KR102206657B1 - 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 시간적 제어를 기반으로 세포에 도입함으로써 염색체 안정성이 유지되는 도파민 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 도파민 신경세포로의 분화방법은 도파민 신경세포 유도 전사인자를 종래 레트로바이러스 벡터를 이용한 방법과 달리 유전자 변형의 위험이 없는 mRNA 형태로 합성 및 도입함으로써 성숙하고 기능적인 염색체 안정형 도파민 신경세포를 제조할 수 있는바, 파킨슨 질환의 치료를 위한 임상분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법{Method for differentiation of dopamine neurons from neural stem cells or neural precursor cells and use thereof}

본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 시간적 제어를 기반으로 세포에 도입함으로써 염색체 안정성이 유지되는 도파민 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

파킨슨 질환(Parkinson’s disease; PD)은 운동불능, 경직, 떨림과 같은 운동 장애를 동반하는 중추 신경계 퇴행성 뇌 질환으로, 중뇌 흑색질에 존재하는 도파민 신경세포의 점차적인 사멸로 인해 줄무늬체에 도달해야 하는 도파민 신경세포의 감소가 발병 원인으로 알려져 있다.

현재 파킨슨 질환의 치료법으로는 도파민 전구물질인 levo-DOPA(L-DOPA)를 투여하는 방법이 있으나, 이는 메스꺼움, 안절부절못함, 수면장애, 저혈압, 상동적 운동, 환각과 망상 등의 부작용이 있고, 그 외의 방법들 또한 일시적으로 증세를 호전시키는 수준의 효과를 갖는다. 그러나 약 15년 전 도파민 신경세포가 포함되어 있는 사산된 사람 태아의 뇌조직을 파킨슨 질환 환자에게 이식하였을 때, 도파민 신경전달이 회복되어 줄무늬체로 도파민 신경세포의 도달이 가능해졌고, 이로 인해 몇몇 파킨슨 질환 환자에서 운동 불능 증상의 개선이 관찰되었다(NeuroRX, October 2004, Volume 1, Issue 4, pp 382?393). 이러한 결과로 손실된 세포를 외부로부터 이식하여 증상 호전을 기대하는 세포 치료의 개념이 도입되었다. 그러나 이것 또한 윤리적, 기술적 문제를 동반하게 됨에 따라 이러한 문제점을 해결하기 위해 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산할 수 있고, 분화 자극에 따라 각각 다른 특정세포로 분화할 수 있는 유연성을 가지는 신경줄기세포를 이용한 세포치료법 연구가 대두되었다. 기존의 신경줄기세포를 이용하여 도파민 신경세포를 유도하기 위한 방법으로는 레트로바이러스(Retrovirus)를 이용하는 방법이 알려져 있다. 하지만 상기 방법은 유전자 변형의 위험성, 돌연변이 발생이라는 문제점으로, 더 나아가 임상적용에는 적합하지 않은 한계점이 있다. 따라서, 역분화 줄기세포 연구에서 이용된 RNA, 단백질(Protein)을 기초로 한 유전자 전달 방법이 DNA-free한 도파민 신경세포를 발생시키는 적절한 방법으로 주목받았다. 그러나 단백질 전달 방법은 희망하는 유전자를 발현시키는데 있어서 많은 양의 단백질을 준비 및 정제해야 해야 했고, RNA 전달 방법은 RNA 바이러스를 이용했기 때문에 virus-free한 상태를 유지하기 위한 추가적인 선별 단계가 필요한 한계점이 있다.

