CN111088229B - 一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法。包括以下步骤：挑选诱导分化第50‑60天的人多能干细胞来源的3d视网膜杯，除去RPE及其他非3d视网膜杯组织，然后置于含有液体培养基的容器中，机械分离，离弃3d视网膜杯中的较暗及棕黑色部分的色素层，保留金黄色部分的神经层，再将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。本发明的制备方法可获得数量稳定的3d视网膜组织，可获得数量可控的纯度较高的视网膜前体细胞，可缩短视网膜前体细胞获得的时间并简化了获得的工序，获得的视网膜前体细胞具有较强的增值能力及重新向视网膜其他类型的细胞分化的能力。

Description

一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法。

背景技术：

目前视网膜细胞的退行性变、损伤及坏死成为了致盲眼病中重要的病因之一，而干细胞的替代治疗成为治疗这一类视网膜病变的新希望。随着诱导多能干细胞(iPS)的广泛应用，原本限制干细胞与再生医学发展的伦理及免疫排斥问题得到了很好的解决。早在20世纪80年代，科学家们就已经诱导小鼠、蛙等动物的干细胞分化为视网膜的节细胞、光感受器等。在此后的时间里，不断有人视网膜细胞被诱导分化获得，也有许多研究团队尝试将特定的视网膜细胞类型移植进入视网膜。但人类视网膜有着严格的排列分层，各类的细胞也有特定的定位和方向，单细胞的注射移植难以满足这些要求，更无法实现功能的重建。因此，具有完整分层结构的视网膜组织成为了移植与替代治疗的新供体材料。

人多能干细胞(hPSC)包括hESC和hiPSC，可以向机体几乎所有细胞分化，为细胞治疗提供种子细胞，展示了巨大应用前景。各国正投入大量资金开发关键技术，抢占市场先机。眼睛由于其自身解剖、生理特点及多种无创检查手段，被认为是干细胞临床转化研究的优势器官。多项hPSC临床转化的首例都应用在视网膜变性疾病的治疗，首次公开报道的ESC临床试验(Schwarttz et al，Lancet 2012)；第一例自体iPSC及率先批准的异体iPSC的临床研究(日本Masayo Takahashi团队，2013及2016)。这些I期临床研究初步显示了安全性,尽管疗效尚不确定。目前用于临床研究的hPSC来源视网膜细胞都为视网膜色素上皮细胞(RPE)。然而，RPE只是视网膜中的支持细胞，视网膜变性疾病除了RPE损伤，还有视网膜功能神经元细胞变性损害，更需要补充替代。因此，如何获取、制备视网膜细胞，特别是功能神经元细胞，是神经致盲眼病细胞治疗中的关键难题，是急需解决的技术瓶颈。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法。

本发明的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，包括以下步骤：挑选诱导分化第50-60天的人多能干细胞来源的3d视网膜杯，除去RPE及其他非3d视网膜杯组织，然后置于含有液体培养基的容器中，机械分离，离弃3d视网膜杯中的较暗及棕黑色部分的色素层，保留金黄色部分的神经层，再将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。

所述的液体培养基优选为RC2培养基，所述的RC2培养基是以DMEM/F12(1:1)培养基和DMEM基础培养基按体积比为10:7混合作为基础培养基，每425mL基础培养基中加入不含有维生素A的50×B27 10 mL、100×antibiotic and antimycotic 5mL、100×MEM-NEAA5mL、FBS 50mL、100×GlutaMax 5mL和1000×Taurine 0.5mL(不需添加任何其他神经营养因子)。

所述的人多能干细胞来源的3d视网膜杯是通过以下方法制备的：将贴壁生长的人多能干细胞消化为小细胞团得到拟胚体，将拟胚体接种到mTeSR1培养基中培养，逐步将mTeSR1培养基替换为神经诱导培养基，当完全替换为神经诱导培养基时将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养，然后吸去神经诱导培养基更换为视网膜分化培养基，直至形成突出于培养板孔底表面的三维视网膜组织，再将三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中，将三维视网膜组织按1个三维视网膜组织/孔接种于含有视网膜分化培养基的低吸附培养板中悬浮培养，悬浮培养1周后吸去视网膜分化培养基更换为RC2培养基，培养得到人多能干细胞来源的3d视网膜杯。

