JP7114134B2 - 分化用培地及びオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
髄鞘は、脊椎動物の中枢神経系(central nervous system、 CNS)でオリゴデンドロサイト(oligodendrocytes、 OLs)がニューロンの軸索に巻き付いてなるものであり、神経発達の初期段階では、神経前駆細胞が最初にニューロンを生じた後、オリゴデンドロサイト前駆細胞(oligodendrocyte precursors、 OPs)の生成を開始し、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、神経系の他の部分に遊走し、増殖し、最終的に成熟したオリゴデンドロサイト(OLs)に分化して髄鞘を形成する。
多能性幹細胞研究の推進に伴い、オリゴデンドロサイト前駆細胞の供給源の問題も解決されている。現在、多能性幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化は、主にオリゴデンドロサイトのin vivoでの自然発生過程を参照してシミュレートし、まず、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化誘導し、さらに、オリゴデンドロサイト前駆細胞に分化する。しかしながら、現在、多能性幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化の手順は、複雑で手間がかかり、培養プロセス全体には約4か月程度かかり、長いものには6か月かかり、細胞療法又は疾患モデルの構築におけるOPsの適用を大幅に制限している。今まで、神経上皮細胞からOPsへの培養方法では、培地にウシ胎児血清、非ヒトアルブミン又は非ヒト由来成長因子などの異物を多く添加し、臨床応用におけるOPsのリスクが増加している。現在、多くの学者は、分化時間を短縮し、分化の効率を向上させることができる培地及び培養方法にの研究に専念している。
本発明で提供される神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地は、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化する時間を短縮し、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化効率を向上させ、ここで、前記培地に2-メルカプトエタノールを添加することにより、細胞の抗酸化能力を向上し、細胞生存率を高めるだけでなく、前記2-メルカプトエタノールと培地でのPDGF-AA及びβ-HRG1との組み合わせ作用にり、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を大幅に高めることができる。
さらに好ましくは、前記培地は、Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が0.5~2.5%のGlutaMAX、1~5%のB27、0.5~2.5%のN2、2~25ng/mlのbFGF、2~25ng/mlのPDGF-AA、2~25ng/mlのIGF-1、2~25ng/mlのWnt3A、25~250ng/mlのβ-HRG1、1~20μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む。
さらにオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を向上させ、その生産量を増加させるために、前記神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地において、Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを体積比1:1で混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が1%のGlutaMAX、2%のB27、1%のN2、10ng/mlのbFGF、10ng/mlのPDGF-AA、10ng/mlのIGF-1、5ng/mlのWnt3A、100ng/mlのβ-HRG1、10μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む。
Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを混合した基礎培地を含み、さらに最終濃度が0.5~2.5%のGlutaMAX、1~5%のB27、0.5~2.5%のN2、2~25ng/mlのbFGF、2~25ng/mlのPDGF-AA、25~250ng/mlのβ-HRG1、1~20μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む培地を調製するステップと、
濃度が2.5~25μg/mlのPLO及び2.5~25μg/mlのラミニンで細胞培養容器にコーティングした後、上記ステップに記載の培地を加え、1×104~5×104cells/cm2の密度で神経幹細胞を前記細胞培養容器に播種するステップと、
細胞に十分な成長因子及び栄養素があることを保証する条件下でオリゴデンドロサイト前駆細胞が前記培地に現れるまで前記培地を定期的に交換し、前記培地を48hおきに定期的に交換してもよいステップと、を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法を提供する。
ここで、分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞を臨床適用基準に近づけるか、又は満たすために、細胞培養容器にコーティングされるラミニン(laminin)は、ヒト由来ラミニンであることが好ましい。
