CN101735983B - 少突胶质前体细胞的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了少突胶质前体细胞的分离纯化方法，是将新生大鼠大脑皮质和部分白质用胰蛋白酶和DNA酶消化后，吹打成单细胞悬液，用混合细胞培养基接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，培养3～5天待底层细胞融合达65～75％时，换为少突胶质前体细胞增殖培养基，培养3～5天，再换为少突胶质前体细胞分离培养基，37℃消化，从混合细胞中分离出少突胶质前体细胞，吹打成单细胞悬液，用少突胶质前体细胞接种培养基接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，待细胞贴壁后，换为少突胶质前体细胞纯化培养基，培养2～4天，所得贴壁细胞即为少突胶质前体细胞；本发明可以方便、短时、经济、高效地获得大量纯度高、活性好的少突胶质前体细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞的分离纯化方法，特别涉及少突胶质前体细胞的分离纯化方法。
背景技术
少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，在易化神经冲动的传递和维持神经轴突的存活上发挥了至关重要的作用。越来越多的研究表明，许多精神和神经方面的疾病如精神分裂症、抑郁症、多发性硬化症、异染行脑白质病变、创伤性脊髓损伤恢复障碍等都与少突胶质细胞发育异常、脱髓鞘或髓鞘再生障碍有关。因此，了解少突胶质细胞的生物学特性对少突胶质细胞相关性疾病的治疗具有指导意义。
目前，对少突胶质细胞相关性疾病的研究多采用体内脱髓鞘模型，但该模型有它不可解决的缺陷，如：只能观察到少突胶质细胞整个群体的情况，不能对单个少突胶质细胞的发育过程进行跟踪观察；只能得到多种细胞类型的综合结果，不能排除其它细胞类型的干扰；病理过程涉及多系统反应，情况复杂等。
因此，需要通过体外建立少突胶质细胞模型以弥补体内脱髓鞘模型的不足。成熟的少突胶质细胞来源于少突胶质前体细胞(OPCs)。作为一种神经系统的前体细胞，OPCs不仅具有增殖能力，还可以迁移到髓鞘损伤部位发育成少突胶质细胞并进一步形成新的髓鞘。自1980年McCarthy等首次从混合培养的胶质细胞中分离出OPCs，至今已发展出多种OPCs分离纯化方法，如振荡分离法，免疫筛选法或荧光激活流式细胞术筛选法，神经干细胞诱导分化法等。但这些方法存在如下问题：①操作步骤不易掌握；②耗时较长，一般为18～20天；③OPCs获得率较低，每只新生大鼠约可获得104个OPCs；④OPCs纯度较低，通常为90％～95％；⑤机械分离对细胞损伤大，易造成细胞大量死亡；⑥需要多种细胞生长因子的刺激，成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种OPCs分离纯化方法，可以方便、短时、经济、高效地获得大量纯度高、活性好的OPCs，为体外建立少突胶质细胞模型提供必要的技术支持，同时为少突胶质细胞的发育调控、少突胶质细胞相关性疾病的发病机制、治疗药物的筛选等多方面研究创造有力条件。
为达到此目的，本发明的少突胶质前体细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：
①获取混合细胞：取出生0～3天的大鼠大脑，去除脑干、小脑、嗅球、脑膜、海马和海马周边白质，将剩余的大脑灰质和白质用胰蛋白酶和DNA酶消化后，吹打成单细胞悬液，离心弃去上清液，细胞用混合细胞培养基重悬，备用；所述混合细胞培养基由DMEM/F12培养基和体积分数为10％的胎牛血清组成；
②培养混合细胞：将步骤①所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，温度37℃培养，培养3～5天待底层细胞融合达65～75％时，将混合细胞培养基更换为少突胶质前体细胞增殖培养基，继续培养3～5天；所述少突胶质前体细胞增殖培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15～20％的B104条件培养基组成；
③消化分离少突胶质前体细胞：将步骤②所得培养瓶中的少突胶质前体细胞增殖培养基更换为少突胶质前体细胞分离培养基，温度37℃消化10～20分钟，从混合细胞中分离出少突胶质前体细胞，吹打成单细胞悬液，离心弃去上清液，细胞用少突胶质前体细胞接种培养基重悬，备用；所述少突胶质前体细胞分离培养基由DMEM/F12培养基、质量体积分数为0.01％的乙二胺四乙酸、浓度为0.2～0.4mg/ml的DNA酶和浓度为5～10μg/ml的胰岛素组成；所述少突胶质前体细胞接种培养基由体积分数为50％的少突胶质前体细胞增殖培养基和体积分数为50％的混合细胞培养基组成；
