KR101022349B1 - 중배엽간세포 혹은 ｅｓ세포, 또는 불사화한중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법 - Google Patents

Abstract

골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획으로부터 얻어진 중배엽간세포, 또는 ES 세포를 기본 배지에서 배양하면, 당해 중배엽간세포 또는 당해 ES 세포가 신경간세포, 신경세포 또는 아교세포로 분화유도 되는 것을 관찰하였다. 나아가, 상기의 기본 배지에 허혈뇌추출액(ischemic brain extract)을 첨가하는 것에 의하여, 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도가 촉진되는 것을 발견하였다. 또한, 상기 분화유도 방법에 의하여 얻어진 신경계세포는 뇌경색 모델, 치매 모델, 척수손상 모델, 탈수(demyelination)모델에 있어서, 신경재생 능력이 있는 것으로 판명되었다.

또한, 중배엽간세포에 있어서, 불사화유전자를 고발현 또는 활성화시키는 것에 의하여 당해 중배엽 세포를 불사화시키고 나아가 당해 세포를 적당한 조건 하에서 배양하는 것에 의하여, 신경계세포로 분화유도 하는 것이 가능하게 되었다. 본 발명의 방법은 신경재생 치료에 있어 대단히 유용하다.

중배엽간세포, 신경계세포, 분화유도

Description

중배엽간세포 혹은 ＥＳ세포, 또는 불사화한 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법{Method of inducing differentiation of mesodermal stem cells, ES cells or immortalized cells into nervous system cells}

본 발명은 중배엽간세포 또는 ES세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법, 불사화한 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법 및 그 이용에 관한 것이다.

희돌기교세포(稀突起膠細胞, oligodendrocyte)(Archer, DR. et al., Exp Neurol, 125, 268-77, 1994, Blakemore, WF. and Crang, AJ., Dev Neurosci, 10, 1-11, 1988, Gumpel, M. et al., Ann New York Acad Sci, 495, 71-85, 1987), 또는 슈완세포(Schwann cell)(Blakemore, WF., Nature, 266, 68-9, 1977, Blakemore, WF. and Crang, AJ., Dev Neurosci, 10, 1-11, 1988, Honmou, O. et al., J Neurosci, 16, 3199-208, 1996), 또는 olfactory ensheating cell(Franklin, RJ. et al., Glia, 17, 217-24, 1996, Imaizumi, T. et al., J Neurosci, 18(16), 6176-6185, 1998, Kato, T. et al., Glia, 30, 209-218, 2000) 등의 수초형성세포(myelin-forming cell)를 이식하면 동물모델에 있어서 재유수화(再有髓化, remyelination)가 유발되고, 전기생리학적 기능을 회복시킬 수 있다(Utzschneider, DA. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91, 53-7, 1994, Honmou, O. et al., J Neurosci, 16, 3199-208, 1996). 이러한 세포를 환자 혹은 타인으로부터 얻어 세포치료법(cell therapy)에 사용하고 있는 것도 불가능한 것은 아니지만, 조직재료를 뇌 또는 신경으로부터 재취하지 않으면 안되기 때문에 문제가 많다.

뇌로부터 얻어진 신경전구세포 또는 간세포(幹細胞)에는 자기 복제능력이 있어서, 여러 가지 계통의 신경세포(neuron)와 교세포(膠細胞, glial cell)로 분화하는 것이 알려져 있다(Gage, FH. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 92, 11879-83, 1995, Lois, C. and Alvarez-Buylla, A., Proc Natl Acad Sci USA, 90, 2074-7, 1993, Morshead, CM. et al., Neuron, 13, 1071-82, 1994, Reynolds, BA. and Weiss, S., Science, 255, 1707-10, 1992). 태아조직으로부터 채취한 사람 신경간세포를 갓 태어난 마우스의 뇌에 이식하면 신경세포와 성상세포(astrocyte)로 분화하기도 하고(Chalmers-Redman, RM. et al., Neurosci, 76, 1121-8, 1997, Moyer, MP. et al., Transplant Proc, 29, 2040-1, 1997, Svendsen, CN. et al., Exp Neurol, 148, 135-46, 1997) 또는 재유수화(remyelination) 시킬 수도 있다(Flax, JD. et al., Nat Biotechnol, 16, 1033-9. 1998). 탈수화(脫髓化, demyelination)한 설치류의 척수에 성인 뇌 유래의 신경전구세포를 이식하면 재유수화가 행해져서 임펄스의 전도를 회복한 사실이 보고되어 있다(Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 167: 27-39, 2001).

이들 연구는 상기 세포가 신경계질환의 회복에 이용될 수 있을지도 모른다는 것을 시사하고 있기 때문에 큰 관심을 끌고 있다(Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 167: 27-39, 2001, Chalmers-Redman, RM. et al., Neurosci, 76, 1121-8, 1997, Moyer, MP. et al., Transplant Proc, 29, 2040-1, 1997, Svendsen, CN. et al., Exp Neurol, 148, 135-46, 1997, Yandava, BD. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 7029-34, 1999).

이미 본 발명자 등은 사람 성인 유래의 신경세포를 뇌로부터 추출, 배양하고 셀라인화하여 그 기능을 검토하고, 당해 신경세포에는 자기복제기능과 다분화기능이 존재하는 것을 발견하였다(Akiyama, Y. et al., Exp Neurol, 167: 27-39, 2001). 즉, 뇌로부터 얻은 신경세포의 전구세포(progenitor cell)를 단일세포전개(single cell expansion)하고, 셀라인화한 것을 시험관 내(in vitro)에서 클론 분석을 행한 경우, 자기복제능(즉, 증식능)과 다분화능(즉, 뉴런(neuron), 교성상세포 (astrocytes), 희돌기교세포(oligodendrocytes)로의 분화)이 인지된 것으로부터 이 세포에는 신경간세포의 성질이 있음을 확인하였다.

실제로, 이 세포를 래트 허혈(虛血)모델(cerebral ischemic model), 외상모델(traumatic model)을 이용하여 이식실험을 행한 경우, 극히 양호한 생존률, 유주(遊走, migration), 분화를 보였다. 또한, 상기 세포를 척수탈수(脊髓脫髓)모델 래트(demyelination model rat)에 이식한 경우, 정상 기능을 하는 수초(myelin sheath)가 형성됨을 알았다. 즉, 척수 탈수모델 래트에 있어서 탈수된 신경축색이 재유수화(remyelination)되고 신경기능이 회복하는 것으로 당해 세포의 이식치료법의 효과를 조직학적, 전기생리학적, 행동과학적으로 확인하였다.

상기 사실로부터 판단하면, 자기의 대뇌로부터 소량의 신경조직을 채취하여 신경간세포를 추출, 배양하고 얻어진 신경간세포를 자기의 척수의 손상부위에 이식하는 것은 자가이식요법으로서 극히 응용성이 높은 치료법이 된다고 생각된다.

그러나, 대뇌로부터 신경간세포를 포함한 조직을 채취하는 것은 채취에 있어 신경장애가 발생하지 않는다고 말할 수는 있지만 용이한 것은 아니다. 따라서, 보다 안전하고 또 간단한 자가이식요법을 확립하는 것은 현재의 복잡한 각종 질환에 대응하는 치료법의 확립이라고 하는 점으로부터 극히 중요한 것이다. 이것에 대응하여 본 발명자 등은 도너 세포(donner cell)의 획득을 위하여 신경간세포의 채취기술보다 용이한 골수세포(bone marrow cell), 제대혈세포(umbilical blood cell), 또는 태아간세포(fetal hepatocyte)로부터 단핵세포 분획(mononuclear cell fraction) 등을 채취하는 기술을 개발하였다(특허출원 2001-160579). 즉, 본 발명자 등은 골수세포로부터 얻은 단핵세포 분획이 신경계세포로의 분화능을 갖는다는 것을 발견하였다. 나아가, 본 발명자 등은 당해 단핵세포 분획으로부터 분리한 중배엽간세포(mesodermal stem cell)를 포함하는 세포분획, 간질세포(interstitial cell)를 포함하는 세포분획 및 AC133 양성세포를 함유하는 세포분획이 신경계세포로의 분화능을 가지는 것을 발견하였다.

본 발명은 이러한 상황에 비추어 그 목적은 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법, 중배엽간세포를 증식시키는 것으로 충분한 양의 세포를 획득하고, 신경간세포 및 신경계세포로 효율적으로 분화유도 시키는 방법, 당해 방법에 의하여 얻어지는 신경계세포, 당해 신경계세포를 포함하는 신경계 질환의 치료를 위한 조성물, 및 당해 조성물을 이용한 신경계 질환의 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자 등은 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획에 포함된 중배엽간세포, 또는 ES 세포가 인비트로 계에 있어서, 신경계세포로의 분화를 유도하는 것을 새로이 발견하였다.

구체적으로는, 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획으로부터 얻은 중배엽간세포 또는 ES 세포를 배양액 1[DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%, bFGF(Basic fibroblast growth factor) 10 ng/㎖ 및 EGF(Epidermal growth factor) 10 ng/㎖을 매일 첨가)], 또는 배양액 2[NPBM(Neural Progenitor Basal Medium), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% hEGF(human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF(human fibroblast growth factor), bFGF 10 ng/㎖ 및 EGF 10 ng/㎖을 매일 첨가)]에서 부유(浮遊)한 그대로의 상태에서 5% CO₂, 37℃ 조건으로 배양하면, 당해 중배엽간세포 또는 ES 세포가 신경간세포로 분화하는 것을 발견하였다.

또한, 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획에 포함된 중배엽간세포, 또는 ES 세포를 배양액 1(DMEM 50%, F-12 50%, FSC 1%) 혹은 배양액 2[NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors(Clonetics), 0.2% hEGF(human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF(human fibroblast growth factor)]에서 배양하는 것에 의하여 당해 중배엽간세포 또는 ES 세포가 신경세포 또는 아교세포(glial cell)로 분화유도 되는 것을 발견하였다.

나아가, 상기의 배양액에 허혈뇌추출액(ischemic brain extract)을 첨가하는 것에 의하여 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도가 촉진되는 것을 발견하였다.

또한, 상기 분화유도 방법에 의하여 얻어지는 신경계세포의 신경재생능력에 관하여는 뇌경색 모델, 치매 모델, 척수손상 모델, 탈수 모델에 있어서 검토한 결과 뇌로부터 추출, 배양한 신경간세포와 같은 정도의 재생능력이 있음이 판명되었다.

이상의 결과로부터 뇌경색, 치매, 척수손상, 탈수질환 등의 치료에, 상기 분화유도 방법에 의하여 얻어지는 신경계세포를 사용하는 것이 가능하게 되었다. 또한, 본 발명은 보다 일반적으로, 넓은 영역의 뇌신경손상에 대응하는 신경이식, 재생요법으로의 응용도 가능하다고 생각된다. 즉, 중추신경계 및 말초신경계의 허혈성 뇌신경손상, 외상성뇌신경손상, 뇌신경변성질환, 대사성신경질환에의 자가이식요법에 응용가능하다.

나아가, 상기 분화유도 방법은 중배엽간세포와 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화기작을 푸는 열쇠를 제공하고 있다. 이러한 분화를 규정하는 유전자가 동정, 해석되면 그들 유전자를 이용하여 중배엽간세포와 ES 세포를 효율적으로 또한 충분한 양으로 신경계세포로 형질전환 시키는 것이 가능하게 된다. 따라서, 신경조직의 재생을 촉진하기 위한 유전자치료가 가능하게 될 것으로 크게 기대된다.

