CN109666642B - 一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法 - Google Patents

一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，属于细胞分离纯化技术领域。该方法利用胰蛋白酶与DNaseⅠ联合消化大脑皮层，通过两次差速贴壁纯化，较好的分离纯化树鼩OPCs。本发明方法操作步骤简单，具有细胞贴壁快、存活率高等特点，在后续的鉴定实验中呈现极高的细胞纯度，鉴定结果可信度高，可以满足医学、生物学、药学和生命科学各研究领域对树鼩OPCs相关实验研究的要求，适宜在一般实验室进行推广应用。

Description

一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法
技术领域
本发明属于细胞分离纯化技术领域，具体涉及一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法。
背景技术
少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)是中枢神经系统（CNS）髓鞘形成的唯一细胞，起源于胚胎神经管腹侧的神经上皮细胞。其主要功能是产生髓鞘包绕神经轴突，维持神经冲动沿轴突跳跃性传导。另外它还能分泌多种神经营养因子，支持神经元、胶质细胞的生长发育与存活。少突胶质细胞（OL）在发育过程中，大致经历了少突胶质祖细胞、少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPC)、未成熟少突胶质细胞（immatureoligodendrocyte）和成熟少突胶质细胞（mature oligodendrocyte）几个阶段，其形态、功能和表达产物呈现连续渐变过程，各发育阶段没有严格界限之分。越来越多的研究表明，OL异常在CNS脱髓鞘病变、神经元损伤、精神疾病等的发病机制中起着重要作用。有研究者曾尝试将体外培养成熟的OLs移植入髓鞘，对脱髓鞘病变的CNS进行细胞治疗。但是，成熟的OLs缺乏增殖和迁移能力，移植后并不能使病变受损部位形成具有正常功能的髓鞘。已有研究证明，少突胶质前体细胞（OPCs）在一定的条件下可定向分化成为成熟的OLs。因此有研究者预测，将体外培养OPCs移植入体内并诱导其分化为成熟的OLs形成具有正常功能的髓鞘。那么，OPCs将有可能成为治疗CNS疾病或者损伤的理想细胞。所以，高纯度、高质量OPCs的体外培养是该研究工作的基础。
树鼩是一种新型的实验动物，与非人灵长类亲缘关系接近，其生理、生化、解剖结构以及基因组等生物学特性比啮齿类更接近于人类，且大脑较发达，已被用于神经系统相关疾病的研究。目前，国内外对大鼠小鼠OPCs的培养报道很多，有关树鼩OPCs的培养方法及研究尚无报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，该方法操作步骤简单，具有细胞贴壁快、存活率高等特点，在后续的鉴定实验中呈现极高的细胞纯度，鉴定结果可信度高，可以满足医学、生物学、药学和生命科学各研究领域对树鼩OPCs相关实验研究的要求，适宜在一般实验室进行推广应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，包括如下步骤：
步骤（1），少突胶质前体细胞分离：
将1只新生48h内的树鼩离体大脑的大脑皮层剪碎成模糊状后加入3mL 0.25%胰蛋白酶和1mL 500~1000U/mL DNase Ⅰ联合消化，吹打成细胞混悬液，放入37℃、5% CO2培养箱孵育5~10min；加入6mL混合培养液终止消化，吹打混匀，70目细胞筛网中过滤，滤液离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于培养瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中培养1~2h，吸出细胞悬液接种于预先用PDL包被过的细胞培养瓶中，然后放入37℃、5% CO2培养箱培养；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的细胞培养瓶是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养瓶可在37℃培养箱保存2周；
步骤（2），少突胶质前体细胞增殖培养与纯化：
