JP2003521910A

JP2003521910A - 網膜幹細胞の分離及び移植

Info

Publication number: JP2003521910A
Application number: JP2001557570A
Authority: JP
Inventors: ヤング，マイケル，ジェイ．; クラッセン，ヘンリー; シャトス，マリー，エー．; 桂子水本
Original assignee: ザスキーペンズアイリサーチインスティテュートインコーポレイテッド
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2001-02-12
Publication date: 2003-07-22
Also published as: ATE473751T1; EP1261357B1; AU2001234998B2; DE60142553D1; WO2001058460A1; EP1261357A4; US20090104694A1; EP1261357A1; CA2399434A1; US20030207450A1; AU3499801A; US7514259B2; CA2399434C

Abstract

(57)【要約】本発明は体外及び体内において、目の神経網膜から得た無色素網膜幹細胞を分離、体外増殖、移植及び組合わせる方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の相互参照この出願は、２０００年２月１１日に出願された、米国暫定特許出願第６０/
１８１、７２３号の優先権を主張し、これらの全体は、参考に本書に引用されて
いる。

【０００２】（発明の背景）中枢神経系の一部としての網膜は、成長及び表現形で機能回復に関連して脳及
び脊髄の抵抗を共に分担する。遺伝的条件のうち、網膜ニューロンの損失に関連
する１００種類以上の疾病例があるという事実は不幸なことである。これらの細
胞を代替するための一つの方法は、健康なドナーからの網膜組織を疾病にかかっ
た宿主の網膜に移植するものであった。これに関連する研究の結果は、グラフト
（移植）生存の側面で励みになったが、移植片と宿主との間の調和性の問題が深
刻であると立証された。

【０００３】網膜の成長に関する研究は、胎児の網膜細胞の培養法（例えば、Ｋｅｌｌｅｙ
等^１０）を用いて実現できた。しかし、培養された細胞は本物の幹細胞の多能
性の特性が欠けているので、純粋な幹や前駆細胞ではない。研究所の規模で行わ
れている最近の多能性幹細胞（前駆細胞、未成熟細胞、未分化細胞、または増殖
細胞等と多様に表現される）の分離と増殖^１、２は哺乳類の研究と移植分野で活
発に行われている。成熟した齧歯類の海馬状隆起に存在するこれらの増殖性、幹
または先駆体細胞を分離して培養し、ニューロンまたはグリア細胞で微分できる
中枢神経系（ＣＮＳ）内の各種部位に移植する方法を例に挙げることができる。
移植した成熟体の海馬状隆起の前駆細胞は発育異常の網膜に移動して内部で分化
することができる。しかし、神経網膜で本物の幹細胞を分離すること、特に体内
と体外の両側で機能的な光受容体により分化できる細胞を分離することは困難で
あることが立証された。

【０００４】最近では、ｖａｎｄｅｒＫｏｏｙ等の米国特許第６、１１７、６７５号（
２０００年９月）には、毛様体帯域の色素上皮層から得た推定の“網膜幹細胞”
が染色され、ネスチン−陰性であり、また成長因子の欠乏状態で増殖及び通過で
きることが開示された。このような染色、ネスチン−否定性及び成長因子に対す
る非信頼性等は哺乳類の幹細胞の場合、一般的でない現象である。ｖａｎｄｅ
ｒＫｏｏｙ等は、これらの推定網膜幹細胞が宿主網膜の中に結合され、及び体
内で機能性成熟細胞に分化できる能力を持ったものかどうかについての何らの証
拠も提示しなかった。

【０００５】また、幹細胞について生物学的に関心を持つようにしたこれらの優れた適応性
は、宿主細胞内への結合経路を追跡するのに難しくなっている。

【０００６】したがって、体外で増殖することができ、更に容易に光受容体細胞に分化して
目に移植可能な多能性及び神経網膜幹細胞が続けて要求される実情であり、本発
明はこのような要求を達成するためのものである。また、本発明は宿主器官内に
導入される時のこれらの細胞の経路を追跡する方法も提供する。