나아가, 본 발명자 등은 다량으로 안정하게 세포를 증식시킬 수 있는 신경계분화유도 방법의 개발에 성공하였다. 통상, 신경재생치료에 있어서 중배엽간세포가 유용하게 사용되지만, 배양조건 하에서의 증식은 어느 정도 제한된다는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명자 등의 연구에 의하여 인비트로에 있어서 스트로마 세포(stroma cell)에 틸로머라아제와 같은 불사화유전자(immortalization gene)를 삽입한 바이러스 벡터를 도입하면, 세포분열을 반복해도 세포의 증식이 계속되고 세포의 수명이 비약적으로 연장됨에도 불구하고 세포형상이 정상세포와 같은 것이 명백하게 되었다. 그리고, 본 발명자 등은 불사화유전자를 중배엽간세포에 도입하여 당해 세포를 불사화하는 것에 의하여 당해 세포를 안정화 하는 동시에 다량으로 증식시키는 것이 가능하다는 것에 착안하였다. 그리고 더욱 연구를 진행한 결과, 불사화유전자를 도입함으로써 불사화한 중배엽간세포를 적당한 조건 하에서 배양하는 것에 의하여 효율적으로 신경간세포 및 신경계세포로 분화유도 할 수 있음을 발견하였다.

구체적으로는, 불사화유전자인 hTERT 유전자를 중배엽간세포에 도입하는 것에 의하여 불사화한 중배엽간세포를 지방세포, 연골아세포, 골아세포 등으로 분화 유도시키는 것에 성공하였다. 나아가, hTERT 유전자도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포를 배양조건 하에서 고효율로 신경간세포를 포함하는 신경계세포로 분화를 유도하고 또한 이들 세포(중배엽간세포 그 자체, 중배엽간세포보다 분화유도한 신경계세포, 중배엽간세포보다 분화유도한 신경간세포를 분화유도한 신경계세포, 중배엽간세포보다 분화유도한 신경계세포)를 이식하는 것에 의하여 척수탈수 부위가 회복되는 것을 명확히 하였다.

또한, 불사화유전자를 도입한 중배엽간세포가 본 발명의 상기 방법에 의하여 분화유도된 신경간세포 및 신경계세포는 신경재생에 대단히 유용한 것으로 기대된다.

암 유전자 등을 도입하여 세포를 불사화한 경우, 세포 그 자체의 형질전환이 일어나는 것에 대하여, 본 발명에 있어서 불사화유전자를 도입하는 것에 의하여 세포를 불사화한 경우에는 원래 세포의 성질을 유지한 그대로이며 나아가 불사화유전자의 도입에서는 충분한 증식이 얻어진 후, 당해 유전자를 제거하는 것도 가능하다.

상기와 같이, 본 발명자 등은 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화를 유도시키는 효율적인 신규방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법, 중배엽간세포를 불사화시키고 이어 신경간세포를 포함하는 신경계세포로 효율적으로 분화유도 하는 방법, 당해 방법에 의하여 얻어지는 신경계세포, 당해 신경계세포를 포함하는 신경계 질환의 치료를 위한 조성물, 당해 조성물을 이용한 신 경계 질환의 치료방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는,

[1] 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획에 포함된 중배엽간세포, 또는 ES 세포를 기본 배지에서 33℃ 내지 38℃ 조건에서 배양하는 것에 의하여 신경계세포로 유도하는 방법,

[2] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 중배엽간세포를 신경계세포로 유도하는 방법,

(a) 불사화유전자를 고발현 또는 활성화시키는 것에 의하여 불사화한 중배엽간세포를 제공하는 공정,

(b) 공정 (a)의 불사화한 중배엽간세포를 기본 배지에서 배양하는 것에 의하여 당해 중배엽간세포를 신경계세포로 유도하는 공정,

[3] 불사화유전자를 중배엽간세포 내에 도입하는 것에 의하여 불사화유전자를 고 발현 또는 활성화시키는 [2]에 기재된 방법,

[4] 불사화유전자를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 중배엽간세포에 도입하는 것에 의하여 중배엽간세포를 불사화시키는 [3]에 기재된 방법,

[5] 레트로바이러스 벡터가 pBabe인 [4]에 기재된 방법,

[6] 신경계세포가 유전자 제거처리에 의하여 불사화유전자가 제거될 수 있고 또는 제거된 것인 [2] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[7] 불사화유전자의 유전자 제거처리가 불사화유전자를 loxP 배열(loxP sequence) 또는 loxP 모양 배열(loxP like sequence)에 삽입된 후 리콤비나아제 처리하는 것에 의하는 [6]에 기재된 방법,

[8] 불사화유전자가 틸로머라아제 유전자 틸로머라아제로부터 파생하는 유전자, 혹은 틸로머라아제의 발현 혹은 활성을 조절하는 유전자 중 어느 하나인 [2] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[9] 중배엽간세포가, 골수액, 제대혈, 말초혈, 피부, 피부의 모근세포, 근조직, ES 세포 또는 ES 세포로부터 파생하는 세포 중 어느 하나에서 유래하는 [2] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[10] 중배엽간세포가 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획에 포함되는 중배엽간세포인 [2] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[11] 단핵세포 분획이 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈을 2000 회전에서 비중에 상응하는 분리에 충분한 시간으로 용액 중에서 밀도구배 원심분리를 행하고 원심분리 후, 비중 1.07 g/㎖로부터 1.1 g/㎖의 범위에 포함되는 세포분획을 회수하는 것에 의하여 얻을 수 있는 세포분획인 [1] 또는 [10]에 기재된 방법,

[12] 중배엽간세포가 SH2(+), SH3(+), SH4(+), CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)의 특징을 가지는 세포인 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[13] 33℃ 내지 38℃의 조건에서 배양을 행하는 [2] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[14] 기본 배지에 bFGF(Basic fibroblast growth factor), EGF(Epidermal growth factor), 또는 허혈뇌추출액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [13] 중 어 느 하나에 기재된 방법,

[15] 신경계세포가 신경간세포, 신경전구세포, 신경세포 및 아교세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 [1] 내지 [14]에 기재된 방법,

[16] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의하여 얻어지는 세포,

[17] [16]에 기재된 세포를 포함하는 신경계 질환의 치료를 위한 조성물,

[18] 신경계 질환이 중추성 및 말초성의 탈수질환, 중추성 및 말초성의 변성질환, 뇌졸증, 뇌종양, 고차기능장애, 정신질환, 간질, 외상성의 신경계질환, 염증성질환, 감염성질환 및 척수경색으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 [17]에 기재된 조성물,

[19] [16]에 기재된 세포, 또는 [17]에 기재된 조성물을 수용자(recipient)에 이식하는 것을 특징으로 하는 신경계질환의 치료방법,

[20] 신경계질환이 중추성 및 말초성의 탈수질환, 중추성 및 말초성의 변성질환, 뇌졸증, 뇌종양, 고차기능장애, 정신질환, 간질, 외상성의 신경계질환, 염증성질환, 감염성질환 및 척수경색으로 구성되는 군으로부터 선택된 것인 [19]에 기재된 방법,

[21] 이식하는 세포가 수용자에서 유래하고 있는 [19] 또는 [20]에 기재된 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 있어서는, 우선 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획에 포함되는 중배엽간세포 또는 ES 세포를 기본 배지에서 33 ℃ 내지 38℃ 의 조건에서 배양하는 것에 의하여 신경계세포로 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 불사화유전자를 중배엽간세포로 도입하는 것에 의하여 다량의 중배엽간세포를 확보하고, 나아가 신경간세포 및 신경계세포로 효율적으로 분화유도할 수 있는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 중배엽간세포에 있어서 불사화유전자를 고발현 또는 활성화시키는 것에 의하여 당해 중배엽간세포를 불사화시키고 당해 세포를 배양하는 것에 의하여 신경계세포로 분화를 유도한다.

본 발명의 상기 방법에 있어서는, 우선, 불사화유전자를 고발현 또는 활성화시키는 것에 의하여 불사화한 중배엽간세포를 제공한다[공정 (a)].

본 발명에 있어서 중배엽간세포(mesodermal stem cell)라 함은, 발생학적으로 중배엽으로 분류되는 조직을 구성하고 있는 세포를 가리키며 혈액세포도 포함된다. 또한, 중배엽간세포라 함은 자기와 같은 능력을 갖는 세포를 카피(분열, 증식)할 수 있고, 중배엽의 조직을 구성하고 있는 전체 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 가리킨다. 중배엽간세포는 예를 들어 SH2(+), SH3(+), SH4(+), CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)의 특징을 갖는 세포이나, 이들 마커에 특히 제한되지 않는다. 또한, 소위 간엽계에 관련하는 간세포(mesenchyme-related stem cell)도 본 발명의 중배엽간세포에 포함된다.

간엽계에 관련하는 세포(mesenchyme-related cell)라 함은, 간엽계간세포, 간엽계세포, 간엽계세포의 전구세포, 간엽계세포로부터 유래하는 세포를 의미한다.

간엽계간세포(間葉系幹細胞)라 함은, 예를 들어, 골수, 말초혈, 피부, 모근, 근조직, 자궁내막, 혈액, 제대혈, 나아가 각종 조직의 초기 배양물로부터 얻을 수 있는 간세포이다.

간엽계세포의 전구세포라 함은, 간엽계간세포로부터 분화하고 간엽계세포로의 분화의 선상에 있는 세포를 의미한다.

간엽계세포는 간엽계간세포의 분화에 의하여 생기고 간세포와 같이 다방면으로 분화하는 능력은 없으나, 어느 방향으로의 분화능력과 증식능력을 가지고 있는 세포이다. 정상 상태에서는 G0기에 멈추어 있으나 자극에 의하여 G1기(분열개시)로 이행할 수 있는 세포이다. 간엽계세포는 예를 들어, 스트로마 세포, 스트로마 세포의 성질을 가지는 세포도 포함하고 있다. 간엽계세포는 피하조직, 폐, 간 등 여러 장기에 존재하여 골, 연골, 지방, 힘줄, 골격근, 골수간질이라고 일컫는 간엽계 조직에 존재하고 있다.

간엽계세포로부터 유래하는 세포라 함은 (1) 내피세포 또는 심근세포 등의 심혈관계의 세포 또는 심혈관계의 세포의 전구세포 및 이들 세포로서의 성질을 갖는 세포, (2) 골, 연골, 힘줄 또는 골격근 중 어느 하나의 세포, 및 골, 연골, 힘줄, 골격근 또는 지방조직 중 어느 하나의 세포의 전구세포, 나아가, 이들 세포로서의 성질을 갖는 세포, (3) 신경계의 세포 또는 신경계세포의 전구세포, 나아가 이들 세포로서의 성질을 갖는 세포, (4) 내분비세포 또는 내분비세포의 전구세포, 나아가 이들 세포로서의 성질을 갖는 세포, (5) 조혈세포 또는 조혈세포의 전구세 포, 나아가 이들 세포로서의 성질을 갖는 세포, (6) 간(肝)세포 또는 간세포의 전구세포, 나아가 이들 세포로서의 성질을 갖는 세포를 포함하고 있다.