培养5d后，去除原培养液后加入增殖培养液增殖培养，每天换液；增殖培养2d后，去除培养液，PBS清洗细胞以去除残留的增殖培养液，之后加入2mL分离液，并放入37℃、5%CO2培养箱孵育10~15min，轻轻吹打细胞表面至成细胞混悬液，吸取细胞混悬液入40目细胞筛网中过滤一次，离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于PDL包被过的培养板培养1~2min，之后轻轻吸取培养板上的细胞悬液到另一普通培养板中，放入37℃、5% CO2培养箱中培养1~2h；轻轻吸出细胞悬液接种于PDL包被过的培养板中，然后放入37℃、5% CO2培育箱过夜培养，之后将培养液更换为增殖培养液，继续培养；
所述的增殖培养液为含10ng/mL bFGF、5ug/mL insulin、1%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的分离液为含0.02%EDTA、5ug/mL insulin、0.5%DNaseⅠ和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的培养板是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到培养板中，摇匀铺满培养板，静置5min，吸出液体并将培养板放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养板可在37℃培养箱保存2周；
步骤（3），少突胶质前体细胞定向诱导分化：
培养3天后，加入分化培养液定向分化，最后去除培养液终止培养；
所述的分化培养液为含30ng/mL T3、10ng/mL CNTF、5ug/mL insulin、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
进一步，优选的是，所述的大脑皮层的获取方式为：取1个新生48h内的树鼩离体大脑，置于装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤以去除血迹；之后从大脑腹侧及边缘去除脑膜和血管，再去除脑干和小脑，接着夹取大脑皮层移入另一个装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中洗涤。
进一步，优选的是，树鼩离体大脑在D-Hanks液中洗涤2次，大脑皮层在D-Hanks液中洗涤1次。
进一步，优选的是，步骤（1）和步骤（2）中，离心的参数均为1000 rpm离心10 min。
进一步，优选的是，步骤（1）中，培养瓶为PDL包被过的25cm2的培养瓶。
进一步，优选的是，步骤（2）中，PBS清洗两次。
进一步，优选的是，步骤（2）中，培养板为PDL包被过的6孔培养板。
本发明中的分离方法为双酶消化法，具体是指通过含有两种消化酶的消化液对树鼩大脑皮层进行实验操作来达到分离OPCs的目的，消化液中主要行使分离作用的是胰蛋白酶与DNase Ⅰ，在达到分离目的的同时最大程度上增加获得的细胞数量，相对于以往报道的酶消化法（主要通过单一的胰蛋白酶对细胞间连接进行消化以达到分离目的），已报道的方法存在单一的酶消后，细胞悬液粘稠度高，过滤后大量细胞被浪费，而DNase Ⅰ的加入，能降低细胞悬液粘稠度，从而获得大量的细胞。
此外，本发明中的OPCs的纯化方法进行了优化，采用了两次差速贴壁法，并首次使用0.1~0.5mg/ml PDL包被过的培养瓶或培养板来纯化OPCs。多聚-D-赖氨酸（PDL）是广泛应用于组织切片、培养瓶和玻片等的粘合剂。培养瓶表面的性质对于细胞培养至关重要，细胞表面的糖蛋白（阴性）易于吸附在亲水性的表面上，包被后细胞培养表面含有一定量的多聚阳离子更能促进细胞吸附贴壁。首先，最开始纯化下来的细胞，经过离心稀释成细胞悬液，接种于PDL包被过的培养瓶或培养板中孵育1~2min，能最先除去较大和易贴壁细胞，但同时也会损失部分OPCs。其次，取细胞悬液上清接种于普通的培养瓶或培养板里孵育1~2h，能进一步的除去较难贴壁的杂细胞。最后，将纯化后的细胞悬液接种于PDL包被过的培养瓶或培养板培养。纯化时，全过程都使用混合培养液，其中的高血清能减少对OPCs的损伤，提高细胞活性。纯化后继续培养，OPCs能在2h内完全贴壁，再换培养液进行增殖或分化培养。
本发明所述树鼩OPCs分离、纯化操作步骤简单，具有细胞贴壁快、存活率高等特点，细胞培养体系稳定性好，是一种较为理想的树鼩OPCs培养方法，在后续的鉴定实验（采用互为对照的免疫学鉴定方法）中呈现极高的细胞纯度，鉴定结果可信度高，可以满足医学、生物学、药学和生命科学各研究领域对树鼩OPCs相关实验研究的要求，适宜在一般实验室进行推广应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
