CN116144595A - 一种促使msc分化为少突胶质前体细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种促使间充质干细胞(MSC)分化为少突胶质前体细胞的方法，包括将分离的MSC原代培养、二次传代培养后，以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理，再采用“少突胶质前体细胞分化培养基”进行分化培养。本发明通过特定细胞分化处理和培养工艺，使用经过重组人层粘连蛋白处理的细胞培养基质，对MSC进行培养、促使其分化，在较短时间内获得MSC来源少突胶质前体细胞。本发明进一步提供了一种高效收获少突胶质前体细胞的方法，具体通过一种限速摇动方法，收获少突胶质前体细胞并允许进一步增殖，可以在短时间内收获较大量且纯度较高的少突胶质前体细胞，用于生产细胞治疗产品。

Description

一种促使MSC分化为少突胶质前体细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种促使间充质干细胞(MSC)分化为少突胶质前体细胞的方法。
背景技术
中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。
少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor，OPs)在中枢神经系统发育过程中负责髓鞘的产生，对中枢神经系统的正常发育和运作起关键作用，因各种原因导致的OP或髓鞘损伤是中枢神经系统发育或功能异常的重要原因，会直接导致脑白质营养不良、小儿脑瘫等严重疾病，同时和脊髓损伤、脑卒中等伤病的恶化有关，对人类健康有重大威胁。既往的研究表明，移植OP可以修复髓鞘，从根本治疗脑白质营养不良、小儿脑瘫等疾病，也可以显著促进脊髓损伤、脑卒中等伤病的康复，但OP来源极为有限，限制了其临床应用。成体OP的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内几乎无法取材，而流产胎儿脑组织分离OP受到伦理学限制，每批次脑组织样本分离得到的OP在质量上不均一，影响治疗效果。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞及诱导多能干细胞均有少突胶质前体细胞分化潜能，但胚胎干细胞的适用同样受到伦理学限制，并且胚胎干细胞及诱导多能干细胞分化少突胶质前体细胞的工艺耗时长、成本高、失败几率大、批次间质量波动大，不利成药及临床应用。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)可从脂肪、脐带、骨髓等多种组织采集，是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。目前应用于间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法极为有限，仅限于使用多种生长因子诱导MSC先分化为神经干细胞，再分化为少突胶质前体细胞。细胞生长因子诱导法存在诱导效率低下，诱导周期长，且批次间质量波动较大和产量低等缺点。因此，本领域还有必要开发改进的技术，来提高分化效率、提高少突胶质前体细胞的质量和产量。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种促使MSC分化为少突胶质前体细胞的方法。具体为一种通过表观遗传学手段，对MSC进行培养的方法，所述方法可以促使MSC以较高效率分化成少突胶质前体细胞，在缩短分化耗时同时，提高少突胶质前体细胞的质量和产量。
本发明首先提供一种促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞产量的方法，包括如下步骤：
(1)分离间充质干细胞，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
(4)对第二次传代培养后的间充质干细胞，以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理，其后再次传代接种于细胞培养基质表面，添加“少突胶质前体细胞分化培养基”进行分化培养，完成少突胶质前体细胞分化，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理，所述“少突胶质前体细胞分化培养基”为无动物源性配方。
进一步的，步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。来源于人类的间充质干细胞用于获得人少突胶质前体细胞，可应用于人髓鞘损伤性疾病的治疗。
进一步的，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。所述组织都是人体容易获取间充质干细胞的组织。
进一步的，步骤(1)中所述的原代培养采用的培养基、步骤(2)和(3)中所述的细胞培养基均为MSC基础培养基，成分为MEM-alpha+5％人血小板提取物。