【０００７】（発明の要約）まず、神経系網膜組織（非神経網膜の色素上皮組織と区別するために“神経網
膜”とも言う）特に、出生後の組織から得た生体幹細胞を分離した。これらの神
経網膜由来の網膜幹細胞（“ＮＲＳＣ”または“ＲＳＣ”と略称する）は、自己
再生及び多能性と網膜−特異的分化が可能な本物の幹細胞である。これらの細胞
はネズミと大人の双方の網膜組織から分離された。従来に記述した幹または前駆
細胞とは異なり、これらの細胞は病んでいる成長した目に移植する場合、体内で
光受容体に分化できることを示した。したがって、これらの細胞は本物の網膜幹
細胞である。

【０００８】はじめに記述したように、生体幹細胞は未成熟及び成熟したネズミの双方の神
経網膜組織から分離された。未成熟なドナーの場合、これらは神経網膜から幹細
胞を得ることができる末期の胎児ないし初期の出生後の期間（すなわち、出生前
の約５日及び出生後の１ないし２日の期間）の機会を提示する窓となる。

【０００９】更に、人体の神経網膜由来の幹細胞は大人のドナーから分離された。驚いたこ
とに、神経網膜由来の網膜幹細胞は老化したドナー（７０才以上を含む）から得
た網膜組織から分離できることが明らかになった。

【００１０】本発明の神経網膜幹細胞に関連して特別に重要な複数の観点がある。特に、本
発明の網膜幹細胞は神経網膜から誘導され、網膜色素上皮、毛様体細胞または虹
彩の色素細胞からは誘導されない。したがって、本発明の無色素幹細胞はｖａｎ
ｄｅｒＫｏｏｙ等の米国特許第６、１１７、６７５号に記載された“網膜幹
細胞”のような色素細胞と相反するものである。ｖａｎｄｅｒＫｏｏｙ等の
特許は特にこれらの色素細胞を神経網膜から得ることができないと記載したが、
本発明は前述した幹細胞の誘導に無色素、神経系網膜組織のみを単独で使用する
。

【００１１】また、ｖａｎｄｅｒＫｏｏｙ等の“網膜幹細胞”とは対照的に、本発明の
ＮＲＳＣｓは成長因子の欠乏状態では増殖しない。これらは血清及び/外因性の
成長因子をそれらの培地に添加しなければ増殖が誘導されない。本発明のＮＲＳ
Ｃｓは成長因子の制御下でのみ増殖するので、因子−自律方式で増殖する細胞、
特に（網膜を含む）眼球の細胞類を再現することでよく知られている髄様上皮腫
のような眼球腫瘍に起因した細胞と容易に区別される。

【００１２】更に、本発明の人体ＮＲＳＣｓ培養は、従来の網膜幹細胞の培養、または選別
された神経幹細胞の培養それぞれ、またはこれらの組合せから得たならし培地を
追加すれば、更に有利である。これは人体の神経網膜由来の網膜幹細胞（ｈＮＲ
ＳＣ）の増殖を調節する付加的な役割をするものであって、まだ特徴化していな
い自己因子または共同因子で提示される。

【００１３】幹細胞を人体の神経網膜から誘導する時、解剖過程において高粘着性の硝子体
液を管理しなければならない。これは硝子体茎切除術、眼球逆位、機械的切除及
び吸収創面切除術、また酵素消化法等を含んだ多様な技術を単独で、または組み
合わせて応用することによって達成できる。適切な酵素としては特に限定するも
のではないが、ヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼ等を挙げられる。また、網膜
幹細胞の分離のための標本から非神経網膜組織を全て分離することが特に有利で
ある。非神経組織は典型的に末梢部位（鋸状縁）に沿って存在する毛様体の硝子
体にある視神経頭及び上皮組織を含む。

【００１４】本発明のＮＲＳＣｓ培養法は、更に血清（例えば、ウシ胎仔血清）に対して培
養された神経網膜由来の細胞を初期露出させた後、この培地を、特異成長因子を
含む規定の培地に完全に代替する従来の技術とは相異なる。この技術は神経網膜
を分離するために網膜またはブドウ膜区域の層から誘導される幹細胞に関連して
は開示していない。初期の滅菌微細孔スクリーンを通じた機械的組織分離法は成
長因子受容体のような細胞の表面分子を分解する酵素の使用が最小化できる。