본 발명의 중배엽간세포는 예를 들어, 척추동물의 골수액, 제대혈, 말초혈, 피부, 피부의 모근세포, 근조직, ES 세포 또는 ES 세포로부터 파생하는 세포를 기원으로 얻어질 수 있다. 예를 들어, 피부로부터의 세포 채취에 대해서는 영 등의 방법(Young et al. Anat Rec, 264(1), 51-62, 2001, Campagnli et al. Blood, 98(8), 2396-2402, 2001), 근육으로부터의 세포 채취는 아사쿠라 등의 방법(Asakura A et al. Differentiation, 68(4-5), 245-253, 2001), 지방조직으로부터의 세포채취는 주크 등의 방법(Zuk PA et al. Tissue Eng, 7(2), 211-228, 2001), 또는 활막(滑膜)으로부터의 세포채취는 드 바리 등의 방법(De Bari C et al. Arthritis Rheum, 44(8), 1928-1942, 2001)에 따라 행할 수 있다.

본 발명에 있어서의 척추동물로서는 바람직하게는 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 사람 등)을 가리키나, 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서 사용되는 골수액은 예를 들어, 척추동물(사람을 포함한다 )을 마취하고(국소 또는 전신마취), 골에 바늘을 꽂아 실린지로 흡인하는 것에 의하여 채취할 수 있다. 당해 골로서는 예를 들어 대퇴골, 흉골, 골반을 형성하고 있는 장골 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 출생시에 제대(臍帶)에 직접 바늘을 꽂아 주사기로 흡인하여 제대혈을 채취, 보존하여 두는 것은 확립된 기술로 되어 있다.

또한, 본 발명에 있어서 ES 세포의 조제방법(preparation method)으로서는 당업자 등에 주지한 방법(Doetschman TC, et al. J Embryol Exp Morphol, 87, 27-45, 1985, Williams RL et al., Nature, 336, 684-687, 1988)에 의하여 얻어질 수있다. 본 발명에 있어서는, 이와 같이 행하여 조제된 ES 세포를, 실시예에 기재된 조건 등에서 신경계세포로 분화유도 시키는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 중배엽간세포는 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈을 900 g 에서 비중에 상응하는 분리에 충분한 시간으로 용액 중에 밀도구배 원심분리를 행하고, 원심분리 후 비중 1.07 g/㎖부터 1.1 g/㎖의 범위에 포함되는 일정 비중의 세포분획을 회수하는 것에 의하여 얻는 것도 가능하다. 여기서 비중에 상응하는 분리에 충분한 시간이라 함은 밀도구배 원심분리를 위한 용액 내에서 세포가 그 비중에 상응하는 위치를 점유하는데 충분한 시간을 의미하고, 통상 10 내지 30 분 정도이다. 회수하는 세포의 비중은 세포가 유래한 동물의 종류(예를 들어, 사람, 래트, 마우스 등)에 의하여 변동할 수 있다. 밀도구배 원심분리를 위한 용액으로서는 Picol액과 Percol액을 사용할 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.

구체적인 예를 제시하면 우선, 척추동물로부터 채취한 골수액(25 ㎖) 또는 제대혈을 동량의 PBS 용액에 혼합하고 원심분리(900 g에서 10 분간)하여 침강세포를 PBS에 혼합하여 회수(세포 밀도는 4×10⁷ 세포/㎖ 정도) 하는 것에 의하여 혈액성분을 제거한다. 그 후, 그 중 5 ㎖을 Percol액(1.073 g/㎖)과 혼합하고 원심분리(900 g으로 30 분간)하여 단핵세포 분획을 추출한다. 세포의 세정을 위하여, 추 출한 단핵세포 분획을 예를 들어, 배양액 1[DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium-Low Glucose), 10% FBS (fetal bovine serum), 1% anti-biotic-antimycotic solution), 배양액 2(MSCBM(Mesenchymal Stem Cell Basal Medium), 10% MCGS(Mesenchymal Cell Growth Supplement), 4 mM L-Glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin) 또는 배양액 3(DMEM(sigma), 10% FBS(gibco), 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamine(gibco)]에 혼합하고 원심분리(900 g에서 15 분간, 또는 2000 회전으로 15 분간)한다. 그 다음, 원심분리 후의 상등액을 제거하고 침강한 세포를 회수하여 배양한다(37℃, 공기 중 5% CO₂ ).

또한, 중배엽간세포는 예를 들어, 상기 단핵세포 분획 중에서 상기 SH2(+), SH3(+), SH4(+), CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)등의 세포표면 마커를 가지는 세포를, 항체를 사용하여 선택하는 것에 의하여 얻어질 수 있다. 선택방법으로서는 특별히 제한은 없고, 마그네틱 비즈(magnetic beads)를 사용하는 방법, 또는 통상의 셀 소터(FACS 등)를 사용하는 방법 등이 예시 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서는, 단핵세포 분획(배양액의 상태도 포함한다)으로부터 중배엽간세포를 얻는 것도 가능하다. 단핵세포 분획은 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈을 900 g에서 비중에 상응하는 분리에 충분한 시간으로 용액중에 밀도구배 원심분리를 행하고 원심분리 후, 비중 1.07 g/㎖부터 1.1 g/㎖의 범위에 포함되는 세포 분획을 회수하는 것에 의하여 얻을 수 있다. 여기서 비중에 상응하는 분리에 충분한 시간이라 함은 밀도구배 원심분리를 위한 용액 내에서 세포 가 그 비중에 상응하는 위치를 점유하는데 충분한 시간을 의미한다. 통상, 10 내지 30 분 정도이다. 회수하는 세포분획의 비중은 바람직하게는 1.07 g/㎖부터 1.08 g/㎖의 범위(예를 들어, 1.077 g/㎖)이다. 밀도구배 원심분리를 위한 용액으로서는 Ficol액과 Percol액을 사용하는 것이 가능하지만, 이들에 제한되지 않는다.

구체적인 예를 제시하면, 우선, 척추동물로부터 채취한 골수액(5 내지 10 ㎕)을 용액(L-15를 2 ㎖, Ficol을 3 ㎖)에 혼합하고 윈심분리(900 g에서 15 분간)하여 단핵세포 분획(약 1 ㎖)을 추출한다. 이 단핵세포 분획을 세포의 세정을 위하여 배양용액(NPBM 2㎖)에 혼합하고 다시 원심분리(900 g에서 15 분간) 한다. 그 다음, 상등액을 제거한 후, 침강한 세포를 회수한다.

본 발명에 있어서, 단핵세포 분획은 배양액의 상태로서도 하기의 중배엽간세포의 조제(preparation)에 사용가능하다. 단핵세포 분획을 포함하는 배양액으로서는, 단핵세포 분획을 예를 들어, 상기의 배양액 1, 배양액 2 또는 배양액 3 중에서 37℃, 공기 중 5% CO₂의 조건에서 배양하는 것으로 얻을 수 있지만, 특별히, 이 조건에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명에 있어서, 신경계세포로서는 특별히 제한은 없으며 신경간세포, 신경전구세포, 신경세포 또는 아교세포(glial cell) 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서 세포의 불사화라 함은, 통상 세포는 일정 회수의 분열을 반복하면 증식이 정지하는 것에 대하여, 세포가 이러한 회수의 분열을 반복한 후에도 여전히 증식하도록 된 세포를 의미한다. 결국, 본 발명에 있어서 불사화유전자(immortalization gene)라 함은 이러한 회수의 분열을 반복한 후에도 여전히 세포분열을 계속하게 하는 작용을 관장하는 유전자를 의미한다. 이러한 유전자로서는 예를 들어, 틸로머라아제 유전자, 틸로머라아제로부터 파생하는 유전자, 또는 틸로머라아제의 발현 혹은 활성을 조절하는 유전자(예를 들어, myc 유전자가 틸로머라아제 활성을 높인다고 일컬어지고 있다)등을 드는 것이 가능하지만, 이들에 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서는, 특별히 사람 틸로머라아제 유전자(hTERT)를 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 불사화유전자를 고발현 또는 활성화시키는 방법으로서는, 예를 들어 불사화유전자를 중배엽간세포 내에 도입하는 방법을 들 수 있지만 이 방법에 특별히 한정되지 않는다. 불사화유전자의 중배엽간세포로의 도입방법으로서는 공지의 각종 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 불사화유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하고 당해 벡터를 칼슘 인산 존재 하에서 중배엽간세포에 도입하여 형질전환하는 방법, 혹은 불사화유전자를 리포좀 형태의 소포와 함께 중배엽간세포에 접촉시켜 도입하는 방법, 나아가 불사화유전자의 존재 하에서 일렉트로포레이션 (electroporation)에 의하여 중배엽간세포로 도입하는 방법, 혹은 불사화유전자를 각종 바이러스 벡터에 삽입하고 중배엽간세포에 감염시켜 도입하는 방법 등을 이용할 수 있다. 바이러스 벡터를 이용하는 도입방법으로서는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스(Adeno-associated virus)를 이용하는 방법이 있고, 레트로바이러스 벡터로서는 MoMLV 바이러스를 이용하는 방법 등이 있다. 본 발명에 있어서는, pBabe 벡터를 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 상기 방법에 의하여 중배엽간세포를 불사화시키는 공정은 반드시 포함하지 않아도 되고, 이미 상기의 방법 등에 의하여 불사화한 중배엽간세포를 사용하여 하기의 공정 (b)에 제공하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에 있어서는, 상기 공정 (a) 다음으로 불사화한 중배엽간세포를 기본 배지에서 배양하는 것에 의하여 당해 중배엽간세포를 신경계세포로 유도한다[공정 (b)].

본 공정에 있어 바람직한 태양에 있어서 불사화한 중배엽간세포를 기본 배지에서 배양하는 것에 의하여 당해 중배엽간세포를 신경간세포로 유도한다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 상기 중배엽간세포 또는 상기 ES 세포를 기본 배지에서 33℃ 내지 38℃의 조건에서 배양한다.

본 발명에 있어서 기본 배지으로서는, 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이면 특별히 제한은 없으나 바람직하게는 DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 또는 NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics)이다. 상기 기본 배지의 기타 성분으로서는 특별히 제한은 없으나, 바람직하게는 F-12, FCS, Neural survival factors(Clonetics)등을 들 수 있다. 이들 배양액중 농도로서는 예를 들어, F-12는 50%, FCS는 1%이다. 또한, 배양액에 있어서 CO₂ 농도는 바람직하게는 5%이나 특별히 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 바람직한 태양으로서는, 상기 기본 배지에 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(Epidermal growth factor)를 첨가한다. 이 경우 이들은 단독으로 첨가하여도, 함께 첨가하여도 좋다. 상기 bFGF 또는 EGF의 농도로서는 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖를 들 수 있지만, 바람직하게는 10 ng/㎖이다. 첨가 시기와 첨가 방법으로서는 특별히 제한은 없으나, 바람직하게는 상기 중배엽간세포를 당해 기본 배지에서 배양하면서 매일 첨가하는 방법을 들 수 있다. 또한, 중배엽간세포를 신경간세포로 분화유도를 행하는 경우에는 상기 기본 배지에 bFGF 및 EGF를 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 상기 기본 배지 및 기타 성분을 함유하는 당해 기본 배지에 허혈뇌추출액(ischemic brain extract)을 가하는 것으로 상기 중배엽간세포로부터 상기 신경간세포를 포함하는 신경계세포로의 유도를 촉진하는 것이 가능하다. 통상, 허혈뇌조직으로부터의 추출물을 첨가하지 않은 상태에서는 신경간세포로의 분화에 1 주 이상 필요하지만, 첨가하면 불과 수 일로 유도가 가능하고, 게다가 유도 효율도 대단히 높게 된다. 본 발명에 있어서는, 이러한 신경간세포를 포함하는 신경계세포로의 유도촉진 방법도 또한 제공한다.