进一步的，步骤(2)和(3)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂；步骤(4)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿或细胞培养瓶。
进一步的，步骤(4)中所述的间充质干细胞起始密度为0.1×104/cm2～1.0×104/cm2。
进一步的，步骤(4)所述的间充质干细胞起始密度为1.0×104/cm2。此起始密度获得的少突胶质前体细胞产量更高。
进一步的，步骤(4)所述的含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体可以是慢病毒一类的病毒载体、质粒载体、游离形载体或mRNA载体。
进一步的，步骤(4)所述的“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体含有的基因包括Olig2和Sox10。
进一步的，步骤(4)所述的以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理的具体步骤为：将第二次传代培养后的间充质干细胞以细胞悬液状态进行质粒载体转染，每5×106个细胞电转5～10μg Olig2和5～10μg Sox10质粒。更优选每5×106个细胞电转10μg Olig2和10μg Sox10质粒，该条件下获得的少突胶质前体细胞纯度和产量更高。
进一步的，步骤(4)中所述的分化培养的时间为15～25天。
进一步的，步骤(4)中所述的分化培养的时间为20天。
本发明还提供一种将前述方法得到的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，包括如下步骤：
S1、在完成少突胶质前体细胞分化后，将细胞培养基质置于摇动装置，确保密封后，在37℃以每分钟120～240次，幅度为1.5～4.5厘米条件下进行15～20小时的水平摇动，促使少突胶质前体细胞从细胞培养基质表面分离，而其余细胞保持贴壁；
S2、完成摇动后，收集含有少突胶质前体细胞的培养基，并将其注入新的细胞培养基质表面(少突胶质前体细胞传代)，添加“少突胶质前体细胞增殖培养基”进行增殖培养，完成少突胶质前体细胞增殖，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理。
进一步的，所述步骤S1的摇动条件为每分钟120～240次，幅度为1.5～3.0厘米，时间为15～20小时。
进一步的，所述步骤S1的摇动条件为每分钟180次，幅度为3.0厘米，时间为20小时。此参数下少突胶质前体细胞分离数量和纯度皆较高。
进一步的，步骤S1中的所述细胞培养基质为可密封的细胞培养瓶；步骤S2中所述的细胞培养基质为细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂。
进一步的，步骤S2中所述增殖培养的少突胶质前体细胞接种密度为0.5×104/cm2～1.5×104/cm2。
进一步的，所述步骤S2所述增殖培养的少突胶质前体细胞接种密度为1.0×104/cm2。此参数下少突胶质前体细胞增殖效率较高。
进一步的，所述步骤S2中所述的增殖培养的时间为6～12天。
进一步的，所述步骤S2中所述的增殖培养的时间为9天。此参数下少突胶质前体细胞增殖效率较高。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明的方法效率高，耗时短，15～25天即可得到少突胶质前体细胞。
2.本发明的少突胶质前体细胞分化方法减少加化学诱导剂或细胞因子的使用，使得产物更纯，且无有毒物质的掺入，安全性更高。
3.本发明的少突胶质前体细胞分化方法不使用动物来源或人血液来源材料，使得产物更纯，安全性更高。
4.本发明的方法通过摇动方法从分化培养器皿内分离出高纯度少突胶质前体细胞，在提升少突胶质前体细胞纯度和存活率同时，避免了传统方法常用的、动物来源消化酶的使用。
5.本发明的方法仅需额外15～20小时的摇动时间和6～12天时间的增殖培养，即可大量增殖少突胶质前体细胞。
6.本发明的方法在少突胶质前体细胞增殖过程中，不使用动物来源或人血液来源材料，使得产物更纯，安全性更高。
7.本发明的方法获得的少突胶质前体细胞具有稳定表型以及生成髓鞘的能力。
8.本发明的制备方法得到的少突胶质前体细胞可以用于治疗各类髓鞘损伤相关疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明制备的MSC来源少突胶质前体细胞形态图(摇动纯化后)；
图2为少突胶质前体细胞标志物A2B5和PDGFRα荧光成像检测图(摇动纯化后)；
图3为本发明制备的MSC来源少突胶质前体细胞体外髓鞘生成荧光成像检测图，其中MBP为髓鞘生成标志物，NF200为神经轴突标志物；
图4为本发明实施例2采用的摇动装置实物图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
