CN116286646A - 将精原干细胞直接转分化为神经干细胞样细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种将精原干细胞(SSCs)直接转分化为神经干细胞样细胞(iNSCs)的方法。所述iNSCs具有增殖活性，可以在体外进行稳定的传代培养，并且具有向其他神经细胞如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能。本发明的方法具有高效性，可以在相对短的周期内、在体外获得较多的iNSCs，并且可以获得高纯度的iNSCs，其中Nestin和Pax6双阳性率达到95％以上。

Description

将精原干细胞直接转分化为神经干细胞样细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，更具体地，本发明涉及将精原干细胞直接转分化为神经干细胞样细胞的方法。
背景技术
神经系统性疾病具有高复发性、患病率高、危害大等特点。据统计，在全球范围内，神经系统性疾病的患病率大约在5％左右。常见的神经系统性疾病有阿尔兹海默症、癫痫、脊髓损伤、星形胶质瘤和少突胶质瘤等。然而这些疾病的发生都与神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的功能缺失或异常密切相关。神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)是一种既可自我更新和增殖，又可定向分化为不同类型的功能性神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。这些细胞在维持机体神经系统的正常功能方面发挥重要作用。因此，NSCs在基础研究和神经系统性疾病的临床治疗方面具有广阔的应用前景，但是体内数量有限的NSCs使得其在临床上的应用受限。因此，细胞来源是加快NSCs在临床治疗中首要解决的关键问题之一。目前，NSCs的获得途径包括直接从原始组织中分离提取、多能干细胞分化。多能干细胞如胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPSCs)具有多向分化潜能，是替代原代细胞分离的有效方式。尽管技术人员在探索ESCs和iPSCs将直接分化为神经干细胞样细胞(neural stem cell-like cells，iNSCs)，但是ESCs来源的伦理问题和iPSCs来源的安全性问题限制了其在临床上的应用。
转分化是指将一种类型的分化的细胞通过重编程使其在结构和功能上转变为另一种分化细胞的过程。这一过程主要是由外源表达的细胞特异性转录因子和化合物诱导实现的。目前有研究表明，多能因子的瞬时表达结合适当的神经信号输入或者直接过表达NSCs的特异性转录因子Sox2或者ZFP521都可以直接将人和小鼠的成纤维细胞转分化为iNSCs。尽管如此，该过程所涉及的外源基因的表达通常是由慢病毒介导的，这使得其在临床上的应用安全性具有不确定性。
因此，本领域亟待寻找一种不通过慢病毒介导的、无需转基因操作的直接转分化方法，以期为克服上述限制因素提供有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供将精原干细胞直接转分化为神经干细胞样细胞的方法及应用。
在本发明的第一方面，提供一种制备神经干细胞样细胞的方法，包括：以精原干细胞为出发细胞，直接将精原干细胞转分化为神经干细胞样细胞。
在一种或多种优选实施方式中，所述一种直接将精原干细胞转分化为神经干细胞样细胞的方法，包括：
(1)以精原干细胞培养基培养精原干细胞；
(2)经(1)培养的细胞，以转分化培养基A培养；所述转分化培养基A包括精原干细胞培养基及维甲酸；
(3)经(2)培养的细胞，以转分化培养基B培养；所述转分化培养基B包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2B27、血清白蛋白、胰岛素、SB431542、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、血清、bFGF；获得神经干细胞样细胞。
在一种或多种优选实施方式中，所述方法还包括：(4)经(3)培养的细胞，以扩增培养基培养或传代；所述扩增培养基在转分化培养基B基础上将血清替换为EGF。
在一种或多种优选实施方式中，利用两步酶消化法从睾丸组织分离精原干细胞。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，精原干细胞接种于预包被的容器(如孔板)中；较佳地所述容器以粘连蛋白(10±5μg/mL，更佳地10±3μg/mL或10±2μg/mL)包被；较佳地5000～20000个细胞/孔接种于24孔板；较佳地37±2℃培养。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，培养时间24±12小时；较佳地24±8小时；更佳地24±6小时(如24±4小时，24±3小时，24±2小时等)。
在一种或多种优选实施方式中，(3)中，培养时间2天以上；较佳地3～8天；更佳地3.5～7天(如4、5、6天)。
在一种或多种优选实施方式中，所述精原干细胞培养基包括：基础培养基，及GDNF、EGF、bFGF、LIF、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、牛胰岛素、维他命、转铁蛋白、腐胺、孕酮、β-巯基乙醇、血清；较佳地，包括：
Figure SMS_1
较佳地，所述基础培养基为MEM-α培养基。
在一些实施方式中，所述维他命可以为浓度为100×的成品，使用时调整至工作浓度为1×。