【００１５】更に、体内での神経網膜からの細胞誘導は抗生剤の選択に注意して行う。特に
、ゲンタマイシンは神経網膜細胞の培養に使用しないことが望ましい。人体ＮＲ
ＳＣｓは培養器内の人体細胞接着のための適切な基質として、特にこの場合、ポ
リオルニチンの基底部を覆うフィブロネクチンのような人体蛋白質を用いて培養
することが望ましい。本発明のＮＲＳＣ培養法においては粘着性細胞が観測され
る。従来の方法では、非粘着性球体として色素細胞を紹介した。

【００１６】更に、本発明は改良した緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）の導入遺伝子を発現する
マウスの神経網膜から幹細胞を分離することと、これらの細胞を非形質転換体の
脳及び網膜に移植することも伴う。これらのｅＧＦＰ−発現幹細胞の合体状態を
移植動物から追跡することができる。

【００１７】（実施例の詳細な説明）本発明は神経網膜由来の網膜幹細胞（ＮＲＳＣ）及び、これから得た細胞株の
分離、特性化及び使用方法に関するものである。

【００１８】本発明のＮＲＳＣｓはドナー動物すなわち、霊長類、齧歯類、家畜等（例えば
、人、マウス、ラット、豚等）から得た自然網膜組織から分離する。好ましくは
、分離した神経網膜組織に他の神経の外に、眼球組織、網膜色素上皮細胞等がな
いものである。

【００１９】ドナー哺乳類は胎児、新生児または成人でありうる。ＮＲＳＣｓを老人の神経
網膜からも分離できるという事実は驚くものである。ＮＲＳＣｓは:

【００２０】ａ）体外で自体回復が可能であり、

【００２１】ｂ）ニューロン、星状細胞及び希突起膠細胞から構成される群のいずれかの細
胞類に分化することができ、

【００２２】ｃ）神経網膜内に合体して宿主の後眼部に移植することができ、及び

【００２３】ｄ）網膜体外培養体上に移植された光受容体で分化または移植動物の目に分化
することができる。

【００２４】本発明の神経網膜由来の網膜幹細胞はネスチン（神経幹細胞及び未成熟ニュー
ロンのマーカー）を発現し、非色素型である（すなわち、網膜色素上皮細胞の起
源ではない）。培養時、これらの細胞は体外での増殖のために培地内に少なくと
も一つの外因性の成長因子を必要とする。有効な外因性の成長因子は当業者なら
ば分かるように、神経栄養因子、マイトジェン、サイトカイン成長因子、ホル
モン、及びこれらの組合体を含む。ＮＲＳＣ−支持型培地が次のような因子また
はこれらの因子の組合体のうち、いずれかを含むことがより有利である:上皮細
胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ及び
ＥＧＦの組合体、及びＥＧＦ及びｂＦＧＦの組合体と、また血小板由来の成長因
子（ＰＤＧＦ）等が挙げられる。

【００２５】移植部位または移植されたＮＲＳＣｓの自体環境は分化及び結果として出てき
た表現型に影響を及ぼす。ＮＲＳＣｓのニューロンへの分化はニューロン−特異
マーカー、例えば神経フィラメント蛋白質ＮＦ−２００等の発現により確認され
た。更に、ＮＲＳＣｓの星状細胞への分化はグリア繊維性酸性蛋白質ＧＦＡＰの
発現により現れた。網膜体外培養体上に移植した場合、または成熟体目の網膜の
中に移植した場合、ＮＲＳＣｓは宿主の構造（例えば、外核層）内へ適切に合体
してロドプシン、リカバリンまたはその両方を発現することが現れた。これらの
蛋白質は成熟した光受容体表現型のマーカーである。したがって、ＮＲＳＣｓは
機能障害網膜内に光受容体の機能を再組合せ及び保存する生体手段を提供する。
このような機能障害としては特に限定するものではなく、疾病、傷害及び進行性
欠陥等を含む。