이에 새로운 효율적 유전자 발현 기법을 통해 신경줄기세포로부터 안정한 도파민 신경세포를 분화시킬 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하고 신경줄기세포 또는 신경전구세포로부터 도파민 신경세포를 효율적이고 안정적으로 분화시키기 위한 방법을 연구한 결과, 신경줄기세포에 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 도입함으로써 염색체 안정성이 유지되는 기능적인 도파민 신경세포의 분화가 가능함을 발견하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법 및 상기 분화방법에 의해 제조된 도파민 신경세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 도입하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 도파민 신경세포 유도 전사인자는 Nurr1(Nuclear receptor related 1) 또는 FoxA2(Forkhead box protein A2)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 mRNA 도입 전, 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 5일 내지 10일 동안 도파민 신경세포로의 분화를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA는 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 도파민 신경세포에 1일 내지 2일 간격으로 반복 도입될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 제조된, 도파민 신경세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 도파민 신경세포를 포함하는, 파킨슨 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 도파민 신경세포로의 분화방법은 도파민 신경세포 유도 전사인자를 종래 레트로바이러스 벡터를 이용한 방법과 달리 유전자 변형의 위험이 없는 mRNA 형태로 합성 및 도입함으로써 성숙하고 기능적인 염색체 안정형 도파민 신경세포를 제조할 수 있는바, 파킨슨 질환의 치료를 위한 임상분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1a는 본 발명에 따른 도파민 유도 전사인자 mRNA를 합성하기 위한 형판(template)인 플라스미드 DNA의 구조이며, 도 1b는 상기 플라스미드 DNA가 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 통해 mRNA로 발현되는 과정을 도시한 것이다.
도 2는 HEK293 세포 또는 랫트 신경줄기세포(rat NPCs) 내로 도입된 mRNA의 단백질 발현 여부를 검증한 것으로, 도 2a는 실험방법을 도시한 것이고, 도 2b는 상기 세포 내로 각각 도파민 유도 전사인자인 Nurr1 또는 FoxA2 mRNA를 도입한 후 면역세포화학염색법을 통해 단백질 발현수준을 확인한 결과 및 cAMP에 의한 발현수준 증가를 보여주는 결과이다.
도 3은 세포 내로 도입된 mRNA에 의한 단백질 발현 유지여부를 검증한 것으로, 도 3a는 실험방법을 도시한 것이고, 도 3b는 랫트 신경줄기세포(rat NPCs)에 Nurr1 mRNA를 도입한 후 분화기간(diff. 0, 1, 2, 및 3) 동안 단백질 발현수준이 감소하는 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 세포 내로 반복적인 mRNA 도입에 따른 도파민 신경세포 분화여부를 검증한 결과로서, 도 4a는 실험방법을 도시한 것이고, 도 4b는 랫트 신경줄기세포(rat NPCs)에 Nurr1 mRNA를 반복적으로 도입(N mRNA)하면서 분화 3일(diff. 3) 및 7일째(diff. 7)에 도파민 신경세포로의 분화를 확인한 것이며, 이때 FoxA2를 추가 발현시키는 경우 분화효율이 유의하게 증가함을 보여주는 결과이다.
도 5는 세포 내로 반복적인 mRNA 도입에 따른 영향을 검증한 것으로서, 도 5a는 실험방법을 도시한 것이고, 도 5b는 랫트 신경줄기세포(rat NPCs)에 Nurr1 mRNA를 반복적으로 도입(N mRNA)한 결과 분화 7일(diff. 7)째부터 도파민 신경세포의 세포사멸이 유도됨을 보여주는 결과이다.
도 6은 시간적 제어를 기반으로 한 반복적인 mRNA 도입에 따른 도파민 신경세포의 분화효율을 검증한 결과로서, 도 6a는 실험방법을 도시한 것이고, 도 6b는 분화시작 7일째부터 Nurr1 또는 FoxA2 mRNA를 각각 랫트 신경줄기세포(rat NPCs)에 반복 도입하면서 분화기간(diff. 10, 16, 22, 및 28) 동안 관찰한 결과 단백질 발현 유지 및 도파민 신경세포 분화효율 증가를 확인한 결과이다.
도 7은 상기 도 6의 방법으로 분화시킨 도파민 신경세포의 특성 및 기능성을 검증한 것으로서, 도 7a는 실험방법을 도시한 것이고, 도 7b 내지 도 7e는 도파민 신경세포의 특이적 마커(TH, AADC, DAT, VMAT2, 및 Lmx1A) 발현(도 7b 및 도 7c), 도파민 분비능(도 7d), 및 활성 나트륨 전류와 활동전위 발화(도 7e)를 확인한 결과이다.
도 8은 레트로바이러스 벡터를 이용한 Nurr1 유전자 도입과 비교하여 본 발명에 따른 Nurr1 mRNA 도입에 의해 분화된 도파민 신경세포의 염색체 안정성을 보여주는 결과이다.

본 발명자들은 신경줄기세포에 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 도입하여 성숙하고 기능적인 염색체 안정형 도파민 신경세포의 분화가 가능함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 도입하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법 및 상기 분화방법에 의해 제조된 도파민 신경세포를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “분화(differentiation)”란 초기 단계의 미분화 상태의 줄기세포가 각 조직으로써의 특성을 갖게 되는 과정을 일컫는 것으로서, 본 발명의 목적상 신경줄기세포 또는 신경전구세포가 도파민 신경세포로서의 특성을 지니게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “신경줄기세포(Neural stem cells)”는 신경세포(neuron) 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능을 갖는 세포를 의미하며 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는 50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 다양한 출처에서 수득하는 것이 가능하며 바람직하게는 인간, 마우스, 또는 랫트와 같은 포유류에서 얻을 수 있고 보다 바람직하게는 배아, 성체조직, 태아조직, 배아줄기세포(ES)로부터 유래될 수 있다.