在一种或多种优选实施方式中，所述转分化培养基B包括：
Figure SMS_2
Figure SMS_3
较佳地，完全培养基与神经培养基的混合培养基按照体积比1:5～5:1混合(较佳地以1:3～3:1混合，更佳地以1:2～2:1混合)；更佳地，所述完全培养基为DMEM/F12培养基，所述神经培养基为Neurobasal培养基。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，维甲酸的量为0.2～5μM(较佳地0.4～3μM，更佳地0.7～1.5μM，如1±0.2μM)。
在一种或多种优选实施方式中，(4)中，EGF的量为5～100ng/mL(较佳地8～60ng/mL，更佳地12～40，如20±5ng/mL或20±3ng/mL)。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，培养获得的精原干细胞培养于STO细胞饲养层，备用于转分化。
在一种或多种优选实施方式中，运用转分化培养基后，每天添加20±5ng/mL(较佳地20±3ng/mL 20±2ng/mL)的bFGF。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，培养获得的精原干细胞(高)表达MVH、PLZF、OCT4、ETV5、GFRα1。
在一种或多种优选实施方式中，(3)中，培养获得的神经干细胞样细胞(高)表达Vimentin、ID2、Nrcam、Nestin、Blbp、CD133、Cdh2、L1cam，低表达或不表达Plzf、Id4、Nanos2、Nanos3、Neurog2、Sholh1、Bcl6b、Etv5、Oct4。
在一种或多种优选实施方式中，(3)中，培养获得的神经干细胞样细胞呈Nestin和Pax6阳性。
在本发明的另一方面，提供一种制备神经细胞的方法，包括：
(a)以前面任一所述的方法获得神经干细胞样细胞或其传代的细胞；
(b)将(a)的细胞进一步诱导分化为神经细胞；所述神经细胞包括：神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞。
在一种或多种优选实施方式中，所述神经细胞为神经元，利用神经元分化培养基培养；较佳地，所述神经元分化培养基包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2、B27、L-谷氨酰胺、anti-Hesl寡核苷酸链、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
在一种或多种优选实施方式中，所述神经细胞为星形胶质细胞，利用星形胶质细胞分化培养基培养；较佳地，所述星形胶质细胞分化培养基包括：完全培养基，及非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胎牛血清。
在一种或多种优选实施方式中，所述神经细胞为少突胶质细胞，利用少突胶质细胞分化培养基培养；较佳地，所述少突胶质细胞包括：完全培养基，及N2，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
在一种或多种优选实施方式中，所述神经元分化培养基包括：
Figure SMS_4
在一种或多种优选实施方式中，所述星形胶质细胞分化培养基包括：
Figure SMS_5
在一种或多种优选实施方式中，所述少突胶质细胞分化培养基包括：
Figure SMS_6
在一种或多种优选实施方式中，培养获得的星形胶质细胞(高)表达Gfap、S100β。
在一种或多种优选实施方式中，培养获得的少突胶质细胞(高)表达Ng2，Olig2、Mbp等。
在一种或多种优选实施方式中，培养获得的神经元(高)表达NSE，Tuj1，NeuN、Map2、Gad65、Gad67。
在一种或多种优选实施方式中，培养获得的神经元呈现MAP2，Tuj1，GAD65、GAD67阳性。
在一种或多种优选实施方式中，培养获得的神经元具有产生动作电位的能力。
在本发明的另一方面，提供一种神经干细胞样细胞，其是以精原干细胞为出发细胞，直接由精原干细胞转分化而获得。
在一种或多种优选实施方式中，所述神经干细胞样细胞表达神经干细胞标志物Nestin和Pax6；更佳地Nestin和Pax6双阳性率达到95％以上。
在一种或多种优选实施方式中，所述神经干细胞样细胞由权利要求2～5任一所述的方法获得。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于直接将精原干细胞转分化为神经干细胞样细胞；或，用于制备神经细胞，所述神经细胞包括：神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞。
在一种或多种实施例方式中，上述的方法和应用为体外的方法和应用(为非治疗性、非诊断性的)，所述细胞包括：细胞培养物；或，所述的培养在容器中进行。
在本发明的另一方面，提供用于体外制备神经干细胞样细胞或由其分化的神经细胞的试剂盒，包括：
精原干细胞培养基；较佳地，包括：基础培养基，及GDNF、EGF、bFGF、LIF、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、牛胰岛素、维他命、转铁蛋白、腐胺、孕酮、β-巯基乙醇、血清；
转分化培养基A；所述转分化培养基A包括精原干细胞培养基及维甲酸；
转分化培养基B；所述转分化培养基B包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2B27、血清白蛋白、胰岛素、SB431542、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、血清、bFGF；