【００２６】また、本発明はドナー動物の神経網膜から幹細胞を分離及び培養する方法を伴
っており、この方法は次のような段階からなる:

【００２７】段階（ａ）:神経網膜組織はドナーの目、特に胎児、新生児、または成熟した
ドナー動物から分離される。分離された神経網膜組織は、好ましくは硝子質の体
液やゲル、視神経頭組織、硝子体上皮組織、及び網膜色素上皮組織等が存在しな
い。好ましくは無菌法を用いて処理する。

【００２８】段階（ｂ）:分離された神経網膜組織は、次に機械的に定量し、分離された神
経網膜組織を約１００マイクロ毛穴の大きさのナイロンメッシュスクリーンに通
過して細胞に分裂させた。

【００２９】段階（ｃ）:段階（ｂ）からの細胞の分取液をプラスチックの組織培養フラス
コのような蛋白質層に適切に被覆した培養器に入れた。蛋白質層はＮＲＳＣｓが
分離されたドナー組織と類似した哺乳類の起源から出てきたものが望ましい。有
利なことに、この層はラミニンまたはフィブロネクチンで覆われたポリオルニチ
ンでも良い。

【００３０】段階（ｄ）;細胞分取液は所定量の１次細胞培地内で培養して約３５−３９℃
で約２４時間、また約４−６％ＣＯ_２雰囲気下で約１０^７−１０^８細胞/ml範囲
の細胞濃度を提供する。１次細胞培地はＤ−グルコースの含有量が約０.５−３.
０mg/リットル、好ましくは約１mg/リットルの生理学的平衡食塩水、Ｎ２補充液
、及び約５−１５％のウシ胎仔血清と、また、５−１５体積％の神経/網膜−な
らし培地及び有効量の少なくとも一つの抗生剤（ゲンタマイシン除外）を含む。

【００３１】段階（ｅ）;１次培地内で２４時間培養した後、この培地を培養器から分離す
る。

【００３２】段階（ｆ）;次に、本質的に血清及びゲンタマイシンを含有しない２次培地を
培養器に添加する。２次培地はＤ−グルコースの含有量が約０.５−３.０mg/リ
ットル、好ましくは約１mg/リットルの生理学的平衡食塩水（例えば、ＤＭＥＭ/
Ｆ−１２高グルコースの含有）、Ｎ２補充液、成長因子当たり約３０−５０ng/m
lの濃度を有する少なくとも一つの成長因子、有効量のＬ−グルタミン（約０.５
−３ｍＭ好ましくは約１ｍＭ）、有効量の神経前駆細胞−コンディショニング処
理した培地（ならし培地）、及び有効量の少なくとも一つの抗生剤（ゲンタマイ
シン除外）であり、ペニシリン及び/またはストレプトマイシン等を含む。好ま
しくは、ペニシリン及び/またはストレプトマイシンは次の通り添加することも
ある:１０、０００単位/mlのペニシリン、１０、０００mg/mlのストレプトマイ
シン;培地内でそれぞれ１００単位/ml及び１００mg/mlの最終濃度のために１:５
０−１５０、好ましくは１:１００相対割合で添加される。当業者ならば、培地
の種類はＮＲＳＣｓの維持と成長を支援できる能力をあまり変化させない範囲内
で多少変更可能であることが分かるはずである。

【００３３】本発明の分離及び培養方法は、好ましくは、前記段階（ｆ）に追加してＮＲＳ
Ｃｓが培養される培養器から死んだ細胞及び２次培地の一部を定期的に除去し、
また前記除去された部分と同一の量の新しい２次培地に代替する段階を更に含む
。この培養維持段階は概してＮＲＳＣ培養持続時期の間、２日ないし７日の間隔
で行なわれることもある。

