KR101910269B1 - 인간 뇌 조직 유래 신경줄기세포의 고효율 분리 방법 - Google Patents

인간 뇌 조직 유래 신경줄기세포의 고효율 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경줄기세포를 신속하게 대량으로 증식시키고 고효율로 분리할 수 있는 신경줄기세포 배양 및 분리 방법 및 이에 의해 배양되고 분리된 뇌졸중 환자로부터 유래된 이식용 인간 성체 신경줄기세포에 대한 것이다.

Description

인간 뇌 조직 유래 신경줄기세포의 고효율 분리 방법{METHOD FOR SEPARATING NEURAL STEM CELL DERIVED FROM HUMAN BRAIN TISSUE HAVING HIGH EFFICIENCY}
본 발명은 신경줄기세포의 배양 및 고효율 분리 방법 및 이에 의해 배양되고 분리된 이식용 인간 성체 신경줄기세포에 대한 것이다.
뇌졸중은 뇌 조직으로 통하는 혈류의 장애로 정의된다. 이것은 뇌의 특정부위의 장애이거나, 예를 들어, 심장에 의한 펌프질이 완전히 손상되었을 때의 모든 흐름의 실질적인 감소일 수도 있다. 좀 더 빈번하게, 뇌로 통하는 혈관의 막힘이나 파열에 의해 뇌의 특정부위로의 흐름이 방해되었을 때 뇌졸중이 일어난다. 혈관의 막힘은, 예를 들어, 색전증(embolism)이나 혈전(thrombus)의 형성을 통해, 일반적으로 뇌로 혈액을 공급하는 동맥에서 생기고, 이는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)으로 알려져 있다.
뇌졸중은 선진국에서 사망의 세 번째 주요원인이다. 미국에서, 뇌졸중 사망의 결과로 인한 치료비용과 생산성 손실은 약 40조 달러에 이른다고 추산되고 있다. 한편, 유일하게 효과적인 뇌졸중 치료 방법으로는, 혈전을 생성하게 하는 단백질을 효소학적으로 절단하여 혈전을 없애는 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator; t-PA)와 같은 혈전용해제의 투여이다. 그러나, t-PA의 투여는 너무 늦으면 출혈과 같은 부작용을 일으킬 수 있으므로 t-PA는 첫 번째 증상이 나타난 이후 오직 3시간 이내에만 투여될 수 있다. 더욱이, t-PA는 허혈성 뇌졸중에만 사용될 수 있고, 출혈성 뇌졸중에 투여시에는 일반적으로 사망과 같은 부작용이 발생할 수 있다. 이러한 뇌졸중의 치료 방법은 응급 치료에 그치거나 병의 진행을 늦추는 것에 불가할 뿐 근본적인 치료 대책이 없는 상태이다.
줄기세포는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 세포, 즉 미분화 세포로서, 적절한 조건 하에서 다양한 조직 세포로 분화할 수 있으므로 손상된 조직을 재생하는 등의 치료에 응용할 수 있다. 줄기세포치료제는 손상된 신경의 재생을 가능하게 할 것으로 기대되고 있으며, 직접적인 재생 이외에도 손상된 환경을 개선하는 다양한 물질을 분비하여 재생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 현재 중간엽줄기세포에 대한 연구가 임상적으로 가장 앞서 나가고 있으나, 아직까지 뇌졸중이나 그 외 퇴행성 신경계 질환의 치료에 대한 유효성에 대해 의견이 분분한 상태이다. 태아 유래의 신경줄기세포가 뇌졸중 및 척추 손상 환자 대상으로 임상연구가 진행 중이지만 윤리적인 문제뿐만 아니라 여러 기술적인 문제가 발생하고 있다.
