CN110302398A - 一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物、其制备方法及医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物、其制备方法及医药用途。以病毒作为载体,通过在人或动物视网膜穆勒细胞内过表达以下转录因子:1)Atoh7+Pou4f2、或2)Atoh7+Pou4f3、或3)Atoh7+Pou4f1、或4)Atoh7、Pou4f1、Pou4f2、Pou4f3的任意单体中的一种或上述组合之外的其它组合,可将穆勒细胞定向分化为视网膜神经节细胞(RGCs)。通过应用本发明组合物再生的RGCs能迁移到神经节细胞层,整合到局部神经网络,具有正常RGC的形态和功能,并连接到不同的大脑区域。这些RGCs表达正常神经节细胞的各种特异性标记,具有和体内正常RGCs相似的电生理等活性。本发明组合物可以使体内的RGCs再生,可以应用于青光眼等神经疾病细胞替代治疗等方面。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,尤其涉及一种治疗眼部疾病的药物领域。
背景技术
青光眼(glaucoma)是导致人类失明的三大致盲眼病之一,是一组以视乳头萎缩、视野缺损和视力下降为共同特征的疾病。全球数据显示青光眼的发病率40-80岁高达3.54%,并处于一种上升趋势,到2040年可能达到1.12亿人[1]。在中国,青光眼在总人群中的发病率为2.59%,2050年病人数可达到2500万人[2]。青光眼按病因可分为原发性、继发性和先天性青光眼三大类,其最常见病因是各种因素引起房水循环障碍导致的眼压增高,但眼压升高并不是唯一的危险因素,也并非所有的青光眼都有高眼压症状。青光眼的治疗以药物和手术手段促进房水循环、降低眼压、神经保护为主要方式。
从细胞水平分析致病机理,青光眼会导致视网膜神经节细胞(retinal ganglioncell,RGC)渐进性的、不可逆的死亡。RGC是唯一的负责将视觉信号从视网膜传输到大脑的细胞,其轴突汇集成负责信号传导的视神经。含有感光色素的一类RGC(ipRGCs)还有调节生物钟的功能。RGC的死亡导致视乳头萎缩和视力下降,但现在的药物和手术治疗只能延缓RGC的死亡速度,并不能逆转恢复RGC的数量。
基于干细胞的细胞替代治疗正成为研究的热点。根据干细胞的来源的不同,细胞替代治疗有两种方式。第一种方式是细胞移植,即移植体外来源的异体或自体干细胞或其分化的细胞。自体来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和诱导神经干细胞(induced neural stem cell,iNSC)具有自身免疫原性低、能无限扩增、能分化为各种神经细胞等特性,是非常理想的移植细胞来源。但细胞移植尚处于早期实验阶段,有很多技术困难有待克服,最主要的难点是移植细胞很难整合到视网膜,因此距离临床应用还有很大的空间。
细胞替代治疗的第二种方式是利用体内组织干细胞的原位再生。很多组织器官如皮肤、小肠、肺等拥有很多干细胞,具有很强的组织再生功能。大脑、视网膜等神经组织再生能力较弱,但也拥有类似干细胞功能的胶质细胞,从而维护组织的完整性和正常功能。视网膜穆勒细胞已经被证明可以在体内诱导分化为不同的神经细胞等,并整合到组织中修复部分损伤。
(1)体外分化RGC和细胞移植
青光眼及其它视神经病变代表了一类RGC轴突病变和胞体逐渐死亡的疾病。由于缺乏体内的再生功能,不能生成替代的RGC及其轴突,导致永久的视力减退乃至失明。多能干细胞和诱导多能干细胞为治疗这类疾病提供了新机遇。一种思路是利用移植细胞提供神经营养因子以保护体内的RGC。例如,移植到玻璃体腔的人胎儿视网膜前体细胞能对RGC起到神经保护作用[3]。移植的间充质干细胞虽然不能整合到视网膜,但减少了高眼压导致的RGC死亡,对RGC同样具有很好的保护作用[4]。