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記細胞培養容器は6ウェルプレートである。細胞密度を確保することを前提として、他の細胞培養プレート又は培養皿、例えば、12ウェルプレート、24ウェルプレートが除外されなく、又は実際に分化する必要があるオリゴデンドロサイトの量に従って細胞培養皿を選択して分化する。
本発明に係る実施例の別の目的は、骨髄間葉系幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製するプロセスを安定的に制御しながらオリゴデンドロサイト前駆細胞品質を向上させる方法を提供する。
神経幹細胞用培地として最終濃度が0.5%~2.5%のGlutaMAX、1%~5%のB27、10~60ng/mlのbFGF、10~60ng/mlのEGF、5~40ng/mlのGMP IGF-1及び1%のP/Sを含有するAdvanced DMEM/F12を含む培地を調製するステップと、
前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、7500~20000cells/cm2の密度で細胞非接着性培養容器に播種するステップと、
細胞の成長に応じて前記細胞非接着性培養容器内の神経幹細胞用培地を定期的に交換し、前記神経幹細胞は、ニューロスフェアとして前記神経幹細胞用培地に存在するステップと、を含む。
前記ニューロスフェアは、培養容器内で非接着培養により培養する必要があり、非接着培養は、ニューロスフェアの自律的分化を抑制でき、分化御製に役立ち、非接着性培養を使用して前記ニューロスフェアを収集する場合には細胞を消化する必要がなく、培養液を直接遠心分離することができ、消化ステップでの細胞への損傷を減らすため、非接着培養で骨髄間葉系幹細胞を培養することにより骨髄間葉系細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する収率を向上させることができる。
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記骨髄間葉系幹細胞は、骨髄から以下の手順で調製される。前記手順は、
前記骨髄をStem Pro培地で培養し、48時間後に培地及び非接着細胞を取り除き、新しい培地を追加して培養を続けること;
培地に骨髄間葉系幹細胞のクローンが現れると、培地にCD45陽性細胞の含有量が1%未満になるまで40000cells/cm2の播種密度でStem Pro培地に播種して継代培養を行うことを含む。
骨髄には、骨髄間葉系幹細胞以外の多くの異種細胞が含まれ、骨髄を48h接着培養した後、培地を除去すると、非接着性の異種細胞を大幅に低減させ、骨髄間葉系幹細胞の純度を向上させることができる。
さらに、40000cells/cm2の播種密度で継代すると、骨髄間葉系幹細胞の幹細胞性が維持され、骨髄間葉系幹細胞のランダムな分化が抑制されるため、骨髄からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する収率を向上させる。
さらに好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、神経幹細胞を調製するための骨髄間葉系幹細胞STRO-1、CD90及びCD73陽性発現量が90%より大きく、Nestin陽性発現量が5%より大きく、且つCD45陽性発現量が1%未満である。培地中の細胞マーカーの陽性発現量は、骨髄間葉系幹細胞の継代培養の回数により制御され、培地中のCD45陽性発現量が1%未満である場合には、造血幹細胞が骨髄間葉系幹細胞による神経幹細胞の調製に与える影響は無視できる。
本発明に係る実施例で用いられる培地は、主成分の来源情報は、以下の通りである。
CTS Stem Pro培地:Thermo Fisher、Cat.No.: A1033201
Advanced DMEM/F12:Thermo Fisher、Cat. No.: 12634028
Neurobasal medium:Thermo Fisher、Cat. No.: 21103049
1、原料由来:
骨髄は、30日齢のSprague-Dawleyラット又は年齢が18~40歳の成人に由来するが、これらに限定されない。
2、CTS Stem Pro培地9mlでSprague-Dawleyラット又は成人骨髄1mlを希釈し、細胞接着培養に適するように変性処理された10cmの細胞培養皿に希釈後の骨髄を加えて培養し、骨髄の接着培養を行う日をオリゴデンドロサイト前駆細胞分化過程の初日(D0)を定義した。
4、D6~D7まで培養する際に、培養皿で骨髄間葉系幹細胞(BMSC)クローンを観察でき、D8~D10まで培養する際に、培地を吸引し、培養皿中の非接着性細胞をDPBS 3mlで洗浄し、上記DPBSを取り除き、培養皿にCTS Tryple Select 1mlを加え、37℃で5minインキュベートし、消化された細胞溶液を収集し、室温の条件下、200gで5min遠心してペレットを得、CTS Stem Pro培地で上記遠心ペレットを再懸濁した。
5、上記細胞を4×104 cells/cm2の密度で6cm又は10cmの細胞培養皿に播種した。
6、培養皿中のBMSCは80%~90%のコンフルエントに達する時に、継代培養を行い、ここで、BMSCが10世代を超えて継代培養することはできない。
フローサイトメーターによるそのマーカーの検出:
BMSCがP3に継代されると、細胞を収集し、通常に消化し、DPBSで細胞を再懸濁した後に、4%のPFAを加えて10min固定した後、遠心分離し、細胞ペレットをDPBSで2~3回洗浄してPFAを除去し、それぞれCD90、CD73、CD45、Nestin及びSTRO-1を含む一次抗体のブロッキング溶液で細胞を2hインキュベートし、遠心分離した後、さらに蛍光色素(Alexa488)で標識された二次抗体を含むブロッキング溶液で細胞を30minインキュベートし、遠心分離して細胞をDPBSで再懸濁した後、フローサイトメーターで細胞表面抗原を検出した。陰性対照は、一次抗体の由来、Igタイプ及びラベルに一致する非特異的抗体をアイソタイプコントロールとして使用された。図1に示されるフローサイトメトリー解析結果は、本発明に係る実施例で調製されたBMSCはCD73、CD90及びSTRO-1を安定して発現し、且つBMSCには造血幹細胞がほとんどないことを示している。