较佳地，所述试剂盒还包括扩增培养基；更佳地，所述扩增培养基在转分化培养基B基础上将血清替换为EGF；
较佳地，所述试剂盒还包括神经元分化培养基；更佳地，所述神经元分化培养基包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2、B27、L-谷氨酰胺、anti-Hesl寡核苷酸链、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；
较佳地，所述试剂盒还包括星形胶质细胞分化培养基；更佳地，所述星形胶质细胞分化培养基包括：完全培养基，及非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胎牛血清；
较佳地，所述试剂盒还包括少突胶质细胞分化培养基；更佳地，所述少突胶质细胞包括：完全培养基，及N2，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、SSCs鉴定；
(A)SSCs的MVH免疫荧光染色；Scale bar,20μm；
(B)SSCs的PLZF和OCT4免疫荧光染色；Scale bar,50μm；
(C)RT-PCR检测Plzf、Gfrα1、Etv5、Mvh和Oct4在SSCs和STO细胞中的表达情况。
图2、SSCs向iNSCs直接转分化；
(A)SSCs向iNSCs转分化过程中细胞形态变化；Scale bar,20μm；
(B)qRT-PCR检测转分化过程中NSCs相关基因的表达情况；
(C)qRT-PCR检测转分化过程中SSCs标志物及其相关基因的表达情况；
(D)转分化第6天时细胞的Nestin和Pax6免疫荧光染色；Scale bar,20μm。
图3、iNSCs的增殖能力分析；
(A)P1代iNSCs的Nestin，Pax6和Ki67免疫荧光染色；Scale bar,50μm；
(B)P5代iNSCs的Nestin，Pax6和Ki67免疫荧光染色；Scale bar,50μm；
(C)P10代iNSCs的Nestin，Pax6和Ki67免疫荧光染色；Scale bar,50μm；
(D)不同培养代数的iNSCs的Nestin和Pax6双阳性率统计结果。
图4、iNSCs向星形胶质细胞分化潜能；
(A)iNSCs向星形胶质细胞分化4周后的细胞形态；Scale bar,50μm；
(B)RT-PCR检测iNSCs来源的星形胶质细胞中Gfap和S100β基因的表达。
图5、iNSCs向少突胶质细胞分化潜能；
(A)iNSCs向少突胶质细胞分化后的细胞形态；Scale bar,50μm；
(B)RT-PCR检测iNSCs来源的少突胶质细胞中Ng2，Olig2和Mbp基因的表达。
图6、iNSCs向神经元分化潜能；
(A)iNSCs向神经元分化3周后的细胞形态；Scale bar,50μm；
(B)RT-PCR检测iNSCs和分化的神经元中神经元标志物的表达情况；
(C)qRT-PCR检测iNSCs向神经元分化1周，2周和3周时神经元标志物的表达情况。
(D)由iNSCs分化而来的神经元的MAP2和Tuj1免疫荧光染色以及MAP2和GAD65+67免疫荧光染色。Scale bar,50μm；
(E)iNSCs向神经元分化3周后的电生理检测；左图指示进行电生理检测的神经元，中间的图表示钠钾离子电流，右图表示动作电位。
图7、iNSCs在脑内的分化潜能；
(A)注射iNSCs 4周后，小鼠脑组织石蜡切片的mcherry和eGFP免疫荧光染色。白色箭头指示mcherry阳性且eGFP阳性的细胞，黄色箭头指示mcherry阳性且eGFP阴性的细胞。Scale bar,50μm；
(B)注射iNSCs 4周后，小鼠全脑组织石蜡切片中mcherry阳性细胞数统计结果；
(C)注射iNSCs 4周后，eGFP阳性细胞和eGFP阴性细胞在mcherry阳性细胞中所占比例的统计结果；
(D)注射iNSCs 4周后，小鼠脑组织石蜡切片的mcherry与Tuj1以及GAD65+67免疫荧光染色。白色箭头指示注射的iNSCs在脑内分化为神经元。Scale bar,50μm；
(E)注射iNSCs 4周后，GAD65/67阳性细胞和GAD65/67阴性细胞在mcherry阳性细胞且eGFP阴性细胞中所占比例的统计结果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种高效地直接将精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)转分化为神经干细胞样细胞(neural stem cell-like cells，iNSCs)的方法。所述iNSCs具有增殖活性，可以在体外进行稳定的传代培养，并且具有向其他神经细胞如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能。本发明的方法提供了一种整体性的优化方案，具有高效性，可以在非常短的周期内、在体外获得较多的iNSCs，并且可以获得高纯度的iNSCs，其中Nestin和Pax6双阳性率达到95％以上，有利于下游的细胞分离和纯化。
SSCs是一类能够将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。在睾丸微环境下，SSCs的能自我更新并分化至精子以维持男性生育能力。当SSCs所处微环境发生改变时，SSCs将不再按照严格的精子发生过程分化为精子，而是基于所处微环境转分化为其它类型的细胞。目前研究发现，利用体外培养系统和组织培养技术，可直接将SSCs转分化为肝细胞、肾组织细胞和神经元，但尚无SSCs直接转分化为iNSCs的报道。