RGC的细胞替代治疗刚刚起步,面临着分化、整合等诸多障碍。干细胞必须能适当地分化为RGC,整合到无长突细胞及双极细胞突触前网络以便接收视觉信号,沿着受损的视神经生长轴突,连接到大脑的外侧膝状核(lateral geniculate nucleus)或其它靶标位点。在视网膜发育过程中,RGC的发育受Atoh7(Math5)、Six6、Brn3a/b、Ebf、Sox4/11等一系列转录因子的调控(详见下面分子调控网络部分)。Eiraku等人最早发现利用3D培养系统,可以将胚胎多能干细胞在体外培养生成类视网膜结构,其中包括分化的感光细胞和RGC等[5-7]。Zhong等人将这一发现推广到利用人的iPSC实现同一目的[8]。另外一些实验室利用所谓的2D培养系统,即先生成类胚胎球(Embryoid body),然后贴壁培养,最后得到不同程度的RGC[9-13]。Teotia等人根据体内视网膜发育过程,加入小分子药物模拟RGC的分化条件,最后也从多能干细胞得到了体外分化的RGC[14]。
但这些体外分化方法都面临着一些共同的缺点,包括RGC的分化效率较低、需要体外纯化的过程、移植后很难整合到视网膜等难题,尤其是移植后的整合问题困扰着所有这个领域的实验室。
(2)视网膜干细胞原位再生
正常人体组织都存在一些成体干细胞,用于组织的修复和原位再生,譬如皮肤、肠道、肺部等。成体干细胞原位再生避免了细胞移植不能整合的问题,为治疗疾病提供了一个新方向。人类的神经组织包括大脑存在某些胶质细胞,这些细胞在特殊条件下具有类似成体干细胞的功能,能够进入细胞周期扩增并分化为神经元及胶质细胞。视网膜的成体干细胞是否存在还具有争议,但也存在一种特殊的胶质细胞,即穆勒细胞(Müller)。穆勒细胞在视网膜受损时能够分裂增殖,也能分化为各种视网膜细胞,具有类似成体干细胞的功能[15-17]。
正常状态下,哺乳动物的穆勒细胞处于静息状态,对视网膜神经元提供骨架支持、物质循环代谢、营养保护等功能。当哺乳动物视网膜受伤时,和鱼类、两栖类、爬行类等低等动物不同,穆勒细胞不是对视网膜进行再生修复,而是参与一种反应性胶质化(reactivegliosis)的过程[18]。反应性的穆勒细胞体积增大,上调Vimentin、Nestin和GFAP等中间纤维基因的表达。通过释放抗氧化剂和神经营养因子,短期内的反应性胶质化提供神经保护作用。有时候反应性的穆勒细胞会重新进入细胞周期并增殖,导致形成扩大的纤维疤痕,伴随着TNFα等促炎症因子的释放,对神经元有着毒害作用。
哺乳动物的穆勒细胞具有再生修复功能必须有两个先决条件:(1)必须有增生能力;(2)增生的细胞必须有分化为神经元的能力。为解决第一个问题,研究者发现在视网膜不同的受损条件下,如NMDA、MNU、NaIO3、ouabain、过度光照等,BrdU掺入或PCNA、Ki67等有丝分裂标记显示有一小部分穆勒细胞的确能重新进入有丝分裂周期[19-21],但比例却远低于上述非哺乳动物。低等动物视网膜受损后会表达一些促进再生的生长因子和不同通路的信号分子[22],在哺乳类视网膜中过表达这些因子有可能促进穆勒细胞增生。确实,Karl等人证实了用EGF或FGF和胰岛素处理NMDA损伤的小鼠视网膜明显促进穆勒细胞的增生[23],增生后的细胞可以分化为无长突细胞。
几例报道显示,生长因子等有丝分裂因子促增殖效应依赖于动物的年龄。FGF2和胰岛素能促进出生后两周NMDA损伤大鼠视网膜穆勒细胞的增生[24],但成年大鼠似乎不起作用[19]。EGF能诱导出生后10天小鼠视网膜穆勒细胞的增生,但对出生后14天的不起作用,原因可能是EGF受体(EGFR)的表达下降。但光损伤后上调EGFR的表达,恢复了EGF的促增殖效应[25]。穆勒细胞下调这些受体从而进入静息状态,因为这个阶段视网膜各种细胞基本发育完成,逐步进入成熟视网膜阶段。最近的证据揭示,EGF主要是通过激活下游的MEK/ERK1/2、PI3K/AKT和BMP通路而实现的。
除生长因子外,几个重要的信号通路分子也显示具有促进穆勒细胞增生的能力,如经典的Wnt/β-Catenin、Sonic Hodgehog,Retinoic Acid,VPA等[24,26-28]。