또한 “신경전구세포(Neural precursor cells)”는 성숙한 신경세포인 자손을 생성할 수 있는 세포로서, 배아줄기세포 또는 성체줄기세포나 신경줄기세포로부터 분화시켜 사용할 수도 있고, 또는 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 직접 분리하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “도파민 신경세포(Dopamine neuron)”는 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase; TH)를 발현하는 신경세포를 의미한다. 도파민 신경세포는 중뇌 흑색질에 특이적으로 위치하고, 생체 내에서 선조체, 변연계 및 신피질을 자극하여 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다. 특히, 실제로 체내에서 도파민성 신경세포로 기능하기 위해서는 중뇌 특성을 나타내야만 한다.

본 발명에 있어서, 상기 도파민 신경세포 유도 전사인자는 Nurr1(Nuclear receptor related 1) 또는 FoxA2(Forkhead box protein A2)일 수 있다.

본 발명에 따른 Nurr1 또는 FoxA2를 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 Nurr1 또는 FoxA2를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 Nurr1은 중뇌 도파민성 신경세포에서 발현되는 스테로이드/갑상선(steroid/thyroid) 호르몬 수용체에 속하는 전사인자로서, 도파민성 신경세포에서 발현되어 중뇌 도파민성 신경세포의 발생에 역할을 할 것이라 여겨지고 있다. Nurr1의 변이는 파킨슨 질환, 조현병, 및 조울증을 포함하는 도파민성 기능이상과 관련된 장애와 연관이 있으며, 상기 유전자의 발현조절 이상은 류마티스 관절염과 관련되어 있다고 알려져 있다.

상기 FoxA2은 중추 신경계에서 발현되는 전사인자로서, 중뇌 도파민성 신경세포 발달과의 연관성은 거의 알려진 바가 없으나 도파민 신경세포의 발달 및 유지에 필요한 전사인자로 알려져 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Nurr1 mRNA만을 신경전구세포에 단독으로 도입하는 경우에 비해 FoxA2를 함께 도입하였을 때 도파민 신경세포로의 분화효율이 현저히 증가하는 것으로 나타났다(도 4b 참고).

본 발명에 있어서, 상기 mRNA의 도입은 발현하고자 하는 유전자를 messenger RNA로 합성시켜 전달하는 방법을 의미한다. 이는 기존의 염기성분인 CTP, UTP가 아닌 각각 변형(modification)된 5-메틸시티딘(5-methylcytidin), 슈도우리딘(pseudouridine)을 포함시켜 mRNA가 세포에 도입 되었을 때 선천 항바이러스 면역반응(innate antiviral response)에 대응할 수 있도록 하며, 이러한 mRNA 도입을 통한 유전자 발현 방법은 간단하고, 유전자 변형 위험성이 없으며, 높은 유전자 제어에 의한 훌륭한 전환 효율이라는 장점을 가진다.

상기 mRNA는 mRNA를 합성하도록 제작된 플라스미드 DNA를 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 통해 합성 및 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 도파민 신경세포 유도 전사인자인 Nurr1 및/또는 FoxA2 mRNA의 도입 전, 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 5일 내지 10일 동안 도파민 신경세포로의 분화를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 mRNA를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 1일 내지 2일, 바람직하게는 1일 간격으로 반복 도입함으로써 도파민 신경세포로의 분화를 성공적으로 유도할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 mRNA의 세포 내 도입은 DNA-칼슘 침전법, 리포좀을 이용하는 방법, 폴리아민 계열을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 레트로바이러스를 이용하는 방법, 아데노바이러스를 이용하는 방법 등 당분야에 공지된 유전자의 세포 내 도입기술을 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 리포좀 매개 방법을 이용하였다.

본 발명자들은 실시예를 통해 상기 mRNA 도입법을 통한 도파민 신경세포의 분화효율 및 분화된 도파민 신경세포의 기능성을 실험적으로 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는, HEK293 세포 및 신경줄기세포에 각각 Nurr1 또는 FoxA2 mRNA를 도입한 결과 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(실시예 2 참고). 또한, 상기 발현이 유지되는지 검증한 결과 분화 1~2일 내에 단백질 수준이 감소하는 것을 관찰함으로써 상기 mRNA를 반복적으로 도입하는 방법을 이용함으로써 분화 7일째까지 분화된 도파민 신경세포를 확인하였다(실시예 3 참고).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 방법으로 분화를 진행한 결과 7일 이후 도파민 신경세포의 사멸이 유도되는 것을 관찰하였으며, 이를 해결하기 위해 시간적 제어를 기반으로 하는 mRNA 도입법을 이용하였다. 보다 구체적으로 신경줄기세포의 도파민 신경세포로 분화 시작 7일 후 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 반복적으로 세포에 도입한 결과 상기 전사인자의 단백질 발현 유지 기간 및 도파민 신경세포 수가 증가한 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 분화방법으로 제조된 도파민 신경세포의 특성 및 기능성을 검증한 결과 도파민 신경세포의 특이적 마커의 발현, 도파민 분비, 및 전기생리학적 특성을 확인함으로써 성숙하고 기능성의 도파민 신경세포로의 분화가 성공적으로 이루어진 것을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 mRNA 도입 방법 및 종래 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입방법을 통해 각각 도파민 신경세포로의 분화를 유도한 결과 레트로바이러스 벡터와 달리 mRNA를 도입한 경우 상기 신경세포의 염색체 안정성이 유지되는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).