【００３４】本発明は、神経網膜由来の網膜幹細胞を長期間培養することにより、ＮＲＳＣ
ｓのクローン誘導方法も提供する。

【００３５】また、本発明は体外培養体（体外で）または移植動物の中（体内）に関係なく
、宿主の網膜中に移植された前記細胞の移動と合体経路を追跡することができる
緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のようなリポーター遺伝子を発現するＮＲＳＣｓに関
するものである。ＧＦＰ−発現または“緑色”ＮＲＳＣｓは全ての有核体細胞（
体細胞）内で改良されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）形質転換生成物を発現する形質転換
動物から分離することができる。更に、別に“緑色”ＮＲＳＣｓはＧＦＰ形質転
換をクローン誘導のＮＲＳＣ細胞株の中に２次挿入することによって生成するこ
とができる。ＮＲＳＣｓにより発現されたＧＦＰはこれらの細胞が完全分化した
網膜細胞または他の神経細胞への正常発育及び機能に逆効果を持たないことが確
認された。

【００３６】ＮＲＳＣｓは各種の眼疾患、疾病及び傷、特に網膜と神経網膜組織に関連する
これらの疾患を研究及び処理する手段を提供する。

【００３７】本発明は次の非制限的な実施例を通じてより詳細に説明する。実施例１

【００３８】末期胎児/初期出産後のマウス及び成熟マウスからの網膜幹細胞の分離

【００３９】神経系網膜を緑色蛍光蛋白質（Ｔｇｎ（ベータ−ａｃｔ−ＥＧＦＰ）０.１０b
sdないし０.５０bsd）を発現する胎児及び出産後の形質転換マウスから切除分離
して、直ちに３Ｘ抗生剤（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含有するＰＢＳ
に入れた。神経網膜組織をダブル小刀で細かく切ってＰＢＳで洗浄し、５０ml遠
心分離管に入れて４℃で５分間、１２００rpmで遠心分離した。上澄み液を分離
除去した後、ペレットを５mlの０.１％コラゲナーゼ溶液（１種）に再懸濁して
直ちに磁気撹拌棒を含む滅菌カップに移し入れた。神経網膜組織をゆっくり２０
分間撹拌した後に撹拌板から分離して傾け、消化していない組織が容器の底面に
沈むようにした。遊離された細胞を含む上澄み液を除去して１００マイクロンの
ナイロンメッシュに通過させて５０ml遠心分離管に集め、前述のように（１２０
０rpm等）遠心分離を行った。再び上澄み液を分離及び除去し、結果として得た
細胞ペレットをＥＧＦ補充ウシ胎仔血清が含まれていないＤＭＥＭ/Ｈａｍ'sＦ
１２培地（４０ng/ml）の中に再懸濁した。細胞を６−ウエルプレートにシード
し、３７℃の温度及び９５％空気対５％二酸化炭素から構成された湿潤雰囲気下
で培養した。残りの組織が完全に消化されるまでこの周期を数回繰り返した。

【００４０】次の方式通りに前述した培地と共に２日ごとに細胞を再供給した。約０.５ml
の培地を特定のウェルから取り出して６−ウェルプレートの新しいウェルの中に
入れた。等量（約０.５ml）の新しく製造した培地を両方のウェルに添加した。

【００４１】細胞球体は分離後２４時間内に現れ、この時は非粘着性であった。球体が続けて成長、及び数が増大すれば培養器の底面に全て付着される時点に到
達する。（この時点は分離の程度、マウスの年齢等によって異なる場合がある）
。この時点で、前述したように培養物を再供給しており、皿の底上で続けて増殖
した細胞は分化された細胞と類似した形態的な特性を持つことが推定された。こ
の成長パターンは数日間（７日ないし１０日）持続した。突然、細胞が分離及び
単一細胞懸濁液を形成し始めて新しい前駆球体が生成される。この周期は細胞を
正規的に再供給する間に続けて繰り返すことが確認された。

【００４２】実施例２成人の人体網膜組織からの神経網膜由来の網膜幹細胞株の分離

【００４３】本発明の人体網膜幹/前駆細胞は神経網膜から得てメラミンを生成しない。し
たがって、これらの網膜幹細胞は共同培養時に成長した他の色素細胞から発生し
た色素粒子に関連して確認される場合もあるが、無色素細胞に分類される。