（1）本发明首次提供了树鼩OPCs原代分离及纯化方法，通过此方法可以实现树鼩OPCs的体外培养，填补了目前没有针对树鼩这一物种特定的OPCs原代体外培养技术的空白，分离得到的树鼩OPCs具有较强的细胞活力。此外，本方法同时在体外培养过程中提高了树鼩OPCs的纯度，极大程度地避免了杂细胞对树鼩OPCs生长与增殖的干扰。
（2）本发明中首次对树鼩OPCs从体内的分离采用为双酶消化法，具体是指通过含有两种消化酶的消化液对大脑皮层进行实验操作来达到分离OPCs的目的，消化液中主要行使分离作用的是胰蛋白酶与DNase Ⅰ，在达到分离目的的同时最大程度上增加获得的细胞数量。此外，本发明中的OPCs的纯化方法进行了优化，采用了两次差速贴壁法，并首次使用0.1~0.5mg/ml PDL包被过的培养瓶或培养板来纯化OPCs。通过两次差速贴壁，细胞纯度可达97%左右，细胞活率可达到95%。（3）通过大量重复性实验证明，采用本发明技术方案进行树鼩OPCs体外分离、纯化，可以成功分离得到树鼩OPCs，分离得到的树鼩OPCs具有较高的细胞活力，在培养至7d可以实现树鼩OPCs的纯化，纯化的细胞具有典型的OPCs形态，以两极或三极的突起为主，胞体较小且折光性强。经NG2抗原免疫荧光鉴定，染色率高。本发明通过长时间试验及多种方法的比较的证实，利用胰蛋白酶与DNase Ⅰ联合消化大脑皮层，通过两次差速贴壁联合，能较好的分离纯化树鼩OPCs，该方法纯化效率较高，且价格低廉、使用方便，可以获得大量OPCs。
（4）在中枢神经系统（CNS）疾病或者损伤中，不仅可以导致损伤中心附近区域神经元的大量死亡，同时还能导致OLs的坏死和凋亡，最终导致轴突的脱髓鞘化以及神经功能的恢复困难。移植OLs并不能有效的形成髓鞘，再加上对髓鞘发育/再生过程中的分子机制还没有完全了解，导致这类疾病迄今还没有有效治疗方法。OPCs是CNS中一类干细胞样的细胞，它可以不断的增殖，并且最终可分化为OLs、2型星形胶质细胞以及神经元。故本发明再采用定向诱导OPCs分化发育为OLs，利用OLs的特异性抗原MBP来进行免疫荧光标记的方法来鉴定OLs。在OPCs的特异性抗原NG2和MBP的双重鉴定标准之下，可以确定本发明体外培养的细胞为OPCs。
综上，本发明提供的原代细胞的取材及培养方法操作简单，价格低廉，利用本发明方法在体外培养的树鼩OPCs在培养过程中维持良好的细胞形态及细胞活力，本发明提供的树鼩OPCs培养方法可以方便、快捷且高效率的在体外培养得到OPCs。
附图说明
图1为分离得到的原代树鼩少突胶质前体细胞不同时期生长状态形态学观察结果；A为混合培养第3d（10×）；B为增殖培养第2d（10×）；C为少突胶质前体细胞纯化后培养第1d（10×）；D为未成熟少突胶质细胞（20×）；E为成熟少突胶质细胞（20×）；
图2 为传统的单酶消化和恒温摇床法分离纯化得到树鼩少突胶质前体细胞形态学观察结果；A为培养第3d（10×）；B为增殖培养第2d（10×）；
图3为树鼩少突胶质前体细胞NG2（硫酸软骨素蛋白多糖4）抗原的免疫荧光鉴定；
图4为树鼩少突胶质细胞MBP（髓鞘碱性蛋白）抗原的免疫荧光鉴定；
图5为纯化后的少突胶质前体细胞活力测定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号均为体积百分数。
混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
增殖培养液为含10ng/mL bFGF、5ug/mL insulin、1%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
分离液为含0.02%EDTA、5ug/mL insulin、0.5%DNase Ⅰ和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
分化培养液为含30ng/mL T3、10ng/mL CNTF、5ug/mL insulin、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
PDL包被过的细胞培养瓶是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养瓶可在37℃培养箱保存2周。
PDL包被过的培养板是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到培养板中，摇匀铺满培养板，静置5min，吸出液体并将培养板放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养板可在37℃培养箱保存2周。