现有少突胶质前体细胞生产方法，主要通过使用复数配方各异的培养基，分阶段将胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化，最终得到少突胶质前体细胞。这类方法一般耗时长并成本高昂，同时因为工艺复杂，不但生产失败机率较大，所得到的少突胶质前体细胞在数量和纯度上均未如理想，性价比较低。
本发明公开了一种通过表观遗传手段对MSC进行培养的方法，可以促使MSC以较高效率分化成少突胶质前体细胞，在缩短分化耗时同时，提高少突胶质前体细胞的质量和产量。在干细胞分化成为少突胶质前体细胞的过程中，“分化关键基因”(下文简称关键基因)的表达是促使分化的必要条件。本发明使用表观遗传手段，通过载体转染在MSC内短暂高水平表达关键基因，促使MSC高效分化为少突胶质前体细胞，并且提供一种少突胶质前体细胞分离增殖方法，大大简化了整体工艺，在提升分化效率同时节省了时间和金钱成本，更增进了产品的批次间稳定性，有利工业化、标准化生产，可加速少突胶质前体细胞的临床转化。
在本发明的具体实施方式中，MSC来源于人类，具体来源于健康人骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织，其均可通过本发明的方法获得少突胶质前体细胞。
在本发明的具体实施方式中，采用的“少突胶质前体细胞分化培养基”的成分如下表1所示，在其各组成成分的浓度范围内配制的“少突胶质前体细胞分化培养基”均可用于本发明的分化培养。
表1少突胶质前体细胞分化培养基成分
序号 成分 浓度范围
1 DMEM/F12 /
2 非必需氨基酸(100x) 0.1～5x，即0.1～5％(体积比)
3 胰岛素 0.1～10μg/mL
4 全铁转铁蛋白 2～100μg/mL
5 腐胺 5～200μg/mL
6 人血白蛋白 250～4000μg/mL
7 超氧化物歧化酶 1～10μg/mL
8 谷胱甘肽 0.1～10μg/mL
9 黄体酮 1～10ng/mL
10 视网醇 0.01～2μg/mL
11 维生素A 0.01～2μg/mL
12 dl-α-生育酚乙酸酯 0.1～10μg/mL
13 维生素E 0.1～10μg/mL
14 亚油酸 0.1～10μg/mL
15 α-亚麻酸 0.1～10μg/mL
16 硫辛酸 1～10ng/mL
17 bFGF 0.5～10ng/mL
18 PDGF-AA 0.5～10ng/mL
在本发明的具体实施方式中，采用的“少突胶质前体细胞增殖培养基”的成分与前述表1的成分及浓度范围基本相同，不同仅在于“少突胶质前体细胞增殖培养基”中采用的bFGF的浓度范围在1～15ng/mL、PDGF-AA的浓度范围在1～15ng/mL。在其各组成成分的浓度范围内配制的“少突胶质前体细胞增殖培养基”均可用于本发明的增殖培养。
在本发明的具体实施方式中，进行原代MSC培养、第一次传代培养、第二次传代培养采用的细胞培养基质可以是细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂；进行MSC的分化培养采用的细胞培养基质可以是可密封的细胞培养瓶。
在本发明的具体实施方式中，将分化的少突胶质前体细胞进行增殖培养采用的细胞培养基质可以是细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂。
实施例1
本实施例提供一种MSC分化为少突胶质前体细胞的方法，具体步骤如下：
(1)原代MSC培养
1mL健康成人骨髓原液以9mL MSC基础培养基稀释后，在TCT(“经促进细胞贴壁处理”的简写)表面100mm直径圆形培养皿培养3天后，移除所有培养基，换入10mL新的MSC基础培养基。此阶段MSC定义为P0。P0 MSC以MSC基础培养基再培养10天，每2天换液一次，每次10mL。MSC基础培养基成分为MEM-alpha+5％人血小板提取物。
(2)第一次传代培养
P0 MSC培养10天后，以TrypLE Express消化、收集，再以1:3比例传代至TCT表面100mm直径圆形培养皿。这些MSC定义为P1，P1 MSC以10mL MSC基础培养基培养2天。
(3)第二次传代培养
P1 MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，再以2×104个细胞/cm2的接种密度，传代至“未经过促进细胞贴壁处理(Non Tc-Treated，简称nTCT)”的聚苯乙烯6孔细胞培养板，每孔2mL培养基。这些MSC定义为P2，P2 MSC以MSC基础培养基培养2天。
(4)MSC分化为少突胶质前体细胞-载体处理
P2 MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，先使用含有表观遗传基因表达载体的“少突胶质前体细胞分化载体”对MSC进行处理。如前述，载体性质可以是慢病毒一类的病毒载体、质粒载体、游离形载体或mRNA载体。本实施例采用质粒载体，其架构可以参考以下已公开载体：
Olig2：https://www.addgene.org/32933/
Sox10：https://www.addgene.org/167791/