한국등록특허 제10-1269125호
이에 본 발명자들은 응급 뇌졸중 환자의 수술 중 적출되는 뇌 조직으로부터 분리된 신경줄기세포를 특정된 조건 하에서 배양함으로써 신속하게 대량으로 증식시키고 고효율로 분리시킬 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뇌 조직으로부터 세포를 수득하는 단계; 상기 세포에 콜라게나아제 및 DNase I, 또는 파파인, 시스테인 및 DNase I를 처리하여 단일 세포를 분리하는 단계; 단일 세포를 두 개 이상의 튜브에 나누어 넣고 각각 퍼콜과 혼합한 후 원심분리하여 세포를 회수하는 단계; 회수된 상기 세포를 일차 배양하는 단계; 및 상기 일차 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 뇌 조직은 응급 뇌졸중 환자의 수술 중 적출된 뇌 조직일 수 있으며, 예를 들어, 뇌 또는 척수로부터 적출된 조직일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌 조직은 temporal lobe epilepsy, stroke surgical sample(temporal lobe 포함), trauma 조직(temporal lobe 포함) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 신경줄기세포는 뇌졸중 환자로부터 유래된 이식용 인간 성체 신경줄기세포일 수 있다. 상기 이식용 인간 성체 신경줄기세포는 자가이식 또는 타가이식이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 일차 배양 및/또는 계대 배양은 부착 배양(adherent culture) 방법으로 실시될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 계대 배양은 3회 이하로 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 신경줄기세포 배양 방법에 의해 배양된 뇌 조직으로부터 유래된 이식용 인간 성체 신경줄기세포를 제공한다.
본 발명은 뇌졸증 환자 자체의 뇌 조직으로부터 신경줄기세포를 분리, 배양함으로써 윤리적인 문제를 해결함과 동시에, 이식이 가능한 인간 성체 신경줄기세포를 용이하게 제공할 수 있다.
본 발명은 신경줄기세포의 분리 및 배양 조건을 특정화함으로써 신속하게 대량 증식시킬 수 있다. 구체적으로, 뇌 조직으로부터 분리된 단일 세포를 두 개의 튜브에 나누어 넣고 각각 퍼콜과 혼합하여 세포를 회수함으로써 신경줄기세포의 수율을 약 2배 증가시킬 수 있다. 또한, 일차 배양 또는 계대 배양 시 부착 배양(adherent culture) 방법으로 배양함으로써 기존의 구 배양(sphere culture) 방법에 비해 안정적으로 배양 효율을 증대시키고 순도를 높일 수 있다. 또한, 3회 이하의 계대배양으로 환자에게 이식가능한 수의 세포로 배양시킬 수 있어, 신속한 증식 배양이 가능하여, 특히 응급 뇌졸중 환자에게 빠른 이식이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신경줄기세포의 배양 단계를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 퍼콜 처리에 따른 세포 수를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서 신경줄기세포의 분화 방법을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 분화 조건에 따른 신경줄기세포의 신경세포 및 별아교세포의 분화능을 확인한 결과를 나타낸 이미지이다.
본 발명은 본 발명은 뇌 조직으로부터 세포를 수득하는 단계; 상기 세포에 콜라게나아제 및 DNase I, 또는 파파인, 시스테인 및 DNase I를 처리하여 단일 세포를 분리하는 단계; 단일 세포를 두 개 이상의 튜브에 나누어 넣고 각각 퍼콜과 혼합한 후 원심분리하여 세포를 회수하는 단계; 회수된 상기 세포를 일차 배양하는 단계; 및 상기 일차 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 신경줄기세포는 뇌졸중 환자의 수술 중 적출된 뇌 조직으로부터 분리 및 배양된 것으로, 다시 뇌졸중 환자에게 자가 이식될 수 있으며, 타인에게 타가이식하는 것도 가능하다.
일반적으로 생체 조직으로부터 분리된 단일 세포는 퍼콜(percoll)을 사용하여 불순물을 제거하는 공정을 거치는데, 본 발명의 방법에서는 단일 세포를 두 개의 튜브에 나누어 넣고 각각 퍼콜과 혼합한 후 원심분리하여 세포를 회수함으로써, 종래 단일 튜브 내에서 퍼콜과 혼합하는 경우에 비해 2배 정도 증가된 세포 수율을 나타낼 수 있다(도 2 참조).