实施例1
一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，包括如下步骤：
步骤（1），少突胶质前体细胞分离：
将1只新生48h内的树鼩离体大脑的大脑皮层剪碎成模糊状后加入3mL 0.25%胰蛋白酶和1mL 500U/mL DNase Ⅰ联合消化，吹打成细胞混悬液，放入37℃、5% CO2培养箱孵育5min；加入6mL混合培养液终止消化，吹打混匀，70目细胞筛网中过滤，滤液离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于培养瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中培养1h，吸出细胞悬液接种于预先用PDL包被过的细胞培养瓶中，然后放入37℃、5%CO2培养箱培养；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的细胞培养瓶是经下列操作制得：取1mL 0.1mg/mL PDL加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养瓶可在37℃培养箱保存2周；
步骤（2），少突胶质前体细胞增殖培养与纯化：
培养5d后，去除原培养液后加入增殖培养液增殖培养，每天换液；增殖培养2d后，去除培养液，PBS清洗细胞以去除残留的增殖培养液，之后加入2mL分离液，并放入37℃、5%CO2培养箱孵育10min，轻轻吹打细胞表面至成细胞混悬液，吸取细胞混悬液入40目细胞筛网中过滤一次，离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于PDL包被过的培养板培养1min，之后轻轻吸取培养板上的细胞悬液到另一普通培养板中，放入37℃、5% CO2培养箱中培养1h；轻轻吸出细胞悬液接种于PDL包被过的培养板中，然后放入37℃、5% CO2培育箱过夜培养，之后将培养液更换为增殖培养液，继续培养；
所述的增殖培养液为含10ng/mL bFGF、5ug/mL insulin、1%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的分离液为含0.02%EDTA、5ug/mL insulin、0.5%DNase Ⅰ和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的培养板是经下列操作制得：取1mL 0.1mg/mL PDL加入到培养板中，摇匀铺满培养板，静置5min，吸出液体并将培养板放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养板可在37℃培养箱保存2周；
步骤（3），少突胶质前体细胞定向诱导分化：
培养3天后，加入分化培养液定向分化，最后去除培养液终止培养；
所述的分化培养液为含30ng/mL T3、10ng/mL CNTF、5ug/mL insulin、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
实施例2
一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，包括如下步骤：
步骤（1），少突胶质前体细胞分离：
将1只新生48h内的树鼩离体大脑的大脑皮层剪碎成模糊状后加入3mL 0.25%胰蛋白酶和1mL 1000U/mL DNase Ⅰ联合消化，吹打成细胞混悬液，放入37℃、5% CO2培养箱孵育10min；加入6mL混合培养液终止消化，吹打混匀，70目细胞筛网中过滤，滤液离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于培养瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中培养2h，吸出细胞悬液接种于预先用PDL包被过的细胞培养瓶中，然后放入37℃、5% CO2培养箱培养；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的细胞培养瓶是经下列操作制得：取1mL 0.5mg/mL PDL加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养瓶可在37℃培养箱保存2周；
步骤（2），少突胶质前体细胞增殖培养与纯化：
