KR101269125B1

KR101269125B1 - 노치 신호 활성 유전자를 이용한 줄기세포의 증식 방법

Info

Publication number: KR101269125B1
Application number: KR1020110009708A
Authority: KR
Inventors: 남도현; 홍승철; 강봉구; 주경민
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2013-06-04
Also published as: KR20110090810A

Abstract

본 발명은 노치 (Notch) 신호를 활성화시키는 유전자가 도입되어 있는 줄기세포 및 이를 이용한 줄기세포 증식방법에 관한 것으로, 구체적으로는 줄기세포를 NICD (Notch intracellular domain) 유전자로 형질전환시켜 노치 신호전달 체계를 활성화시킴으로써 줄기세포의 증식능을 현저히 높이는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 노치(Notch) 신호의 활성화를 통해, 증식능이 우수한 줄기세포를 대량으로 수득할 수 있다. 특히, 종래 기내 배양이 어려웠던 신경 줄기세포의 대량 증식이 가능하므로 뇌신경질환 치료용 세포치료제의 제조에 더욱 유용하다

Description

노치 신호 활성 유전자를 이용한 줄기세포의 증식 방법{Method for Proliferating Stem Cells Using Genes Activating Notch Signaling}

본 발명은 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자가 도입되어 있는 줄기세포 및 이를 이용한 줄기세포 증식 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 줄기세포를 NICD(Notch intracellular domain) 유전자로 형질전환시켜 노치 신호전달체계를 활성화시킴으로써 줄기세포의 증식능을 현저히 높이는 방법에 관한 것이다.

21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터 개발이나 질환 유전자에 대한 지식 부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.

이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다.

특히, 신경줄기세포는 자기복제능력 및 중추신경계를 구성하는 신경세포, 성상세포(astrocyte), 핍지세포(oligodendrocyte) 등의 세가지 구성세포로 분화하는 다분화능력을 가지고 있어 이러한 신경줄기세포를 이용한 줄기세포의 증식과 분화기전 및 신경계 발달에 관한 기초연구뿐만 아니라, 한번 손상되면 재생되지 않는다고 알려져 있는 신경계질환에서 신경줄기세포의 생물학적 특성을 이용하여 새로운 세포 및 유전자 치료의 가능성에 대한 관심이 증대하고 있다.

이러한 줄기세포들은 그 배양에 있어서, 특정한 세포적 미세환경 (microenvironment) 또는 적소 (niche)를 필요로 한다는 것이 줄기세포 생물학의 정설이다. 신경줄기세포를 선택적으로 배양하는 배양 기술도 뉴로스페어 (neurosphere) 형성법, 저밀도 배양법, 고밀도 배양법 등이 보고되었으나, 현재까지 메분화 상태의 대규모 배양에서 세포들을 확장하는 것은 어려운 것으로 알려져 있다.

여러 연구자들이 줄기세포의 대량배양을 시도하고 있지만, 특히 인간 성체 신경줄기세포는 기내배양 자체가 매우 어려우며, 또 그 증식능력 또한 제한되어있어 연구의 답보가 거듭되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 인간 성체 신경줄기세포의 제한된 증식능의 문제를 극복하기 위해 본 발명자는 일차 배양된 성체 신경줄기세포에 NICD(notch intracellular domain) 유전자를 도입한 후 NICD 유전자가 성체 신경줄기세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 노치(Notch) 신호 활성화 유전자가 도입되어 있어, 증식능이 우수한 줄기세포 및 이의 증식방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 NICD(Notch intracellular domain) 유전자가 도입된 신경줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 뇌 신경질환 치료용 세포 치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자가 도입되어 있는, 형질전환된 증식능이 우수한 줄기세포 및 상기 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자가 도입되어 있는(형질전환된) 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식방법을 제공한다.

본 발명은 또한 NICD(Notch intracellular domain) 유전자가 도입되어 있고 노치 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에 따르면 노치(Notch) 신호의 활성화를 통해, 증식능이 우수한 줄기세포를 대량으로 수득할 수 있다. 특히, 종래 기내 배양이 어려웠던 신경 줄기세포의 대량 증식이 가능하므로 뇌신경질환 치료용 세포치료제의 제조에 더욱 유용하다.