【００４４】若い人及び老人のドナー（６才−７８才、男性及び女性）を含む事後の人体神
経網膜組織から新しい網膜幹細胞類を分離した。これらの細胞はドナーが死んだ
後、このドナーの神経網膜由来の細胞の培養を開始するまで２４時間以上経過し
ても冷凍された非凍結神経網膜組織から誘導できる。

【００４５】方法論本発明の無色素人体神経網膜由来の幹細胞は切除された標本と共に、事後に提
供された組織からも得ることができる。この細胞は生後及び出産前にも広範囲の
ドナーの年齢にわたって得ることができる。また、本発明の細胞は驚いたことに
成人、甚だしくは７０才以上の老人ドナーの神経網膜からも得ることができる。

【００４６】完全な球、棒（角膜除去された球）形態の人体眼球組織、神経網膜の標本をド
ナーから得て、氷上で実質的に滅菌条件の状態で維持した。組織を氷上のダルベ
ッコ（Dulbecco）の必要最小培地Ｆ−１２（ＤＭＥＭ/Ｆ−１２;オメガサイエン
ティフィック）内で維持し、寄贈後６ないし３６時間のうち、必要とする時に培
養した。

【００４７】滅菌技術で網膜の流体を分離しながら目を切除した。後眼法を用いて硝子体を
管理した。網膜組織を他の眼球組織から分離切除した（すなわち、視神経頭及び
周辺部、硝子体または網膜色素上皮組織（ＲＰＥ）が全く含まれないように）。網膜組織を再び細かく切り、酵素処理と共に、または処理なしに微細なスクリ
ーンに機械的に押し出し通過させた。分離された網膜細胞をプラスチック多重−
ウェルプレートまたはプラスチック組織フラスコ（例えば、６−ウェルプレート
またはＴ−２５フラスコ、グレイナー（Greiner）社）の中でシード処理し、人
体網膜細胞の接着のための適切な気質として人体蛋白質層（例えば、ラミニンま
たはフィブロネクチン）で被覆した。特に、ポリオルニチン上に人体フィブロネ
クチンを被覆することが望ましい。細胞は初期に高グルコース含有量（約０.５
−３.０mg/リットル、好ましく約１mg/リットル）のダルベッコの必要最小培地
Ｆ−１２（ＤＭＥＭ/Ｆ−１２）、血清（５−１５％、好ましくは１０％のウシ
胎仔血清（ＦＣＳ））、及び神経幹細胞−ならし培地を含有する培地が含まれる
約３７℃及び５％の二酸化炭素（ＣＯ_２）雰囲気下の培養器で高密度で懸濁処理
された。ＦＣＳ−含有培地で細胞を約２４時間培養することが有利であることが
確認された。２４時間後、培地を完全に代替した。この時及び、今後の培養時に
培地の組成物をＤＭＥＭ/Ｆ−１２高グルコース培地と共に、神経幹細胞−なら
し培地（５−１５体積％）、Ｎ２補充液（ライフテクノロジー社）、比較的底濃
度のＬ−グルタミン（０.５−３mM）、また、一つ以上の高濃度の成長因子（Ｅ
ＧＦ、ｂＦＧＦ/ｂＦＧＦ/ＥＧＦ、またはＥＧＦ/ｂＦＧＦ/ＰＤＧＦ;それぞれ
２０−５０ng/ml、好ましくは４０ng/ml、プロメガ（Promega）社）、更にペニ
シリン及びストレプトマイシン等を含有する規定の血清無含有培地に変更した。
ゲンタマイシンは使用しなかった。

【００４８】続けて、少なくとも２−７日間隔で培地を新しい無血清、無ゲンタマイシン培
地に分別交換して、また懸濁液から死んだ細胞を除去することが望ましかった。
３−７日間は５時間程度ごとに頻繁に部分的な培地交換をすることが良い場合も
ある。