本发明人致力于功能性神经干细胞样细胞的体外制备的研究，揭示了从精原干细胞向神经干细胞样细胞分化的方法。在优选的方式中，该方法通过合理地设计转分化阶段、添加诱导分化的关键因子，对精原干细胞进行体外诱导分化，从而获得功能性神经干细胞样细胞。
如本发明所用，“功能性”是指根据所描述的方法获得的神经干细胞样细胞具有与所预期的相同或相似的功能。
如本发明所用，“分化”指谱系定型(Lineage Commitment)的发育过程。
“谱系”指细胞发育的途径。
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种体外制备神经干细胞样细胞的方法，包括(1)以精原干细胞培养基培养精原干细胞；(2)经(1)培养的细胞，以转分化培养基A培养；所述转分化培养基A包括精原干细胞培养基及维甲酸；(3)经(2)培养的细胞，以转分化培养基B培养；获得神经干细胞样细胞。在培养期间，还可以根据培养情况，更换新鲜的培养基。
本发明中，所述的方法适用于哺乳动物来源的精原干细胞的转分化。所述的动物包括非人哺乳动物或人，较佳地包括(但不限于)：啮齿类动物(包括小鼠，大鼠，仓鼠等)，非人灵长类动物(如猴，猩猩等)，家畜(如牛，羊，狗，猪，兔等)。
除非另外说明，用于培养或用于诱导的培养基为液体培养基(培养液)。
本发明中，所述的精原干细胞可以是来自机体的精原干细胞，也可以来自已经扩增培养/传代/建系的精原干细胞。例如，本发明人在前期研究中已经建立了精原干细胞。例如，一种精原干细胞的制备方法包括：利用两步酶(Ⅳ型胶原酶+胰酶)消化法从睾丸组织分离和制备精原干细胞。
在本发明的具体实施例中，通过如下具体的步骤进行SSCs向iNSCs的转分化：(1)利用两步酶消化法分离精原干细胞，并用SSCs培养基进行体外扩增；(2)将大约10000个/孔SSCs接种在粘连蛋白包被的24孔板中，在37℃条件下体外培养24小时后，在SSCs培养基中添加1μM维甲酸继续培养24小时；(3)将培养基更换为转分化培养基，在37℃条件下培养6天。应理解，这是一种优选的示例，本发明的总体方案不限于此。
本发明的方法的几个主要特点和优势如下：第一，整个培养体系采用细胞生长因子、化学分子，不引入涉及重编程或转分化功能的外源性基因(不改变基因组结构)，因此可以避免外源基因对原干细胞的基因组稳定性的干扰和外源细胞相关的移植安全隐患。第二，可以高效获得神经干细胞样细胞，具有Nestin和Pax6双阳性的特征。第三，高效获得的神经干细胞样细胞，转分化效率很高，细胞状态理想且能够很好地支持神经干细胞样细胞进一步向神经细胞的分化。
本发明的转分化方法可以在体外获得高纯度的iNSCs，其中Nestin和Pax6双阳性率达到95％以上。
本发明的转分化方法是一个有序操作的、整体性的方案，所需时间非常短、效率非常高(例如仅需8天)。
同时，通过培养方案、培养基的优化设计，本发明的转分化方法无需经历多能性阶段(如图2C结果显示，多能性基因Oct4基因的表达水平在转分化过程中呈递减趋势)，而是可实现直接的贴壁转分化培养，操作过程简易、成功率高。
本发明获得的神经干细胞样细胞具有多方面的应用，包括进一步诱导分化为多种类的神经细胞(包括神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞等)，可实现高效的分化、获得具有典型特征的神经细胞。进一步地，这些神经细胞能够形成脑细胞组织。
本发明获得的神经干细胞样细胞，可将之富集于损伤部位，在局部组织/微环境下分化为神经细胞，修复及补充发生损伤的神经细胞。例如，缺血、缺氧可导致此类损伤，通过给予神经干细胞样细胞是指富集于损伤部位。所述神经干细胞样细胞也可通过产生多种神经营养因子，刺激原有神经元和神经胶质细胞，促进损伤细胞的修复。所述神经干细胞样细胞也可通过增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路，降低脑部氧化性压力。
本发明所述的神经干细胞样细胞可被应用于多种中枢神经系统性的疾病中，包括脑部和脊髓损伤。例如但不限于：脑瘫，脑膜炎或其后遗症，脑发育不良，中风(脑出血或脑梗塞)或其后遗症，脑外伤，脊髓损伤，运动神经元病，肌萎缩性侧索硬化症，脑萎缩，共济失调，帕金森病，癫痫，多系统萎缩症，舞蹈症，多发性神经根炎，神经性耳聋，面瘫，周围神经病等。
本发明也提供了用于各阶段诱导培养的培养基，包括所述SSCs培养基，转分化培养基A，转分化培养基B，所述培养基可用于培养SSCs细胞以及用于产生。较佳地，当iNSCs扩增培养基。
除了本发明实施例中所列举的具体细胞因子或化学组分以外，本领域公知的与它们具有相同或相近功能的细胞因子或化学组分也可被应用于本发明中。所述具体列举的成分的类似物、同功能蛋白(如生长因子的同功能蛋白)或化合物、诱导相同靶点的等效化合物、类似物、衍生物和/或它们的盐、水合物或前体，也可用于替换上述具体列举的成分，以实现同样的技术效果。这些类似物、同功能蛋白或化合物也应被包含在本发明中。化合物的类似物包括但不限于：化合物的异构体、外消旋体。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。所述的“化合物的前体”指当用适当的方法施用或处理后，该化合物的前体在培养基中可转变成上述任一化合物的一种化合物，或上述任一化合物的一种化合物所组成的盐或溶液。
作为本发明的优选方式，所述的培养基中还可加入用于预防细胞培养的细菌污染，例如革兰氏阳性和阴性细菌污染的成分，例如一些抗生素。在优选实施例中，采用了双抗。