도 1A는 인간 측두엽 뇌조직 및 해마 뇌조직의 일차배양을 통해 확보한 성체 신경줄기세포의 계대별 사진[P0: 기내 배양 시작 시점의 세포 ; P18: 계대 배양 18회차의 세포] 이고, 도 1B는 기내 계대배양을 통해 증식시킨 성체 신경줄기세포 수를 누적하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간 성체 신경줄기세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법 (innumolcytochemistry)을 통해 검증한 결과를 나타낸 것이다[A:Nestin+/CD133+/GFAP+/Olig2-/Tuj-1- ; B: Sox2+/Sox9+/Vimentin+/Sox10-]
도 3은 인간 성체 신경줄기세포의 분화능을 검증하기 위해 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법 (immunocytochemistry) 통해 검증한 결과를 나타낸 것으로, 기내 배양을 통해 확보한 성체 신경줄기세포가 전 계대에 걸쳐 분화능을 유지하고 있음을 검증한 결과로, 3회 계대 배양을 거친 초기단계의 세포 (Early paggasge) 및 18회 계대 배양을 거친 후기 단계의 세포 (Late passage) 모두 신경세포로의 분화한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 성체 신경줄기세포에 NICD 유전자의 도입을 위해 제작한 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터의 구조(A)와 NICD 유전자가 도입된 성체 신경줄기세포를 대상으로 신경 줄기세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법을 통해 검증한 결과(B, 신경줄기세포 특이적인 마커) 및 이들 세포를 대상으로 하위 신경세포로의 분화능을 검증한 결과이다(C, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, 뉴런 특이적인 마커).
도 5은 NICD 유전자가 도입된 성체 신경줄기세포의 증식능을 CCK 분석법을 통해 검증한 결과(A)와 계대 배양하여 증식된 총 세포의 숫자를 누적하여 나타낸 그래프(B)이다.

본 발명은 일 관점에서 노치(Notch) 신호 활성화 유전자가 도입되어 있는, 증식능이 우수한 줄기세포 및 상기 줄기세포 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식방법에 관한 것이다.

에 관한 것이다. 즉, 다양한 조직으로의 분화능을 가지고 있어 세포 치료에 효과적인 줄기세포에 관한 것이다.

'줄기세포 (stem cell)'란 조직을 구성하는 각 세포로 분화 (differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 나눌 수 있는데, 본 발명에서는 생물학적, 윤리적, 그리고 법적인 문제가 많아 임상적용에 제한이 많은 배아 줄기세포가 아닌, 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 "성체 줄기세포 (adult stem cell)"는 성장한 신체조직으로부터 추출해낸 줄기세포로서, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포다. 성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 인체에 내재된 조직 특이적 전구세포로 분화할 수 있다. 성체 줄기세포는 분화하여 다양한 특성을 가지는 세포가 될 수 있고, 심장, 췌장, 신경 조직, 근육, 연골 등과 같은 광범위하게 위치한 조직 및 기관에 대한 대체 세포를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있다.

상기와 같은 성체 줄기세포는 인간, 영장류, 설치류, 및 조류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 포유류, 특히, 마우스, 랫트 및 인간으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간의 골수, 지방, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 뇌, 췌장, 간, 눈 및 태아 조직 등 대부분의 조직으로부터 성체 줄기세포를 수득할 수 있다.

인간의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 각 조직에 적절한, 당업계에 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수득한 특정 조직을, 트립신 용액 및/또는 콜라게나아제 등을 처리하여 단일 세포체로 분리한 후, bFGF, EGF등의 성장인자 (growth factor)를 적합한 양으로 첨가한 적합한 배지에서 배양한 다음, FACS 등으로 분리하거나 성장속도에 따라 성체 줄기세포를 분리하는 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 예로는 성체 신경줄기세포 (Neural stem cells) 또는 신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells;. NCSCs)를 들 수 있다.