④纯化少突胶质前体细胞：将步骤③所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，温度37℃培养，待细胞贴壁25～35分钟后，将少突胶质前体细胞接种培养基更换为少突胶质前体细胞纯化培养基，继续培养2～4天，所得贴壁细胞即为少突胶质前体细胞；所述少突胶质前体细胞纯化培养基由无糖DMEM培养基、浓度为5～10mmol/L的乳酸、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15～20％的B104条件培养基组成。
进一步，所述OPC增殖培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15％的B104条件培养基组成；
进一步，所述OPC分离培养基由DMEM/F12培养基、质量体积分数为0.01％的乙二胺四乙酸、浓度为0.2mg/ml的DNA酶和浓度为5μg/ml的胰岛素组成；
进一步，所述OPC纯化培养基由无糖DMEM培养基、浓度为5mmol/L的乳酸、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15％的B104条件培养基组成；
进一步，所述B104条件培养基采用如下方法制备：将神经母细胞瘤细胞B104用混合细胞培养基培养至完全融合，用无菌D-Hank’s液漂洗除去残留血清，再用含有体积分数为1％的N2添加剂的DMEM/F12培养基培养3～4天，吸出培养基，过滤除去残存细胞和可能存在的细菌，再加入防腐剂苯甲基磺酰氟化物(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)至终浓度为1μg/ml，即得B104条件培养基。
本发明的有益效果在于：①组合使用多种培养基从脑组织混合细胞中分离纯化OPCs，并以效果最好、对细胞损伤最小和用量最省等为评价指标，对各种培养基的组成成分及其浓度进行了优化；②方法简单，可操作性强，重现性好；③分离纯化时间缩短为10～12天，较现有方法缩短8～10天；④台盼蓝活细胞计数结果显示，采用本发明方法，每只新生大鼠约可获得107个OPCs，OPCs获得率较现有方法提高近1000倍；⑤OPCs标志物Olig2的免疫组织化学染色结果显示，本发明所得OPCs的纯度高于95％；⑥避免了现有方法中的机械分离筛选方式，对细胞损伤小；⑦不需要细胞生长因子的刺激，成本仅为现有方法的1/5～1/10。综上所述，本发明方法可以方便、短时、经济、高效地获得大量纯度高、活性好的OPCs，所得OPCs在体外条件下保持良好的增殖生长及定向分化的能力，为体外建立少突胶质细胞模型提供了必要的技术支持，同时为少突胶质细胞的发育调控、少突胶质细胞相关性疾病的发病机制、治疗药物筛选等多方面研究创造了有力条件。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为贴壁的混合细胞；
图2为融合的混合细胞；
图3为混合培养的OPCs；
图4为纯化培养的OPCs；
图5为诱导OPCs分化各阶段的细胞形态学鉴定；
图6为诱导OPCs分化各阶段的免疫组织化学细胞染色鉴定；
图7为诱导OPCs分化各阶段的Western-Blotting鉴定。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。
1、实验材料
出生0～3天的清洁级SD大鼠购自中国人民解放军第三军医大学动物中心，将大鼠冰埋5分钟进行麻醉，酒精喷擦头部，断头，置温度4℃预冷的无菌PBS中漂洗两次除去血液，再置温度4℃预冷的含有浓度为160U/ml的青霉素和浓度为200U/ml的链霉素的无菌D-Hank’s液中，在解剖显微镜下剥出大脑，备用。
胰蛋白酶购自Boster公司，DNA酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司，多聚赖氨酸(Poly-D-Lysine)、胰岛素和三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine)购自Sigma公司，胎牛血清和DMEM/F12培养基购自Hyclone公司，无糖DMEM培养基和N2添加剂(N2-supplement)购自Invitrogen公司，乳酸(Lactate)购自合肥博美生物科技有限责任公司，N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)购自AMERSCO公司。
混合细胞培养基由DMEM/F12培养基和体积分数为10％的胎牛血清组成；OPC增殖培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15％的B104条件培养基组成；OPC分离培养基由DMEM/F12培养基、质量体积分数为0.01％的乙二胺四乙酸、浓度为0.2mg/ml的DNA酶和浓度为5μg/ml的胰岛素组成；OPC接种培养基由体积分数为50％的OPC增殖培养基和体积分数为50％的混合细胞培养基组成；OPC纯化培养基由无糖DMEM培养基、浓度为5mmol/L的乳酸、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15％的B104条件培养基组成；OPC分化培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为1％的N2添加剂、浓度为5μg/ml的N-乙酰-L-半胱氨酸、浓度为15nmol/L的三碘甲腺原氨酸、体积分数为1％的胎牛血清和浓度为5μg/ml的胰岛素组成。