フローサイトメトリー法により以下の3群のマーカーを検出した。即ち
A:BMSCマーカー:STRO-1、CD90及びCD73;
B:神経幹細胞マーカー:Nestin;
C:造血幹細胞マーカー:CD45。
培養皿内の細胞のA群マーカーに陽性が90%より大きく、B群マーカーに陽性率が5%より大きく、且つC群マーカーに陽性率が1%未満である場合には、培養皿中での細胞は、次の操作に用いれた。
1、神経幹細胞用培地の調製
最終濃度が1%のCTS GlutaMAX、2%のCTS B27、40ng/mlのGMP bFGF、40ng/mlのGMP EGF、20ng/mlのGMP IGF-1及び1%のP/Sを含むAdvanced DMEM/F12培地を調製した。
2、BMSCが第3世代から第10世代の間に継代した時に(好ましくはD15)、CTS Tryple SelectでBMSCを消化し、遠心分離した後、神経幹細胞用培地でBMSCを再懸濁し、1×104cells/cm2の密度でUltra Low(登録商標)非接着性培養用6ウェルプレートに播種した。
3、神経幹細胞用培地を48時間おきに交換し、培養時間の延長に伴い、神経幹細胞はニューロスフェアを形成し、神経幹細胞用培地に懸濁し、非接着性培養の5~7日目に、培地を200gで5min遠心分離してニューロスフェアとして存在する神経幹細胞を得た。
骨髄間葉系幹細胞を対照として、実施例2に係る非接着性培養の5日目のニューロスフェアを分散させた後に、免疫蛍光法にてニューロスフェアでのNestin及びGFAP陽性細胞の含有量を検出してカウントし、図2から、実施例2においてニューロスフェア中のNestin及びGFAP陽性細胞の含有量が85%を超えることが分かった。
実験により、実施例2にかかるニューロスフェアのNestin及びGFAP陽性細胞の含有量が75%を超える時に、そのニューロスフェアを使用してさらに分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞の純度及び分化効率は高くなることが分かった。
1、オリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地の調製
実施例2で調製された神経幹細胞を分化させるために、それぞれ以下の10群のオリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地を調製した。即ち
(1)第1群の分化用培地は、Advanced DMEM/F12とCTS Neurobasal mediumを体積比1:1で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が1%のCTS GlutaMAX、2%のCTS B27、1%のCTS N2、10ng/mlのGMP bFGF、10ng/mlのGMP PDGF-AA、100ng/mlのGMP β-HRG1、10μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む。
(3)第3群の分化用培地は、Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを体積比1.5:7.5で均一に混合した基礎培地、及びそれぞれ最終濃度が2.5%のGlutaMAX、5%のB27、2.5%のN2、25ng/mlのbFGF、25ng/mlのPDGF-AA、250ng/mlのβ-HRG1、20μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む。
(5)第5群の分化用培地は、Advanced DMEM/F12とCTS Neurobasal mediumを体積比1:1で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が1%のCTS GlutaMAX、2%のCTS B27、1%のCTS N2、10ng/mlのGMP bFGF、10ng/mlのGMP PDGF-AA、25ng/mlのIGF-1、2ng/mlのWnt3A 100ng/mlのGMP β-HRG1、10μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む。
(7)第7群の分化用培地は、Advanced DMEM/F12とCTS Neurobasal mediumを体積比1:1で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が1%のCTS GlutaMAX、2%のCTS B27、1%のCTS N2、10ng/mlのGMP bFGF、10ng/mlのGMP PDGF-AA、100ng/mlのGMP β-HRG1及び1%のP/Sを含む。
(9)第9群の分化用培地は、Advanced DMEM/F12とCTS Neurobasal mediumを体積比1:1で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が1%のCTS GlutaMAX、2%のCTS B27、1%のCTS N2、10ng/mlのGMP bFGF、10ng/mlのGMP PDGF-AA、10μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む。
2、濃度がいずれも10μg/mlであるポリ-L-オルニチン(PLO)及びヒト由来ラミニンで6ウェルプレートにコーティングし、その6ウェルプレートにオリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地を加えた後、実施例2で調製された神経幹細胞を播種し、ここで、播種密度は4×104cells/cm2である。