본 발명에 있어서, 허혈뇌추출액으로서는, 예를 들어 척추동물의 허혈뇌조직의 분쇄액을 원심분리하는 것으로 얻을 수 있다. 구체적으로는, 전뇌 허혈모델동물(래트 등)로부터 전뇌를 적출하여 제작한 소절편을 NPBM(신경간세포용 배양액)에 가하고 호모지나이저(homogenizer)에서 기계적으로 분쇄한다. 그 다음 300 g에서 5 분간 또는 800 rpm으로 5 분간 원심분리하고, 상등액을 모아 메브레인 필터에서 세포성분을 제거하여 허혈뇌추출액을 조제(preparation)할 수 있지만, 이 방법에 한정되지 않는다. 당해 전뇌 허혈모델동물로서는 동물을 넴부탈(Nembutal)에서 마 취 후, 생리식염수에 관류하는 것으로 제작하는 것이 가능하다. 이와 같이 하여 얻어진 허혈뇌추출액을 상기 기본 배지 및 기타 성분을 함유하는 기본 배지에 첨가한다. 첨가시기로서는 특별히 제한은 없다.

본 발명에 있어서는, 상기의 조건에 의하여 상기 중배엽간세포 또는 상기 ES 세포를 배양하는 것으로 신경계세포로 유도한다. 당해 신경계세포로서는 구체적으로는, 신경간세포, 신경전구세포, 신경세포, 또는 아교세포 등을 예시할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 배양 온도 조건으로서는 33℃ 내지 38℃이나 바람직하게는 37℃이다.

기타 배양조건에는 특별히 제한은 없다. 세포는 부유한 상태(neurosphere 상태)이어도 배양용기에 부착한 상태이어도 좋다. 당해 배양 용기로서는 예를 들어, 비코팅 접시(non-coating dish )등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 의하여 분화 유도된 신경계세포는 불사화유전자를 제거하는 것에 의하여 안전성이 향상되는 것으로 생각된다. 본 발명에 있어서는, 기존에 확립된 기술에 의하여 세포에 도입한 불사화유전자를 제거하는 것도 가능하다. 예를 들어, 불사화유전자를 loxP 배열(loxP sequence) 또는 loxP 모양 배열(loxP like sequence)에 삽입되도록 구성하여 두는 것에 의하여 Cre 리콤비나아제 등의 리콤비나아제 처리를 행하여 불사화유전자를 특이적으로 제거하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서는 상기 중배엽간세포의 배양액을 새로운 배양액[DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%)] 혹 은 배양액 2[NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% Gentamycine-amphotericinB, 10 ng/ml hFGF)]로 바꾸어 수일 내지 4 주간 정도 배양하는 것에 의하여 중배엽간세포로부터 직접적으로 (신경간세포로의 전환을 하지 않고) 신경세포와 아교세포로 분화를 유도시키는 것이 가능하다. 이와 같이 중배엽간세포로부터 직접적으로 신경세포와 아교세포로 분화 유도시키는 방법도 본 발명에 포함된다.

본 발명은 본 발명의 상기 방법에 의하여 얻어지는 세포를 제공한다. 당해 세포라 함은, 신경계세포이고 예를 들어, 신경간세포, 신경전구세포, 신경세포, 또는 아교세포 등을 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 상기방법에 의하여 얻어지는 세포를 포함하는 신경계 질환의 치료를 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포는 그대로 이식에 사용하는 것도 가능하지만 이식에 따른 치료효율을 향상시키기 위하여 각종 약제를 첨가한, 혹은, 유전자 도입한 조성물로서 이식하는 것도 생각할 수 있다.

본 발명의 조성물의 조제에 있어서는 예를 들어, ⅰ) 본 발명의 세포증식률을 향상시키는 또는 신경계세포로의 더한층 분화를 촉진하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅱ) 본 발명의 세포의 손상신경조직 내에서의 생존률을 향상시키는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅲ) 본 발명의 세포가 손상신경조직으로부터 받는 악영향을 저지하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅳ) 도너세포(donner cell)의 수명을 연장시키는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅴ) 세포주기를 조절하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅵ) 면역반응의 억제를 목적으로 하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅶ) 에너지 대사를 활발히 하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅷ) 도너세포의 숙주 조직 내에서의 유주능(遊走能)을 향상시키는 물질, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, ⅸ) 혈류를 향상시키는 물질, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입(혈관신생 유도도 포함한다), ⅹ) 숙주(host) 뇌신경으로 어떠한 치료효과를 가지는 물질의 첨가(대상질환으로서는 예를 들어, 뇌종양, 중추성 및 말초성의 탈수질환, 중추성 및 말초성의 변성질환, 뇌졸증(뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈(subarachnoid hemorrhage)을 포함한다), 뇌종양, 치매를 포함하는 고차기능장애, 정신질환, 간질, 외상성의 신경계질환(두부외상, 뇌좌상, 척수손상을 포함한다), 염증성질환, 감염성질환 등),혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입을 행하는 것을 들 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 세포 및 조성물은 수용자(recipient)에 이식하는 것으로, 신경계 질환의 치료에 이용할 수 있다. 치료의 대상이 되는 신경계질환으로서는 예를 들어, 중추성 및 말초성의 탈수질환, 중추성 및 말초성의 변성질환, 뇌졸증(뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈(subarachnoid hemorrhage)을 포함한다), 뇌종양, 치매를 포함하는 고차기능장애, 정신질환, 간질, 외상성의 신경계질환(두부외상, 뇌좌상, 척수손상을 포함한다), 염증성질환, 감염성질환(예를 들어 야콥병 등) 및 척수경색을 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.

본 발명에 의하면, 수용자 유래의 예를 들어, 골수액, 제대혈, 말초혈, 피부, 근조직, 지방조직, 활막, 모근으로부터 분리하여 얻은 세포를 도너세포로서 이식할 수 있다(자가이식요법). 이것은 이식에 의한 거부반응의 위험성도 작고 면역억제제를 병용하지 않으면 안되는 곤란성이 없는 점에서 바람직하다. 자가이식치료법이 곤란한 경우에는 타인 또는 다른 치료용 동물 유래의 세포를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명자 등은 세포이식을 언제 시행하면 어느 정도의 치료효과를 얻을 수 있는가에 대하여 검토하고, 초급성기의 이식치료(수 시간 이내)가 가장 높고 그 다음 급성기(수 일 후), 그리고 만성기(수 주간 후)의 순서로 치료효과가 있음을 제시하였다. 따라서, 초급성기의 이식치료가 바람직하다고 생각되는 것으로부터, 사전에 세포를 채취, 배양, 유전자 도입, 증식, 분화유도, 보존하여 두는 것은 대단히 유용하다. 결국, 미리 수용자로부터 세포를 채취하고 본 발명의 방법에 의하여 불사화유전자를 도입하고 그 다음 배양하는 것에 의하여 분화유도시킨 신경계세포를 이식에 대비하여 적당히 보존하여 두는 것도 바람직하게 실시된다. 보존하여 둔 세포의 종류로서는 하기의 상태를 생각할 수 있다. 당업자에게 있어서는, 치료하는 질환에 상응하여 적절한 상태의 세포를 선택하는 것이 가능하다.

1: 채취한 그대로의 상태(crude fraction), 2: 어느 정도 정제한 상태, 3: 정제한 세포를 배양하고 증식한 상태, 4: 정제한 세포를 불사화하여 증식한 상태, 5: 신경간세포로 분화 유도한 상태, 6: 신경계세포로 분화한 상태. 또한, 골수 은행과 제대혈 은행 등에 보존된 세포를 이식에 사용하는 것도 가능하다. 세포는 냉동보존 한 것이어도 좋다.

나아가, 본 발명은 중배엽간세포(불사화한 것을 포함한다)를 그대로 수용자에 대하여 이식을 행하는 것에 의하여, 신경조직으로 이행한 당해 중배엽간세포는 신경계세포로 분화하고 기능적인 재건이 보여짐을 명확히 하였다. 따라서, 중배엽간세포를 직접 수용자로 투여(이식)하고 수용자 체내에서 당해 세포를 신경계세포로 분화유도시키는 방법도 본 발명의 하나의 태양으로서 본 발명에 포함된다. 이 경우의 투여방법은 특별히 제한되지 않고 예를 들어, 국소 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 뇌척수액 내 투여(예를 들어, 요추천자(lumbar puncture)와 뇌실 내 투여(intraventricular adminstration)) 등을 들 수 있다.

환자로의 세포이식은 예를 들어, 이식하는 세포를 인공뇌척수액과 생리식염수 등을 사용하여 부유시킨 상태에서 주사기에 모으고, 수술에 의하여 손상한 신경조직을 노출하여 이 손상부위에 주사바늘로 직접 주입하는 것에 의하여 행할 수 있다. 본 발명의 세포는 유주능이 높기 때문에, 신경계조직 내를 이동할 수 있다. 따라서, 손상부위의 근방에 이식하여도 좋다. 또한, 뇌척수액 중으로의 주입도 효과를 기대할 수 있다. 이 경우, 통상의 요추천자(lumbar puncture)로 세포를 주입하는 것이 가능하기 때문에 환자 수술의 필요가 없고, 국소마취만으로 끝내기 때문에 병실에서 환자를 처치할 수 있는 점에서 좋다. 나아가, 동맥 내와 정맥 내로의 주입도 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 통상의 수혈 요령으로 이식이 가능하게 되고, 병동에서의 이식조작이 가능하다는 점에서 좋다.

또한, 본 발명의 세포는 그 유주능이 높기 때문에, 유전자의 운반체(벡터)로 서 이용하는 것도 생각할 수 있다. 예를 들어, 뇌종양, 중추성 및 말초성 탈수질환, 중추성 및 말초성의 변성질환, 뇌졸증(뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈을 포함한다), 뇌종양, 치매를 포함하는 고차기능장애, 정신질환, 간질, 외상성의 신경계질환(두부외상, 뇌좌상, 척수손상을 포함한다), 염증성질환, 감염성질환(예를 들어 야콥병 등) 등의 각종 신경질환에 대응하는 유전자 치료용 벡터로서의 이용이 기대된다.

도 1은 배양 중배엽간세포를 나타내는 사진이다. 중배엽간세포의 마커인 SH3를 발현하고는 있지만(A), 신경간세포의 마커인 네스틴(nestin)은 음성이다(B). 배양조건 하에서의 분화유도 후, 형태학적으로도 신경간세포 모양으로 변화하고 또 중배엽계세포의 마커인 SH3가 음성화하고(C), 신경간세포의 마커인 네스틴이 양성으로 된다(D). 눈금자는 A, B에서 10 ㎛을 나타내고 C, D에서는 200 ㎛을 나타낸다.