본 발명의 일차 배양 또는 계대 배양을 위해 사용되는 배지로는 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 예를 들어, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지를 사용할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.
일반적으로 줄기세포의 계대 배양은 7회 또는 9회 이상 실시되나, 본 발명의 방법은 두 개 튜브에서의 퍼콜 혼합, 부착 배양 방법의 사용으로 인해 3회 이하로 계대 배양을 실시할 경우에도 자가 이식에 충분한 양의 신경줄기세포를 획득할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신경줄기세포의 획득
인간 신경줄기세포의 분리 및 배양
뇌졸중 환자의 외과적 수술을 통해(삼성 서울병원 신경외과) 제거되는 뇌 조직(측뇌실 외측 천장 부위의 뇌조직(출혈제거나 뇌실천자를 위해 접근하는 경로의 뇌조직))을 수득하고, 도 1에 도시된 바와 같은 공정에 따라 배양하였다.
우선, 수득된 뇌 조직을 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, Wellgene) 용액에 3% antibiotics antimycotic(Gibco) 또는 3% Penicillin/Streptomycin (Gibco)이 첨가된 용액에 담아서 보관하였으며 수술 후 최대 12시간 이내에 세포를 분리하였다. 세포 분리를 바로 진행하기 어려울 경우 4℃ 냉장에 보관 후 세포 분리를 실시하였다.
수득한 뇌 조직은 무게를 측정한 후 2-3차례 멸균된 PBS 용액으로 씻어낸 후 가위나 면도칼로 기계적으로 분쇄하고 Collagenase(0.4 ㎎/㎖, Gibco)와 DNaseI(0.01-1 ㎎/㎖, Roche)을 혼합하거나 Papain(10 unit/㎖, Sigma), D-L-Cystein(400 ng/ml, Sigma)과 DNaseI(0.01-1 ㎎/㎖, Roche)를 혼합하여 제조한 효소액에 1 시간 동안 37℃ CO2 인큐베이터에 보관하였다. 그런 다음, 효소 용액과 동량 이상의 DMEM:F12(Gibco)와 1% FBS 용액을 처리하여 효소를 불활성화시킨 후, 파이펫으로 파이펫팅을 하여 분쇄 후 70 uM 나일론 메쉬를 통과시켜 단일 세포를 수득하였다.
퍼콜(Percoll)(Sigma)을 37℃ 수조에서 5분 정도 데운 후 멸균된 50 mL ultracentrifuge tube에 퍼콜 9 mL과 10X PBS 1mL을 첨가하여 1X 농도로 맞추었다. 수득된 단일 세포 현탁액을 총 40 mL이 되도록 1X PBS로 희석 후 20mL 씩 2개의 50 mL conical 튜브에 나누어 담은 후 퍼콜을 추가하여 각 튜브의 총 볼륨을 30 mL로 맞추었다. 그런 다음, 20,000 rpm으로 20 분간 18℃로 원심분리하여 적혈구 및 기타 조직과 세포들을 제거하였다. 원심분리 후 생기는 백색 층을 파이펫을 사용하여 분리한 후 DMEM:F12(Gibco) 용액을 사용하여 2차례 세척하였다.
최종 세포들은 DMEM:F12(Gibco) 용액을 기반으로 0.5-1% FBS, 1x B27 supplement(Gibco), bFGF(R&D), EGF(R&D)를 포함하는 배양액에 현탁한 후 세포수를 확인하고, 100 파이 디쉬는 세포 배양 전에 Poly-L-Ornithine(Sigma)로 전처리한 후 디쉬 당 4 × 105 세포가 되도록 배양하였다. 이때 배양액은 3-4일 간격으로 절반만 교환하며, 일반적으로 일차 계대배양까지 10-14일이 소요되었다.