所述的将拟胚体接种到mTeSR1培养基中培养，逐步将mTeSR1培养基替换为神经诱导培养基，当完全替换为神经诱导培养基时将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养具体为：将构建拟胚体当天记为诱导分化第0天，次日记为第1天，以此类推，第0天将拟胚体接种到含有10μM RI(核糖核酸酶抑制因子)的mTeSR1培养基中培养，第1天，将含有10μM RI(核糖核酸酶抑制因子)的mTeSR1培养基替换为培养基A，所述的培养基A是由神经诱导培养基和mTeSR1培养基按体积比1:3混合而成，第2天，将培养基A替换为培养基B，所述的培养基B是由神经诱导培养基和mTeSR1培养基按体积比1:1混合而成，第3天，将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到含有神经诱导培养基(NIM)的经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养。

所述的将贴壁生长的人多能干细胞消化为小细胞团具体为：人多能干细胞维持培养于mTeSR1培养基中，待克隆生长至占满80％～90％孔底面积时，将已分化的细胞刮除，吸去mTeSR1培养基，用无菌PBS润洗后加入已复温至37℃的0.5mM EDTA，放入37℃CO₂培养箱中消化5-6min，吸去EDTA，取mTeSR1培养基轻轻吹落细胞，得到小细胞团。

所述的将三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中具体为：用尖头玻璃针将三维视网膜组织附着于孔底的基底部组织松解，轻轻推动其隆起部分使三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中。

所述的将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞具体为：将神经层转移至培养皿中，吸弃液体培养基后加入PBS，将神经层分割成若干个小组织片，吸弃PBS后加入accutase于37℃水浴中20min消化细胞，吸弃accutase，加入PBS反复吹打细胞，过滤后回收细胞，将回收的细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。

优选，所述的神经诱导培养基是以DMEM/F12(1:1)培养基作为基础培养基，每500mL基础培养基中加入100×N2 5 mL、肝素1mg和100×MEM-NEAA 5mL。

优选，所述的视网膜分化培养基是以DMEM/F12(1:1)培养基和DMEM基础培养基按体积比3:2混合作为基础培养基，每500mL基础培养基中加入不含有维生素A的50×B2710mL、100×antibiotic and antimycotic 5mL和100×MEM-NEAA 5mL。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、可获得数量稳定的3D视网膜组织；

2、可获得数量可控的纯度较高的视网膜前体细胞；

3、可缩短视网膜前体细胞获得的时间并简化了获得的工序，不需像传统培养方法一样需要加入多种神经营养因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、睫状神经营养因子(CNTF)脑源性神经营养因子(BDNF)等来维持细胞生长活性；

4、获得的视网膜前体细胞具有较强的增殖能力及重新向视网膜其他类型的细胞分化的能力；

5、获得的视网膜前体细胞可采用实验室常规方法冻存并复苏成功。

本发明直接从3d视网膜杯中分离得到视网膜前体细胞，相比于现有技术采用人多功能干细胞通过诱导分化出前体细胞，本发明更加简便，并且能够获得细胞种类单一且较纯的视网膜前体细胞，不会夹杂很多其他类型的细胞。并且利用本发明的方法获得的视网膜前体细胞能够采用实验室常规方法冻存并复苏成功，这是现有技术中常规方法获得的视网膜前体细胞所不具备的。

附图说明：

图1是本发明获得的3D视网膜组织；其中D50-60为诱导分化第50-60天的3D视网膜组织，D90-100为诱导分化第90-100天的3D视网膜组织；方框部分为神经层。

图2是机械分离获得的小组织片；其中D50-60为诱导分化第50-60天的3D视网膜组织获得的小组织片，其中D90-100为诱导分化第90-100天的3D视网膜组织获得的小组织片。

图3是视网膜前体细胞的台盼蓝染色光镜照片；其中D50-60的细胞来源为诱导分化第50-60天的3D视网膜组织；D90-100的细胞来源为诱导分化第90-100天的3D视网膜组织。

图4是分离获得的视网膜前体细胞贴壁培养情况。图5是视网膜前体细胞的Chx10和ki67免疫荧光染色光镜照片。

图5是视网膜前体细胞的Chx10和ki67免疫荧光染色光镜照片。

图6是利用流式细胞术分析获得的视网膜前体细胞的特异分子RX和ki67的表达；其中mouse-555为mouse IgG(Alexa Fluor 555标记小鼠IgG)阴性对照；rx-555为特异分子RX；con为rabbit IgG(Alexa Fluor 488标记兔IgG)阴性对照；ki67为特异分子ki67。

图7是RT-PCR检测诱导多能干细胞和获得的视网膜前体细胞的chx10和RX基因表达水平。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.BC1-GFP细胞的维持培养与拟胚体的构建