培养5d后，去除原培养液后加入增殖培养液增殖培养，每天换液；增殖培养2d后，去除培养液，PBS清洗细胞以去除残留的增殖培养液，之后加入2mL分离液，并放入37℃、5%CO2培养箱孵育15min，轻轻吹打细胞表面至成细胞混悬液，吸取细胞混悬液入40目细胞筛网中过滤一次，离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于PDL包被过的培养板培养2min，之后轻轻吸取培养板上的细胞悬液到另一普通培养板中，放入37℃、5% CO2培养箱中培养2h；轻轻吸出细胞悬液接种于PDL包被过的培养板中，然后放入37℃、5% CO2培育箱过夜培养，之后将培养液更换为增殖培养液，继续培养；
所述的增殖培养液为含10ng/mL bFGF、5ug/mL insulin、1%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的分离液为含0.02%EDTA、5ug/mL insulin、0.5%DNase Ⅰ和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的培养板是经下列操作制得：取1mL 0.5mg/mL PDL加入到培养板中，摇匀铺满培养板，静置5min，吸出液体并将培养板放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养板可在37℃培养箱保存2周；
步骤（3），少突胶质前体细胞定向诱导分化：
培养3天后，加入分化培养液定向分化，最后去除培养液终止培养；
所述的分化培养液为含30ng/mL T3、10ng/mL CNTF、5ug/mL insulin、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
所述的大脑皮层的获取方式为：取1个新生48h内的树鼩离体大脑，置于装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤以去除血迹；之后从大脑腹侧及边缘去除脑膜和血管，再去除脑干和小脑，接着夹取大脑皮层移入另一个装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中洗涤。
实施例3
一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，包括如下步骤：
步骤（1），少突胶质前体细胞分离：
将1只新生48h内的树鼩离体大脑的大脑皮层剪碎成模糊状后加入3mL 0.25%胰蛋白酶和1mL 700U/mL DNase Ⅰ联合消化，吹打成细胞混悬液，放入37℃、5% CO2培养箱孵育8min；加入6mL混合培养液终止消化，吹打混匀，70目细胞筛网中过滤，滤液离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于培养瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中培养1.5h，吸出细胞悬液接种于预先用PDL包被过的细胞培养瓶中，然后放入37℃、5% CO2培养箱培养；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的细胞培养瓶是经下列操作制得：取1mL 0.3mg/mL PDL加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养瓶可在37℃培养箱保存2周；
步骤（2），少突胶质前体细胞增殖培养与纯化：
培养5d后，去除原培养液后加入增殖培养液增殖培养，每天换液；增殖培养2d后，去除培养液，PBS清洗细胞以去除残留的增殖培养液，之后加入2mL分离液，并放入37℃、5%CO2培养箱孵育13min，轻轻吹打细胞表面至成细胞混悬液，吸取细胞混悬液入40目细胞筛网中过滤一次，离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于PDL包被过的培养板培养1.5min，之后轻轻吸取培养板上的细胞悬液到另一普通培养板中，放入37℃、5% CO2培养箱中培养1.6h；轻轻吸出细胞悬液接种于PDL包被过的培养板中，然后放入37℃、5% CO2培育箱过夜培养，之后将培养液更换为增殖培养液，继续培养；
所述的增殖培养液为含10ng/mL bFGF、5ug/mL insulin、1%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的分离液为含0.02%EDTA、5ug/mL insulin、0.5%DNase Ⅰ和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周；