상기 실시예로부터 본 발명의 분화방법에 따라 염색체 안정성이 유지되는 성숙한 기능성의 도파민 신경세포를 제조할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

상기 세포치료제는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 랫트 신경줄기세포(rat NPC) 분리

실험 동물들은 한양대학교의 실험동물운영위원회(IACUC, 2016-0194A)의 지침에 따라 사육 및 처리하였다. Rat NPC(Neural precursor cells)는 Sprague-Dawley(SD) 랫트(DaeHan BioLink)의 태령 14.5일된 태아의 대뇌피질(cortex)로부터 얻었다. 이후 랫트의 대뇌피질 조직으로부터 분리한 신경줄기세포를 37℃, 5% CO2에서 15 mg/mL 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithine; PLO, Sigma-Aldrich) 및 1 mg/mL 피브로넥틴(fibronectin; FN, Sigma-Aldrich)으로 코팅된 배양접시 상에서 배양하였다.

다음으로, 상기 랫트 유래 신경줄기세포를 20 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF, R & D Systems)가 보충된 N2 배지에서 증식시키고 0.2 mM 아스코르빈산(ascorbic acid, Sigma-Aldrich), 20 ng/mL 뇌유래신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF, R&D Systems), 20 ng/mL 교세포유래신경영양인자(glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF, R&D Systems) 및 250 mg/mL dibutyryl-cAMP(db-cAMP, Sigma-Aldrich)가 보충된 N2 배지에서 분화시켰다. 또한 합성된 mRNA를 트랜스펙션(transfection)하기 전에 db-cAMP, 10 mM Forskolin(Sigma-Aldrich) 및 5 mM NKH477(Sigma-Aldrich)와 같은 cAMP 유도체들을 랫트 유래 신경줄기세포에 처리하였다. 이후 합성된 mRNA를 트랜스펙션 하여 세포 내로 도입한 다음, 200 ng/mL의 B18R(인터페론-감마 억제제, eBioscience)를 첨가하였다.

1-2. 플라스미드 구조체

mRNA 합성을 위한 벡터인 pcDNA/UTR120A는 pcDNA3.1(+)(Invitrogen) 플라스미드를 이용하여 제작하였다. 보다 구체적으로, pcDNA3.1+의 일부 제한효소 부위 (896-930 bp, 980-992 bp)를 제한 효소 NheI, BamHI, NotI 및 XbaI로 대체하였고, 합성 된 5’ UTR, 5’ UTR 역방향, 3’ UTR, 3’ UTR 역방향, 120 pA 및 120 pA 역방향 올리고머(IDT)를 어닐링하고 pcDNA3.1(+)의 T7 프로모터 뒤에 삽입하였다. 또한 eGFP, FLAG가 접합된 Nurr1 및 HA가 접합된 FoxA2 유전자는 pcDNA/UTR120A의 5’ UTR과 3’ UTR 사이에 삽입하였다.

1-3. mRNA 합성

eGFP/UTR120A, Nurr1(FLAG)/UTR120A 및 FoxA2(HA)/UTR120A 구조물들을 EcoRV(Takara Bio) 제한 효소를 이용해 선형화시킨 다음 이를 주형으로 하여 MEGAscript T7 Kit(Ambion)를 이용해 mRNA 합성을 진행하였다. 이후 전사 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 시험관 내에서 배양하고 변형된 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)인 5’-메틸시티딘(methylcytidine) 및 슈도우리딘(pseudouridine)(Trilink Bio technologies)을 첨가하여 변형된 mRNA를 생산하였다. 다음으로 DNase를 37℃에서 15분 동안 처리하고 합성된 mRNA에 ScriptCap m7G Capping System, 2’-O-메틸전달효소(methyltransferase) 및 폴리 (A) 중합효소(poly (A) polymerase)(Epicenter, 현재 CELL®SCRIPT에서 사용 가능)를 첨가하여 5’ 캡핑 및 폴리 A 테일링을 수행하였다. 마지막으로, mRNA를 2.5 M 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)(Ambion)로 침전시키고 RNA 저장 용액(Ambion)에 용해시킨 다음 -70℃에서 냉동 보관하였다.