材料和仪器：

①细胞：BC1-GFP细胞，为骨髓来源的诱导多能干细胞。

②试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851，4℃；

2)EDTA：Invitrogen，15575-038，常温；

3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202，常温；

4)Matrigel：Corning，354277，-20℃；

5)(-)-Blebbistatin：Sigma，B0560，-20℃；

6)六孔板：FALCON，353046；

7)离心管：BD FALCON，352096。

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C；

2)倒置显微镜：Nikon，TS100。

具体步骤如下：

BC1-GFP细胞维持培养于mTeSR1培养基中，约4-5天克隆可生长至占满约80％～90％孔底面积。传代前，在光学显微镜下将已分化的细胞刮除。吸去mTeSR1培养基，用无菌PBS润洗两遍。加入已复温至37℃的0.5mM EDTA 1mL，放入37℃CO₂培养箱中消化5-6min。吸去EDTA，取1mL mTeSR1培养基轻轻吹落细胞(在此过程中勿过度吹打，以免将干细胞过度消化为单细胞，传代后易发生自动分化)，得到小细胞团(构建得到拟胚体(EB))，移入离心管中。向已用Matrigel过夜包被好的六孔板中加入含有10μM RI(核糖核酸酶抑制因子)的mTeSR1培养基，每孔2mL。吸取小细胞团悬液，逐滴滴入孔中，大约4-5滴/孔。将六孔板放入37℃CO₂培养箱中，十字摇匀法摇匀，静置过夜。

2.诱导分化

材料和仪器：

①试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851，4℃；

2)NIM培养基；

3)Matrigel：Corning，354277，-20℃；

4)RDM培养基；

5)组织培养板24孔板：Costar 3524。

②仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C。

表1神经诱导培养基(NIM)

成分	含量(mL)	最终浓度
			DMEM/F12(1:1)(Gibco,C11330500BT)	500.00
100×N2(Gibco,17502-048)	5.00	1％
			肝素(2mg/mL in PBS)	0.50	2μg/mL
100×MEM-NEAA(Gibco,11140-050)	5.00	1％
			总计	510.50

表2视网膜分化培养基(RDM)

成分	含量(mL)
		DMEM/F12(1:1)(Gibco,C11330500BT)	300.00
DMEM basic(Gibco,C11995500BT)	200.00
		50×B27 without vitamin A(Gibco,17504044)	10.00
100×antibiotic and antimycotic(Gibco,15240)	5.00
		100×MEM-NEAA(Gibco,11140-050)	5.00
总计	520.00

具体步骤如下：

将构建拟胚体当天记为诱导分化第0天，次日记为第1天，以此类推。第1天，将含有10μM RI(核糖核酸酶抑制因子)的mTeSR1培养基替换为培养基A，培养基A是由NIM培养基和mTeSR1培养基按体积比1:3混合而成；第2天，将培养基A替换为培养基B，培养基B是由NIM培养基和mTeSR1培养基按体积比1:1混合而成。第3天，将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到含有NIM培养基的24孔板中，开始贴壁培养。贴壁培养所用的24孔板需用Matrigel 37℃过夜包被。

第4-9天密切观察培养液性状，若无培养液发黄迹象可不更换培养液。第10天，将培养液补足到1mL每孔。此后至第16天前，每隔3天更换培养液。第16天，吸去NIM培养基，更换为RDM培养基。此后至第28天前，应隔2天全量换液。

3.三维视网膜组织的获取

材料与仪器：

①试剂及耗材：

1)RC2培养基；

2)钨针；

3)未处理24孔板：BIOFIL，170313-076。

②仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C。

表3 RC2培养基

成分	含量(mL)	最终浓度
			DMEM/F12(1:1)(Gibco,C11330500BT)	250.00	50％
DMEM basic(Gibco,C11995500BT)	175.00	5％
			50×B27 without vitamin A(Gibco,12587-010)	10.00	2％
100×antibiotic and antimycotic(Gibco,15240)	5.00	1％
			100×MEM-NEAA(Gibco,11140-050)	5.00	1％
FBS(Gibco,10099-141)	50.00	10％
			100×谷氨酰胺(Gibco,35050-061)	5.00	1％
1000×牛磺酸(sigma,#T-0625)	0.50	100μM
			总计	500.50