도 2는 중배엽간세포를 배양조건 하에서 신경간세포로 분화유도하고 나아가 계속하여 분화유도하면 신경세포(A, D), 성상세포(astrocyte)(B, E), 희돌기교세포(oligodendrocyte)(C,F)로 분화하는 것을 나타내는 사진이다. D는 NSE(neuron-specific enolase), E는 GFAP(glial fibrillary acidic protein), F는 GalC(galactocerebroside)로 면역염색한 사진이다. 눈금자는 25 ㎛을 나타낸다.

도 3은 이식세포가 뇌경색소(腦梗塞巢)를 회복한 것을 나타내는 사진이다. 중배엽간세포를 배양조건 하에서 신경간세포로 분화유도한 도너세포는 LacZ유전자(대장균 갈락토시다제를 발현한다)로 유전적으로 마크(labeling)하고 있어 기질 X-gal로 처리하면 반응하여 청색을 발현한다. 따라서, 도너세포를 숙주 뇌조직 내에서 추적할 수 있다. 래트 뇌경색 모델(중대뇌동맥 일시폐쇄 모델로 대뇌기저핵, 측두엽, 해마 등이 뇌경색으로 함몰되어 있다)에 LacZ 유전자로 마크한 도너세포를 이식한 결과, 뇌경색으로 함몰된 대뇌기저핵, 측두엽, 해마 등에 생착하고, 조직 회복하였다.

도 4는 이식세포가 척수손상 부위를 회복한 것을 나타내는 사진이다. 래트 척수손상 모델(제일흉수 레벨에서 횡단한 모델)에 LacZ유전자로 마크한 도너세포를 이식한 결과, 도너세포는 손상을 받은 부위만이 아니라 뇌, 경수(cervical spinal cord)(B), 요수(lumbar cord)(C)로도 유주하고 조직회복 하였다. D, E, F는 A, B, C를 고배율로 관찰한 사진이다. A, B, C, D, E, F에 있어서, 눈금자는 A, B, C에서는 200 ㎛을 나타내고, D, E, F에서는 10 ㎛을 나타낸다.

도 5는 이식세포가 척수탈수 부위를 회복한 것을 나타내는 사진이다. A는 성인 중배엽간세포 유래로부터 유도한 신경간세포를 성숙한 래트의 척수탈수 영역으로 이식한 후, 재유수화를 나타내는 사진이다. B는 재유수화 축색을 고배율로 관찰한 사진이다. A, B, C, D, E, F에 있어서, 눈금자는 A, B, C에서는 250 ㎛을 나타내고, D, E, F에서는 10 ㎛을 나타낸다.

도 6은 ES 세포로부터 유도한 신경간세포에서 네스틴 양성의 뉴로스피어 (neurosphere) 사진이다.

도 7은 스트로마 세포로의 유전자 도입에 이용하는 벡터의 구성을 나타내는 도면이다.

도 8은 스트로마 세포로의 트랜스펙션(transfection)을 모식적으로 나타내는 도면이다.

도 9는 중배엽간세포(초대배양: primary culture)와 hTERT 도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포의 세포분열 세대수를 나타내는 도면이다.

도 10은 hTERT 도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포(A)와 불사화한 중배엽간세포로부터 분화유도된 지방세포(B: Oil Red 0 염색)를 나타내는 사진이다.

도 11은 hTERT 도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포(A)와 불사화한 중배엽간세포로부터 분화유도된 연골아세포(B: Alcian blue 염색)를 나타내는 사진이다. 염색(동결절편) 연골기질 내의 콘드로이친(chodroitin)이 파랗게 염색된다.

도 12는 hTERT 도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포(A)와 불사화한 중배엽간세포로부터 분화유도된 골아세포(B: von Kossa 염색; 미네랄 침착)를 나타내는 사진이다.

도 13은 hTERT 도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포로부터 분화유도한 네스틴 양성의 신경간세포를 나타내는 사진이다. 눈금자는 100 ㎛을 나타낸다.

도 14는 hTERT 도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포로부터 분화유도한 신경간세포로부터 다시 분화유도한 NSE 양성 신경세포(A)와 GFAP 양성의 아교세포(B)를 나타내는 사진이다. 눈금자는 A에서는 20 ㎛을 나타내고, B에서는 10 ㎛을 나타낸다.

도 15는 hTERT 도입에 의하여 불사화한 중배엽간세포를 이식하는 것에 의하여 척수탈수 부위가 회복된 것을 나타내는 사진이다. A는 hTERT 유전자가 도입된 중배엽간세포를 성숙 래트의 척수탈수 영역으로 이식 후, 재유수화한 것을 나타내는 사진이다. 눈금자는 A에서는 250 ㎛을 나타내고, B에서는 10 ㎛을 나타낸다.

도 16은 각 세포를 본 발명의 방법에 의하여 신경간세포로 분화유도를 시도한 결과를 나타내는 사진이다. 각 세포를 부유시키고 NPBM배지/비처리 접시(Neural Progeniter Basal medium/ Non-treated Dish)에서 배양하고 48 시간 후에 관찰한 경우, 각 세포 모두 부유상태에서의 생존이 가능했지만, MSC-hTERT, Stroma-hTERT, PDF만이 뉴로스피어 모양을 나타내었다.

도 17은 각 세포를 본 발명의 방법에 의하여 신경간세포로 분화유도를 시도한 후, 총 RNA를 조정하고 RT-PCR로 네스틴의 발현을 확인한 사진이다. 레인 A는 DMEM-10% FBS : 배양 접시(culture dish), B는 NPBM: 비처리 접시(non-treated dish) /1 일, C는 NPBM: 비처리 접시/2 일, D는 NPBM: 비처리 접시 /5 일이다. NPBM은 Neural Progenitor basal medium을 나타낸다.

도 18은 MSC로부터 유도한 신경간세포가 신경세포로 분화한 상태를 RT-PCR로 확인한 사진이다. 상단은 GAPDH(GAPDH를 내부 콘트롤로서 사용)로 보정한 결과이며, 하단은 뉴로필라멘트(NF)의 서브유니트인 NF-M에 의하여 보정된 결과를 나타낸다. 레인 1은 DDW, 2는 신경간세포(Neuro Stem Cell), 3은 MSC-hTERT, 4는 스트로마-hTERT, 5는 PDF-hTERT, 6은 MSC-hTERT BHA, DMSO, 7은 Stroma-hTERT BHA, DMSO, 8은 PDF-hTERT BHA, DMSO, 9는 MSC-hTERT NPBM(-), 10은 Stroma-hTERT NPBM(-), 11 은 PDF-hTERT NPBM(-) 12는 NSC NPBM(-) PDL/laminin, 13은 MSC-hTERT NPBM(-), PDL/laminin, 14는 Stroma-hTERT NPBM(-) PDL/laminin, 15는 PDF-hTERT NPBM(-) PDL/laminin을 나타낸다.

도 19는 MSC-hTERT에 네스틴이 양성으로 되면 EGFP가 발현하는 벡터를 유전자 도입하고 본 발명의 방법으로 신경간세포로 분화유도한 결과를 나타내는 사진이다. 공초점 레이저 현미경에 의한 관찰에서는 MSC-hTERT은 신경간세포로의 분화유도 전에는 발현하지 않았던 EGFG가 유도 후에는 EGFP를 높게 발현하도록 되는 것이 관찰되었다.

도 20은 RT-PCR에서 MSC-hTERT의 네스틴 발현을 확인한 사진이다. 레인 1은 MSC-hTERT에 네스틴 인핸서(enhancer)/프로모터 EGFP를 도입한 세포, 레인 2는 MSC-hTERT에 네스틴 인핸서/프로모터 EGFP를 도입하고 신경간세포로 분화유도한 세포이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 단핵세포 분획 및 중배엽간세포의 조제(preparation)

(1) 단핵세포 분획 및 당해 단핵세포 분획의 배양액

마우스(및 사람)로부터 채취한 세포 샘플을 Ficol 3㎖을 함유하는 L-15배지(2 ㎖) 중에 희석하고, 원심분리(2000 rpm, 15 분간)하였다. 단핵구 분획으로부터 세포를 모아 2 ㎖의 무혈청 배지(전구신경세포 유지배지(Neural Progenitor cell Maintenance Medium): NPMM) 중에 현탁하고, 이어 원심분리(2000 rpm, 15 분간)하고 상등액을 제거하여 침강한 세포를 회수하였다. 이 세포를 다시 NPMM에 현탁하고 단핵세포 분획을 얻었다.

또한, 단핵세포 분획을 배양액 1[DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium-Low Glucose) 10% FBS (fetal bovine serum), 1% anti-biotic-antimycotic solution)], 배양액 2[MSCBM(Mesenchymal Stem Cell Basal Medium), 10% MCGS(Mesenchymal Cell Growth Supplement), 4 mM L-Glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin), 배양액 3 중에서 37℃ , 5% CO₂의 조건으로 배양하고 당해 단핵세포 분획의 배양액을 얻었다.

(2) 중배엽간세포

상기(1)에 기재된 방법으로 얻어진 단핵세포 분획, 또는 당해 단핵세포 분획의 배양액으로부터 SH2(+), SH3(+), SH4(+), CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-) 등의 특징을 가지는 세포를, 항체를 사용하여 추출하였다. 선별방법은 마그네틱 비즈를 사용하는 방법, 또는 통상의 셀 소터(FACS 등)을 사용하는 방법을 이용하였다.

<실시예 2> 중배엽 간세포로부터 신경계세포로의 분화유도

(1) 중배엽간세포로부터 신경간세포로의 유도

우선, 세정을 행하고, 그 다음 배양용액으로부터 세포를 산소처리[시약( 0.05% trypsin, 0.02% EDTA), 실온, 5분간]에 의하여 떼어내고, 등량의 배양액을 가하고 수회 피펫팅하여 단일세포로 분리하였다. 그 다음, 600 회전으로 5 분간 원심분리하고 침전한 세포를 피펫으로 빨아올렸다. 그 다음, 새로운 배양액 1[DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%, Basic fibroblast growth factor(bFGF) 10 ng/㎖ 및 Epidermal growth factor(EGF) 10 ng/㎖을 매일 첨가)] 또는 배양액 2[NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% hEGF(human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF(human fibroblast growth factor), Basic fibroblast growth factor(bFGF) 10 ng/㎖ 및 Epidermal growth factor(EGF) 10 ng/㎖을 매일 첨가)], 배양용기(non-treated polystyrene dish)에서, 부유한 그대로의 상태에서 5% CO₂, 37℃ 조건으로 배양을 계속하였다.

(2) 중배엽간세포로부터 신경세포와 아교세포로의 유도

배양하고 있는 중배엽간세포의 배양액을 새로운 배양액[DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%)] 혹은 배양액 2[NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 0.2% hEGF(human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamicine-amphotericinB, 0.2% hFGF)]로 바꾸고 약 4 주간 정도 배양하는 방법에 의하여 중 배엽간세포로부터 직접적으로 (신경간세포로의 전환을 하지 않고) 신경세포와 아교세포로 분화유도 시키는 것에도 성공하였다.

상기 (1) 및 (2)의 방법에 의한 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도의 확인은, 중배엽세포의 마커인 SH2와 SH3가 사라지고(신경간세포의 마커인 네스틴은 원래 음성) 그 대신 신경간세포의 마커인 네스틴(nestin)이 양성이 되는 것으로 하였다(도 1).