1-4. mRNA Transfection

트랜스펙션 하루 전에 항생제가 포함되지 않은 증식 배지가 들어있는 PLO/FN로 코팅된 24-well 플레이트의 슬라이드 글라스 위에 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포(NPC)(50,000 cells/Ø12 mm)를 씨딩하였다. 이후 합성된 mRNA와 트랜스펙션 시약인 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 Opti-MEM 배지(Invitrogen)에서 각각 희석하고 실온에서 5분 동안 놓아둔 다음, 상기 두 가지 용액을 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양하였다. 배양된 혼합물을 상기 랫트 유래 신경줄기세포에 처리하고 3 시간 후 혼합물을 증식 배지 또는 재조합 단백질 B18R이 첨가된 분화 배지로 교체하였다.

1-5. RT-PCR 및 Real-Time PCR

cDNA를 합성하기 위해, TRI REAGENT(Molecular Research Center)를 사용하여 랫트 유래 신경줄기세포로부터 RNA를 추출한 다음 추출된 5 ug의 total RNA에 대하여 Superscript Kit(Invitrogen)를 사용해 cDNA를 합성하였다. 이후 합성된 cDNA를 증폭에 사용하였고, 1.5% 아가로오스겔 전기영동을 통해 앰플리콘(amplicon)의 동일성을 확인하였다.

Real-time PCR 분석은 종래의 방법에 따라 수행하였고, iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 사용해 CFX96 real-time system에서 실시하였으며, 상기 Real-time PCR 반응 조건은 60℃ 어닐링 온도와 45사이클 반복으로 설정하였다. 상기 RT-PCR 및 Real-time PCR에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1 및 표 2에 각각 나타내었다.

유전자	방향	서열 (5'-3')	서열번호
eGFP	Forward	ACCCTCGTGACCACCCTGACCT	1
	Reverse	ACCATGTGATCGCGCTTCTCGT	2
Nurr1	Forward	TTCTCCTTTAAGCAATCGCCC	3
	Reverse	AAGCCTTTGCAGCCCTCACAG	4
FoxA2	Forward	GCTCCCTACGCCAATATCAA	5
	Reverse	CCGGTAGAAAGGGAAGAGGT	6
TH	Forward	AGCCCCCACCTGGAGTATTTTG	7
	Reverse	AGCAATCTCTTCCGCTGTGTATTC	8
VMAT2	Forward	GCACACAAAATGGGAAGGTGGC	9
	Reverse	CATTTTTTCCTCCTTAGCAGGTGG	10
Actin	Forward	TGAGAGGGAAATCGTGCGTG	11
	Reverse	GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG	12

유전자	방향	서열 (5'-3')	서열번호
TH	Forward	AGCCCCCACCTGGAGTATTTTG	7
	Reverse	AGCAATCTCTTCCGCTGTGTATTC	8
AADC	Forward	GCCTTTATCTGTCCTGAGTTCCG	13
	Reverse	TGATGAGTCCTGAGTCCTGGTGAC	14
DAT	Forward	GCTGGCACATCTATCCTCTTTGG	15
	Reverse	CAATGCCCACGACCACATAC	16
VMAT2	Forward	GCACACAAAATGGGAAGGTGGC	9
	Reverse	CATTTTTTCCTCCTTAGCAGGTGG	10
Lmx1A	Forward	CAGCCTCAGACTCAGGCAAAAGTG	17
	Reverse	GAACCACACCTGAACCACAC	18
Actin	Forward	TGAGAGGGAAATCGTGCGTG	11
	Reverse	GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG	12

1-6. 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)

배양된 세포를 4% 포름알데히드(formaldehyde, Sigma-Aldrich)로 고정시킨 다음, 상기 고정된 세포에 0.1% BSA/PBS, 10% 정상 염소 혈청(NGS, Pel-Freez) 및 0.03% Triton X-100(Sigma-Aldrich)을 1시간 동안 처리하였다. 이후 1차 항체를 처리하여 4℃에서 밤새 배양한 다음, 바이오틴이 접합된 2차 항체(Vector Laboratories) 또는 형광(DTAF, Rhodamin 또는 Cy3)이 표지된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Labora tories)를 처리하였다. 다음으로 DAPI(Vector Laboratories) 마운팅 배지를 포함하는 VECTASHIELD로 슬라이드 글라스를 마운팅하였으며, 염색된 세포를 epifluorescence 현미경(Leica Microsystems) 또는 공초점 현미경(Leica Microsystems)으로 시각화하였다. 또한 티로신 수산화효소를 발현하는 세포(TH+) 섬유의 길이는 Leica Application Suite(LAS) 이미지 분석 패키지를 사용하여 측정하였다.