"신경줄기세포 (Neural stem cells)"는 20-30회 이상 세포 분열을 수행할 수 있고, 뉴런 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능 (potency)을 유지하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는 50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 다분화능 (multipotent)으로 정의되고, 즉, 다수의 신경세포 유형들(예를 들면, 뉴런/신경아교세포)로 분화할 수 있다. 신경줄기세포는 중추신경계 (Central nervous system: CNS)와 말초신경계 (peripheral nervous system: PNS)의 조직을 일차 배양하여 확보할 수 있으며, 이 세포는 특정 분화 조건에서 glial lineage와 neural lineage 등으로 분화하게 된다(Sally Temple et al. 2001). "신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells;. NCSCs)"는 초기 배 발생 과정 중 한시적으로 나타나는 줄기세포로서, 마찬가지로 다분화능 줄기세포이다.

다양한 출처로부터 신경줄기세포를 수득하는 것이 가능하다. 예를 들어 인간 성체 뇌조직으로부터 수득할 수 있는데, 상기 뇌는 대뇌, 간뇌, 중뇌, 소뇌, 연수, 뇌교 및 척수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 대뇌로부터 유래한 것, 구체적 예로는 측두엽 조직 또는 해마 조직일 수 있다. 인간의 신경줄기세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 바람직하게는 인간 성체의 뇌조직으로부터 얻은 세포를 신경줄기세포 성장인자가 첨가된 배지에서 배양하여 제조할 수 있다(실시예 1).

특히, 상기 성체 신경줄기세포는 기내 배양 자체가 매우 어려우며 그 증식능력 또한 제한되어 있어 기존의 배양 방법으로는 미분화 상태의 신경줄기세포를 대량으로 증식하는 것이 곤란했다.

신경줄기세포들의 대칭적 분열을 촉진하는 방법을 개시하고 있는 WO 2005/121318에서는 EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성 및 FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성을 이용하고 있으나, 이와 달리, 본 발명에서는 줄기세포를 노치 신호 활성화 유전자로 형질전환시켜, 노치 신호전달체계를 활성화시킴으로써 줄기세포, 특히 신경줄기세포의 증식능을 개선하여, 대량으로 수득할 수 있게 함으로써 상기 문제점을 해결하고 있다.

본 발명의 줄기세포는 구조적으로는 노치 (Notch) 신호를 활성화시키는 유전자로 형질전환되어 있고, 기능적으로는 노치 신호전달체계가 활성화되어 있다.

노치 (Notch)는 변이 시 초파리의 날개의 과잉성장을 유도하여 날개의 홈을 만드는 유전자에서 유래한 이름이며, 다세포동물에서 세포간의 빠른 신호전달과 증폭을 목적으로 하는 신호체계이다. 노치 (Notch)는 세포에 부착된 Delta 또는 Serrate ligand를 통하여 세포와 세포의 접촉에 의한 신호를 보내게 되고, 본 발명에서는 이러한 노치 신호전달체계를 활성화시키기 위하여 이에 관여하는 유전자를 줄기세포에 도입하였다.

줄기세포를 노치 (Notch) 신호 활성화 유전자로 형질전환한다는 것은 상기 유전자를 암호화하는 핵산을 줄기세포에 도입하는 것을 말한다.

본 발명에서는 노치 (Notch) 신호를 활성화시키는 유전자라면 제한없이 사용할 수 있지만, 바람직하게는 NICD 유전자를 사용할 수 있다. NICD를 암호화하는 핵산으로는, 당업계에 공지된 NICD를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열을 포함하는 NICD를 암호화하는 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 NICD의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다.

상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 80％,보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 NICD과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％,71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％,88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. NICD와 '동등한 생리활성'이란 노치(Notch) 신호전달체계를 활성화하는 활성을 의미한다. 또한 상기 NICD을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명에서, 노치 (Notch) 신호를 활성화시키는 유전자, 예를 들어 NICD을 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. '발현 조절 서열 (expression control sequence)'이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 그리고 '발현 벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.

상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 등이 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 렌티 바이러스 벡터를 사용하였다.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용한 렌티 바이러스를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 줄기세포 내로 도입할 수 있다.

본 발명의 일 구체예인 노치(Notch) 신호 활성화 유전자로 형질전환된 신경줄기세포는 예를 들어, 이하와 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

(a) NICD을 암호화하는 핵산을 함유한 DNA 구조물을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 NICD 발현 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및

(c) 상기 NICD 발현 재조합 바이러스로 신경줄기세포를 감염시키는 단계.

