CN103484432B - 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物学、神经生物学领域，特别是涉及一种诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途。本发明的技术方案是：将人神经干／祖细胞经过预处理培养基预处理培养一定时间后，在诱导培养基的作用下，迅速分化为高纯度表达O4、A2B5、NG2、SOX10、PDGFR等少突胶质前体细胞标志物的少突胶质前体细胞，所述诱导培养基的关键成份为bFGF、PDGF-AA及NT-3。发明所述方法及所获得的少突胶质前体细胞可应用于制备治疗神经系统损伤疾病的药物，在实验研究和临床治疗上应用前景颇为广泛。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学、神经生物学领域，特别是涉及一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途。
背景技术
各种各样的髓鞘相关疾病，如脑白质损伤、脊髓损伤、多发性硬化等疾病由于神经元的髓鞘化障碍或脱髓鞘化，导致了神经元不能正常传递电兴奋，从而导致机体运动等功能失能，给这些疾病的患者及家庭带来了极大的伤害，但是目前还没有任何一种药物可以有效地治疗这些髓鞘相关疾病。
不论是髓鞘化障碍还是脱髓鞘病变，其根源都是神经元轴突髓鞘程度减少或丢失，因此如果能够恢复神经元轴突的髓鞘化程度，使得神经元电流得以稳定快速地传导，理论上这些疾病就可以被治愈。研究发现，少突胶质前体细胞(oligodendrocyteprogenitorcells,OPCs)是负责中枢神经系统髓鞘化的关键细胞，在中枢神经系统中，OPCs可以分化为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)，OL进一步包绕神经元轴突形成完整的髓鞘结构，从而保证神经元电流的稳定快速传导。髓鞘相关的疾病一方面是因为疾病破坏了已经形成的髓鞘结构，另一方面更是由于神经系统中OPCs受到了损伤，使得OL失去了源泉，因此难以髓鞘再生。动物实验研究发现，向先天性髓鞘化形成障碍的shiver小鼠或脑白质损伤大鼠移植OPCs时，移植的OPCs可以在体内正常包绕神经元轴突形成髓鞘使得这些动物的神经功能恢复，表明OPCs移植可能是治疗髓鞘损伤疾病的一个新的方向。
尽管啮齿类动物的OPCs很容易获得，人OPCs获得却相当困难，通过种种细胞分离技术尽管可以分离得到OPCs，但是数量相当有限，距离临床应用还非常遥远。干细胞的研究为OPCs获得提供了新的思路，干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞及各种成体干细胞，胚胎干细胞可以分化为机体的任何一种细胞，而成体干细胞则通常只能分化为其谱系决定的细胞。美国的Hans等人研究发现，胚胎干细胞体外可以分化为OPCs，且OPCs移植有助于脊髓损伤的神经功能恢复，该方法在美国进入了临床I期的治疗研究。但胚胎干细胞的全能性是把双刃剑，既能分化为各种细胞，也有致瘤的风险，因此此方法获得的OPCs在临床上应用还存在一定的致瘤风险。成体干细胞由于分化能力受到限制，在一定程度上避免了致瘤的风险，临床应用上更为安全。神经干/祖细胞(neuralstem/progenitorcells,NS/PCs)就是一种成体干细胞，它来源于神经组织或者胚胎干细胞分化，从发育学上看NS/PCs是OPCs的前体细胞，因此理论上最适合于OPCs的诱导。
干细胞所处的微环境同干细胞分化方向密不可分，NS/PCs同样如此。NS/PCs在体外呈悬浮培养形成球状结构，这些细胞并非完全均一，不同的预处理会使得这些细胞呈现出不同的分化能力。例如，表皮生长因子(EGF)预处理会增加星形胶质细胞分化的比例，而碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预处理则能增强神经元分化的比例。
发明内容
鉴于以上缺陷，本发明通过长时间预处理和生长因子联合诱导，提供一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途。
本发明中，我们首次发现一定浓度的EGF联合bFGF预处理人NS/PCs可以大大提高OPCs分化的比例，这些进一步证实了细胞外和细胞间的相互通讯是干细胞分化的关键决定因素。但是仅仅采用EGF联合bFGF预处理不足以将人NS/PCs直接分化为OPCs，还需要生长因子的进一步诱导作用才能获得大量的高纯度OPCs。本发明中我们发现采用三种生长因子：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)和神经营养因子3(NT-3)的组合足以诱导预处理后的NS/PCs向OPCs分化，且这三种因子缺一不可，否则将大大降低分化诱导的效率。
本发明提供的该种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基，其关键组份为碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子-AA和神经营养因子3。