可能是受局部微环境的影响,上述方法增生的穆勒细胞本身可以发育为无长突细胞、双极细胞及感光细胞,但很少水平细胞及神经节细胞。另一种促进向RGC分化策略是使用促神经因子刺激穆勒细胞向神经细胞分化。最常用的促神经因子是Ascl1,具有改变染色质构象及开放程度的能力,在体外可以将成纤维细胞和星形胶质细胞重编程为神经元。Pollak等人将表达Ascl1的慢病毒感染分离培养的穆勒细胞,发现Ascl1能高效地将其转化为神经前体细胞,并分化为神经元,具有典型的神经元形态且表达神经元的分子标记[29]。其它促神经因子如Lin28也被证实了具有促进穆勒细胞分化的作用[30]。
但问题是,增生穆勒细胞的分化方向是随机的,而不是定向分化为某种细胞,譬如感光细胞,在大多数疾病中我们需要这种定向分化的能力。这种定向分化需要在体内的发育过程中寻找线索,利用前体细胞中命运分化的决定因子来引导。的确如此,根据这种思路,在测试了不同的转录因子之后,Yao等人发现转录因子组合Otx2+Crx+Nrl可以将增生的穆勒细胞在小鼠体内定向分化为感光细胞[31]。体内分化的感光细胞具有正常的功能,并可以恢复先天性盲眼Gnat1rd17Gnat2cpfl3小鼠的部分视力。
作为一个再生的难点,神经节细胞需要连接双极细胞,并通过很长的轴突将信号传导到大脑。体内定向再生神经节细胞还没有报道。
(3)RGC发育机制与分子调节网络
成熟的视网膜由7大类细胞组成,包括神经节细胞、水平细胞、无长突细胞、双极细胞、穆勒细胞、视锥细胞和视杆细胞等(图1A-C)。所有这些细胞都由一小群前体细胞增殖并分化而得到的(向孟清,Cell.&Mole.Life Sci.2013)[32]。图1C是视网膜的结构示意图,视网膜7大类细胞组成外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL),中间通过外网层(ONL)和内网层(INL)连接;最早分化的细胞类型是神经节细胞(图1D),不同细胞类型的分化形成时间段不同,从胚胎期E10一直到出生后12天(P12)为止基本分化完毕。但细胞及神经回路成熟还需要一段时间(向孟清,Cellular&Molecular Life Science 2013)。bHLH基因Atoh7(Ath5/Math5)在视网膜祖细胞内短暂表达,使祖细胞获得了分化为RGC的能力。斑马鱼中lakritz基因是Atoh7的同源基因,lakritz的突变导致RGC全部消失[33]。在人体中,ATOH7的增强子缺失会引起非综合征型先天性视网膜脱离(nonsyndromic congenitalretinal nonattachment,NCRNA)疾病,表现为视神经萎缩引起的先天性致盲[34]。小鼠中敲除Atoh7基因引起大约80%RGC消失,并使祖细胞向无长突细胞、视锥细胞、水平细胞和穆勒细胞方向分化导致这些细胞的增生[35]。但是,表达Atoh7的祖细胞能够分化为视网膜所有主要细胞类型,而且过表达Atoh7并不偏向RGC的产生[36,37],说明Atoh7仅仅赋予祖细胞分化为RGC的‘开关’,但本身并不掌控这个‘开关’。这些结果综合说明Atoh7对于RGC的产生是必要的但非充分的条件。Atoh7的对RGC分化的部分作用是通过Brn3b和Isl1介导的[38,39],二者的表达在Atoh7敲除小鼠中都是下调的,而且它们控制的基因也都是下调的[35,38]。
往年的研究发现并鉴定了Brn3(Pou4f)家族在视网膜RGC发育和功能维护中的重要作用。Brn3(Pou4f)家族是具有Pou结构域的蛋白,进化上非常保守,包括Brn3a、Brn3b和Brn3c(Pou4f1、Pou4f2、Pou4f3)3个成员,在视网膜内特异性表达在RGC细胞。三者结构相似,在功能上有部分重叠;Brn3b在RGC发育中更为重要,Brn3a则在RGC生存和功能维护中不可缺少(Neuron 1993;PNAS 1996a,1996b,1996c,1997;Dev Biol 1998;Development1998,2000;J Neurosci 1995,2008;向孟清,第一作者或通讯作者)。Brn3b在祖细胞内表达不仅促进RGC的发育,而且通过调节转录网络抑制其它细胞类型的分化。在小鼠中敲除Brn3b会导致绝大部分RGC消失、视神经萎缩、投射错误等表型。Brn3b的效应部分是通过EBF家族成员介导的(J Neurosci 2010,通讯作者)。Isl1似乎和Brn3b平行起作用,共同调节RGC的发育。Isl1失活也会导致大多数RGC的消失,但Isl1可能不参与RGC的特化和命运决定,只参与调节其末端分化和功能维持[38,39]。