B104条件培养基采用如下方法制备：将神经母细胞瘤细胞B104接种至未经多聚赖氨酸包被处理的培养瓶中，用混合细胞培养基进行培养，每隔1天全量更换新鲜的混合细胞培养基，直至细胞完全融合；将培养细胞用无菌D-Hank’s液漂洗两次除去残留血清，再用含有体积分数为1％的N2添加剂的DMEM/F12培养基培养4天，吸出培养基，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤除去残存细胞和可能存在的细菌，再加入PMSF至终浓度为1μg/ml，即得B104条件培养基，温度-80℃冻存，备用。
2、OPCs分离纯化方法
①获取混合细胞：取出生0～3天的大鼠大脑3个，去除脑干、小脑、嗅球、脑膜、海马和海马周边白质，将剩余的大脑灰质和白质置温度4℃预冷的含有抗生素的无菌D-Hank’s液中漂洗两次，再置无菌培养皿中，用刀片切成约1mm3的组织块，加入消化液3ml(取质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液120μl和浓度为2mg/ml的DNA酶溶液15μl，加D-Hank’s液稀释至3ml，即得)，温度37℃孵育15分钟，再加入胎牛血清120μl(与质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液的加入体积相等)终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，1200rpm离心5分钟，弃去上清液，加入混合细胞培养基30ml重悬细胞，备用；
②培养混合细胞：将步骤①所得细胞悬液接种至预先用浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸包被的25cm2培养瓶中，每瓶5ml(含有5×106个细胞)，温度37℃培养，24小时后可见大部分细胞已贴壁(如图1所示)，半量更换新鲜的混合细胞培养基，之后每隔1天全量更换新鲜的混合细胞培养基，培养至第3～5天可见底层细胞融合达65～75％(如图2所示)，将混合细胞培养基更换为OPC增殖培养基5ml，之后每隔1天全量更换新鲜的OPC增殖培养基，继续培养3～5天获得较多的OPCs(如图3所示)；
③消化分离OPCs：将步骤②所得培养瓶中的OPC增殖培养基更换为OPC分离培养基3ml，温度37℃消化15～20分钟，沿瓶底小心吹打，使贴于瓶底的OPCs脱落，将培养基和脱落的OPCs转移至离心管中，吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入OPC接种培养基6ml重悬细胞，备用；
④纯化OPCs：将步骤③所得细胞悬液接种至预先用浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸包被的25cm2培养瓶中，每瓶3ml，温度37℃培养，待细胞贴壁30分钟后，将OPC接种培养基更换为OPC纯化培养基5ml，培养2～4天，所得贴壁细胞即为OPCs，记为P1代。
待P1代OPCs增殖融合达60～70％时，进行消化传代：将培养瓶中的OPC纯化培养基更换为OPC分离培养基，温度37℃消化15～20分钟，吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用OPC接种培养基制成细胞密度为105/ml的细胞悬液，所得细胞悬液分别接种至底部铺有盖玻片(预先用浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸包被盖玻片)的24孔板中和预先用浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸包被的培养皿中，温度37℃培养，待细胞贴壁后，将OPC接种培养基更换为OPC增殖培养基，培养1～2天，所得贴壁细胞即为P2代OPCs(如图4所示)。
3、采用本发明所得OPCs的鉴定
待P2代OPCs在24孔板或培养皿中增殖达到足够量时，将OPC增殖培养基更换为OPC分化培养基诱导OPCs分化，温度37℃培养，每隔1天全量更换新鲜的OPC分化培养基，培养4～6天至OPCs分化成熟，分别于诱导分化过程中的不同时间点，取样进行细胞形态学鉴定、免疫组织化学细胞染色鉴定和Western-Blotting鉴定。
①细胞形态学鉴定：结果如图5所示，OPCs在OPC增殖培养基中呈典型的OPC形态，具有双极或三极的细胞突起和立体感强的细胞胞体，经过三次传代后，细胞形态仍不发生改变；OPCs在OPC分化培养基中培养3天分化为未成熟少突胶质细胞，在形态上突起数量不断增加；培养6天分化为成熟少突胶质细胞，具有多极突起，大量棘和膜样扁平结构。