更进一步的，本发明提供的该种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基，其由基础培养基及添加物二构成，其中：
所述基础培养基可为商用NeuralBasalMedium或自行配制的DFmedium任一一种。所述DFmedium培养基组成：由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml。所述添加物二包括：B27、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、乳酸钠、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子-AA、神经营养因子3及青链霉素(可选)。其中，B27为1×，转铁蛋白浓度为5-20μg/ml，孕酮浓度为5-20nmol/L，腐胺浓度为20-40μmol/L，亚硒酸钠浓度为10-20nmol/L，胰岛素浓度为5-20μg/ml，肝素浓度为2-10μg/ml，乳酸钠浓度为3-10mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子浓度为5-30ng/ml，PDGF-AA浓度为5-30ng/ml，NT-3浓度为5-30ng/ml，青链霉素(可选)浓度为100U/ml。
本发明提供的该种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导方法，其技术方案为：将人神经干/祖细胞经过预处理培养基预处理培养一定时间后，在诱导培养基的作用下，迅速分化为高纯度表达O4、A2B5、NG2等少突胶质前体细胞标志物的少突胶质前体细胞，所述诱导培养基的关键组份为bFGF、PDGF-AA、NT-3。具体包括如下步骤：
1.将人NS/PCs分散为单个细胞悬液；
2.细胞洗涤后重悬于预处理培养基中，调整密度为2～10×105/ml；
3.将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，在5-8.5％CO2、37℃和饱和湿度的培养条件下进行培养；
4.之后每3～5天进行一次半量换液，至细胞连续培养7-12天；
5.将细胞收集到离心管中，400g离心5分钟沉淀细胞；
6.弃上清，采用质量体积百分比0.025％的胰酶消化细胞球，使细胞消化为单细胞悬液，消化约10分钟后，并用浓度为1mg/ml的胰酶抑制剂终止消化；
7.400g离心5分钟收集细胞；
8.弃上清，用诱导培养基重悬细胞，调整密度为2～10×105/ml；
9.将细胞悬液接种于细胞培养瓶；
10.诱导4-10天后，可见细胞培养瓶底出现大量贴壁的OPCs；
11.进行形态学和OPCs标志物免疫荧光染色鉴定。
上述预处理培养基由基础培养基和添加物一构成，基础培养基可为商用NeuralBasalMedium或自行配制的DFmedium任一一种。所述DFmedium培养基组成：由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml。所述添加物一成分包括B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素和肝素。其中，B27为1×，表皮生长因子浓度15-25ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子浓度10-20ng/ml，白血病抑制因子浓度7-13ng/ml，转铁蛋白浓度50-150μg/ml，孕酮10-30mmol/L，腐胺50-150μmol/L，亚硒酸钠20-40mmol/L，胰岛素10-50μg/ml，肝素3-10μg/ml。
上述诱导培养基由基础培养基及添加物二构成，其中：所述基础培养基可为商用NeuralBasalMedium或自行配制的DFmedium任一一种。所述DFmedium培养基组成：由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml。所述添加物二包括：B27、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、乳酸钠、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子-AA、神经营养因子3及青链霉素(可选)。其中，B27为1×，转铁蛋白浓度为5-20μg/ml，孕酮浓度为5-20nmol/L，腐胺浓度为20-40μmol/L，亚硒酸钠浓度为10-20nmol/L，胰岛素浓度为5-20μg/ml，肝素浓度为2-10μg/ml，乳酸钠浓度为3-10mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子浓度为5-30ng/ml，PDGF-AA浓度为5-30ng/ml，NT-3浓度为5-30ng/ml，青链霉素(可选)浓度为100U/ml。
上述神经干/祖细胞(NS/PCs)，可以来源于但不局限于如下：人脑组织的各个部位或脊髓，或者由诱导多能干细胞(iPS)等细胞所诱导。
本发明方法及通过该方法获得的少突胶质前体细胞，可应用于治疗神经系统损伤疾病的体内外实验研究和临床治疗研究。