상기 바이러스 생산 세포주는 사용한 바이러스 벡터에 해당하는 바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있으며, 예컨대 렌티 바이러스 벡터를 사용한 경우에는 렌티 바이러스 생산세포주인 293FT 세포를 사용할 수 있다. 그리고 나서, NICD을 발현하는 재조합 렌티 바이러스 벡터를 인간의 신경줄기세포에 감염시킨다. 본 발명에서는 특히, 일차 배양된 줄기세포에 노치 (Notch) 신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자를 도입하는 것이 바람직하다.

렌티 바이러스를 인간의 신경줄기세포에 감염시키기 위해서는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 신경줄기세포를 성장인자 함유 배지에 플레이팅하고, 폴리브렌 (polybrene)을 처리한 후 적정 MOI (multiplicityof infection)에 해당하는 바이러스성 입자를 배지에 첨가하여 세포를 감염시킨다. 감염 후 기존 바이러스 포함 배지를 새로운 신경줄기세포 배양 배지로 교체하여 배양하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 노치 신호 활성화 유전자 과발현 줄기세포주는 증식 능력이 매우 우수하다. 즉, 줄기세포에 노치 신호 활성화 유전자를 도입시킴으로써 노치 신호전달체계가 활성화되면 해당 줄기세포의 증식이 활발해진다. 이와 같은 본 발명의 증식능이 우수한 줄기세포의 가장 바람직한 예는, NICD 유전자가 도입되어 있고 노치 신호전달체계가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포이다.

본 발명의 일 태양으로, 상기 방법으로 제조된 NICD 유전자가 도입되어 있고 노치 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포는 이하와 같은 특성을 가진다.

(i) 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin, CD133 및 을 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP를 발현함.

(ii) 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 Olig2, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질은 발현하지 않음.

(iii) 신경원세포, 희소돌기아교세포 및 성상세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 분화할 수 있는 능력을 가짐.

(iv) NICD를 과발현함.

(iv) 노치 신호 전달체계가 활성화되어 있음.

본 발명의 일 실시예에서는 NCID 유전자가 도입된 신경줄기세포를 배양한 결과, 야생형 세포주에 비하여 세포증식이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(실시예 4-3 참조).

본 발명의 줄기세포의 배양에 사용할 수 있는 배지는 당업계에서 줄기세포의 종류에 따라 공지되어 있는 적절한 배지를 사용할 수 있고, 아스코르브산, 표피성장인자 (EGF), 인슐린, 항생제 및 FBS (Fetal bovine serum) 등을 첨가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 신경줄기세포인 경우에는 성장인자 함유 NBE 배지, 보다 구체적으로 B27 ^TM supplement, N2 ^TM supplement, bFGF 및 EGF 등을 함유하는 배지를 사용할 수 있다.

줄기세포를, 노치신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자로 형질전환시켜 배양하면, 형질전환하지 않은 줄기세포와 비교하여 세포 증식이 매우 활발히 이루어진다. 그리고, 계대 배양을 진행함에 따라 줄기세포수의 누적 증가율 또한 현저하게 차이가 나타난다. 이때, 3대 계대 이상 배양하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 줄기세포 증식 방법에서는 노치 신호 활성화 유전자를 줄기세포에 도입시켜 노치 신호전달체계가 활성화시킴으로써, 줄기세포가 미분화 상태로 대량으로 증식시키도록 한다. 노치 신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자의 줄기세포로의 도입은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명은 다른 관점에서, 구조적으로는 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자로 형질전환되어 있고, 기능적으로는 노치 신호전달체계가 활성화되어 있는 줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 세포 치료제에 관한 것이다.

특히, NICD 유전자가 도입되어 있고 노치 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 함유하는 뇌신경질환 치료용 세포 치료제로 사용할 수 있다. 상기 뇌신경질환으로는 대표적으로 신경퇴행성 질환이 있다. 신경퇴행성 질환 또는 질병은 뉴런 소실 또는 기능장애와 관련된 질환 또는 의학적 상태이다.