1-7. 재조합 레트로바이러스 생산

본 발명자들은 이전 연구에서 개시한 레트로바이러스 벡터 pCL을 사용하였다. HA가 접합된 FoxA2 또는 비어있는 레트로바이러스 구조물(retroviral construct)을 암호화하는 레트로바이러스 구조체를 Lipofectamine 2000을 사용하여 293GPG 패키징 세포에 트랜스펙션하였다. 72시간 후, 바이러스가 포함된 상청액을 10일 동안 수집하였고 2 mg/mL의 Polybrene(hexadimethrine bromide, Sigma-Aldrich)을 바이러스 상등액에 첨가한 다음 -70℃에서 보관하였다.

1-8. DA 분비 분석

도파민(Dopamine; DA) 분비 분석은 Dopamine Research ELISA Kit(Labor Diagnostika Nord)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 단, DA가 분비된 상청액을 24시간 동안 배양하거나 56 mM KCl로 30분 동안 자극시킨 두 가지 조건하에 수집하였다. DA 수준은 표준 제어로 생성된 표준 곡선을 기반으로 계산하였다.

1-9. 전기생리학적 분석

랫트 유래 신경줄기세포로부터 EPC 10 USB 증폭기(HEKA Elektronik)를 사용하여 실온(22 ± 1℃)에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하였다. 140 mM K-글루코네이트(K-gluconate), 5 mM 디-트리스-포스포크레아틴(di-tris-phosphocreatine), 5 mM NaCl, 4 mM MgATP, 0.4 mM Na2GTP, 15 mM HEPES, 및 2.5 mM Na-pyruvate로 구성된 용액으로 채울 때 피펫의 저항은 4-8 MU였고, KOH로 pH 7.3으로 조정하였다. 직렬 저항은 70%-80%로 보상되었으며, 전류는 2kHz에서 저역 통과 필터링되었고 10kHz에서 샘플링되었으며 60 mV의 전위를 나타내었다. 수조 용액은 95% O2 및 5% CO2로 포화된 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 1.25 mM NaHPO4 및 10 mM 글루코스를 포함하였다.

1-10. 세포 수 측정 및 통계분석

세포 수 측정(Cell counting)은 실험 조건 당 3개 웰에 대하여 웰 당 현미경 상의 10-15개 구역을 무작위로 선택하여 실시하였다. 각 실험은 독립적으로 최소 3회 수행하였다.

모든 실험 결과는 평균 ± 표준오차(mean ± SE)로 표시하였고, 데이터의 통계적 분석에는 대응표본 t 검정(paired t test)법을 사용하였다.

실시예 2. 합성된 도파민 유도 전사인자 mRNA의 세포내 도입에 의한 단백질 발현 확인

본 발명자들은 상기 실시예 1-1의 방법으로 분리한 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포를 도파민 신경세포로 분화시키기 위해, 도파민 유도 전사인자의 단백질 발현 수단으로써 상기 전사인자의 mRNA를 합성하여 상기 신경줄기세포 내로 도입하고자 하였다.

이를 위해, 먼저 도파민 유도 전사인자를 안정적으로 발현하는 mRNA를 합성하기 위하여 도 1a에 도시한 구조의 플라스미드 DNA를 각각 제작하였다. 구체적으로, 상기 플라스미드 DNA들은 각각 시험관내 전사(in vitro transcription)를 위한 T7 promoter(pT7), mRNA의 안정성을 위한 UTR(5’ UTR 및 3’ UTR) 및 poly A tail(120pA), 발현시키고자 하는 유전자(대조군: eGFP, 도파민 유도 전사인자: Nurr1 또는 FoxA2)가 포함되어 있다. 상기와 같은 구조를 갖는 플라스미드 DNA들은 도 1b에 도시한 바와 같이 제한효소를 통한 절단에 의해 선형의 형태를 띄게 되고(Cut DNA Template with Restriction enzyme), in vitro 전사(transcription) 과정과 capping, poly A tailing 과정을 통해 안정적인 mRNA로 합성된다.

본 발명자들은 상기 과정을 통해 합성된 mRNA가 실제로 세포 내에서 단백질로 발현되는지 검증하기 위해, 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 세포 내 높은 도입 효율을 가지는 HEK293 세포 및 랫트 유래 신경줄기세포(rat NPCs 또는 rNPCs)에 상기 합성된 mRNA 각각을 트랜스펙션하고 상기 실시예 1-6의 면역세포화학염색법에 따라 각 단백질의 발현수준을 관찰하였다.