【００４９】生体粘着性細胞は培養１−３日内に容易に確認された。これらの無色素細胞は
一つの軸方向に延長して十分に融解された形態または豆の鞘形態のようになった
。７日目に、粘着性細胞が概してもっと大きくなるかその数が多くなった。一部
は両極型または多極型であり、一部は長くて薄く延びた形態であった。２週が過
ぎれば、粘着性細胞はその数が続けて増加した。増加現象は焦点のパッチで最大
となった。このパッチ内の細胞は、核中心から遠く、体細胞から分離及び新しい
組織で生成される別の円形のプロファイルと十分に結合した。これと類似した作
用が、本発明で記述した脳由来の人体神経前駆細胞株とマウス由来の網膜幹細胞
株の両方で全て現れた。他の場合で、パッチ内の円形のプロファイルは懸濁液内
で浮遊状態または粘着性であり、また停止しない状態、すなわち長い母細胞と並
べて配列していない状態であって、これらの細胞が培養時展開される一つの方式
として提示される。どんな場合でも、円形のプロファイルは多様な有糸分裂段階
で可視化されてその過程が完了したことを観測することができる。更に、小型の
円形細胞は下に含まれている粘着性細胞の体細胞を被覆するか、またはこの上に
浮き上がり神経球体を形成するクラスター内に存在した。１８日になれば、粘着
性群集はその数及び表現型の複雑性がずっと増加した。長くて薄い神経突起網が
神経表現型と調和してセルの間に広がることを明確に見ることができる。図１３
−１９は正常な成人の事後提供された神経網膜から得た無色素網膜幹/前駆細胞
の多様な光顕微鏡写真である。

【００５０】実施例３単一細胞、粘着性、神経網膜由来の網膜幹細胞の製造神経網膜由来の網膜幹細胞（ＮＲＳＣ）の単一細胞、粘着性製造物をＮＲＳＣ
球体培養物から次の方式によって製造する。単一細胞の製造物は新しいＮＲＳＣ
培養物を成長させるのに使用したり、後続使用のために冷凍することができる。

【００５１】１．前述したように、培養フラスコ内で、ＥＧＦ−含有培地で成長した神経網
膜由来の網膜幹細胞（ＮＲＳＣ）球体培養物すなわち、Ｔ−７５（Corning）を
用いて開始する。

【００５２】２．トリプシン/ＥＤＴＡ溶液（例えば、Ｔ−７５フラスコに２mlの０.０５％
トリプシン、０.５３mMＥＤＴＡを添加した１０x溶液）で前のことを処理して細
胞を分解する。

【００５３】３．フレームポリッシュパスツールピペット（flamed polished Pasteur p
ipette）で粉砕して中間直径のチップ（３００−６００マイクロン範囲）で作っ
た後、また小直径のチップ（１００−３００マイクロン範囲）で粉砕する。チッ
プの直径当たり１０回程度の粉砕作業を行う。

【００５４】４．１０mlのＣａ^２+及びＭｇ^２+無含有ＨＢＳＳを添加して洗浄する。

【００５５】５．１１００rpmで３分程度遠心分離して上澄み液は除去する。

【００５６】６．残りの細胞ペレットを前述したように（段階３）再びフレームポリッシュ
パスツールピペットで粉砕する。

【００５７】７．細胞を約１０mlのＣａ^２+及びＭｇ^２+無含有ハンクの平衡食塩水（ＨＢＳ
Ｓ）で再懸濁して細胞を洗浄し、また前述のように遠心分離する。上澄み液を全
て除去し、細胞はまた１mlの新しいＨＢＳＳに再懸濁する。

【００５８】８．残りの細胞ペレットを前述したように（段階３）、また簡単にフレームポ
リッシュパスツールピペットで粉砕する。

【００５９】９．結果として出てきた１−９百万個の細胞数/mlの細胞懸濁液を蛋白質被覆
した培養器、好ましくは、ラミニン被覆されたフラスコに入れる。細胞は単一粘
着性細胞のように成長して、約５日目には上皮細胞の成長因子含有培地（ＥＧＦ
培地）内で集合体形態に到達する。