중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도에 의하여, 배양세포는 형태적으로도 변화하였다. 구체적으로는, 단일세포였던 세포가 뉴로스피어를 형성하였다 (도 1). 또한, 이 신경간세포로부터 신경세포(NSE 양성)와 아교세포(GFAP 양성)가 분화하여 가는 것도 확인하였다(도 2).

<실시예 3> 허혈뇌추출액을 사용한 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도의 촉진

뇌에 허혈 스트레스를 주고 허혈뇌의 추출액을 배양 중배엽간세포에 첨가하는 것으로, 중배엽간세포가 신경간세포로 고효율로 분화하는 것을 발견하였다. 이 방법에 의하면 배양 중배엽간세포가 신경간세포로 불과 수일간으로 고효율로 유도할 수 있음이 판명되었다.

(1) 허혈뇌추출액의 조제(preparaion)

우선, 래트를 넴부탈(Nembutal)에서 깊게 마취 후, 전복벽으로부터 전흉부를 절개하고 심장 및 상행 대동맥을 노출한다. 심첨부를 절개하고 좌심실로부터 상행 대동맥에 튜브를 삽입한다. 다음에, 우심이(right auricle of heart)에 절개를 넣고 튜브로부터 생리식염수를 3 분간 관류시켜 충분한 전신의 탈혈을 행하였다. 관류 후, 4 내지 5 시간 그대로 방치하고 전뇌 허혈모델로 하였다. 다음으로, 상기 전신 허혈모델 래트로부터 대뇌, 중뇌를 적출하여 날카로운 칼로 1 내지 2 mm 정도의 소절편으로 만들었다. 제작한 소절편을 NPPM에 가하고 호모지나이저에서 기계적으로 분쇄하여 혼탁액(suspension)을 제조하였다. 다음으로, 혼탁액을 윈심분리관에 옮겨 800 rpm, 5 분간 원심분리를 행하고, 상등액을 모았다. 0.22 ㎛의 멤브레인 필터로 세포성분을 제거하고 허혈뇌추출액으로 하였다.

(2) 배양 중배엽간세포(MSC)의 신경간세포로의 분화유도

MSC세포를 100 mm 비코팅 접시(IWAKI), 컨디셔닝 배지(3 종류: 별도 기재), 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양을 계속하였다. 90% 컨플루언트에서 파스퇴르 피펫으로 배양액을 흡입하여 Dulbecco's PBS로 3회 린싱하였다.

0.05% Trypsin, 0.02% EDTA를 함유하는 PBS를 2 ㎖ 가하고, 세포가 분리될 때까지 37℃에서 2 내지 5 분간 배양하였다. 컨디셔닝 배지를 2 ㎖ 가하여 트립신(trypsin)의 반응을 중지시켰다. 상등액 및 분리된 세포를 파스퇴르 피펫으로 원심분리관에 모아 수 회 피펫팅한 후, 1000 rpm에서 5 분간 원심분리를 행하였다. 상등액을 버리고 NPMM을 가하여 재현탁하였다. 37℃에서 데워둔 50% NPMM, 50% 허혈뇌추출액 배지에 플래이팅하고 37℃, 5% CO₂ 조건 하, 100 mm 비코팅 접시(IWAKI)에서 부유배양하였다. bFGF 10 ng/㎖ 및 EGF 10 ng/㎖을 매일 첨가하였다.

<실시예 4> 신경재생능의 평가

상기 분화유도 방법에 의하여 얻어진 신경계세포의 신경재생능력에 관하여는, 뇌경색 모델(도 3), 치매 모델(도 3), 척수 손상모델(도 4), 탈수 모델(도 5 )에서의 검토 결과, 뇌로부터 추출, 배양한 신경간세포와 같은 정도의 재생능력이 있는 것이 판명되었다.

<실시예 5> ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도

마우스 ES 세포를 100 mm 젤라틴-코팅 접시(IWAKI), 컨디셔닝 배지 20 ㎖(DMEM, 10% FCS, 100 uM 2-머캅토 에탄올, 1000 UNITs/㎖ ESGRO(CHEMICON)), 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양을 계속하였다. 90% 컨플루언트에서 파스퇴르 피펫으로 배양액을 흡입하여 PBS로 3회 린싱하였다. 0.25% Trypsin, 0.03% EDTA가 함유된 PBS를 2 ㎖ 가하고 세포가 분리될 때까지 37℃에서 2 내지 5 분간 배양하였다. FCS를 400 ㎕ 가하고 트립신의 반응을 중지시켰다. 상등액 및 분리된 세포를 파스퇴르 피펫으로 원심분리관에 모아 수 회 피펫팅한 후, 1000 rpm에서 5 분간 원심분리를 행하였다. 상등액은 버리고 NPMM을 가하여 재현탁하였다. 37℃에서 데워둔 50% NPMM, 50% 허혈뇌추출액 배지에 37℃, 5% CO₂ 조건 하, 100 mm 비코팅 접시(IWAKI)에서 부유배양하였다. bFGF 10 ng/㎖ 및 EGF 10 ng/㎖을 매일 첨가하였다.

<실시예 6> 세포로의 hTERT 유전자의 도입

이하에서, 스트로마 세포(stroma cell)로 hTERT 유전자를 도입하는 것에 의하여 당해 세포를 불사화시키는 방법을 제시한다.

1. 초대 스트로마 세포의 채취

건강한 성인 남성의 장골(腸骨)로부터 얻어진 골수액 10 ㎖로부터 단핵구를 분리하고, 하룻밤 배양 후에 플라스크에 부착한 세포를 스트로마 세포로서 이용하였다.

2. 스트로마 세포에 도입하는 유전자로서, 사람 틸로머라아제의 촉매활성 서브유니트(hTERT)를 코딩하는 유전자를 사용하였다. hTERT의 배열(sequence)은 예를 들어, Science 277, p.955-959에 기재되어 있다. 나아가, 세포의 암화에 관련하는 유전자로서 알려져 있는 공지의 ras 유전자, SV40 T 유전자에 관해서도 스트로마 세포에 도입하였다.

3. 스트로마 세포로의 유전자 도입에 이용하는 벡터(도 7) pBABE-hygro-hTERT(Dr. Robert A Weinberg로부터 공여)는 PNAS vol95, p14723-14728 중에 기재되어 있는 것처럼, pCI-Neo-hTERT-HA로부터 PCR로 얻은 hTERT EcoRV-SalI 단편을 pBABE-hygro에 클로닝한 것이다. pBABE-puro-rasV12(Dr. Scott W Lowe로부터 공여)는 Cell 88, 593-602, 1997에 기재된 방법으로 제조되었다. pMFG-tsT-IRES-neo는 MFG-tsT (pZIPtsU19{Dr. R. McKay로부터 받은 것}으로부터 클로닝하여 MFG벡터에 재조합한 것{Lab.Invest. 78, 1467-1468, 1998})에 IRES-neo(pRx-hCD25-ires-neo{Human gene therapy 9, 1983-1993, 1998}로부터 잘라낸) BamHI 단편을 클로닝하여 제조하였다.

4. 레트로바이러스 생산 세포와 그에 의한 바이러스의 감염은 ‘실험의학 프로토콜 시리즈 유전자 도입 & 발현해석 실험법(사이토 이즈미, 스간오 스미오 편 양토사)’에 준하여 행하여졌다(p58-62).

구체적으로는, BOSC23 패키징세포(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8392-8396, 1993)를 사용하여 다음과 같이, ψCRIP 패키징세포(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543, 1993)를 제작하였다.

4-1. 재조합 레트로바이러스 벡터 생산 세포의 제작

(ⅰ) BOSC23 세포를 10 cm 접시에 트랜스펙션 18 내지 24 시간 전에 5.5 ×10⁶ 개 플레이팅(plating)하였다.

(ⅱ) 15 ㎍의 DNA(레트로바이러스 벡터)에 OPTI-MEM(Gibco/BRL)을 800 ㎕ 부드럽게 가하여 교반하고 A 용액을 제조하였다.

(ⅲ) 멸균된 튜브에 OPTI-MEM을 750 ㎕ 넣어 LIPOFECTAMINE(2mg/ml Gibco/BRL)을 50 ㎕ 가하고 부드럽게 혼합하여 B 용액을 제조하였다.

(ⅳ) A 용액을 부드럽게 B 용액에 혼합하여 C 용액을 제조하고, 실온에서 30 내지 45 분 방치하였다.

(ⅴ) BOSC23 세포를 항생제가 없고 FBS가 없는 37℃ 배지에서 한 번 세척하였다.

(ⅵ) C 용액(1.6 ㎖)을 부드럽게 BOSC23 세포에 가하였다.

(ⅶ) 다시, 2.4 ㎖의 OPTI-MEM을 가하였다.

(ⅷ) 5 시간, 5% CO₂하에서 배양하였다.

(ⅸ) 4 ㎖의 20% 소태아 혈청(fetal bovine serum)을 함유하는 DMEM을 가하고, 하룻밤 배양하였다.

(ⅹ) 10% 소태아 혈청을 함유하는 37℃ 배지로 바꾸고 동시에 패키징 세포인 ψCRIP을 10 cm 접시에 1 내지 2 ×10⁶ 개 플레이팅하였다.

(ⅹi) 24 시간 후, BOSC23 세포의 배지를 0.45 또는 0.20 ㎛의 시린지 필터로 여과하고, ψCRIP의 배지를 5 ㎖의 여과한 배지로 교환하였다. 동시에 폴리브렌(Hexadimethrine Bromide, SIGMA H-9268)을 8 ㎍/㎖이 되도록 가하였다.

(ⅹⅱ) 4 내지 24 시간 배양 후, 5 ㎖의 배지를 가하고 다시 하룻밤 배양하였다.

(ⅹⅲ) 약제선택(drug selection)을 행하여 레트로바이러스를 생산하는 ψCRIP 세포가 제조되었다.

다음으로, 상기 3 종의 벡터를 각각 레트로바이러스 생산세포(ψCRIP/P131)에서 증식시켜 스트로마 세포에 다음과 같이 트랜스펙션(transfection)시켰다(도 8).

우선, 트랜스펙션을 행하기 전날 스트로마 세포를 세포농도가 5 ×10⁴ 세포/10 cm접시가 되도록 재플래이팅하고, 레트로바이러스를 생산하는 ψCRIP/P131의 배지를 10% 소 혈청을 함유하는 DMEM으로부터 12.5% 비활성화된 말 혈청, 12.5% 비활성화된 소태아혈청/2-머캅토에탄올/하이드로코티즌(hydrocortisone)을 함유하는 α-MEM의 배지로 바꾸어 배양한다. 당일에 배양 상등액을 0.20 ㎛ 필터에서 여과하고 폴리브렌(polybrene)을 최종 농도 8 ㎍/㎖이 되도록 가하였다. 그 다음, 상등액에 생산된 재조합 레트로바이러스 벡터를 스트로마 세포에 감염시켰다. 4 시간 후, 배양 상등액을 새로운 배지로 바꾸어 다시 2 주간 배양하였다. 그 후, pBABE-hygro-hTERT는 하이그로마이신 100 ㎍/㎖로 5 일간, pBABE-puro-rasV12는 퓨로마이신 1 ㎍/㎖로 5 일간, pMFG-tsT-IRES-neo는 G418 1 mg/㎖로 5 일간 각각 약제선택을 행하였다.