②免疫组织化学细胞染色鉴定：取细胞爬片，以少突胶质细胞发育各阶段的特征标志物(早期标志物NG2、中期标志物O4、成熟标志物MBP、少突胶质细胞标志物Olig2)进行免疫组织化学细胞染色鉴定，结果如图6所示，诱导分化前，OPCs的胞浆、突起和棘呈早期标志物NG2阳性(红色荧光)；诱导分化3天，未成熟少突胶质细胞呈中期标志物O4阳性(红色荧光)；诱导分化6天，成熟少突胶质细胞的胞浆、突起和膜样扁平结构呈成熟标志物MBP阳性(红色荧光)；其中，Olig2作为少突胶质细胞标志物，在OPCs、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞的胞核中均可检测出(绿色荧光)。
③Western-Blotting鉴定：分别提取OPCs、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞的总蛋白，以少突胶质细胞发育各阶段的特征标志物(早期标志物NG2、成熟标志物MBP、少突胶质细胞标志物Olig2)进行Western-Blotting鉴定，结果如图7所示，少突胶质细胞标志物Olig2的表达量在诱导分化前后变化不明显，早期标志物NG2的表达量随着OPCs分化成熟稍有下降，成熟标志物MBP在OPCs的终末分化阶段才表达。
根据上述实验结果，本发明分离纯化的OPCs具有典型的OPC形态，呈Olig2和NG2阳性，能进一步分化为成熟少突胶质细胞并表达MBP，在体外条件下保持良好的增殖生长及定向分化的能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (5)
1.少突胶质前体细胞的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
①获取混合细胞：取出生0～3天的大鼠大脑，去除脑干、小脑、嗅球、脑膜、海马和海马周边白质，将剩余的大脑灰质和白质用胰蛋白酶和DNA酶消化后，吹打成单细胞悬液，离心弃去上清液，细胞用混合细胞培养基重悬，备用；所述混合细胞培养基由DMEM/F12培养基和体积分数为10％的胎牛血清组成；
②培养混合细胞：将步骤①所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，温度37℃培养，培养3～5天待底层细胞融合达65～75％时，将混合细胞培养基更换为少突胶质前体细胞增殖培养基，继续培养3～5天；所述少突胶质前体细胞增殖培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15～20％的B104条件培养基组成；
③消化分离少突胶质前体细胞：将步骤②所得培养瓶中的少突胶质前体细胞增殖培养基更换为少突胶质前体细胞分离培养基，温度37℃消化10～20分钟，从混合细胞中分离出少突胶质前体细胞，吹打成单细胞悬液，离心弃去上清液，细胞用少突胶质前体细胞接种培养基重悬，备用；所述少突胶质前体细胞分离培养基由DMEM/F12培养基、质量体积分数为0.01％的乙二胺四乙酸、浓度为0.2～0.4mg/ml的DNA酶和浓度为5～10μg/ml的胰岛素组成；所述少突胶质前体细胞接种培养基由体积分数为50％的少突胶质前体细胞增殖培养基和体积分数为50％的混合细胞培养基组成；
④纯化少突胶质前体细胞：将步骤③所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，温度37℃培养，待细胞贴壁25～35分钟后，将少突胶质前体细胞接种培养基更换为少突胶质前体细胞纯化培养基，继续培养2～4天，所得贴壁细胞即为少突胶质前体细胞；所述少突胶质前体细胞纯化培养基由无糖DMEM培养基、浓度为5～10mmol/L的乳酸、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15～20％的B104条件培养基组成。
2.根据权利要求1所述的少突胶质前体细胞的分离纯化方法，其特征在于：所述少突胶质前体细胞增殖培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15％的B104条件培养基组成。
3.根据权利要求1所述的少突胶质前体细胞的分离纯化方法，其特征在于：所述少突胶质前体细胞分离培养基由DMEM/F12培养基、质量体积分数为0.01％的乙二胺四乙酸、浓度为0.2mg/ml的DNA酶和浓度为5μg/ml的胰岛素组成。
4.根据权利要求1所述的少突胶质前体细胞的分离纯化方法，其特征在于：所述少突胶质前体细胞纯化培养基由无糖DMEM培养基、浓度为5mmol/L的乳酸、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15％的B104条件培养基组成。
5.根据权利要求1所述的少突胶质前体细胞的分离纯化方法，其特征在于：所述B104条件培养基采用如下方法制备：将神经母细胞瘤细胞B104用混合细胞培养基培养至完全融合，用无菌D-Hank’s液漂洗除去残留血清，再用含有体积分数为1％的N2添加剂的DMEM/F12培养基培养3～4天，吸出培养基，过滤除去残存细胞和可能存在的细菌，再加入防腐剂苯甲基磺酰氟化物至终浓度为1μg/ml，即得B104条件培养基。
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