所述的PDL包被过的培养板是经下列操作制得：取1mL 0.4mg/mL PDL加入到培养板中，摇匀铺满培养板，静置5min，吸出液体并将培养板放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；该包被后的培养板可在37℃培养箱保存2周；
步骤（3），少突胶质前体细胞定向诱导分化：
培养3天后，加入分化培养液定向分化，最后去除培养液终止培养；
所述的分化培养液为含30ng/mL T3、10ng/mL CNTF、5ug/mL insulin、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；该培养液可在2~8℃保存1周。
其中，所述的大脑皮层的获取方式为：取1个新生48h内的树鼩离体大脑，置于装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤以去除血迹；之后从大脑腹侧及边缘去除脑膜和血管，再去除脑干和小脑，接着夹取大脑皮层移入另一个装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中洗涤。
步骤（1）和步骤（2）中，离心的参数均为1000 rpm离心10 min。步骤（1）中，培养瓶为PDL包被过的25cm2的培养瓶。步骤（2）中，PBS清洗两次；培养板为PDL包被过的6孔培养板。
应用实例
1 少突胶质前体细胞分离
取新生48h内的树鼩，安乐死后75%的乙醇浸泡15s，取出后PBS冲洗两遍去乙醇。眼科剪剪去头皮，镊子掀去头骨，弯镊小心取出大脑，置于装有D－Hanks液( 4℃预冷)的无菌培养皿中，洗涤2遍，去除血迹。镊子从大脑腹侧及边缘小心地撕去脑膜和血管，去除脑干和小脑，夹取大脑皮层移入另一个装有D－Hanks液的无菌培养皿中洗涤1次，以上都在冰板上操作。将大脑皮层移入一无菌小瓶中，用眼科剪尽量将大脑皮层剪碎成模糊状，加入3mL0.25%胰蛋白酶和1mL 500~1000U/mL DNase Ⅰ联合消化，吸管吹打成细胞混悬液，放入37℃、5% CO2培养箱孵育5~10min。加入6mL混合培养液终止消化，吸管吹打混匀，吸取细胞混悬液入70目细胞筛网中过滤一次，使之分散成单个细胞。收集入15 mL离心管中，1000 rpm离心10 min，弃上清，留沉淀，加入混合培养液重悬细胞沉淀。将细胞悬液接种于普通的细胞培养瓶，放入培养箱中培养1h，轻轻吸出细胞悬液（以去除已贴壁的成纤维细胞和较大的组织碎片）接种于预先用PDL包被过的细胞培养瓶中，然后放入培养箱培养，原代混合细胞培养。
2 少突胶质前体细胞增殖培养与纯化
原代混合细胞培养5d后，加入增殖液培养，隔天换液。2d后，去除增殖培养液，PBS清洗两次，加入分离液，放入培养箱孵育10~15min。见上层细胞团脱落，并用吸管吸取培养液轻轻吹打细胞培养面，并吸取细胞混悬液入40目细胞筛网中过滤一次，1000 rpm离心10min，弃上清，留沉淀，加入混合培养液，将细胞悬液接种于PDL包被过的六孔板培养1~2min，之后吸取上清到未处理过的六孔板中，放入培养箱中培养1~2h。轻轻吸出细胞悬液接种于预先用PDL包被过的六孔板中，然后放入培育箱过夜培养。弃混合培养液，加入增殖液，继续进行纯化后的少突前体细胞增殖培养。
3 少突胶质前体细胞定向诱导分化
纯化过后的少突前体细胞培养三天后，加入分化培养液定向分化，最后终止培养，吸出残余培养基，进行少突胶质细胞的进行免疫荧光鉴定。
4 少突胶质前体细胞活力测定：
使用MTT法测定OPCs增殖活力：选取步骤2纯化后单层生长的细胞制成细胞悬液，培养液稀释细胞浓度至1.5×104cell/mL，以每孔100μL接种于96孔培养板中，设2h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h共9组，每组3个复孔，空白调零组为不接种细胞只加增殖培养液，于37℃、5％CO2条件下培养，分别按设置的时间段，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h，去除培养液，每孔加入200μL DMSO，37℃下溶解30min，选择波长490nm，以空白组调零，在酶标仪上测定各孔吸光度值。
5 细胞免疫荧光鉴定
（1）少突胶质前体细胞NG2抗原鉴定