本发明方法及通过该方法获得的少突胶质前体细胞，可应用于制备治疗神经系统损伤疾病药物。
上述神经系统疾病包括：脑白质损伤、多发性硬化症、脊髓损伤等髓鞘相关疾病。
本发明提具有以下有益效果：
1、本方法不但有助于髓鞘疾病的临床治疗和药物筛选，也有利于髓鞘发育基础理论的研究：①获得高纯度OPCs有望应用于髓鞘相关疾病的临床治疗研究；②通过体外扩增获得大量OPCs为临床应用提供足够量的细胞；③研究少突胶质前体细胞的发育调控机制；④为髓鞘相关的疾病提供药物筛选模型。
2、本发明所诱导的OPCs可以在体外扩增至少10代以上同时维持生物学性状不变，扩增倍数上千倍，因此可以为基础或临床研究提供足够的细胞。
3、本发明所获得的OPCs可以冷冻保存和复苏继续培养，且冻存复苏后其生物学性状维持不变，这将进一步有助于OPCs临床移植治疗临床研究的广泛推广。
附图说明
图1为诱导所得的OPCs可见光形态，结果显示OPCs呈双极或多极，胞体较小；
图2为诱导获得OPCs的O4荧光染色，结果显示为阳性；
图3为诱导获得OPCs的A2B5荧光染色，结果显示为阳性；
图4为诱导获得OPCs的SOX10荧光染色，结果显示为阳性；
图5为诱导获得OPCs的NG2荧光染色，结果显示为阳性；
图6为诱导获得OPCs的PDGFR荧光染色，结果显示为阳性。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进一步说明，但不作对其的限定：
实施例1
本实施例从我实验室所建立的NSCs细胞系诱导OPCs，诱导时NSCs传代至第10代。
1、将NSCs消化为单细胞，洗涤后重悬于预处理培养基中，细胞悬液按2×106/T25密度接种于T25细胞培养瓶中，8.5％CO2，37℃，饱和湿度条件下进行培养。
2、细胞培养第4天时，进行半量换液。
3、细胞培养第8天时，进行半量换液。
4、细胞培养至第12天时，将细胞收集到离心管中，400g离心5分钟。
5、采用0.025％胰酶消化神经干细胞球，胰酶抑制剂终止消化，将细胞吹打为单细胞悬液。
6、离心收集细胞，离心条件为400g，5分钟。
7、用诱导培养基重悬细胞，并按2×106/T25接种于新的T25细胞培养瓶。
8、诱导5天后，可见细胞培养瓶底出现大量OPCs；
9、OPCs的鉴定，鉴定内容包括：
1)形态学鉴定，结果如图1所示；
2)OPCs标志物(O4、A2B5、SOX10、NG2、PDGFR)免疫荧光染色，结果如图2-6所示。
OPCs的鉴定方法与通常的细胞鉴定方法一致，结果显示OPCs呈双极或多极，胞体较小，且这些细胞高表达O4、A2B5、SOX10、NG2、PDGFR等OPCs标志物，阳性率为80-90％。
实施例2
分离大脑组织，采用机械法将组织分散为单细胞悬液，加入预处理培养基培养，培养条件为8.5％CO2，37℃，饱和湿度，细胞成球后，传代至进行OPCs的诱导。
培养、诱导及鉴定方法同实施例1。鉴定结果显示所获得的OPCs高表达O4、NG2等OPCs标志物，阳性率为80-90％。
实施例3
本实施例从我实验室所建立的另外一株NSCs细胞系诱导OPCs，诱导时NSCs传代至第25代。
培养、诱导及鉴定方法同实施例1。鉴定结果显示所获得的OPCs高表达O4、NG2等OPCs标志物，阳性率为80-90％。
上述实施例涉及的培养基及成分如下：
DFmedium培养基配方：
预处理培养基配方如下：
OPCs诱导培养基配方如下：
DMEM、F12为细胞培养中常见的培养基，可购自任何商业公司，本实施中这两种培养基购自Invitrogen公司，DMEM货号为11965-118，具体配方可参见http:// zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Product-Technical-Resources/media_ formulation.8.html，F12货号为11765-054，具体配方可参见http:// zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Product-Technical-Resources/media_ formulation.64.html。
NeuralBasalMedium是神经细胞培养中常用的培养基，可购自商业公司。本实施中这两种培养基购自Invitrogen公司，货号为10888022：具体配方可参见：http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.253.html
B27是神经细胞培养中常用的添加剂，可购自商业公司，本实施中购自Invitrogen公司，B27货号是17504-044，其成分可参考http://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/ home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.250.html。
表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、血小板源性生长因子-AA和神经营养因子3是细胞培养中常见的细胞因子，可购自商业公司，本实施中购自Peprotech公司，货号为：表皮生长因子：AF-100-15，碱性成纤维细胞生长因子：AF-100-18B，白血病抑制因子：AF-300-05，血小板源性生长因子-AA：100-13A-10，神经营养因子3：450-03-10。