其它参与调节RGC发育的重要机遇家族包括Sox,Dlx等。SoxC家族属于高迁移(high mobility group,HMG)的小蛋白,其中Sox4和Sox11对于视网膜发育起到不可缺少的作用。Sox4和Sox11地表达和功能有重叠,它们在RGC中高表达,但可能不参与RGC的特化和命运决定,对RGC生存至关重要[40]。Mason实验室发现Sox4、Sox11和Sox12主要控制向大脑对侧投射RGC的发育[41]。Dlx1和Dlx2在RGC发育过程中和Brn3b共表达,在晚期RGC的发育中起到主要作用[42]。
基于这些科学发现,我们以小鼠模型作为代表,采用Atoh7(Ath5/Math5)和Pou4f家族的组合,用于体内诱导穆勒细胞定向分化为神经节细胞。
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发明内容
本发明是采取载体携带Atoh7和/或Pou4f的转录因子:1)Atoh7+Pou4f2,或2)Atoh7+Pou4f1,或3)Atoh7+Pou4f3,或4)Atoh7、Pou4f1、Pou4f2、Pou4f3的任意一种单体或上述组合之外的其它组合,得到质粒,将质粒转染包装细胞,制备包含上述转录因子的病毒颗粒。将病毒颗粒注射到玻璃体腔或视网膜下腔之后,感染穆勒细胞,并在穆勒细胞特异性启动子的作用下表达外来基因。这几种转录因子单体或组合都可以将体内视网膜的穆勒细胞转分化为RGCs,可以应用于疾病模型、药物筛选以及疾病治疗等领域。
具体技术方案如下:
一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物,
包括如下病毒颗粒:携带有Atoh7的病毒颗粒、携带有Pou4f的病毒颗粒,同时包括携带有Atoh7和Pou4f的病毒颗粒中一种或两种以上。
进一步地,所述Pou4f是Pou4f1、Pou4f2、Pou4f3的任意一种。
所述携带有Pou4f的病毒颗粒包括携带有Pou4f1的病毒颗粒、携带有Pou4f2的病毒颗粒、携带有Pou4f3的病毒颗粒中的一种或两种以上;
所述同时携带有Atoh7和Pou4f的病毒颗粒包括同时携带有Atoh7和Pou4f1的病毒颗粒、同时携带有Atoh7和Pou4f2的病毒颗粒、同时携带有Atoh7和Pou4f3的病毒颗粒的任意一种或两种以上。
进一步地,所述病毒颗粒中是腺相关病毒、慢病毒或腺病毒、逆转录病毒、仙台病毒中一种或两种以上,当然其他药物学上可接受的病毒同样可作为载体。
进一步地,所述Atoh7和Pou4f的来源是人体或者是脊椎类动物体。
一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物的制备方法,步骤如下:
(1)采用以下一种或两种以上方式制备含有转录因子的质粒:
a、把Atoh7克隆进入载体,得到携带Atoh7的质粒;
b、把Pou4f克隆进入载体,得到携带Pou4f的质粒;
c、把Atoh7和Pou4f分别克隆进入不同载体,得到携带Atoh7的质粒和携带Pou4f的质粒组成的混合物;
d、把Atoh7和Pou4f克隆进入同一载体,得到同时携带Atoh7和Pou4f的质粒;
(2)培养病毒包装细胞,病毒包装细胞采用含有包装质粒或含有包装病毒必须成分如衣壳蛋白的包装细胞株;病毒包装质粒是含有包装病毒必须的蛋白编码的,如衣壳蛋白等;
病毒包装细胞可以采用HEK293T细胞或其它起到相同作用的细胞株。
(3)利用质粒转染病毒包装细胞:把步骤(1)制备的质粒、连同病毒包装质粒一同通过脂质体或电转或氯化钙或磷酸钙等不同转染方法转染病毒包装细胞。