所述的细胞因子或化学组分被添加于适宜的基础培养基/完全培养基/神经培养基或混合培养基中。所述基础培养基/完全培养基可以是MEM-α、DMEM/F12、DMEM、RPMI1640或与它们的营养组分类似的可替代型培养基；所述神经培养基可以是Neuronal basal等或与其营养组分类似的可替代型培养基。应理解，本领域技术人员熟悉所述的基础细胞培养基的配制或购买途径。而本发明的实施例中则提供了的优选的细胞培养基。
本发明还提供了一种试剂盒，其中含有本发明所述的转分化培养基A、转分化培养基B、精原干细胞培养基。
在本发明的优选方式中，所述试剂盒中还含有SSCs细胞，可以是天然分离的或扩增/传代的细胞。
在本发明的优选方式中，所述试剂盒中还含有SSCs扩增培养基。较佳地，其中还含有神经元分化培养基、星形胶质细胞分化培养基和/或少突胶质细胞分化培养基。
在需要的情况下，所述的试剂盒中还含有用于分离和维持细胞的培养基/试剂。较佳地，所述试剂盒中还包含使用说明书，从而便于本领域人员在研究中或在临床上应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第四版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料和方法
1、RT-PCR和qRT-PCR
用0.05％胰酶消化液收集SSCs以及步中转分化时期的iNSCs，分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，300×g离心5min，弃上清。用TRIzol裂解液提取细胞中的总RNA，并进行反转录合成cDNA链，随后进行RT-PCR和qRT-PCR检测。
2、免疫荧光染色鉴定
弃去培养基，PBS缓冲液润洗细胞后，每孔加入200μL 4％多聚甲醛溶液，室温固定30min，PBST洗3次，每次5min；每孔加入200μL 0.5％Triton X-100溶液，室温透膜20min(对于膜蛋白如MVH则不需要透膜处理)，PBST洗3次，每次5min；每孔加入200μL 10％山羊血清，于37℃孵育箱中封闭15min后，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜。次日，弃去一抗，PBST洗3次，每次5min；加入稀释好的二抗，室温避光孵育1h，PBST洗3次，每次5min；DAPI复染细胞核5-10min，PBST洗3次，每次5min；加入含荧光淬灭剂的封片液，成像。
3、神经元电生理检测
1)电极制备：取外径1.50mm、内径0.89mm的普通硬质硅酸盐玻璃微电极(VitalSense Scientific Instruments,China)经微电极拉制仪四步拉制而成，充灌电极内液后，电极阻抗为4-6ΜΩ；
2)全细胞膜片钳记录：在室温(20-25℃)下，用膜片钳放大器进行全细胞膜片钳记录。实验参数设置、数据采集和刺激方案施加均通过采样软件pClamp10.7(MD,USA)来控制。
3)刺激和记录：
电压钳下，钳制电压-70mV，给予-70～+70mV，时程30ms，步幅10mV的去极化步阶电压刺激记录不同电压下的全细胞电流。
电流钳下，钳制电流0pA，给予-20～+70pA，时程200ms，步幅10pA的去极化步阶电流刺激，记录不同电流刺激强度下细胞的动作电位。
4、双荧光慢病毒载体的构建及感染SSCs
为了更好的追踪iNSCs在小鼠海马体内的变化，发明人将194bp的Nestin核心启动子与720bp eGFP序列克隆至Plvx-mcherry-N1慢病毒载体上，从而获得双荧光慢病毒载体-CMV-mcherry-Nestin core promoter-eGFP，其中mcherry荧光是质粒本身携带的，用于指示感染细胞的效率，而eGFP特异性的表征Nestin基因的表达。将慢病毒载体包被慢病毒后，进行SSCs慢病毒感染。
5、iNSCs脑立体定位注射
对感染双荧光慢病毒的SSCs进行转分化，并利用流式荧光分选技术收集转分化后eGFP阳性细胞。然后利用脑立体定位仪将iNSCs注射到小鼠两侧海马体内(每侧各注射50×104个iNSCs)，以检测其在脑内向神经元的分化潜能。将微量注射器在打孔的位置垂直向下进针1-2mm。以0.06-0.1μL/min的速度向两侧海马体CA1区各注射1μL iNSCs细胞悬液或者1μL PBS缓冲液。注射完毕后，留针2min，然后以1mm/min的速度缓慢拔出进样针。在注射4周后，进行脑组织的石蜡切片免疫荧光染色。
6、脑组织石蜡切片免疫荧光染色
利用颈椎脱臼法处死小鼠后，小心剥离颅骨并获取脑组织。将修整好的脑组织4％多聚甲醛溶液中4℃固定过夜，然后经梯度脱水、组织透明化和浸蜡处理后，利用切片机进行切片，切片厚度为10μm。待切片抗原修复后，进行免疫荧光染色。
II.实施例
实施例1、精原干细胞(SSCs)的分离及鉴定
1、精原干细胞(SSCs)的分离培养
实施例中使用的小鼠均为DBA/2雄鼠与C57BL6雌鼠交配产生的F1代6日龄雄性小鼠。利用两步酶消化法分离SSCs，步骤如下：用眼科剪刀剪开小鼠腹部皮肤，充分暴露腹腔，用眼科镊子将小鼠睾丸置于含有1％双抗(青霉素-链霉素溶液，商购青霉素-链霉素成品混合液，该溶液内含5000单位/mL青霉素和5000μg/mL链霉素，按照1％的体积比添加至培养基中)的D-Hanks缓冲液中，充分洗涤3-5次后，用镊子仔细去除睾丸白膜，暴露疏松的睾丸组织。将睾丸组织剪碎后，将其转移至15mL离心管中，用含1％双抗的D-Hanks缓冲液洗涤3次后，300×g离心5min，弃上清。向离心管中加入5mL 1mg/mLⅣ型胶原酶并重悬组织沉淀，于37℃水浴锅中摇动消化10-15min，具体消化时间以睾丸组织无大组织块为标准，消化过程中每隔3-5min用移液枪轻轻吹打沉淀，使其被充分消化，300×g离心5min，弃上清。向15mL离心管中加入3mL 0.05％胰酶消化液，重悬沉淀后，于37℃水浴锅中孵育5min。