具体步骤如下：

对于本细胞系，在第22-24天时，三维视网膜组织可初步形成。至第28天，结构良好的三维视网膜可突出于培养孔底表面，平均每1个拟胚体可获得2-3个三维视网膜组织，在光学显微镜40倍放大下观察，三维视网膜呈边界清晰的椭圆形，外围有一圈细胞排列整齐紧密、折光性强的高亮环；或可呈现为自原拟胚体贴附处向外延伸的指状外爬结构，末端椭圆形隆起，边界较前一种略模糊，外围亦有一圈高折光环。用尖头玻璃针将诱导分化第28天的三维视网膜组织附着于孔底的基底部组织松解，轻轻推动其隆起部分，三维视网膜组织即向侧方掀起，并脱离孔底悬浮于培养液中。吸取悬浮的三维视网膜组织，用RDM培养基培养，悬浮培养于低吸附24孔板中，1个三维视网膜组织/孔。挑起后1周更换RC2培养基，每周2次全量换液，培养得到3d视网膜杯。

4.视网膜前体细胞的获取

材料与仪器：

①试剂及耗材：

1)RDM及RC2培养基；

2)钨针；

3)组织培养板24孔板：Costar 3524；

4)Accutase：Invitrogen，13150-016；

5)1×PBS(0.1M)：GNM，20012；

6)1×Matrigel：Corning，356234；

7)0.4％台盼蓝染液：Invitrogen，15250-061。

②仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C；

2)体式解剖显微镜：ZEISS，stemi305；

3)离心机：TDL-40B。

具体步骤如下：

1、于实验前一天挑选锋利的钨针及形态状态较好的诱导分化第56天的3d视网膜杯，平均每1个拟胚体可获得2-3个三维视网膜组织，使用钨针于3倍正置显微镜下，除去RPE及其他非3d视网膜杯组织，并拍照记录(图1)。

2、实验当天早上，将需处理的3d视网膜杯置于含有RC2培养基的60mm培养皿中，使用钨针于3倍正置显微镜下机械分离，离弃3d视网膜杯中的较暗及棕黑色部分(色素层)；保留金黄色部分(神经层)(图1)。

3、首先准备好3根15mL离心管，标明1、2、3。将分离出的神经层，使用1mL大枪头轻轻吸起(预先使用0.3-0.5mLPBS湿润枪头，避免组织粘附枪头)转移至3.5cm培养皿，吸弃RC2培养基，加入2cm的PBS(去除培养基成分)，并于3倍正置显微镜下将每个神经层切割成4-6个小组织片(图2)，便于消化充分。

4、将小组织片转移至1号离心管内，静置3min待小组织片沉到管底吸弃PBS加入3mL的accutase消化细胞，于37℃水浴中20min。注：消化10min时拿起离心管小心震荡几次，再继续水浴，不要移动。

5、20min消化时间到了后小心拿出离心管，避免震荡，置于安全柜内，吸弃全部accutase，加入950μL PBS反复吹打细胞约20次，期间避免气泡产生，将所有细胞悬液置于70μm滤网内过滤(先用PBS湿润滤网)，tips小心缓慢离开滤网些距离将细胞滤过到60mm培养皿内，并用PBS冲洗滤网3次，尽量回收所有的细胞，将回收的细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。

6、将皿内细胞悬液移入2号离心管内，离心(1000rpm，5min)，同时取出18μL细胞悬液与2μL 0.4％台盼蓝染液混匀2-3min后镜下计算细胞存活率及活细胞数(图3)。根据实验每10个3d视网膜杯得到细胞数约为1×10⁶个，活细胞率>85％。将所获得视网膜前体细胞用RDM培养基维持培养，同时可用实验室常规的细胞冻存方法液氮保存，并可复苏成功。

5.视网膜前体细胞的鉴定

为了提高获得视网膜前体细胞的纯度及活性，我们也进行了3d视网膜杯不同分化阶段的分离，如诱导分化第50-60天的3D视网膜组织(d50-d60)，诱导分化第90-100天的3D视网膜组织(d90-d100)。因为在起始状态上，分化后期的视网膜杯状态及神经层的透亮程度及区域大小都不如分化早期的视网膜杯好，而初步实验结果也验证了从分化早期的视网膜杯中分离的前体细胞在细胞活性及细胞增殖能力等方面均优于从分化后期的视网膜杯中分离的前体细胞，所以后期实验均使用早期分化的d50-d60的3d视网膜杯。