신경퇴행성 질환 또는 질병의 예로는 신경퇴행성 질환, 중추신경계 손상 또는 기능장애가 포함된다. 신경퇴행성 질환으로는, 예를 들면, 알츠하이머병 또는 기타 치매, 다발성 경화증 (MS), 정신분열증, 시력 감퇴, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 말초신경 장애, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병이 포함된다. CNS 손상으로는, 예를 들면, 뇌졸중과 같은 뇌혈관 사고 (예를 들면, 출혈성 뇌졸중, 국소 허혈성 뇌졸중, 또는 전뇌 허혈성 뇌졸중), 안허혈, 및 경막 정맥동 혈전증; 외상성 뇌 또는 척수 손상 (예를 들면, 뇌 또는 척수 수술 또는 신체 사고에 의해 야기된 손상); 뇌진탕; 약물(예를 들면, 화학치료제, 기분전환용 약물, 및 신경이완제)에 의해 야기된 손상; 관상동맥 우회로 이식 (CABG) 수술; 및 분만시 허혈이 포함된다. CNS 기능장애로는, 예를 들면, 우울증, 간질, 신경증 및 정신병이 포함된다

상기에서 '치료 (treatment)'는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화 (palliation),(일부 또는 완전한) 완화 (remission)를 포함한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다.

또한, 본 발명은 세포 치료제를 제조하기 위한 노치 신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자로 형질전환된, 줄기세포 특히, 신경줄기세포의 용도를 제공한다. 본 발명의 줄기세포 및 이의 효과에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.

본 발명에 따른 줄기세포는 원하는 조직 부위로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여되어, 기능적으로 결핍된 부위를 재구성하거나 재생한다. 예를 들어, NICD 유전자가 도입되어 있고 노치신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선 줄기세포를 인간의 신경줄기세포를 중추신경계의 유조직 또는 수막강내 부위로직접 이식한다. 이식은 단세포 현탁액 또는 ㎕ 당 1×10⁵~1.5×10⁵세포 밀도의 작은 집합체를 이용하여 수행할 수 있다. 세포치료제의 통상적인 투여량은 10⁴~10¹⁰ cells/body, 바람직하게는 10⁶~10⁸ cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명에 따른 줄기세포는 인간 내로의 투여를 위해 약학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 의약 제형의 일반적인 원리에 대해서는 공지의 문헌을 참고할 수 있다.

아울러, 본 발명은 노치신호가 활성화되어 있는 줄기세포, 특히 신경줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 종양의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 '유효한 양'이라 함은 본 발명의 줄기세포가 투여 대상인 개체 내에서 치료하는 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체(subject)'란 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물을 의미한다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다. 본 발명의 줄기세포는 상기 기재한 효과 중에서 원하는 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 인간 신경줄기세포의 획득

1-1: 인간 신경줄기세포의 분리 및 배양

간질 환자의 외과적 수술을 통해(삼성 서울병원 신경외과) 측두엽(temporal lobe) 및 해마(hippocampus) 조직을 수득하였다.

각 조직을 수술 후 3 시간 이내에 PBS로 수세한 후 수술용 가위 또는 면도칼 등을 사용해 기계적으로 분쇄하고, 37 ℃ 하에서 Collagenase(0.4 ㎎/㎖, Gibco) 와 DNaseI(0.01-1 ㎎/㎖, Roche) 또는 Papain(10 unit/㎖, Sigma), D-L-Cystein(400 ng/ml, Sigma)과 DNaseI(0.01-1 ㎎/㎖, Roche)를 혼합하여 제조한 효소액에 1 시간 이내로 처리하였다. 이후 혈청 피펫을 사용해 단세포 수준으로 해리시킨 후 나일론 메쉬(nylon mesh)를 통과시켜 단일 세포들을 확보하였다.

상기 단일 세포현탁액을 퍼콜 (Percoll, Sigma) 농도 구배 원심분리하여 적혈구 및 죽은 세포들을 제거하였다. 최종 수득한 세포들을 FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco), bFGF(R&D), EGF(R&D)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후, Poly-L-Ornithine(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여, 일차 배양된 신경줄기세포를 수득하였다.