MSC以细胞悬液状态进行质粒载体转染，过程采用电转仪(nucleofector，例如Lonza产品：https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/CH/en/Catalogue/Products/Transfection/c/6)，每5×106个细胞电转5～10μg Olig2和5～10μg Sox10质粒。
(5)MSC分化为少突胶质前体细胞-分化培养
完成载体处理后，再以起始密度0.1×104/cm2～1.0×104/cm2接种至经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理的聚苯乙烯6孔细胞培养板，每孔2 mL培养基，再使用“少突胶质前体细胞分化培养基”进行20天分化培养。
所述进行“重组人层粘连蛋白”处理的步骤具体为：以5～30μg/mL的重组人层粘连蛋白溶液对培养板表面进行30分钟的浸泡铺板处理，温度在37摄氏度。本实施例中具体采用浓度为20μg/mL的重组人层粘连蛋白溶液。
表2所示为MSC分化为少突胶质细胞过程，在不同的起始MSC密度，以及不同载体浓度下的分化结果。在完成20天分化培养，并确认质粒载体不存在细胞内后，分析少突胶质前体细胞标志物Olig2阳性百分比以及细胞是否具有少突胶质前体细胞典型形态，以Olig2阳性并且具有少突胶质前体细胞典型形态为成功分化的标准，再计算出细胞产量，判断最优分化条件。“少突胶质前体细胞分化载体”组合在表3列出，“少突胶质前体细胞分化培养基”成分在表4列出。
表2 MSC少突胶质前体细胞标志物阳性率检测
Figure BDA0004112643020000091
Figure BDA0004112643020000101
表3分化载体组合
组别 关键基因Olig2载体浓度 关键基因Sox10载体浓度
01 5μg/1×106细胞 5μg/1×106细胞
02 10μg/1×106细胞 5μg/1×106细胞
03 5μg/1×106细胞 10μg/1×106细胞
04 10μg/1×106细胞 10μg/1×106细胞
表4少突胶质前体细胞分化培养基成分
序号 成分 浓度
1 DMEM/F12 /
2 非必需氨基酸(100x) 1x，即1％(体积比)
3 胰岛素 5μg/mL
4 全铁转铁蛋白 5μg/mL
5 腐胺 20μg/mL
6 人血白蛋白 2500μg/mL
7 超氧化物歧化酶 2μg/mL
8 谷胱甘肽 1μg/mL
9 黄体酮 5ng/mL
10 视网醇 0.2μg/mL
11 维生素A 0.2μg/mL
12 dl-α-生育酚乙酸酯 1μg/mL
13 维生素E 1μg/mL
14 亚油酸 1μg/mL
15 α-亚麻酸 1μg/mL
16 硫辛酸 10ng/mL
17 bFGF 5ng/mL
18 PDGF-AA 5ng/mL
由表2的结果发现，在不同起始密度的不同培养时间点，使用不同“少突胶质前体细胞分化载体”均可获得纯度(即Olig2阳性并具有典型形态的百分比)≥8％的少突胶质前体细胞，每cm2的Olig2阳性细胞产量最高可达10466.42±1209.59/cm2，其中使用“少突胶质前体细胞分化载体”组合04，在不同接种密度下的少突胶质前体细胞产量均为最高。最终优选“少突胶质前体细胞分化载体”组合04、接种密度为1.0×104/cm2的组合。
在本发明人前期的筛选实验中还发现，MSC起始密度过高会影响分化效率，超过1.0×104/cm2产量不再上升，并且产率进一步下降。而对于“少突胶质前体细胞分化载体”的浓度，可以预测的是，进一步提升载体浓度有机会提高产率和产量，但载体浓度有上限，过高会引起毒性反应。
实施例2
为确保少突胶质前体细胞足够位患者进行治疗且纯度够高，本实施例提供一种将获得的少突胶质前体细胞摇动提纯以及在无动物源性条件下扩增的方法，具体步骤如下：
(1)在采用实施例1方法(以步骤(5)中接种密度为1.0×104/cm2、“少突胶质前体细胞分化载体”为表2中的组合04条件进行分化培养)完成少突胶质前体细胞分化后，将细胞培养瓶至于摇动装置(如图4所示，其设备型号为S41i Incubator Shaker，Eppendorf)，确保密封后，在37℃以每分钟120～240次，幅度为1.5～4.5厘米条件下进行15～20小时的水平摇动，促使少突胶质前体细胞从培养基质表面分离，而其余细胞保持贴壁；
(2)完成摇动后，收集含有少突胶质前体细胞的培养基，并以MSC接种密度为0.25～1.5×104/cm2将其注入新的经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理的细胞培养基板表面(少突胶质前体细胞传代)，添加“少突胶质前体细胞增殖培养基”进行增殖培养6～12天，完成少突胶质前天细胞增殖。
表5所示为采用步骤(2)中不同摇动参数所得少突胶质细胞的纯度和数量，其中纯度以分析少突胶质前体细胞标志物Olig2阳性百分比判断。表5中的组别17为不进行摇动，仅在摇动装置中静置20h后所得结果。表6为完成摇动后，以不同接种密度接种少突胶质前体细胞并完成6～12天扩增培养后，少突胶质前体细胞的产量和纯度，其中纯度以Olig2阳性百分比判断。“少突胶质前体细胞增殖培养基”成分在表7列出。