(4)从培养液或/和细胞中收集病毒颗粒,得到携带所述转录因子的病毒颗粒。
优选的,步骤(1)中Atoh7和Pou4f克隆进入同一载体的详细操作是通过P2A或T2A或E2A或F2A把Atoh7和Pou4f连接在一起,再克隆进入同一载体。
将病毒颗粒注射到玻璃体腔或视网膜下腔感染穆勒细胞;
过表达这些转录因子的方法也有多种,可以利用下列不同的途径达到同样目的:
利用CRISPR(成簇规律间隔短回文重复技术)技术,通过dCAS9-VP64(或类似功能融合蛋白)和分别靶向Atoh7、Pou4f的gRNAs激活它们在穆勒细胞内的表达。
利用ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)等分别靶向Atoh7、Pou4f成员的核酸酶-VP64融合蛋白(或类似功能融合蛋白)激活它们在穆勒细胞内的表达。
携带Atoh7和/或Pou4f2的病毒感染穆勒细胞后,在穆勒细胞内特异性表达这些基因,将穆勒细胞定向分化为RGCs。
分化后的RGCs自动迁移到神经节细胞层,并整合到视觉神经回路,发挥正常功能。
一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物能在制备治疗青光眼药物中应用。
一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物能在制备使视网膜神经节细胞原位再生药物中应用。
一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物能在制备治疗与视网膜神经节细胞死亡有关疾病药物中应用。
本发明实现了体内穆勒细胞转分化为视网膜神经节细胞;应用本发明比细胞移植更优的地方在于,原位转分化再生的RGCs很容易迁移到神经节细胞层并整合到局部神经网络形成功能性的神经回路。具有正常RGC的形态和功能,并连接到不同的大脑区域。这些RGCs表达正常神经节细胞的各种特异性标记,具有和体内正常RGCs相似的电生理等活性。因此,本发明在青光眼等神经疾病细胞治疗等应用中更具有可靠性和代表性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本申请的一部分,并不构成对本发明的不当限定,在附图中:
图1.视网膜的细胞类型及发育示意图。
(A-B)视网膜由一小群前体细胞(retinal progenitor cell,RPC)发育而来,并生成所有的细胞类型(小胶质细胞除外)的示意图;
(C)视网膜的结构示意图;视网膜7大类细胞组成外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL),中间通过外网层(ONL)和内网层(INL)连接;
(D)不同细胞类型的分化形成时间段不同示意图;从胚胎期E10一直到出生后12天(P12)为止基本分化完毕。但细胞及神经回路成熟还需要一段时间。(向孟清,Cellular&Molecular Life Science 2013)
图2.利用AAV病毒携带Atoh7和Pou4f2实现视网膜神经节细胞(RGCs)体内再生的实验图。
图3.利用AAV病毒携带Pou4f3单体实现RGCs再生的实验图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明,在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明,但并不作为对本发明的限定。
实施例一
下面以“Atoh7和Pou4f2将体内穆勒细胞转分化为RGCs”为实施例详细描述本发明的具体过程与细节。
(一)AAV病毒载体(质粒)的构建
将小鼠Atoh7(MGI:1355553,NCBI Gene:53404)和Pou4f2(MGI:102524,
NCBI Gene:18997)编码序列分别克隆进入不同的AAV病毒载体,其表达受GFAP启动子控制,得到质粒AAV-Atoh7和质粒AAV-Pou4f2。