도 2a의 과정에 따라 실험한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 단 한번의 mRNA 도입만으로 도파민 유도 전사인자인 NURR1 및 FOXA2 단백질이 발현되는 것을 관찰하였다. 또한 세포 내 mRNA의 안정성과 반감기를 증가시키기 위해 cyclic AMP(cAMP)를 함께 첨가한 결과 단백질의 발현수준이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 3. 합성된 mRNA 도입에 따른 세포 내 단백질 발현 유지 검증

상기 실시예 2의 결과에 더하여 세포 내로 도입된 mRNA에 의한 단백질 발현이 유지되는지 여부를 검증하기 위해 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 도파민 유도 전사인자인 Nurr1의 mRNA를 랫트의 신경줄기세포에 도입한 후 도 3a에 도시한 바와 같이 분화기간(diff. 1~diff. 3) 동안 단백질 발현수준을 관찰하였다.

그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 분화 3일째(diff. 3)까지 관찰하였을 때 세포 내에서 mRNA의 빠른 분해 때문에 도파민 유도 전사인자인 NURR1 단백질의 발현은 1~2일 정도만 유지되는 것을 확인하였다.

이러한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 도 4a에 도시한 바와 같이 세포 내 단백질의 발현이 유지되도록 Nurr1 mRNA를 1일 간격으로 반복적으로 트랜스펙션한 후, 분화 3일째(diff. 3) 및 7일째(diff. 7)에 면역세포화학염색법으로 도파민 신경세포로의 분화 여부를 관찰하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 Nurr1 mRNA를 반복적으로 세포 내로 도입(N mRNA TF)한 결과 도파민 신경세포의 특이적인 마커인 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase; TH)를 발현하는 도파민 신경세포로 분화되는 것을 확인하였고, 여기에 coactivator인 FoxA2 RNA를 레트로바이러스를 이용해 세포에 추가적으로 도입한 경우(N mRNA + F mRNA) 도파민 신경세포로의 분화가 현저히 증가된 것을 확인하였다.

실시예 4. 시간적 제어를 기반으로 한 세포 내 반복적인 합성 mRNA 도입 및 이의 효과 검증

본 발명자들은 상기 실시예 3에서와 같이 랫트 신경줄기세포에 도파민 유도 전사인자 mRNA를 반복적으로 도입하는 경우 세포에 영향을 미치는지 검증하기 위해 도 5a에 도시한 바와 같이 Nurr1 mRNA를 반복적으로 트랜스펙션하면서 분화 10일째(diff. 10)까지 관찰하였다.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 반복적인 mRNA 도입의 영향으로 도파민 신경세포 분화 7일 이후에는 도파민 신경세포의 세포사멸이 유도되어 9~10일 이후에는 상기 세포가 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 본 발명자들은 도파민 신경세포가 존재하는 중뇌에서 Nurr1의 발현은 지연된 발현(delayed expression) 패턴을 가진다는 것을 확인하고, 도파민 유도 전사인자인 Nurr1 및 FoxA2의 시간적 제어를 위해 delayed expression을 시도하였다. 보다 구체적으로 도 6a에 나타낸 바와 같이, 랫트 신경줄기세포의 도파민 신경세포로의 분화시작 후 7일째부터 도파민 유도 전사인자의 mRNA를 세포 내로 반복적으로 도입하였고, 분화 10일(diff. 10), 16일(diff. 16), 22일(diff. 22), 및 28일째(diff. 28)에 도파민 신경세포로의 분화 정도를 관찰하였다.

그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 NURR1 단백질의 발현수준 측정을 통해 상기 단백질 발현의 유지 기간이 더욱 증가한 것을 확인하였고, TH를 발현하는 세포(TH+) 수 및 TH fiber의 수와 길이를 측정함으로써 성숙한 도파민 신경세포가 증가된 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 도파민 신경세포 유도 전사인자 mRNA 도입에 의해 분화된 도파민 신경세포의 특성과 기능성 검증

상기 실시예 4의 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 랫트 태아의 대뇌피질로부터 분리된 신경줄기세포 내로 시간적 제어를 통해 도파민 유도 전사인자 mRNA를 도입하여 제조한 도파민 신경세포의 특성과 기능성을 관찰하고자 하였다.

이를 위해, 도 7a에 나타낸 과정에 따라 실험을 진행한 다음 먼저 분화 14일째(diff. 14)에 도파민 신경세포 마커(TH, AADC, DAT, VMAT2, Lmx1A)들의 발현을 각각 RT-PCR 및 quantitative real-time PCR로 관찰하였다. 그 결과 도 7b 및 도 7c에서 볼 수 있는 바와 같이 대조군 세포(N.C)와 비교하여 분화된 도파민 신경세포(Nr(L)Fr(L))는 상기 마커들을 모두 발현하는 것으로 나타났다.