用6mL含10％胎牛血清的培养基终止消化后，用40μm细胞筛去除组织块，将细胞悬液收集于50mL离心管中，300×g离心5min，弃上清。用适量D-Hanks缓冲液重悬细胞后，利用免疫磁珠分选方法纯化SSCs。向细胞悬液中添加50μL Anti-Mouse CD90.2 Magnetic Particles，于4℃冰箱孵育30min后，利用磁力架收集磁珠。最后，将与磁珠结合的SSCs用SSCs培养基(MEM-α基础培养基，20ng/mL GDNF(glialcellline-derived neurotrophic factor)，20ng/mL EGF，10ng/mL bFGF，10ng/mL LIF，1mM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，25μg/mL牛胰岛素，1×维他命(将商购的100×维他命添加于培养基，最终工作浓度为1×)，100μg/mL转铁蛋白，60μM腐胺，60ng/mL孕酮，0.1mMβ-巯基乙醇，1％双抗，10％胎牛血清)重悬，并接种在STO细胞饲养层(经丝裂霉素C处理)上进行短期培养。每2天半量换液1次，每隔5-7天传代一次，传代比例为1:2或1:3。
2、SSCs鉴定
对如上获得的细胞进行鉴定，采用RT-PCR和免疫荧光染色。
结果如图1，RT-PCR和免疫荧光染色结果显示，体外培养的SSCs除表达生殖细胞Marker(包括MVH)外，还特异性的表达多个SSCs标志物及其相关基因，包括PLZF、OCT4、ETV5和GFRα1，而这些基因在STO细胞中不表达，并且PLZF与OCT4具有明显的共定位。
以上结果说明，本发明所描述的SSCs的分离方法可以有效地分离SSCs，并能够实现SSCs的短期体外扩增。
实施例2、SSCs向神经干细胞样细胞(iNSCs)的直接转分化
1、SSCs转分化
将短期培养的SSCs用0.05％胰酶于37℃培养箱中消化3-5min，用含10％胎牛血清的培养基终止消化后，300×g离心5min，弃上清。用SSCs培养基重悬后，将细胞接种在0.2％明胶包被的35mm培养皿中以尽可能去除饲养层细胞及其他睾丸体细胞等，差速贴壁2h后，轻轻摇晃培养皿并收集上清。对细胞进行计数。之后进行如下培养：
(1)将大约10000个/孔SSCs细胞接种在10μg/mL粘连蛋白包被的24孔培养板(含SSCs培养基)中，于37℃培养箱中培养。
(2)24h后，将SSCs培养基更换为转分化培养基A(SSCs培养基+1μM维甲酸)，继续培养24h。
(3)将转分化培养基A更换为转分化培养基B(DMEM/F12培养基与Neurobasal培养基1:1，0.5％N2，1％ B27，25μg/mL牛血清白蛋白，25μg/mL牛胰岛素，10μM SB431542，2mML-谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，1％双抗，1％胎牛血清，20ng/mL bFGF)进行转分化，每2天更换一次培养基，每天向培养基中补充20ng/mL bFGF。
2、iNSCs扩增及传代培养
当SSCs转分化至第6天时，弃去转分化培养基B，用D-Hanks缓冲液润洗细胞，向培养板中加入适量0.05％胰酶消化液，于37℃培养箱中孵育5min。用含有10％胎牛血清的基础培养基终止消化后，将细胞收集在1.5mL离心管中，300×g离心5min，弃上清。
加入适量iNSCs扩增培养基(DMEM/F12培养基与Neurobasal培养基1:1，0.5％N2，1％ B27，25μg/mL牛血清白蛋白，25μg/mL牛胰岛素，10μM SB431542，2mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，1％双抗，20ng/mL EGF，20ng/mL bFGF)轻轻重悬细胞后，按照1:1的比例将细胞接种在10μg/mL粘连蛋白包被的24孔培养板中，置于37℃培养箱中培养，每2天更换一次培养基。待细胞密度达到85％左右时(大约5-6天)进行传代培养，传代比例为1:3-1:4。
3、培养及转分化结果
培养及转分化结果如图2。
如图2A所示，自转分化第2天起，细胞形态开始发生明显改变。此时部分细胞集落散开，细胞形态由原来的圆形或卵圆形变为双极形态，突起延长。到转分化第6天时，几乎观察不到与SSCs细胞形态相似的细胞，绝大部分细胞变为梭形细胞。
如图2B所示，qRT-PCR结果表明，随着转分化时间的延长，NSCs相关基因的表达呈动态变化过程，部分基因(Vimentin，ID2和Nrcam)表达水平呈逐步上升趋势，而其他相关基因如Nestin，Blbp，CD133，Cdh2和L1cam等的表达水平在转分化第6天时达到最高水平，随后从第8天开始逐渐降低。
如图2C所示，与SSCs相比，自转分化第2天开始，SSCs标志物及相关基因的表达便显著降低，到转分化第6天时几乎检测不到这些基因的表达，说明SSCs细胞基本上转分化为iNSCs。
如图2D所示，免疫荧光染色结果表明，转分化第6天时的细胞表达NSCs的标志物Nestin和Pax6。并且，Nestin和Pax6双阳性率达到95％以上。
实施例3、iNSCs自我更新能力鉴定
本实施例中，检测由SSCs转分化而来的iNSCs是否具有增殖能力。
利用iNSCs扩增培养基，对转分化获得的iNSCs(转分化培养第6天)进行了传代培养，传代比例为1:3-1:4，并进行免疫荧光染色。每3-5天传一代，依次计为P1、P2、P3，依次类推。
结果表明，P1代、P5代和P10代iNSCs均表达NSCs标志物Nestin和Pax6，以及细胞增殖marker—Ki67，并且三者之间具有明显的共定位(图3A-C)。这说明由SSCs转分化而来的iNSCs具有增殖活性。