将步骤2里纯化并培养一段时间的OPCs，去除培养液，用PBS漂洗3次，每次2min；4%多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次，每次2min；0.5%Triton X-100室温穿孔20min，PBS漂洗3次，每次2min；5%的山羊血清室温封闭30min，PBS漂洗3次，每次2min；加500uL稀释好的抗NG2（1:200稀释）一抗，对照孔加相同体积PBS代替一抗，4℃过夜孵育，PBS漂洗4次，每次3min；避光条件下，加入500uL Cy3标记的驴抗兔荧光二抗，37℃孵箱1h，PBS漂洗4次，每次3min；滴加DAPI避光孵育5min，PBS清洗3次，每次2min；吸走液体，加入500uL抗荧光淬灭剂（1:500稀释），在荧光显微镜下观察并拍照。
（2）少突胶质细胞MBP抗原的鉴定
将步骤3里定向分化后的少突胶质细胞，去除培养液，用PBS漂洗3次，每次2min；4%多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次，每次2min；0.5%Triton X-100室温穿孔20min，PBS漂洗3次，每次2min；5%的山羊血清室温封闭30min，PBS漂洗3次，每次2min；加500uL稀释好的抗MBP（1:200稀释）一抗，对照孔加相同体积的PBS代替一抗，4℃过夜孵育，PBS漂洗4次，每次3min；避光条件下，加入500uL Cy3标记的驴抗兔荧光二抗，37℃孵箱1h，PBS漂洗4次，每次3min；滴加DAPI避光孵育5min，PBS清洗3次，每次2min；吸走液体，加入500uL抗荧光淬灭剂（1:500稀释），在荧光显微镜下观察并拍照。
经双酶联合消化后刚接种的细胞悬浮于培养液中，呈圆形，折光性较强。接种10min就可见少量细胞开始贴壁，贴壁1h后转移至经PDL包被过的培养瓶中，8h后大部分细胞已贴壁。培养3d后，在荧光显微镜下观察，细胞表面开始长出突起，且多数细胞的体积较大，紧贴于瓶底生长，胞核较大，呈圆形或长条形，细胞扁平状有较粗大的突起。少数为体积较小，胞体呈圆形或椭圆形，具有单极或双极细小突起的强折光性的细胞（见图1A）。
加入增殖培养液继续培养2d后，OPCs不断分裂增殖并呈现出典型的双极或三极形态、细胞核大、胞体较小、折光性较强且呈圆形或椭圆形(见图1B和1C)。
加入分化培养液继续培养，OPCs分化成未成熟或成熟OLs时，细胞突起数量明显增加，突起变长且有分支，分支常交互形成“蜘蛛网”样，极为茂密（见图1D和1E）。
从图2可知，采用传统的单胰蛋白酶和恒温摇床纯化法分离纯化OPCs。经单胰蛋白酶消化后，原代混合细胞培养（见图2A），目的细胞少而杂细胞多。通过恒温摇床法纯化后，所获得的细胞继续增殖培养2d，可明显观察到OPCs细胞形态较差，突触断裂严重且杂细胞比较多（见图2B）。
硫酸软骨素蛋白多糖4(NG2)是少突胶质前体细胞的特异性标志蛋白，而髓鞘碱性蛋白（MBP）是成熟胶质细胞的特异性标志蛋白。分别使用这两种抗体对纯化后的OPCs及分化后的OLs进行免疫荧光染色，再使用携带Cy3的荧光二抗标记，DAPI染核。结果显示阳性细胞发红色荧光，细胞核被染为蓝色。
从图3可知，树鼩OPCs的NG2免疫荧光染色呈阳性，结果显示大部分细胞为NG2阳性的少突胶质前体细胞，形态为两极或三极突起状，还存在少量NG2阴性的杂细胞。
从图4可知，树鼩OLs的MBP免疫荧光染色呈阳性，结果显示一部分细胞为MBP阳性的成熟少突胶质细胞，形态为“蜘蛛网”样的突起，也存在较多的MBP阴性的杂细胞。
从图5可知，在PDL包被的六孔板，OPCs可以在2h内全部贴壁，OPCs从两极开始伸出突起，在12h内细胞增殖相对较慢，而在之后的时间里，出现明显扩增，而且呈现OPCs的典型形态。在12~60h，细胞增殖明显，在此之间，细胞进入对数生长期。72h后，细胞增殖变缓，细胞数量逐渐减少，细胞开始不再增多而进入分裂终期。根据每天测得的OD490，取平均值作生长曲线（见图5）。
实验结果证实，利用胰蛋白酶与DNase Ⅰ联合消化大脑皮层，通过两次差速贴壁纯化，能较好的分离纯化树鼩OPCs，可以保证细胞的纯度较高、细胞结构完整及相对较高的细胞活力。本研究为树鼩OPCs的体外分离培养作出了实验性探索，也为今后开展树鼩CNS疾病模型奠定了基础。
本发明强调利用胰蛋白酶与DNase Ⅰ联合消化大脑皮层，通过两次差速贴壁纯化，能较好的分离纯化树鼩OPCs，细胞纯度可达97%左右，细胞活率可达到95%。而采用传统的单胰蛋白酶和恒温摇床纯化法分离纯化OPCs，在单胰蛋白酶消化下，组织液聚集并形成了透明状的胶体，在过滤时，胶体吸附在滤膜表面，不仅降低了过滤效率，还导致原代细胞数量减少。而恒温摇床法纯化时间长达20h，OPCs在纯化过程中受到机械力的伤害，导致OPCs突触断裂，细胞活性降低，并且一些杂细胞也被摇下来，降低细胞的纯度。通过传统法得到的OPCs纯度只有77%左右，而细胞活率不到70%。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），少突胶质前体细胞分离：