将获得的视网膜前体细胞进行贴壁分化实验(见图4)，从图4可以看出，培养的视网膜前体细胞完全贴壁，可见大量的类似于轴突样结构，相互连接交织成网，部分细胞聚集成菊花团样结构，结果表明，获得的视网膜前体细胞具有很强的细胞增殖能力和多向视网膜细胞分化的能力。对获得的视网膜前体细胞进行Chx10和ki67免疫荧光染色(见图5)，从图5可知，绝大部分的视网膜前体细胞均为Chx10和ki67阳性，结果表明，本实施例获得了高纯度的视网膜前体细胞。利用流式细胞术分析获得的视网膜前体细胞的特异分子RX和ki67的表达(见图6)，从图6可知，获得的视网膜前体细胞的RX阳性率为89.0％，ki67阳性率为82.6％。

分别提取诱导多能干细胞(iPS)和获得的视网膜前体细胞(RPC)的RNA，然后以RNA为模板进行RT-PCR，以检测chx10和RX基因的表达量(见图7)。从图7可以看出，获得的视网膜前体细胞均表达chx10和RX基因，且两个基因的表达量均显著高于诱导多能干细胞。说明获得的细胞为视网膜前体细胞。

Claims (4)

1.一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：挑选诱导分化第50-60天的人多能干细胞来源的3d视网膜杯，除去RPE及其他非3d视网膜杯组织，然后置于含有液体培养基的容器中，机械分离，离弃3d视网膜杯中的较暗及棕黑色部分的色素层，保留金黄色部分的神经层，再将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞；

所述的人多能干细胞来源的3d视网膜杯是通过以下方法制备的：将贴壁生长的人多能干细胞消化为小细胞团得到拟胚体，将拟胚体接种到mTeSR1培养基中培养，逐步将mTeSR1培养基替换为神经诱导培养基，当完全替换为神经诱导培养基时将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养，然后吸去神经诱导培养基更换为视网膜分化培养基，直至形成突出于培养板孔底表面的三维视网膜组织，再将三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中，将三维视网膜组织按1个三维视网膜组织/孔接种于含有视网膜分化培养基的低吸附培养板中悬浮培养，悬浮培养1周后吸去视网膜分化培养基更换为RC2培养基，培养得到人多能干细胞来源的3d视网膜杯；

所述的将拟胚体接种到mTeSR1培养基中培养，逐步将mTeSR1培养基替换为神经诱导培养基，当完全替换为神经诱导培养基时将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养具体为：将构建拟胚体当天记为诱导分化第0天，次日记为第1天，以此类推，第0天将拟胚体接种到含有10μM RI的mTeSR1培养基中培养，第1天，将含有10μM RI的mTeSR1培养基替换为培养基A，所述的培养基A是由神经诱导培养基和mTeSR1培养基按体积比1:3混合而成，第2天，将培养基A替换为培养基B，所述的培养基B是由神经诱导培养基和mTeSR1培养基按体积比1:1混合而成，第3天，将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到含有神经诱导培养基的经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养；

所述的液体培养基为RC2培养基，所述的RC2培养基是以DMEM/F12 1:1培养基和DMEM基础培养基按体积比为10:7混合作为基础培养基，每425mL基础培养基中加入不含有维生素A的50×B27 10mL、100×antibiotic and antimycotic 5mL、100×MEM-NEAA 5mL、FBS50mL、100×GlutaMax 5mL和1000×Taurine 0.5mL；

所述的神经诱导培养基是以DMEM/F12 1:1培养基作为基础培养基，每500mL基础培养基中加入100×N2 5mL、肝素1mg和100×MEM-NEAA 5mL；

所述的视网膜分化培养基是以DMEM/F12 1:1培养基和DMEM基础培养基按体积比3:2混合作为基础培养基，每500mL基础培养基中加入不含有维生素A的50×B27 10mL、100×antibiotic and antimycotic 5mL和100×MEM-NEAA 5mL。

2.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，所述的将贴壁生长的人多能干细胞消化为小细胞团具体为：人多能干细胞维持培养于mTeSR1培养基中，待克隆生长至占满80％～90％孔底面积时，将已分化的细胞刮除，吸去mTeSR1培养基，用无菌PBS润洗后加入已复温至37℃的0.5mM EDTA，放入37℃ CO₂培养箱中消化5-6min，吸去EDTA，取mTeSR1培养基轻轻吹落细胞，得到小细胞团。

3.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，所述的将三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中具体为：用尖头玻璃针将三维视网膜组织附着于孔底的基底部组织松解，轻轻推动其隆起部分使三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中。

4.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，所述的将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞具体为：将神经层转移至培养皿中，吸弃液体培养基后加入PBS，将神经层分割成若干个小组织片，吸弃PBS后加入accutase于37℃水浴中20min消化细胞，吸弃accutase，加入PBS反复吹打细胞，过滤后回收细胞，将回收的细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。

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