1-2 : 계대배양

실시예 1-1에서 수득한 신경 줄기세포에 대하여 약 10 일 마다 계대배양을 실시하였다. 계대배양은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

세포 배양 플레이트에서 배지를 모두 제거하고, 세포에 0.05% 트립신/EDTA(T/E, Gibco) 2 ㎖를 처리하고, 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 1 분간 반응시켰다.이후, 트립신의 작용을 중단시키기 위하여 FBS가 1% 함유된 배양액 2.5 ㎖를 첨가하여 잘 혼합하였다. 세포 현탁액을 15 ㎖ 코니컬 튜브(cornical tube, Falcon)에 옮겼다. 원심분리를 하여 상층액을 제거하였다. 세포를 Neurobasal-A(Gibco) 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액 1 ㎖로 재부유 시킨 다음 세포수를 측정한 후, 약 1×10⁵~ 5×10⁵개의 세포를 포함하고 있는 세포 현탁액을 기존의 배지가 50% 포함되어 있는 새로운 세포 배양 플레이트에 옮기고, 50 ng/㎖ bFGF, 50 ng/㎖ EGF를 첨가한 후, 계속하여 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

도 1A는 분리한 인간 측두엽 및 해마 뇌조직의 성체 신경줄기세포의 계대별 사진을 나타내었다.

신경줄기세포의 계대 배양을 수행하며 증식하는 세포의 개수를 누적하여 분석한 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 기울기가 일정한 세포의 성장곡선을 확인하였다.

1-3 : 인간 신경줄기세포의 특성 분석

상기에서 수득한 신경줄기세포를 4% 파라포름알데히드 (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) 또는 아세톤/메탄올 고정액을 사용하여 고정시킨 후, 0.05% Triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 15 분간 permiablization을 진행하고 5% normal horse serum/1% normal goat serum(Vector lab.)으로 상온에서 1 시간 동안 조직을 blocking하였다.

이후, 0.01% triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 anti-CD133(Abcam),anti-musashi (Chemicon),anti-nestin(Abcam or Millipore), anti-Sox2(R&D), anti-Sox9(Abcam), anti-Sox10(Abcam), anti-Vimentin(Millipore), anti-GFAP(Sigma or Abcam), anti-Olig2(Millipore), anti-O4(Chemicon), anti-Tuj-I(Millipore) 각각의 항체를 조합하여 처리한 후 4℃에서 overnight로 반응을 시켰다.

그리고, 0.01% triton X-100을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 상온에서 1시간 동안 처리한 1차 항체에 대응되는 anti-mouse-488(BD), anti-mouse-594(BD), anti-rabbit-488(BD), anti-rabbit-594(BD), anti-rat-488(BD), anti-rat-594(BD) 2차 항체를 처리한 후 마지막으로 DAPI(Sigma)를 사용하여 핵 염색을 시행하였고, 최종 형광 발현은 형광현미경(Axiovert, Zeiss)하에서 검증하였다.

그 결과, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin, CD133 및 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP의 발현이 확인되었고, 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 Olig2, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질은 발현되지 않음을 확인하였으며(도 2A), Sox2, Sox9, 및 Vimentin은 강하게 발현하였다(도 2B). 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 신경 줄기세포의 특성 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

1-4 : 인간 신경줄기세포의 분화능 검증

상기에서 획득한 성체 신경줄기세포가 하위 신경세포로의 분화능력을 가지며, 계대 배양기간 중 분화능이 유지되는 것을 확인하기 위하여, FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후 Poly-L-Ornithine(Sigma) 및 Laminin(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여 부착시켰다. 이후 10%FBS를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액이나 Nerve growth factor(R&D), IBMX, dcAMP를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액에 1-2주일간 배양하여 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포를 대상으로 실시예 1-3에 기재된 방식으로 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역염색화학법을 이용해 분석하였고 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 분화능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).