비교예로서 단일 세포를 단일 튜브 내에서 퍼콜과 혼합하는 것을 제외하고 상기 실시예의 공정과 동일하게 진행하여 신경줄기세포를 배양하였으며, 그 결과를 두 개 튜브에서 퍼콜과 혼합한 상기 실시예 결과와 비교하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 단일 튜브 내에서 퍼콜과 혼합한 경우 5 × 105 세포수를 나타내는 반면, 본 실시예에 따라 두 개 튜브에 나누어 퍼콜과 혼합한 경우 1 × 106 세포수를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
계대 배양
상기 배양에서 세포가 디쉬 전체 면적의 70-80% 정도로 차게 될 때 계대배양을 실시하였다.
우선, 기존 세포 배양액을 제거한 후 DPBS로 1회 세척하였다. 그런 다음 0.05% Trypsin/EDTA(T/E, Gibco)이나 Accutase를 세포가 잠길 정도로 처리하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 2-3 분간 보관한 후 DMEM:F12(Gibco)와 1% FBS가 들어간 용액을 처리하여 효소를 불활성화시켰다. 원심분리기를 사용하여 세포를 펠렛으로 만든 후 상층액을 제거하고 세포배양액으로 현탁하였다.
세포를 계수한 후에 100 파이 디쉬에 4 × 105 세포를 넣어 배양하였다. 1회 계대배양시에 평균 10배의 세포수가 증가하게 되며 3회 계대배양으로 103배의 세포를 얻을 수 있었다.
1회 평균 계대배양 시간은 3-4일이며 계대배양 3번까지 2주 이내에 가능하여 1달 이내에 1 × 108의 세포수를 얻을 수 있었다.
계대배양이 7 이상에서는 세포의 성장이 느려지게 되며 세포 모양이 길어지는 등 노화와 유사한 형태를 갖게 되는 경우가 많으며, 이에 따라 줄기세포의 특성을 점차 잃어버리게 된다. 또한 장기간 배양은 유전적 변이 (mutation)의 증가를 발생시키게 된다.
본 발명의 방법에 따라 배양시 계대배양 3번 이내에 다회 투여 및 자가 이식을 위한 충분한 수의 세포를 얻을 수 있다.
실시예 2. 신경줄기세포의 분화
실시예 1에서와 같이 수득한 신경줄기세포의 분화능을 확인하기 위해 도 3에 도시된 바와 같이 신경줄기세포를 분화시켰다.
우선, PLO(poly-L-ornithine)가 코팅된 배양접시에 신경줄기세포를 3일간 배양하여 세포가 디쉬 전체 면적의 70-80%가 되었을 때 분화 배지(DMEM/F12, 1% P/S, 1 x B27, 0.5% FBS, 100 ng/mL bFGF, 100 ng/mL EGF, 0.5mM IBMX)로 교체하였다. 분화 후 2일째와 4일째 세포를 고정하고 미분화 마커인 Nestin, 신경세포 마커인 MAP2, 별아교세포 마커인 GFAP로 면역형광염색을 실시한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 신경줄기세포가 신경세포 및 별아교세포로 분화하였음을 확인할 수 있었다. 분화조건에서 분화 전 (0 DIV)와 분화 후(2, 5, 9 DIV)에 신경세포 (MAP2+) 및 별아교세포(GFAP+)로의 분화능을 확인하였으며, 또한 미분화 마커인 Nestin의 발현이 분화가 진행됨에 따라 감소하는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. 뇌졸중 환자로부터 분리된 뇌조직으로부터 세포를 수득하는 단계;
    상기 세포에 콜라게나아제 및 DNase I, 또는 파파인, 시스테인 및 DNase I를 처리하여 단일 세포를 분리하는 단계;
    상기 단일 세포를 두 개의 튜브에 나누어 넣고 각각 퍼콜과 혼합한 후 원심분리하여 세포를 회수하는 단계;
    회수된 상기 세포를 일차 배양하는 단계; 및
    상기 일차 배양된 세포를 1회 내지 3회로 계대 배양하는 단계
    를 포함하는, 생체 외 신경줄기세포 배양 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 일차 배양 또는 계대 배양은 부착 배양(adherent culture) 방법으로 실시되는 것인 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
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