分化用培地にIGF-1及びWnt3Aを添加することにより、神経幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化効率を向上させることができ、神経幹細胞を第4群の分化用培地で培養開始後6日目に調製された細胞のOlig2、PDGFRα、NG2、及びSOX10陽性率は、それぞれ79.11%、84.75%、84.32%及び87.69%であり、神経幹細胞を第5群の分化用培地で培養開始後6日目に調製される細胞のOlig2、PDGFRα、NG2、及びSOX10陽性率は、それぞれ81.51%、88.62%、83.73%及び80.34であり、神経幹細胞を第6群の分化用培地で培養開始後5日目に調製される細胞のOlig2、PDGFRα、NG2、及びSOX10陽性率は、それぞれ95.35%、98.81%、95.33%及び94.17%である。
神経幹細胞を第8群の分化用培地で培養開始後10日目に調製された細胞のOlig2、PDGFRα、NG2、及びSOX10陽性率は、それぞれ76.62%、71.45%、79.81%及び77.69%であり、神経幹細胞を第9群の分化用培地で培養開始後10日目に調製された細胞のOlig2、PDGFRα、NG2、及びSOX10陽性率は、それぞれ71.37%、68.45%、72.69%及び71.11%であり、これらの2群の実験より、2-メルカプトエタノールとβ-HRG1の両方を含む培地は、2-メルカプトエタノールとPDGF-AAの両方を含む培地よりも神経幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化を促進できることが分かった。
細胞の以上の4つのマーカーの陽性率がいずれも90%よりも高くなる場合には、該細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞の純度が高くなり、さらに細胞製剤の有効成分として使用されるか、又は臨床研究に適用されることができる。
1、Myelin Forming Medium(MFM)の調製
最終濃度が1%のCTS GlutaMAX、2%のCTS B27、10μMの2-メルカプトエタノール、1%のP/S及び最終濃度が10μMのT3を含むCTS Neurobasal Mediumを調製した。
2、上記の方法でSprague-Dawleyラット又は成人骨髄により調製されるBMSCから分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞及びニューロンをMFMで15間共培養した際にミエリン塩基性タンパク質の発現量の顕著な増加が認められた。
1、細胞注射用バッファーの調製(Cell Injection Buffer、CIB)
最終濃度が20 mM的D-グルコース、1%のP/SをCa2+フリーのフェノール溶液又はMg2+フリーのハンクス平衡塩溶液(HBSS)溶液を調製した。
2、CTS Tryple Selectにて実施例4で調製されるオリゴデンドロサイト前駆細胞を消化し、CIBを追加して消化を停止し、200gで5min遠心した後にCIBでペレットを再懸濁させ、オリゴデンドロサイト前駆細胞注射液とした。
3、動物実験
それぞれshivererモデルマウスの中枢神経にヒト由来骨髄から分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞注射液及びSprague-Dawleyラット骨髄から分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞注射液を注射し、ここで、注射液濃度は、4×104cells/ulであり、且つ対照としてオリゴデンドロサイト前駆細胞が含まれていないCIBを使用した。
ここで、shivererモデルマウスは、中枢神経系の髄鞘が損傷し、寿命が約90日間のみである実験マウスであり、現在、髄鞘障害の研究に広く使用されている。
また、図6より、オリゴデンドロサイト前駆細胞がshivererモデルマウスの平均寿命を125日間(最長138日間)まで延長し、且つヒト由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞とマウス由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞とは、同様にモデルマウス寿命を延長させることができ、ヒト由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞をshivererモデルマウスに注射した後、明らかな拒絶反応が認められない。
以上の実験結果より、本発明に係る分化条件で骨髄間葉系幹細胞から分化するオリゴデンドロサイト前駆細胞は髄鞘障害又は他のオリゴデンドロサイトに関連する神経系疾患を治療する潜在能力を有し、本発明で提供される方法は、骨髄間葉系幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化時間を顕著に短縮させ、しかも、本発明で用いれる培地がいずれも非動物由来成分処方であるため、さらにオリゴデンドロサイト前駆細胞の臨床応用を促進することが分かった。
本発明の実施例に開示されている様々な実験パラメータは、発明者が複数回の実験により選別された、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を効果的に向上させる可能なものであるが、本発明の保護範囲を制限しない。本発明を基づいて培地の組成、含有量又は実験条件、例えば、培養時間、遠心力、遠心時間、培養温度などに加える明らかな変更、置換または修正は、すべて本発明の範囲内にある。
Claims (12)