실시예 2 : NICD ( Notch intracellular domain ) 발현 재조합 렌티 바이러스 제작

2-1 : 재조합 바이러스 벡터 제조

먼저, 서열번호 1의 NICD 유전자는 신경 줄기세포로부터 RT-PCR로 증폭하였다. 실시예 1의 신경 줄기세포로부터 total RNA는 Rneasy kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였고, 이후 역 전사효소인 Superscript III (Invitrogen)를 처리 cDNA를 합성하여 PCR 증폭의 주형으로 사용하였으며, EmGFP (Invitrogen) 유전자는 pLenti6.3/V5-GW/EmGFP (Invitrogen) 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머는 두 유전자 모두 lentivirus 벡터에서의 아미노산 발현을 개시하기 위해 CACC 서열을 포함하고 있다. 구체적으로 서열은 아래와 같다:

Forward primer: CACC ATG　 CGG CGG CAG CAT GGC CAG (서열번호 3)

Reverse primer: TTA CTT GAA GGC CTC CGG AAT G　　(서열번호 4)

PCR 반응은 94 ℃에서 5 분간 초기 변성; 94 ℃에서 1 분간 변성, 60 ℃에서 30 초간 어닐링(annealing) 및 72 ℃에서 3 분간 신장 (extension)의 15 사이클; 및 72 ℃에서 10 분간 최종 신장으로 수행되었다. 증폭된 PCR 산물을 pENTR-D-TOPO(Invitrogen) 벡터에 클로닝하였다.

그리고, 신경줄기세포에서의 안정적인 도입 유전자의 발현을 위해 인간 ubiquitin C (UbC) 유전자의 프로모터 부분을 pLenti6/UbC/V5-DEST (Invitrogen) 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머는 용이한 클로닝을 위해 ClaI 및 SpeI 제한효소 서열을 포함하고 있다. 상기에서 증폭된 UbC 유전자 프로모터 부분을 pGEM-T easy (Promega) 벡터에 클로닝하였고, 이후 ClaI 및 SpeI 제한효소를 처리를 통해 유전자 단편을 확보하였으며, 동일한 제한 효소를 사용하여 pLenti7.3/V5-DEST (Invitrogen) 벡터의 CMV 프로모터 부위를 제거하여 벡터의 단편을 확보하였다. 이후 상기의 유전자 단편과 벡터 단편을 Ligase(promega) 처리를 통해 UbC 프로모터가 삽입된 발현 벡터를 확립하였다.

Reporter 유전자의 삽입을 위해 상기의 벡터에 KpnI 제한효소를 처리해 벡터의 절편을 확보하였고, 동일한 제한 효소의 처리를 통해 pSuper-retro (Oligoengine) 벡터에서 항생제 발현 프로모터 및 유전자 단편을 확보하였다. 이후 상기의 유전자 단편과 벡터 단편을 Ligase(promega) 처리를 통해 UbC 프로모터가 삽입된 발현 벡터를 확립하였다. 확립된 발현 벡터에 LR clonase (Invitrogen)를 이용하여, NICD 및 EmGFP 유전자를 전달하여 최종 발현벡터를 확립하였다.

상기 방법으로 제조한 렌티 바이러스 벡터의 구조를 도 4-A에 도시하였다.

2-2 : NICD 발현 재조합 렌티 바이러스 제조

(1) 렌티 바이러스(Lentivirus)의 생산

Virus packaging 세포주로는 293FT (Invitrogen) 세포주를 사용하였다. 상기293FT 세포주에 실시예 2-1에서 제작한 NICD 과발현 벡터 및 virus packaging 관련 벡터 3종을 (pLP-1, pLP-2, pLP/VSVG) (Invitrogen) Lipofectamine reagent (Invitrogen)를 이용해 co-transfection 하여 virus 생산을 유도하였다.

(2) Lentivirus particle의 수거

상기에서 확보한 virus 생산 세포주의 세포 배양액을 co-transfection 후 72 시간까지 수거하였다. Virus가 생산되어 나오는 배양액을 새로운 배양 배지로 12 시간 간격으로 교체하며 상층 배양액을 6 회 수거하였다. 이 기간 중 수거한 virus는 4 ℃에서 보관하였다.

(3) Lentivirus particle의 적정 (titration)

상기에서 수거한 virus를 포함하는 상층 배양액을 0.22 ㎛ syringe filter를 통과시켜 세포 부유물을 제거하였다. 24-well plate에 1x10⁴ cells/ml의 세포농도로 배양된 293FT 세포에 6 ㎍/㎖ 농도의 polybrene (Sigma)을 처리하고, 준비한 virus를 10x, 1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x의 농도로 순차적으로 희석하여 감염시켰다.

