즉, 이를 통해, 상기 세포수 변화의 차이는 세포사멸의 차이에 의함을 apoptotic nuclei 및 caspase3+ 세포수 측정에 의해 확인할 수 있었다.

한편, E14 랫트 대뇌피질 NPC를 형질도입 후 6일동안 분화시키고 H₂O₂ (25-200μM) 또는 MPP+ (5-500 μM)를 24시간동안 처리하였다. H₂O₂-처리된 경우 세포 생존성은 MTT분석에 의해 측정하였고(l; n=6), 사멸세포 핵을 가진 세포수는 직접 계수하였다(m; n=6) 미처리된 대조군에 대한 상대적인 % MTT 값을 도 6 l에 나타내었다. 또한, MPP+-처리한 경우를 TH에 대해 면역염색한 후, 살아있는 TH+ 세포들을 계수하였다. 도 6 o에 나타낸 그래프는 미처리한 경우의 퍼센트로서 표시하였다. 이의 one-way ANOVA plus post hoc Dunnett’s test 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 각 독성 농도에서 대조군과 비교하여 현저한 차이를 나타냈다(P <0.05)

즉, 도 6 l-o에서 알 수 있는 바와 같이, Foxa2-발현 세포는 H₂O₂ (25-200μM) 또는 MPP+ (5-500 μM) 처리에 의해 유도된 독성 자극(toxic stimuli)에 저항성을 가지는 것이 확인되었다.

한편, 신경세포 성장인자들의 Foxa2-매개된 상향 조절 발현에 관해 알아보았다. 세포 생존 인자 BDNF, GDNF, NT3, 및 SHH의 mRNA 발현 수준을 Real-time RT-PCR 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 도6 p에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군과 비교하여 Foxa2 발현의 경우 상기 생존인자들의 발현도 현저히 증가함을 확인할 수 있었다(P <0.01, n=3)

상기와 같은 결과들은 Foxa2에 의해 세포생존능이 향상됨을 보여준다.

즉, Foxa2는 분화중인 또는 분화된 도파민 신경세포의 세포 사멸을 억제하여 생존을 촉진하고, 파킨슨 독소인 H₂O₂ 및 MPP+에 의해 유도되는 세포 사멸도 억제한다(도6 l-o). Foxa2는 신경줄기세포 및 신경세포의 세포생존인자로 알려진 BDNF, GDNF, NT-3, SHH유전자 발현을 증가시키는바(도6 p), Foxa2에 의한 상기 세포 생존효과가 이와 같은 유전자 발현 유도에 의함을 추측할 수 있다.

실시예 3 : In Vivo 이식

Nurr1+Foxa2 과발현된 신경줄기세포를 파킨슨모델쥐의 선조체에 이식하고 세포 치료효과를 관찰하였다. E14 랫트 대뇌피질 유래 NPC에 Nurr1 (N) 및 Nurr1+Foxa2 (N+F)를 형질도입하고 성인 랫트 뇌의 선조체에 이식하였다.

6-하이드록시-도파민 (6-OHDA)-병변된 PD 랫트의 선조체에 후-형질도입 및 이식 후 2일 째 신경전구세포를 수득하였다. 이식 후 8주 동안 일정한 간격으로 4 경우에 대해서 암페타민-유도된 회전 불균형을 평가하였다. 이식체 부피 및 전체 TH+ 세포를 확인하였다.

우선, N (n=6) 및 N+F (n=10)가 형질도입된 NPCf를 이식한 모의-수술(sham-operated)(PBS-injected, n=6) 동물에서 암페타민-유도된 회전 불균형 실험으로 행동 회복성을 평가하였다.