- 神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地であって、前記培地は、Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを混合した基礎培地、0.5~2.5%のGlutaMAX、1~5%のB27、0.5~2.5%のN2、2~25ng/mlのbFGF、2~25ng/mlのPDGF-AA、25~250ng/mlのβ-HRG1、1~10μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含むことを特徴とする培地。
- 前記培地が、Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを体積比1:1で混合した基礎培地、1%のGlutaMAX、2%のB27、1%のN2、10ng/mlのbFGF、10ng/mlのPDGF-AA、100ng/mlのβ-HRG1、10μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の培地。
- 前記培地が、Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを混合した基礎培地、0.5~2.5%のGlutaMAX、1~5%のB27、0.5~2.5%のN2、2~25ng/mlのbFGF、2~25ng/mlのPDGF-AA、2~25ng/mlのIGF-1、1~10ng/mlのWnt3A、25~250ng/mlのβ-HRG1、1~20μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の培地。
- 前記培地が、Advanced DMEM/F12とNeurobasal mediumを体積比1:1で混合した基礎培地、1%のGlutaMAX、2%のB27、1%のN2、10ng/mlのbFGF、10ng/mlのPDGF-AA、10ng/mlのIGF-1、5ng/mlのWnt3A、100ng/mlのβ-HRG1、10μMの2-メルカプトエタノール及び1%のP/Sを含む、ことを特徴とする請求項3に記載の培地。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の培地によりオリゴデンドロサイト前駆細胞を製造する方法において、
前記培地を調製するステップ、
濃度が2.5~25μg/mlのPLO及び2.5~25μg/mlのラミニンで細胞培養容器にコーティングした後、前記培地を加え、1×104~5×104cells/cm2の密度で神経幹細胞を前記細胞培養容器に播種するステップ、および
オリゴデンドロサイト前駆細胞が前記培地に現れるまで培地を定期的に交換するステップ、
を含むことを特徴とするオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。 - 前記細胞培養容器が6ウェルプレートである、ことを特徴とする請求項5に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
- 神経幹細胞を前記細胞培養容器に4×104cells/cm2の密度で播種する、ことを特徴とする請求項5に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
- 前記神経幹細胞が、
神経幹細胞用培地として、0.5%~2.5%のGlutaMAX、1%~5%のB27、10~60ng/mlのbFGF、10~60ng/mlのEGF、5~40ng/mlのIGF-1及び1%のP/Sを含有するAdvanced DMEM/F12を含む培地を調製するステップ、
前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、7500~20000cells/cm2の密度で細胞非接着性培養容器に播種するステップ、および
前記神経幹細胞用培地を定期的に交換し、前記神経幹細胞はニューロスフェアとして前記神経幹細胞用培地に存在するステップ、
によって製造される、ことを特徴とする請求項5に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。 - 前記神経幹細胞が、
神経幹細胞用培地として、1%のGlutaMAX、2%のB27、40ng/mlのbFGF、40ng/mlのEGF、20ng/mlのIGF-1及び1%のP/Sを含有するAdvanced DMEM/F12を含む培地を調製するステップ、および
前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、10000cells/cm2の密度で細胞非接着性培養容器に播種して培養するステップ、
によって製造される、ことを特徴とする請求項8に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。 - 前記ニューロスフェアを、100g~300gで5min遠心分離して前記神経幹細胞用培地から分離する、ことを特徴とする請求項8に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
- 前記骨髄間葉系幹細胞は、骨髄から以下の手順で調製されてなり、前記手順は、
Stem Pro培地で前記骨髄を培養し、48時間後に培地及び非接着細胞を取り除いて培養を続け;
培地に骨髄間葉系幹細胞のクローンが現れると、培地にCD45陽性細胞の含有量が1%未満になるまで40000cells/cm2の播種密度でStem Pro培地に播種して継代培養を行う、ことを特徴とする請求項8~10のいずれか1項に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。 - 神経幹細胞を調製するための骨髄間葉系幹細胞STRO-1、CD90及びCD73陽性発現量が90%より大きく、Nestin陽性発現量が5%より大きく、且つCD45陽性発現量が1%未満である、ことを特徴とする請求項11に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
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