감염에는 3 종류의 레트로바이러스 벡터를 (1) 콘트롤, (2) pBABE-hygro-hTERT 벡터만, (3) pMFG-tsT-IRES-neo 벡터만, (4) pBABE-puro-rasV12 벡터만, (5) pMFG-tsT-IRES-neo/ pBABE-hygro-hTERT 2종 벡터,

(6) pBABE-puro-rasV12/ pBABE-hygro-hTERT 2종 벡터, (7) pMFG-tsT-IRES-neo /pBABE-puro-rasV12 2종 벡터, (8) pBABE-puro-rasV12/pMFG-tsT-IRES-neo /pBABE- hygro-hTERT 3종 벡터로 감염시켰다.

이들 바이러스 및 세포는 발명자 등이 보관해 오고 있으며 특허 후 언제라도 분양할 수 있는 상태에 있다.

<실시예 7> 간엽계간세포(mesenchymal stem cell)의 분화능

골, 연골, 근육 등으로 분화하는 능력과 자기복제능을 함께 갖는 간엽계간세포의 분화와 혈액간세포의 지지능을 검토하였다.

건강한 성인의 장골로부터 골수천자(骨髓穿刺, ilium puncture)를 행하고 비중 원심분리법에 의하여 단핵구를 채취, 10% 비활성화 소태아혈청을 함유하는 DMEM에서 하룻밤 배양하였다. 다음날부터 부착된 세포(adherent cell)를 배양하였다. 2 주 후에 T-E(trypsin-EDTA)로 세포를 회수한 것을 초대 간엽계간세포로하여 동결보존하였다. 그 후, hTERT 유전자를 실시예 1과 같은 방법으로 도입하였다. 다음으로, 초대 간엽계간세포와 hTERT 유전자가 도입된 불사화 간엽계간세포와의 증식곡선을 비교하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9로부터 명확한 것처럼, 초대 간엽계간세포는 42 일 세대수 17(PD=17)로 세포분열의 정지(crisis)가 일어났으나, 불사화 간엽계간세포는 270 일 세대수 54(PD=54) 경과한 현재에도 분열속도가 느리게 됨이 없이 계대배양이 가능한 것으로부터 안정한 셀라인을 수립한 것이라고 생각되어진다.

다음으로, 제작한 간엽계간세포가 다분화능을 유지하고 있을지를 검토하였다.

(1) 우선, 1 uM 덱사메타존(dexamethazone), 60 uM 인도메타신(indomethacine), 0.5 uM 3-이소부틸메틸잔틴(isobutylmethylxanthine), 5 ug/㎖ 인슐린을 사용하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 약 1 주 간의 배양 후 Oil Red 0 염색으로 염색되었다(도 10; 붉은 것은 지방적(脂肪滴)).

(2) 다음으로, 1 uM 덱사메타존, 50 ug/㎖ 아스코르빈산-2-인산(ascorbate-2-phosphate), 6.25 ug/㎖ 인슐린, 6.25 ug/㎖ 트랜스페린(transferrin), 5.35 ug/㎖ 셀레닉 산(selenic acid), 1.25 mg/㎖ 리놀레닉 산(linolenic acid), 10 ng/㎖ TGF-β를 사용하여 연골분화를 유도하였다. 2 내지 3 주간의 배양으로 알샨블루(Alcian blue)로 염색되었다. 염색(동결절편) 연골기질 내의 콘드로이친이 파랗게 염색되었다(도 11).

(3) 나아가, 1 uM 덱사메타존, 50 uM 아스코르빈산-2-인산, 10 mM β- 글리세로포스페이트(β- glycerophosphate)로 골분화를 유도하였다. 2 내지 3 주의 배양으로, 본 코사(von Kossa)염색으로 염색되었다(미네랄의 침착). 결과를 도 12에 나타내었다.

<실시예 8> 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도

(1) 중배엽간세포로부터 신경간세포로의 유도

상기 실시예와 같은 양상의 방법으로 hTERT 유전자를 도입하는 것에 의하여 불사화된 중배엽간세포인 간엽계간세포(MSC)를 사용하여 이하의 실험에 제공하였다.

우선, 불사화된 세포를 세정하고 다음으로, 배양용액으로부터 세포를 산소처리(시약 (0.05% 트립신, 0.02% EDTA, 실온, 5 분간)에 의하여 떼어내고 등량의 배양액을 가하여 수회 피펫팅하여 단일세포로 분리하였다. 다음으로, 900 g에서 5 분간 원심분리하였다. 침전한 세포를 피펫으로 흡인하였다. 다음으로, 새로운 배양액 1[DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FCS 1%, bFGF 10 ng/㎖ 및 EGF 10 ng/㎖을 매일 첨가)] 또는 배양액 2[NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 10 ng/ml hEGF(human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamycine-amphotericinB, 10 ng/ml hFGF(human fibroblast growth factor), bFGF(Basic fibroblast growth factor)10 ng/ml 및 EGF(Epidermal growth factor)10 ng/ml을 매일 첨가)], 배양용기(Non-treated polystyrene dish)에서 부유한 그대로의 상태에서 5% CO₂, 37℃로 배양을 계속하였다.

이 방법에 의한 중배엽간세포로부터 신경간세포로의 분화유도의 확인은, 중배엽계세포의 마커인 SH2와 SH3가 사라지고(신경간세포의 마커인 네스틴(nestin)은 원래 음성), 그 대신 신경간세포의 마커인 네스틴이 양성이 되는 것으로 하였다(도 13).

중배엽간세포로부터 신경간세포로의 분화유도에 의하여, 배양세포는 형태적 으로도 변화하였다. 구체적으로는, 단일 세포였던 세포가 뉴로스피어를 형성하였다(도 7). 또한, 이 신경간세포로부터 신경세포(NSE 양성)와 아교세포(GFAP 양성)가 분화하여 가는 것도 확인하였다(도 14).

(2) 중배엽간세포로부터 신경세포와 아교세포로의 유도[1]

배양하고 있는 상기의 중배엽간세포의 배양액을 새로운 배양액 [DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 50%, F-12 50%, FSC 1%)] 혹은 배양액 2[NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics), 2% Neural survival factors (Clonetics), 10 ng/ml hEGF(human Epidermal growth factor), 0.2% Gentamycine-amphotericinB, 10 ng/ml hFGF)]로 바꾸고 약 4 주간 정도 배양하는 방법에 의하여 중배엽간세포로부터 직접적으로 (신경간세포로의 전환을 하지 않고) 신경세포와 아교세포로 분화유도 시키는 것에 성공하였다.

(3) 중배엽간세포로부터 신경세포와 아교세포로의 유도[2]

중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도는 이하와 같이 행하는 것도 가능하다. 신경유도에 관하여는 과거의 문헌에 준하여 행하였다(Journal of neuroscience research 61 : 364-370, 2000). 우선, MSC KY hTERT 세포수를 조절하였다. 구체적으로는, 10 cm 접시에서 미리 배양하고, 70 내지 80 % 컨플루언트의 시점에서 상등액을 흡인하여 PBS 5 ㎖로 세정 후 trypsin-EDTA 1 ㎖을 가하여 세포를 회수하였다. 210 g에서, 10 분의 원심분리로 세포를 펠렛으로 만들어 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 2 ×10⁴ 세포/1 ㎖이 되도록 세포농도를 조절하였다. 6 웰 플레이트에 2 ㎖ 씩(4 ×10⁴ 세포) 플레이팅하고, 24 시간 후에 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM을 제거하고 1 mM의 2-ME, 10% 소태아혈청을 함유하는 DMEM 2 ㎖로 배지를 교체하였다(전유도, pre-induction). 나아가, 24 시간 후에 혈청을 제거하여 이하 3 종의 신경유도를 행하였다.

ⅰ) 1 mM의 2-ME을 함유한 DMEM 2 ml, ⅱ) 10 mM의 2-ME을 함유한 DMEM 2 ml, ⅲ) 200 uM의 BHA(buthylated hydroxyanisole, Sigma)와 2% DMSO(dimethylsulfoxide, NACALAI)을 포함한 DMEM 2 ml. 이상의 배지에서 24 시간 유도 후 형태관찰을 행하였다.

그 결과, ⅰ)의 배지에서는, 평평한(flat) 세포질을 갖는 MSC KY hTERT는 세포질이 퇴축(退縮)하고, 2 극 혹은 다극을 가지면서 인접하는 세포와 연락을 취하는 것 같은 형태를 나타내었다. ⅱ)ⅲ)의 배지에서는, 대부분 같은 모양의 형태를 가지는 세포가 ⅰ)에 비해 많이 보여졌다. 이러한 형태 변화는 과거의 문헌과 같은 형태의 소견을 나타내는 것이다. 나아가, 더 한층 분석하여 신경 마커의 면역염색을 행하였다. 항체는 GFAP(Glial fibrillary acidic protein, Cappel), MBP(Myelin basic protein, Chemicon), NSE(Neuron specific enolase, ARP)의 3 종류로 각각 원액의 50배, 200배, 200배 희석하여 사용하였다. 또한, 면역염색에는 Vec tastain Elite ABC kit(VECTOR laboratories)와 기질로서는 DAB 기질 키트(VECTOR laboratories)를 사용하였다. 고정은 2% 파라포름알데히드, 내재성 퍼옥시다제 저해약으로서 0.3% 과산화수소를 이용하였다. 신경유도는 전술한 바와 같이 행하고 면역염색도 유도 24 시간 후에 행하였다.

<실시예 9> 신경재생능의 평가

상기 분화유도 방법에 의하여 얻어진 신경계세포의 신경재생능력에 관하여는, 뇌경색 모델, 치매 모델, 척수손상 모델, 탈수 모델에서의 검토 결과, 뇌로부터 추출, 배양한 신경간세포와 같은 정도의 재생능력이 있는 것이 판명되었다(도 15).

<실시예 10> 뉴로스피어(neurosphere) 모양 세포의 신경세포 분화

상기 실시예와 같은 양상의 방법에 의하여 hTERT 유전자를 도입하는 것에 의하여 불사화된 중배엽간세포인 간엽계세포(MSC-hTERT), 비슷하게 hTERT 유전자를 도입한 스트로마 세포(Stroma-hTERT), PDF 세포, Hella 세포, HepG2의 각 세포를 부유 후, NPBM/비처리 접시(Neural Progeniter basal medium/Non-treated dish)에서 배양하였다. 48 시간 후에 세포의 형태를 관찰한 경우, MSC-hTERT 세포, Stroma-hTERT, PDF 세포가 스피어 모양을 나타내었다(도 16).

또한, 상기 각 세포를 본 발명의 방법으로 신경간세포로 분화유도 후, 곧 부유시킨 상태에서 NPBM/비처리 접시(Neural Progeniter basal medium/ Non-treated dish)에서 1 일, 2 일, 5 일간 배양 후, 총 RNA를 조제하고(prepared) RT-PCR로 네스틴(nestin)의 발현을 관찰하였다.