그 결과를 도 8의 a에 도시하였다. 중앙 및 아래 그래프는 각각 N- 및 N+F-세포가 이식된 개개의 동물의 절대적인 회전 수를 나타낸다. 그리고 위의 그래프는 이식전 값과 비교한 회전 스코어에서 %변화의 평균±SEM 값을 나타낸다. N과 N+F의 경우 행동 회복성의 현저한 차이를 확인할 수 있었다. 즉, 암페타민 유도된 회전 불균형 테스트(Ampetamine-induced rotation test)에서 대조군 (Sham)과 Nurr1 단독 발현 신경줄기세포 이식쥐(N)에서는 회전 스코어(rotation score)가 의미있게 변화하지 않았으나, Nurr1+Foxa2 과발현 신경줄기세포를 이식한 쥐(NF)에서는 그 score가 현저히 감소하였다.

도 8의 b와 c는 이식 8주 후, N-(b 및 b’), N+F (c 및 c’)-형질도입된 세포들에 의해 생성된 TH+ 세포들의 공초점 이미지 사진이다(35 μm in z). 도8 b와 c의 점선 박스 영역을 확대하여 도8 b'와 c'로 나타냈다. 이식된 도파민신경세포는 형태학상 완숙한 신경세포의 모양을 보였다.

도 8의 d와 e는 이식 2주 후의 세포증식 마커 PCNA+ 세포들에 대한 사진이다. 이식 경계는 점선으로 표시하였다. 앞서 살핀 도 4의 in vitro 결과와 같이, 증식세포 마커인 PCNA+ 세포수는 Nurr1+Foxa2 이식 뇌조직에서 현저히 낮게 나타났다.

도 8의 f-i 그래프는 이식체 부피(graft volum)(f), 전체 생존 세포(g), TH+ 세포수(h) 및 PCNA+ 세포의 %를 나타낸다. N-세포 이식체와 N+F 세포 이식체의 결과 차이가 현저함을 확인할 수 있었다(P <0.001, Student's t-test, n=6 (N) 및 10 (N+F)). 즉, 면역화학검사상 Nurr1단독 발현세포 이식 부위에 비해 Nurr1+Foxa2 과발현 세포이식 뇌조직 부위에서, 이식체 부피(graft volume)(도8 f), 생존한 세포수 (도8 g)의 증가와 함께 TH+ 도파민신경세포의 수 (Fig. 8b-c, h)가 현저히 증가하였다.

그리고, 이식체에서 GFP(green fluorescent protein)-표지된 공여세포를 도 8의 j에 나타냈다. 공여세포는 N(Nurrl-IRES-GFP)+F로 형질도입함으로써 GFP로 표지하고, 이식 2주째에 GFP/DAPI(왼쪽) 및 GFP/TH(오른쪽)에 대해 염색하였다.

도 8의 k-m은 N+F 세포 이식에 의해 생성된 TH+ DA세포의 중뇌(midbrain) 및 A9 nigral 형태학적 발현을 나타내는 사진이다. N+F 이식체를 TH/Nurr1 (k), TH/GirK2 (l) 및 TH/Ptx3 (m)에 대해 염색하였다. 공통 표지된 세포들을 화살표로 나타내었다(Scale bars, 70 μm). 이를 통해 N+F 세포 이식에 의해 생성된 DA세포는 TH+ DA세포의 중뇌(midbrain) 및 A9 nigral 형태학적 발현을 보임을 확인할 수 있었다.

Claims (14)

1. 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 중뇌특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 신경전구세포는 배아 또는 성체 줄기세포로부터 분화시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 신경 전구세포는 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 분리된 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법
   
5. 제1항에 있어서, 상기 도입은 바이러스 벡터를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 도입은 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 FoxA2는 티로신 수산화 효소(TH)를 코딩하는 유전자 발현용 프로모터에 직접 결합되는 것을 특징으로 하는, 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 도파민 신경세포로의 분화는 그 과정 중 wnt-3a, corin, lmx1b, Nurr1, Ptx3, AHD2, 및 GirK2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, 및 DAT 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 FoxA2는 도파민 신경세포 생존인자인 BDNF, GDNF, NT-3 및 SHH로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 FoxA2는 세포분열 억제인자인 p15, p16, p21, p27 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
    
12. FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 치료용 조성물.
13. 삭제
14. 삭제

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