그 다음, FACS (FACS Calibur., BD) 분석을 통해 EGFP 발현 세포의 계수 또는 puromycin 항생제 선발을 통해 virus particle의 수와 세포의 수가 1:1이 되는 농도를 선택하였다. 이때의 농도를 기준으로 각 virus particle의 개수를 일량화 시켰다.

실시예 3 : NICD 발현 재조합 렌티 바이러스에 의한 신경줄기세포의 감염 및 감염 세포 주 선발

Poly-L-Ornithine으로 전 처리한 24-well plate에 1x10⁴ cells/ml의 세포농도로 배양된 신경줄기세포에 6 ㎍/㎖ 농도의 polybrene (Sigma)을 처리하였다. 그 후, 실시예 2에서 준비한 NICD 발현 재조합 렌티 바이러스를 1x10³ Transducing unit (TU)으로 희석하여 감염시켰다.

감염 시작 3 시간 후 기존 바이러스 포함 배지를 새로운 신경줄기세포 배양배지로 교체하고, 이후 12 시간 배양을 진행하였다. 배양 후 Puromycin (Sigma) 항생제를 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 5 일간 항생제 선발을 진행하였다.

실시예 4 : NICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인

4-1 : NICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인

실시예 3에서 선발된 NICD 발현 재조합 렌티 바이러스로 감염된 신경줄기세포주에 대하여, 실시예 1-2와 같은 방법으로 NICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Musashi, Nestin, Sox2, CD133의 강하게 발현 (도 4-B)되는 것을 확인할 수 있었다.

4-2 : NICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 분화능 검증

상기에서 획득한 NICD 과발현 성체 신경줄기세포가 하위 신경세포로의 분화능력을 가지며, 계대 배양기간 중 분화능이 유지되는 것을 확인하기 위해 FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후 Poly-L-Ornithine(Sigma) 및 Laminin(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여 부착시켰다. 이후, 10% FBS를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액이나 Nerve growth factor(R&D), IBMX, dcAMP를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액에 1-2주일간 배양하여 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포를 대상으로 실시예 1-3에 기재된 방식으로 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역염색화학법을 이용해 분석하였고 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 분화능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4C; 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP, 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 O4, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질)

4-3 : NICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 세포 증식능 검증

실시예 3에서 선발된 NICD 발현 재조합 렌티 바이러스로 감염된 신경줄기세포주에 대하여, Poly-L-Ornithine으로 전 처리한 24-well plate에 5x10³ cells/ml의 세포농도로 배양하였다. 그 후, CCK-8 (Dojindo) 시약을 동량 처리하고 37 ℃ 5% CO₂ 세포배양기에서 2-4 시간 동안 배양하고, 상층액을 96-well plate에 옮긴 후 micro well plate reader 기기를 이용하여 460 nm의 파장 영역에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, wild type 및 EmGFP 발현 세포주에 비해 NICD 발현 세포주에서 세포 증식이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 이 후, 계대 배양을 진행하면서 신경줄기세포의 증식 정도를 관찰하였다. 증식되는 세포의 개수를 계수한 결과, 도 5-B에 나타난 바와 같이, 세포수 누적 증가율 또한, NICD 발현 세포주에서 대조군과 비교하여, 확연히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통해, NICD 유전자의 도입을 통한 노치 신호전달체계의 활성화는 성체 신경줄기세포의 증식능을 획기적으로 향상시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는 성체 신경줄기세포의 대량증식을 통한 세포치료제로의 응용 가능성을 시사한다.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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노치 (Notch) 신호 활성화 유전자인 NICD(Notch intracellular domain) 유전자를 포함하는 도 4의 (A) 개열 지도를 가지는 바이러스 벡터로 형질전환되어, 세포증식능이 증가된 재조합 신경줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 신경줄기세포의 증식방법.
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제12항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 일차 배양된 신경줄기세포에서 노치 신호 활성화 유전자가 도입된 것임을 특징으로 하는 증식방법.
제12항에 있어서, 상기 배양은 FBS, B27 supplement, N2 supplement, bFGF 및 EGF를 함유하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 증식방법.
제12항에 있어서, 상기 배양은 3대 계대 배양 이상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 증식방법.