10% FBS 함유 DMEM에서 그대로 배양을 계속한 것을 대조로 하였다. 이 방법에 의한 중배엽간세포로부터 간세포(幹細胞)로의 분화유도의 확인은, 실시예 8에 기재한 것과 같이, 신경간세포의 마커인 네스틴이 양성이 되는 것으로 하였다.

그 결과, MSC-hTERT, MSC, Stroma-hTERT, PDF의 2 일간 및 5 일간 배양세포의 레인에 네스틴(nestin)의 발현이 관찰되었다(도 17).

<실시예 11> 신경세포로의 분화, 뉴로스피어 형성

실시예 10에서 사용한 각 세포를 세포농도가 5 ×10⁴ 개/웰 이 되도록 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 6 웰에 플래이팅하였다. 하룻밤 배양 후, 10% FBS를 함유하는 DMEM에 1 mM β-ME을 첨가한 배지로 교환하고, 다시 하룻밤 배양하였다. 다음으로, 2% DMSO/ 200 uM BHA(butylated hydroxyanisole)을 함유한 DMEM 배지로 교환하고 유도하였다. 4 일 후에 세포를 회수하고, 총 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.

또한, 상기 각 세포를 NPBM(FGF(20 ng/㎖) 및 EGF(20 ng/㎖))배지를 사용한 비코팅 용기에 세포농도가 5 ×10⁵ 개/10 cm접시가 되도록 플래이팅 하고, 뉴로스피어를 형성시켰다. 4 일 후에 세포를 회수하고 각 세포를 NPBM(FGF, EGF(-))에서 1×10⁵ 개/웰(Poly-D-Lysine/laminine coated 6 well)농도로 플래이팅하였다. 10 일 후에 세포를 회수하고 총 RNA를 조제하여 RT-PCR을 수행하였다.

시료 중의 cDNA농도의 차를 보정하기 위하여 보정용 내부 표준으로서 글리세 르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)유전자에 대하여 같은 방법으로 분석을 하였다.

그 결과, MSC-hTERT로부터 유도한 신경세포(도 18 레인 6; BHA, DMSO) 및 MSC-hTERT로부터 신경간세포를 경유하여 신경세포로 분화유도한 세포에 있어서(도 18 레인 13; NPBM(-) PDL/laminin), NF-M의 발현이 특히 강하게 보여졌다.

<실시예 12> 네스틴의 발현

MSC-hTERT에 네스틴(nestin)이 양성이 되면, EGFP가 발현하는 벡터를 유전자도입하여 세포주를 만들었다. 인비트로에서 신경간세포로의 분화유도를 행하고, 공초점레이저 현미경에 의하여 세포를 관찰한 경우, 네스틴 양성의 MSC-hTERT는 녹색 형광을 발하는 것이 확인되었다(도 19). 나아가 RT-PCR에 의해서도 네스틴의 발현이 확인되었다(도 20).

본 발명에 의하여, 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법, 중배엽간세포를 증식시키는 것으로 충분한 양의 세포를 획득하고 나아가, 신경간세포 및 신경계세포로 효율적으로 분화유도 시키는 신규한 방법, 당해 방법에 의하여 얻어지는 신경계세포, 당해 신경계세포를 포함한 신경계질환의 치료를 위한 조성물 및 당해 조성물을 이용한 신경계질환의 치료방법이 제공된다.

통상의 사람 배양 중배엽간세포는 배양조건 하에서의 증식이 어느 정도 제한 되어 버리는 것에 대하여, 본 발명에 있어서 hTERT유전자를 도입한 중배엽간세포는 상당히 다량으로 안정하게 증식시키는 것이 가능하고 게다가, 암 유전자 등을 도입하여 불안정화한 경우에 보여지는 세포 그것의 형질전환은 인지되지 않고, 원래 세포의 성질을 유지한 대로 불사화(immortalization)를 실현할 수 있다. 또한, 충분한 증식이 얻어진 후, hTERT 유전자를 제거하는 것도 가능하다.

본 발명의 방법은 중추성 및 말초성의 탈수질환, 중추성 및 말초성의 변성질환, 뇌졸증(뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈을 포함한다), 뇌종양, 치매를 포함하는 고차기능장애, 정신질환, 간질, 외상성의 신경계질환(두부외상, 뇌좌상, 척수손상을 포함한다), 염증성질환, 감염성질환(예를 들어 야콥병 등) 및 척수경색 등의 각종 신경계질환의 치료에 크게 기여하는 것이다. 또한, 본 발명은 보다 일반적으로 넓은 영역의 뇌신경손상에 대응하는 신경이식, 재생요법으로의 응용도 가능하다고 생각된다. 즉, 중추성 및 말초성의 탈수질환, 중추성 및 말초성의 변성질환, 뇌졸증(뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈을 포함한다), 뇌종양, 치매를 포함하는 고차기능장애, 정신질환, 간질, 외상성의 신경계질환(두부외상, 뇌좌상, 척수손상을 포함한다), 염증성질환, 감염성질환(예를 들어 야콥병 등) 및 척수경색에의 자가이식요법에 응용가능하다.

나아가, 본 발명의 분화유도 방법은 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화기작을 푸는 열쇠를 제공하고 있다. 이러한 분화를 규정하는 유전자가 동정, 해석되면 그들 유전자를 이용하여 중배엽간세포를 효율적으로 또, 충분량 신경계세포로 형질전환시키는 것이 가능하게 된다. 따라서, 신경조직의 재생을 촉진하기 위 한 유전자치료가 가능하게 되는 것이 크게 기대된다.

또한, 본 발명의 방법은 신약 개발을 위한 기능검사, 독성검사, cDNA 클로닝에의 응용이 기대된다. 신경에 작용하는 치료약의 개발을 위한 기능검사와 독성검사, 사람 유래의 신경계세포의 기능을 수식하는 신규 cDNA를 탐색하는 경우 등, 세포를 사용한 에세이 시스템에는 통상, 다수의 신경세포를 필요로 하지만, 사람 신경세포의 충분한 공급은 종래 매우 곤란하였다. 또한, 마우스 등의 세포로부터 불사화 세포주를 얻는 것은 종래로부터 비교적 간단한 것이었지만, 사람 이외의 동물세포와 사람 신경세포와의 종에 따른 차이(species specificity)가 큰 경우가 많고, 동물세포와 동물개체를 사용하는 실험결과에서는 사람세포의 대체로서 사람에 적용하는 것이 곤란한 경우가 많았다. 당해 발명의 방법과 세포를 사용하면, 모든 실험을 수행하는데 충분한 만큼의 사람 신경계세포를 용이하게 대량으로 얻는 것이 가능하고, 게다가 본래의 사람 신경세포의 성질과 기능을 유지한 상태에서 얻는 것이 가능하다. 신약 개발을 위한 기능검사, 독성검사, cDNA 클로닝으로의 응용에 있어서, 종래에는 양적으로 제한되기 때문에 불가능했던 방법에 대해서 비약적인 기술혁신을 기대할 수 있다.

예를 들어, 지금까지 화합물(약)의 기능검사와 독성검사는 래트 등의 실험동물에 투여하는 것으로 행하여져 왔으나, 래트에서의 실험결과가 사람에는 맞지 않는 것이 많아 사람의 시료를 이용한 실험이 강력히 요망되어 왔다. 그 중에서도 특히, 사람의 신경계세포의 입수는 대단히 곤란하기 때문에 충분한 양의 사람 신경계세포의 입수가 가능하다면 사람 신경계세포를 이용한 기능검사와 독성검사가 용 이하게 되고, 신약개발에 대단히 유용하게 된다. 우리들의 불사화 사람 MCS에서 다량으로 세포를 획득하고 그것을 본 발명의 방법으로 신경계세포로 분화유도 하는 것에 의하여, 다량의 사람 신경계세포를 획득하는 것이 가능하다.

나아가, 본 발명에 있어서는 중배엽세포로부터 신경계세포로 유도하는 기술을 제시하고 있지만, 이 경우 분화하는 유전자를 클로닝하는 것으로 증식, 분화를 억제하는 유전자의 동정을 기대할 수 있다. 또한, 동 연구에 있어서, 다량의 세포가 필요하지만, 본 발명의 방법에 의하여 불사화한 사람 MCS를 다량으로 입수할 수 있으므로 유전자 클로닝도 행하기 쉬운 등의 이점이 있다.

Claims (21)

1. 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획에 포함되는 중배엽간세포 또는 ES 세포를 DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 또는 NPBM(Neural progenitor cell basal medium) 배지에 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 및 EGF(Epidermal growth factor)을 각각 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖ 농도로 첨가한 배양액에서, 33℃ 내지 38℃ 조건으로 부유배양하는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
2. 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.

   (a) 불사화유전자(immortalization gene)를 고발현 또는 활성화시키는 것에 의하여 불사화한 중배엽간세포를 제공하는 공정,

   (b) 공정 (a)의 불사화한 중배엽간세포를 DMEM(Dulbecco's modified essential medium) 또는 NPBM(Neural progenitor cell basal medium) 배지에 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 및 EGF(Epidermal growth factor)을 각각 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖ 농도로 첨가한 배양액에서 부유배양하는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로 유도하는 공정.
3. 제 2항에 있어서, 불사화유전자를 중배엽간세포 내로 도입하는 것에 의하여 불사화유전자를 고발현 또는 활성화시키는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
4. 제 3항에 있어서, 불사화유전자를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 중배엽간세포로 도입하는 것에 의하여 중배엽간세포를 불사화시키는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
5. 제 4항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 pBabe인 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
6. 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 신경계세포가 유전자 제거처리에 의하여 불사화유전자를 제거할 수 있고, 또는 제거된 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
7. 제 6항에 있어서, 불사화유전자의 유전자 제거처리가 불사화유전자를 loxP 배열(loxP sequence) 또는 loxP 모양 배열(loxP like sequence)에 삽입 후 리콤비나아제 처리하는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
8. 제 2항에 있어서, 불사화유전자가 틸로머라아제 유전자, 틸로머라아제로부터 파생하는 유전자, 또는 틸로머라아제의 발현 혹은 활성을 조절하는 유전자 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
9. 제 2항에 있어서, 중배엽간세포가 골수액, 제대혈, 말초혈, 피부, 피부의 모근세포, 근조직, ES 세포 또는 ES 세포로부터 파생하는 세포 중 어느 하나에서 유래하는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
10. 제 2항에 있어서, 중배엽간세포가 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈로부터 분리된 단핵세포 분획에 포함되는 중배엽간세포인 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
11. 제 1항에 있어서, 단핵세포 분획이 척추동물로부터 채취한 골수액 또는 제대혈을 2000 회전에서 비중에 상응하는 분리에 충분한 시간으로 용액 중에서 밀도구배 원심분리를 행하고, 원심분리 후 비중 1.07 g/㎖부터 1.1 g/㎖의 범위에 포함되는 세포분획을 회수하는 것에 의하여 얻을 수 있는 세포분획인 것을 특징으로 하는 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
12. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 중배엽간세포가 SH2(+), SH3(+), SH4(+), CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)의 특징을 가지는 세포인 것을 특징으로 하는 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
13. 제 2항에 있어서, 33℃ 내지 38℃의 조건에서 배양을 행하는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
14. 삭제
15. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 신경계세포가 신경간세포, 신경전구세포, 신경세포 및 아교세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 중배엽간세포 또는 ES 세포로부터 신경계세포로의 분화유도 방법.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제

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