或者使用P2A序列把小鼠Atoh7和Pou4f2连接,然后克隆进入AAV病毒载体中,得到质粒AAV-Atoh7-P2A-Pou4f2,测序验证;
(二)AAV病毒的制备
1)质粒(前述步骤得到的AAV病毒载体)转染前24小时,在10cm细胞培养皿中铺4.0x106的HEK293T细胞,加入含10%FBS的DMEM培养基进行24小时培养;
10%FBS DMEM的配方如下:
2)转染前,移除原培养基,换成9ml新鲜的提前预热的10%FBSDMEM培养基,备用。
3)制备质粒混合液:在装有500μl Opti-MEM培养基的1.5ml离心管中,分别加入质粒AAV-Atoh7-P2A-Pou4f2(10μg),包装质粒AAV-RC(5μg)和AAV-Helper(7μg),充分混匀,得到Opti-MEM/DNA混合液;再准备另一个装有460μl Opti-MEM培养基的1.5ml离心管,加入40ul的lipofectamin 2000,轻轻混匀,室温条件孵育5min,得到Opti-MEM/lipofectamine2000混合液;将Opti-MEM/lipofectamine 2000混合液加入Opti-MEM/DNA混合液中,从液体中间加入,避免贴壁加,轻轻混匀,室温下孵育20-30分钟,得到Opti-MEM/lipofectamine2000/DNA的混合液。
4)将步骤3)得到的Opti-MEM/lipofectamine 2000/DNA的混合液(约1ml),均匀滴加于步骤2)得到的培养HEK293T的10cm培养皿中,CO2培养箱37℃培养。
5)24小时后换新鲜培养基;每两天换液一次。
6)培养60-72小时后收集细胞,纯化AAV得到AAV病毒颗粒;4℃可保存两周;分装后在-80℃可长期保存。一旦解冻,最好用完或者丢弃,避免反复冻融。
(三)AAV病毒感染穆勒细胞
1)将1-2μl步骤(二)所得的AAV病毒颗粒通过视网膜下腔或玻璃体腔方式注射,考虑到对视网膜损伤较小,通常选用玻璃体腔注射。
2)携带Atoh7和Pou4f2的AAV病毒颗粒感染穆勒细胞后,由于穆勒细胞特异性启动子,外来基因只在穆勒细胞内表达。
过表达这些转录因子的方法也有多种,可以利用下列不同的途径达到同样目的:
a、利用CRISPR(成簇规律间隔短回文重复技术)技术,通过dCAS9-VP64(或类似功能融合蛋白)和分别靶向Atoh7、Pou4f成员的gRNAs激活这些转录因子在穆勒细胞内的表达。
b、利用ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)等分别靶向Atoh7、Pou4f成员的核酸酶-VP64融合蛋白(或类似功能融合蛋白)激活这些转录因子在穆勒细胞内的表达。
表达Atoh7和Pou4f2基因的穆勒细胞将在体内转分化为RGCs,并迁移到神经节细胞层,并整合到视觉神经回路,发挥正常功能。
如图2所示,经过上述步骤之后,大部分感染Atoh7和Pou4f2的穆勒细胞转分化为RGCs,而感染对照GFP病毒的穆勒细胞不改变形态。
其中(A)玻璃体腔内注射对照GFP病毒,GFP只在穆勒细胞内表达。穆勒细胞保持典型的细胞形态。(B)RBPBS是RGCs的分子标记。利用RBPMS抗体显示其只在RGCs表达。(C)合并A、B图片显示GFP和RBPMS不共标。(D)玻璃体内注射表达Atoh7和Pou4f2的AAV病毒之后,显示大部分穆勒细胞迁移到神经节细胞层。只有少数细胞仍然在内核层,但这些细胞失去典型穆勒细胞形态。(E)RBPMS抗体染色RGCs细胞。(F)合并图片显示绝大部分迁移到神经节细胞层的GFP阳性细胞和RBPMS共标,表明这些细胞已经分化成为RGCs。
实施例二