表5少突胶质前体细胞提纯摇动参数以及结果
Figure BDA0004112643020000121
表6少突胶质前体细胞扩增结果
Figure BDA0004112643020000122
/>
Figure BDA0004112643020000131
表7少突胶质前体细胞扩增培养基成分
序号 成分 浓度
1 DMEM/F12 /
2 非必需氨基酸(100x) 1x，即1％(体积比)
3 胰岛素 5μg/mL
4 全铁转铁蛋白 5μg/mL
5 腐胺 20μg/mL
6 人血白蛋白 2500μg/mL
7 超氧化物歧化酶 2μg/mL
8 谷胱甘肽 1μg/mL
9 黄体酮 5ng/mL
10 视网醇 0.2μg/mL
11 维生素A 0.2μg/mL
12 dl-α-生育酚乙酸酯 1μg/mL
13 维生素E 1μg/mL
14 亚油酸 1μg/mL
15 α-亚麻酸 1μg/mL
16 硫辛酸 10ng/mL
17 bFGF 10ng/mL
18 PDGF-AA 10ng/mL
由表5的结果发现，不同的摇动参数组合均可获得纯度≥70％的少突胶质前体细胞，而不进行摇动时仅获得纯度约47％、产量仅为16.33±4.40的少突胶质前体细胞，说明通过摇动处理可显著提高获得的少突胶质前体细胞的纯度和产量。以“每分钟摇动次数为120次，摇动幅度为1.5或3.0厘米，摇动时间为15或20小时”条件下得到的Olig2阳性细胞纯度最高，但基于产量考虑并未采用此条件。以“每分钟摇动次数为240次，摇动幅度为1.5或3.0厘米，摇动时间为15或20小时”条件下得到的Olig2阳性细胞产量最高，但纯度已低于80％。因此，基于纯度和产量双重指标考虑，最佳的摇动条件为“每分钟摇动次数为180次，摇动幅度为3.0厘米，摇动时间为20小时”，其得到的Olig2阳性细胞纯度达到了82.82±1.62％、产量达到了4388.33±259.93/cm2。
就扩增而言，由表6的结果发现，以“1.0×104/cm2起始密度增殖9天”条件下，每cm2的Olig2阳性细胞产量较高，可达8396.28/cm2/天(产量除以增殖天数得到)，为经济上最划算的结果。所有扩增条件下，最终Olig2阳性细胞百分比均达到90％以上。
为进一步确认所得少突胶质前体细胞的身份，对MSC分化得到的少突胶质前体细胞进行光学显微镜观察以及免疫荧光检测，结果如图1所示，图1为光学显微镜明场观察下细胞典型少突胶质前体细胞形态(摇动纯化后，可见细胞形态高度一致，反应纯度提升)，图2为少突胶质前体细胞标志物PDGFRα和A2B5荧光成像检测图，进一步证明制备得到的少突胶质前体细胞的身份。
为进一步确认所得少突胶质前体细胞的纯度，在摇动纯化扩增后对细胞的Olig2阳性百分比通过流式进行检测，结果显示：纯化前的Qlig2阳性百分比为≥8％，而纯化后的Qlig2阳性百分比为≥70％，其中优选的条件更可达到≥80％。经纯化的OP进过扩增，纯度可达≥90％。
为进一步确认所得少突胶质前体细胞的功能，将MSC分化得到的少突胶质前体细胞与神经元共培养，观察少突胶质前体细胞发展为少突胶质细胞并生成髓鞘，结果如图3所示，表达髓鞘标志物的少突胶质细胞(MBP，绿色荧光信号)与神经轴突(NF200，红色荧光信号)高度重合，证明少突胶质前体细胞具有功能性，可发展为少突胶质细胞并生成髓鞘，具有修复神经系统脱髓鞘损伤，治疗脱髓鞘疾病的潜力。
以上结果表明，使用“少突胶质前体细胞分化载体”对MSC进行处理，再使用“少突胶质前体细胞分化培养基”进行培养，可在20天内获得纯度≥8％的少突胶质前体细胞。再配合摇动纯化和增殖，仅需额外20小时摇动时间和9天增殖时间即可获得大量高纯度(Olig2阳性百分比≥90％)少突胶质前体细胞。本发明不但大大缩短了少突胶质前体细胞的生产时间，并成功发掘出将间充质干细胞分化成少突胶质前体细胞的新方法，同时解决了伦理和生产时常两大难题。本发明使用无动物源性材料，所生产细胞适合未来的临床应用。
应用实施例1利用本发明的方法制备的少突胶质前体细胞可以应用于神经性疾病的治疗
一、针对脑白质营养不良
以脑白质营养不良小鼠为疾病模型，在左右脑的胼胝体分别微创注射少突胶质前体细胞，细胞移植数量为每侧3×105个细胞，可以再生脑白质、恢复脑功能、延长动物寿命。
二、针对脑卒中
以大脑中动脉闭塞法在SD大鼠造脑卒中疾病模型，在卒中区域附近进行微创注射少突胶质前体细胞，细胞移植数量为3×106个细胞，可以减轻炎症、修复神经、恢复脑功能。
髓鞘损伤在众多神经系统疾病都会发生，并且与神经功能的损失关系密切，少突胶质前体细胞是一种具有泛用性的细胞，可针对多种疾病发挥疗效。故本发明的方法制备的少突胶质前体细胞还可以用于治疗包括脑白质营养不良、脑瘫、多发性硬化、脑卒中等多种神经性疾病。
图3为本发明制备的MSC来源少突胶质前体细胞体外髓鞘生成荧光成像检测图，其中MBP为髓鞘生成标志物(绿)，NF200为神经轴突标志物(红)。由图3结果可见，MSC来源少突胶质前体细胞接种至神经轴突网络后，成熟为MBP阳性少突胶质细胞，并且MBP绿荧光信号与NF200红荧光信号重叠，证明其围绕神经轴突生成髓鞘。