其中，Nestin和Pax6双阳性率一直在95％以上(图3D)，不同代数iNSCs之间的双阳性率无显著差异。
实施例4、iNSCs分化潜能检测：向星形胶质细胞分化
为了进一步探究iNSCs的细胞特性，本实施例中，探究前述制备的iNSCs向星形胶质细胞分化的潜能。
收集iNSCs并计数后，将10000个/孔iNSCs细胞接种在多聚赖氨酸和粘连蛋白包被的24孔板中，于37℃培养箱中培养12h，然后将iNSCs扩增培养基更换为星形胶质细胞分化培养基(DMEM/F12培养基，1mM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，1％双抗，10％胎牛血清)，每2天更换一次培养基，直至分化4周结束。
结果显示，iNSCs在星形胶质细胞分化培养基中培养4周后，此时的细胞形态与星形胶质细胞形态极其相似，即细胞胞体呈星形，细胞核大而圆，胞体四周有许多突起存在(图4A)。
RT-PCR结果表明，分化后的细胞表达星形胶质细胞标志性基因Gfap和S100β(图4B)。
实施例5、iNSCs分化潜能检测：向少突胶质细胞分化
为了进一步探究iNSCs的细胞特性，本实施例中，探究前述制备的iNSCs向少突胶质细胞分化的潜能。
收集iNSCs并计数后，将10000个/孔iNSCs细胞接种在多聚赖氨酸和粘连蛋白包被的24孔板中，于37℃培养箱中培养12h，随后将iNSCs扩增培养基更换为少突胶质细胞分化培养基A(DMEM/F12培养基，0.5％N2，500μM IBMX)，并于37℃培养箱中培养5天，每2天更换一次培养基，然后将少突胶质细胞分化培养基A更换为少突胶质细胞分化培养基B(DMEM/F12培养基，0.5％N2，200μM抗坏血酸，30ng/mL 3,3,5-triiodothyronine(T3))继续分化7天。
当iNSCs向少突胶质细胞分化12天后，此时的细胞具有与少突胶质细胞相似的细胞形态(图5A)。
RT-PCR结果表明，分化后的细胞表达Ng2，Olig2和Mbp等少突胶质细胞标志性基因(图5B)。这说明由SSCs转分化而来的iNSCs具有向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能。
实施例6、iNSCs分化潜能检测：向神经元分化
为了进一步探究iNSCs的细胞特性，本实施例中，探究前述制备的iNSCs向神经元分化的潜能。
收集iNSCs并计数后，将20000个iNSCs细胞接种在多聚赖氨酸和粘连蛋白包被的24孔板中，于37℃培养箱中培养12h后，将iNSCs扩增培养基更换为神经元分化培养基(DMEM/F12培养基与Neurobasal培养基1:1，0.5％N2，1％ B27，2mM L-谷氨酰胺，1％双抗，500nM anti-Hesl寡核苷酸链，500μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX))。在分化第1周，每3天半量更换神经元分化培养基。在第2周和第3周分化过程中，每3天全部更换培养基。
接下来，发明人重点研究了iNSCs在体外和体内环境下向神经元(特别是GABA能神经元)分化的潜能。
如图6A所示，分化3周后细胞呈现于神经元类似的细胞形态，细胞轴突延长，并表达神经元标志性基因NSE，Tuj1，NeuN和Map2(图6B)。
qRT-PCR结果显示，随着分化时间的延长，神经元的标志性基因的表达水平显著升高(图6C)。
值得注意的是，利用本实验所提供的神经元分化体系，分化3周后能够检测到GABA能神经元的标志物Gad65和Gad67的表达(图6B)，并且其表达水平也呈现逐步升高的趋势(图6C)。
同时，免疫荧光染色结果同样说明，iNSCs向神经元分化3周后，表达(GABA能)神经元markers—MAP2，Tuj1，GAD65和GAD67(图6D)。
重要的是，神经元电生理检测结果显示，电压钳下可以检测到内向Na离子和外向K离子电流，说明由iNSCs分化而来的神经元细胞功能完全，并具有产生动作电位的能力(图6E)。
以上结果说明，iNSCs在体外可以分化为功能完全的神经元。
实施例7、iNSCs分化潜能检测：脑内的存活及向神经元分化的能力
在将iNSCs注射进小鼠海马体4周后，对脑组织石蜡切片进行免疫荧光染色，以确定iNSCs在脑内的存活以及向神经元分化的能力。
对全脑的石蜡切片中的mcherry阳性细胞进行了统计，结果共追踪到大约15×104个mcherry阳性细胞(图7A，7B)，其中，eGFP阳性细胞占总的mcherry阳性细胞的13.8％(图7C)，这意味着SSCs来源的iNSCs在脑内可以存活。
进一步的免疫荧光染色及统计分析表明，这些存活的mcherry阳性且eGFP阴性的细胞已经分化为神经元，特别是GABA能神经元(图7D，7E)。
以上实施例的结果表明，通过改变SSCs所处微环境，可以实现SSCs向iNSCs的高效直接转分化。获得的iNSCs具有与NSCs相似的增殖活性，以及向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.一种制备神经干细胞样细胞的方法，包括：以精原干细胞为出发细胞，直接将精原干细胞转分化为神经干细胞样细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述直接将精原干细胞转分化为神经干细胞样细胞的方法，包括：
(1)以精原干细胞培养基培养精原干细胞；
(2)经(1)培养的细胞，以转分化培养基A培养；所述转分化培养基A包括精原干细胞培养基及维甲酸；