利用Atoh7、Pou4f1、Pou4f2或者Pou4f3的单体也能促进穆勒细胞在体内转分化为视网膜神经节细胞。本领域技术人员能够根据实施例一的操作过程理解本实施例的操作,此处不再赘述。实验结果如图3所示,利用AAV病毒携带Pou4f3单体实现RGCs再生的实验中,有少数穆勒细胞能分化为RGCs。虽然大部分穆勒细胞仍保持未分化状态,Pou4f3单体促进穆勒细胞在体内转分化为视网膜神经节细胞的效率要比Atoh7+Pou4f组合低,但不可否认单体在穆勒细胞能分化为RGCs所起到的作用。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明实施例,在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物,其特征在于:
包括如下病毒颗粒:携带有Atoh7的病毒颗粒、携带有Pou4f的病毒颗粒、同时携带有Atoh7和Pou4f的病毒颗粒中一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物,其特征在于:
所述Pou4f是Pou4f1、Pou4f2、Pou4f3中的任意一种;
所述携带有Pou4f的病毒颗粒包括携带有Pou4f1的病毒颗粒、携带有Pou4f2的病毒颗粒、携带有Pou4f3的病毒颗粒中的一种或两种以上;
所述同时携带有Atoh7和Pou4f的病毒颗粒包括同时携带有Atoh7和Pou4f1的病毒颗粒、同时携带有Atoh7和Pou4f2的病毒颗粒、同时携带有Atoh7和Pou4f3的病毒颗粒中的任意一种或两种以上病毒颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物,其特征在于:
所述病毒颗粒中是腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、仙台病毒中一种或两种以上作为载体。
4.根据权利要求1所述的一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物,其特征在于:
所述Atoh7和Pou4f的来源是人体或者是脊椎类动物体。
5.如权利要求1所述的一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物的制备方法,其特征在于:
步骤如下:
(1)采用以下一种或两种以上方式制备含有转录因子的质粒:
a、把Atoh7克隆进入载体,得到携带Atoh7的质粒;
b、把Pou4f克隆进入载体,得到携带Pou4f的质粒;
c、把Atoh7和Pou4f分别克隆进入不同载体,得到携带Atoh7的质粒和携带Pou4f的质粒组成的混合物;
d、把Atoh7和Pou4f克隆进入同一载体,得到同时携带Atoh7和Pou4f的质粒;
(2)培养病毒包装细胞;
(3)利用质粒转染病毒包装细胞:把步骤(1)制备的质粒,连同病毒包装质粒一起利用脂质体或者电转或者氯化钙或者磷酸钙转染病毒包装细胞;
(4)从培养液或/和病毒包装细胞中收集病毒颗粒,得到携带上述转录因子的病毒颗粒。
6.根据权利要求5所述的一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物的制备方法,其特征在于:
所述步骤(1)中Atoh7和Pou4f克隆进入同一载体的详细操作是通过P2A或T2A或E2A或F2A把Atoh7和Pou4f连接在一起,再克隆进入同一载体。
7.根据权利要求5所述的一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物的制备方法,其特征在于:
所述步骤(2)中采用含有包装质粒或含有包装病毒必需成份的包装细胞株。
8.一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物在制备治疗青光眼药物中的应用。
9.一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物在制备使视网膜神经节细胞原位再生药物中的应用。
10.一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物在制备治疗与视网膜神经节细胞死亡有关疾病药物中的应用。
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