综上，本发明的方法通过新型分化方法，使用“少突胶质前体细胞分化载体”对MSC进行处理，再使用“少突胶质前体细胞分化培养基”进行培养，可在较短时间内生产出少突胶质前体细胞，而这些少突胶质前体细胞具有生成髓鞘的功能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分离间充质干细胞，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
(4)对第二次传代培养后的间充质干细胞，以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理，其后再次传代接种于细胞培养基质表面，添加“少突胶质前体细胞分化培养基”进行分化培养，完成少突胶质前体细胞分化，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理。
2.根据权利要求1所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。
3.根据权利要求2所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。
4.根据权利要求1所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂；步骤(4)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿或细胞培养瓶。
5.根据权利要求1所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的间充质干细胞起始密度为0.1×104/cm2～1.0×104/cm2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的间充质干细胞起始密度为1.0×104/cm2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的分化培养的时间为15～25天。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的分化培养的时间为20天。
9.一种将权利要求1-8任一项所述方法得到的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在完成少突胶质前体细胞分化后，将细胞培养基质置于摇动装置，确保密封后，在37℃以每分钟120～240次，幅度为1.5～4.5厘米条件下进行15～20小时的水平摇动，促使少突胶质前体细胞从细胞培养基质表面分离，而其余细胞保持贴壁；
S2、完成摇动后，收集含有少突胶质前体细胞的培养基，并将其注入新的细胞培养基质表面，添加“少突胶质前体细胞增殖培养基”进行增殖培养，完成少突胶质前体细胞增殖，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理。
10.根据权利要求9所述的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，所述步骤S1的摇动条件为每分钟150～200次，幅度为1.5～3.0厘米，时间为18～20小时。
11.根据权利要求10所述的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，所述步骤S1的摇动条件为每分钟180次，幅度为3.0厘米，时间为20小时。
12.根据权利要求9所述的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，步骤S1中的所述细胞培养基质为可密封的细胞培养瓶；步骤S2中的所述细胞培养基质为细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂。
13.根据权利要求9所述的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，步骤S2中所述增殖培养的少突胶质前体细胞起始密度为0.5×104/cm2～1.5×104/cm2。
14.根据权利要求13所述的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，步骤S2所述增殖培养的少突胶质前体细胞起始密度为1.0×104/cm2。
15.根据权利要求9所述的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，步骤S2中所述的增殖培养的时间为6～12天。
16.根据权利要求15所述的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，其特征在于，步骤S2中所述的增殖培养的时间为9天。
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