다음으로 분화된 도파민 신경세포의 도파민 분비능을 확인하기 위해, 분화시작 15일째에 초기 도파민 신경세포(Nr+Fr) 및 후기 도파민 신경세포(Nr(L)+Fr(L))를 각각 24시간 동안 배양하거나 또는 56 mM의 KCl로 30분 동안 자극시킨 후 배양 상청액을 회수하여 도파민 수준을 측정하였다. 그 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이 Nr(L)+Fr(L)의 경우에 도파민 분비량이 유의하게 가장 높았으며 KCl로 자극시킨 경우와 비교하여 24시간 배양한 경우 현저한 차이를 나타내었다. 또한, 분화시작 22일째에 전기생리학적 실험을 실시한 결과 도 7e에 나타낸 바와 같이 활성 나트륨 전류(active sodium current)와 활동 전위 발화(action potential firing)를 확인하였다.

상기 결과들을 통해 분화된 도파민 신경세포가 그 특성 및 기능성을 모두 가지고 있는 성숙한 세포임을 알 수 있었다.

실시예 6. 도파민 신경세포의 염색체 안정성 유지 검증

본 발명자들은 본 발명에 따른 mRNA 도입을 통해 분화된 도파민 신경세포와 종래 다른 유전자 도입법을 통해 분화된 도파민 신경세포의 염색체 안정성을 비교하고자 하였다. 이를 위해, 레트로바이러스 벡터를 이용해 Nurr1 유전자를 도입하여 분화 유도한 도파민 신경세포(NURR1 retrovirus) 및 Nurr1 mRNA를 도입하여 분화 유도한 도파민 신경세포(NURR1 mRNA)로부터 각 유전자 도입 3일 후 genomic DNA를 추출하여 유전자 잔존 상태를 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 상기 바이러스 벡터를 이용한 경우에는 신경세포의 염색체에 레트로바이러스가 무작위 삽입되어 잔존함으로써 염색체 변형을 야기하는데 반하여, mRNA를 도입한 경우에는 염색체로의 유전자 삽입이 없어 염색체 안정성이 유지되는 것을 확인하였다. 이를 통해 기존의 바이러스 벡터를 사용하여 도파민 신경세포를 유도하는 방식과는 달리, mRNA를 이용하여 제조된 도파민 신경세포는 염색체 안정형 세포로서 임상적용에 탁월한 유효성과 안전성을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Method for differentiation of dopamine neurons from neural stem cells or neural precursor cells and use thereof <130> PD17-174 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eGFP_Forward <400> 1 accctcgtga ccaccctgac ct 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eGFP_Reverse <400> 2 accatgtgat cgcgcttctc gt 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nurr1_Forward <400> 3 ttctccttta agcaatcgcc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nurr1_Reverse <400> 4 aagcctttgc agccctcaca g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxA2_Forward <400> 5 gctccctacg ccaatatcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxA2_Reverse <400> 6 ccggtagaaa gggaagaggt 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH_Forward <400> 7 agcccccacc tggagtattt tg 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH_Reverse <400> 8 agcaatctct tccgctgtgt attc 24 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VMAT2_Forward <400> 9 gcacacaaaa tgggaaggtg gc 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VMAT2_Reverse <400> 10 cattttttcc tccttagcag gtgg 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_Forward <400> 11 tgagagggaa atcgtgcgtg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_Reverse <400> 12 gttggcatag aggtctttac gg 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AADC_Forward <400> 13 gcctttatct gtcctgagtt ccg 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AADC_Reverse <400> 14 tgatgagtcc tgagtcctgg tgac 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT_Forward <400> 15 gctggcacat ctatcctctt tgg 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT_Reverse <400> 16 caatgcccac gaccacatac 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lmx1A_Forward <400> 17 cagcctcaga ctcaggcaaa agtg 24 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lmx1A_Reverse <400> 18 gaaccacacc tgaaccacac 20

Claims (6)

1. (a) 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 배양하여 신경세포로의 분화를 유도하는 단계; 및
   (b) 상기 분화 유도 7일부터, 상기 배양된 세포에 도파민 신경세포 유도 전사인자의 mRNA를 도입하여 도파민 신경세포로 전환시키는 단계를 포함하는, 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법으로서,
   상기 도파민 신경세포 유도 전사인자는 Nurr1(Nuclear receptor related 1) 및 FoxA2(Forkhead box protein A2)인 것을 특징으로 하는, 분화방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 mRNA는 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 1일 내지 2일 간격으로 반복적으로 도입되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
   
5. 삭제
6. 삭제

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