乳酸钠、D-葡萄糖、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、胰蛋白酶、胰酶抑制剂购自Sigma公司，货号分别为：乳酸钠：L7022，D-葡萄糖：G8644，转铁蛋白：T2036，孕酮：P8783，腐胺：P5780，亚硒酸钠：S5261，胰岛素：I3536，肝素：H3149，胰蛋白酶：T4674，胰酶抑制剂：T6522。
HEPES购自Corning公司，货号是25-060-CI。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (2)
1.一种高效率诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，将人神经干/祖细胞经过预处理培养基预处理培养一定时间后，在诱导培养基的作用下，迅速分化为高纯度表达O4、A2B5、NG2等少突胶质前体细胞标志物的少突胶质前体细胞，
具体包括如下步骤：
1)将人神经干/祖细胞分散为单个细胞悬液；
2)细胞洗涤后重悬于预处理培养基中，调整密度为2～10×105/ml；
3)将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，在5-8.5％CO2、37℃和饱和湿度的培养条件下进行培养；
4)之后每3～5天进行一次半量换液，至细胞连续培养7-12天；
5)将细胞收集到离心管中，400g离心5分钟沉淀细胞；
6)弃上清，采用质量体积百分比为0.025％的胰酶消化细胞球，使细胞消化为单细胞悬液，消化10分钟后，用浓度为1mg/ml的胰酶抑制剂终止消化；
7)400g离心5分钟收集细胞；
8)弃上清，用OPCs诱导培养基重悬细胞，调整密度为2～10×105/ml；
9)将细胞悬液接种于细胞培养瓶；
10)诱导4-10天后，可见细胞培养瓶底出现大量贴壁的OPCs；
所述预处理培养基由基础培养基和添加物一构成，所述基础培养基采用商用NeuralBasalMedium或自行配制的DFmedium任一一种；所述DFmedium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml；所述添加物一成分包括B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素和肝素，其中，B27为1×，表皮生长因子浓度15-25ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子浓度10-20ng/ml，白血病抑制因子浓度7-13ng/ml，转铁蛋白浓度50-150μg/ml，孕酮10-30mmol/L，腐胺50-150μmol/L，亚硒酸钠20-40mmol/L，胰岛素10-50μg/ml，肝素3-10μg/ml；
所述诱导培养基由基础培养基及添加物二构成，所述基础培养基采用商用NeuralBasalMedium或自行配制的DFmedium任一一种；所述DFmedium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml；所述添加物二包括：B27、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、乳酸钠、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子-AA及神经营养因子3，其中，B27为1×，转铁蛋白浓度为5-20μg/ml，孕酮浓度为5-20nmol/L，腐胺浓度为20-40μmol/L，亚硒酸钠浓度为10-20nmol/L，胰岛素浓度为5-20μg/ml，肝素浓度为2-10μg/ml，乳酸钠浓度为3-10mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子浓度为5-30ng/ml，血小板源性生长因子-AA浓度为5-30ng/ml，神经营养因子3浓度为5-30ng/ml，青链霉素浓度为100U/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经干/祖细胞来源于但不局限于如下：人脑组织的各个部位或脊髓，或者由诱导多能干细胞所诱导。
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| 大鼠神经干细胞向少突胶质细胞定向分化的观察;余沪荣等;《解剖学杂志》;20051231;第1.1、1.2、2.1、2.2、3.1节 * |
| 神经干细胞向少突胶质前体细胞的定向分化诱导;富赛里等;《Acta Physiologica Sinica》;20050425;第57卷(第2期);第1.1节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103484432A (zh) | 2014-01-01 |
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