将1只新生48h内的树鼩离体大脑的大脑皮层剪碎成模糊状后加入3mL 0.25%胰蛋白酶和1mL 500~1000U/mL DNase Ⅰ联合消化，吹打成细胞混悬液，放入37℃、5% CO2培养箱孵育5~10min；加入6mL混合培养液终止消化，吹打混匀，70目细胞筛网中过滤，滤液离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于培养瓶，放入37℃、5%CO2培养箱中培养1~2h，吸出细胞悬液接种于预先用PDL包被过的细胞培养瓶中，然后放入37℃、5% CO2培养箱培养；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；
所述的PDL包被过的细胞培养瓶是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；
步骤（2），少突胶质前体细胞增殖培养与纯化：
培养5d后，去除原培养液后加入增殖培养液增殖培养，每天换液；增殖培养2d后，去除培养液，PBS清洗细胞以去除残留的增殖培养液，之后加入2mL分离液，并放入37℃、5% CO2培养箱孵育10~15min，吹打细胞表面至成细胞混悬液，吸取细胞混悬液入40目细胞筛网中过滤一次，离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于PDL包被过的培养板培养1~2min，之后吸取培养板上的细胞悬液到另一普通培养板中，放入37℃、5% CO2培养箱中培养1~2h；吸出细胞悬液接种于PDL包被过的培养板中，然后放入37℃、5% CO2培育箱过夜培养，之后将培养液更换为增殖培养液，继续培养；
所述的增殖培养液为含10ng/mL bFGF、5ug/mL insulin、1%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；
所述的分离液为含0.02%EDTA、5ug/mL insulin、0.5%DNase Ⅰ和1%双抗的DMEM/F12培养基；
所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；
所述的PDL包被过的培养板是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到培养板中，摇匀铺满培养板，静置5min，吸出液体并将培养板放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；
步骤（3），少突胶质前体细胞定向诱导分化：
培养3天后，加入分化培养液定向分化，最后去除培养液终止培养；
所述的分化培养液为含30ng/mL T3、10ng/mL CNTF、5ug/mL insulin、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，所述的大脑皮层的获取方式为：取1个新生48h内的树鼩离体大脑，置于装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤以去除血迹；之后从大脑腹侧及边缘去除脑膜和血管，再去除脑干和小脑，接着夹取大脑皮层移入另一个装有预冷至4℃的D-Hanks液的无菌培养皿中洗涤。
3.根据权利要求2所述的树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，树鼩离体大脑在D-Hanks液中洗涤2次，大脑皮层在D-Hanks液中洗涤1次。
4.根据权利要求1所述的树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中，离心的参数均为1000 rpm离心10 min。
5.根据权利要求1所述的树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，步骤（1）中，培养瓶为PDL包被过的25cm2的培养瓶。
6.根据权利要求1所述的树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，步骤（2）中，PBS清洗两次。
7.根据权利要求1所述的树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，步骤（2）中，培养板为PDL包被过的6孔培养板。
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