(3)经(2)培养的细胞，以转分化培养基B培养；所述转分化培养基B包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2B27、血清白蛋白、胰岛素、SB431542、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、血清、bFGF；获得神经干细胞样细胞；
较佳地，所述方法还包括：
(4)经(3)培养的细胞，以扩增培养基培养或传代；所述扩增培养基在转分化培养基B基础上将血清替换为EGF。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(2)中，精原干细胞接种于预包被的容器中；较佳地所述容器以粘连蛋白包被；较佳地5000～20000个细胞/孔接种于24孔板；较佳地37±2℃培养；或
(2)中，培养时间24±12小时；较佳地24±8小时；更佳地24±6小时；或
(3)中，培养时间2天以上；较佳地3～8天；更佳地3.5～7天；或
(2)中，维甲酸的量为0.2～5μM；或
(4)中，EGF的量为5～100ng/mL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述精原干细胞培养基包括：基础培养基，及GDNF、EGF、bFGF、LIF、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、牛胰岛素、维他命、转铁蛋白、腐胺、孕酮、β-巯基乙醇、血清；较佳地，包括：
Figure FDA0004154987340000021
较佳地，所述基础培养基为MEM-α培养基。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转分化培养基B包括：
Figure FDA0004154987340000022
较佳地，完全培养基与神经培养基的混合培养基按照体积比1:5～5:1混合；更佳地，所述完全培养基为DMEM/F12培养基，所述神经培养基为Neurobasal培养基。
6.一种神经干细胞样细胞，其是以精原干细胞为出发细胞，直接由精原干细胞转分化而获得；
较佳地，所述神经干细胞样细胞表达神经干细胞标志物Nestin和Pax6；更佳地Nestin和Pax6双阳性率达到95％以上；
较佳地，所述神经干细胞样细胞由权利要求2～5任一所述的方法获得。
7.一种制备神经细胞的方法，包括：
(a)以权利要求1-6任一所述的方法获得神经干细胞样细胞或其传代的细胞；
(b)将(a)的细胞进一步诱导分化为神经细胞；所述神经细胞包括：神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经细胞为神经元，利用神经元分化培养基培养；较佳地，所述神经元分化培养基包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2、B27、L-谷氨酰胺、anti-Hesl寡核苷酸链、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；或
所述神经细胞为星形胶质细胞，利用星形胶质细胞分化培养基培养；较佳地，所述星形胶质细胞分化培养基包括：完全培养基，及非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胎牛血清；或
所述神经细胞为少突胶质细胞，利用少突胶质细胞分化培养基培养；较佳地，所述少突胶质细胞包括：完全培养基，及N2，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
9.权利要求1-8任一所述的方法的应用，用于直接将精原干细胞转分化为神经干细胞样细胞；或，用于制备神经细胞，所述神经细胞包括：神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞。
10.用于体外制备神经干细胞样细胞或由其分化的神经细胞的试剂盒，包括：
精原干细胞培养基；较佳地，包括：基础培养基，及GDNF、EGF、bFGF、LIF、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、牛胰岛素、维他命、转铁蛋白、腐胺、孕酮、β-巯基乙醇、血清；
转分化培养基A；所述转分化培养基A包括精原干细胞培养基及维甲酸；
转分化培养基B；所述转分化培养基B包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2B27、血清白蛋白、胰岛素、SB431542、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、血清、bFGF；
较佳地，所述试剂盒还包括扩增培养基；更佳地，所述扩增培养基在转分化培养基B基础上将血清替换为EGF；
较佳地，所述试剂盒还包括神经元分化培养基；更佳地，所述神经元分化培养基包括：完全培养基与神经培养基的混合培养基，及N2、B27、L-谷氨酰胺、anti-Hesl寡核苷酸链、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；
较佳地，所述试剂盒还包括星形胶质细胞分化培养基；更佳地，所述星形胶质细胞分化培养基包括：完全培养基，及非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胎牛血清；
较佳地，所述试剂盒还包括少突胶质细胞分化培养基；更佳地，所述少突胶质细胞包括：完全培养基，及N2，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
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