【００６０】単一細胞粘着性網膜幹細胞培養物の凍結好ましくは、本発明の神経網膜由来の網膜幹細胞、特に単一細胞の粘着性幹細
胞培養物で製造した細胞は、長期間の貯蔵のために約−１５０℃程度の温度で凍
結できる。凍結されたＮＲＳＣは少なくとも１年間ＮＲＳＣｓの生命力に深刻な
影響を及ぼさないように保管することができ、培養やその他の目的で（解凍時の
細胞生命力は９５％以上である）使用直前に解凍できる。ＮＲＳＣｓは次のよう
に凍結する:

【００６１】１．培養フラスコ内で成長した神経網膜由来の網膜幹細胞（ＮＲＳＣ）の粘着
性培養群集物すなわち、Ｔ−７５を用いて開始する。培地を除去する。

【００６２】２．約１−３ml好ましくは２mlのトリプシン/ＥＤＴＡ溶液（好ましくは０.０
５％トリプシン、０.５３mMＥＤＴＡ、１０x溶液）を添加して細胞を培養フラス
コ（例えば、プラスチックＴ−７５フラスコ）から分離する。約１−５分間、好
ましくは約１分間撹拌する。

【００６３】３．約１０mlのＣａ^２+及びＭｇ^２+無含有ハンクの平衡食塩水（ＨＢＳＳ）を
添加してトリプシン/ＥＤＴＡ溶液を洗浄する。

【００６４】４．１１００rpmで３分程度フラスコを遠心分離して上澄み液を除去する。

【００６５】５．残りの細胞ペレットを簡単にフレームポリッシュパスツールピペットで粉
砕して中直径のチップに作った後、再び小直径のチップで粉砕する。チップの直
径当たり１０回程度の粉砕作業を行う。

【００６６】６．細胞をアンプル当たり１mlの５０％ＥＧＦ培地/５０％ならし培地（ＶＷ
Ｒ）に再懸濁し、ここに７５mlのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加する
。“ならし培地”とは神経幹細胞により“ならし”すなわち、培養中の細胞に供
給して、これを除去及びろ過させたＥＧＦ培地を言う。培地には各種細胞分泌生
成物及び老廃物が含まれている。（“神経前駆細胞−ならし培地”とは“ならし
培地”の場合と同様の意味である）。“Ｎ−２補充剤”は市販されるＧＩＢＣＯ
/ライフサイエンステクノロジー社の製品で、トランフェリン、インシュリン及
び各種成長因子を含むことで知られている。当業者ならば、Ｎ−２培地を“規定
の培地”または“血清無含有培地”等とも称し、これは“血清含有培地”と区別
されるということを分かるはずである。

【００６７】７．ナルゲン（Nalgene）イソプロピル凍結装置に懸濁細胞のアンプルを入れ
て、またこれを−８０℃冷凍庫に少なくとも４時間入れて置く。

【００６８】８．長期間保存時には−１５０℃の冷凍庫にアンプルを移す。

【００６９】再使用のための凍結ＮＲＳＣの解凍凍結された単一細胞の粘着性ＮＲＳＣサンプルを解凍するには、次のような方
法にしたがう:

【００７０】１．約３７℃の水槽に凍結ＮＲＳＣｓガラスビンまたはアンプルを入れて解凍
する。

【００７１】２．細胞を１０mlの冷凍ＥＧＦ培地内で（細胞濃度は約１−９x１０^６細胞数/
ml..）１５ml管に移す。

【００７２】３．再懸濁した細胞を約８００rpmで３分間遠心分離する。

【００７３】４．上澄み液を捨て、ＮＲＳＣ細胞を１mlＥＧＦ培地内に再懸濁し、これをＴ
−７５フラスコに入れる。

【００７４】網膜幹細胞の特性化

【００７５】Ｗｅｉｓｓ等^８は幹細胞の５種類の特性について説明しており、例えば;（１
）増殖し、（２）自己調節または自己回復、特に自己回復は対称的に起こり、（
３）多数の子孫を産み、（４）時間経過にも拘わらず多能性、すなわち各種細胞
血統に分化される能力を維持し、及び（５）疾病または傷に対応して新しい細胞
を生成する能力等がそれである。ここでは体内及び体外で分離した神経網膜由来
の網膜幹細胞を特徴化して、これらが本物の網膜幹細胞であることを次の証拠に
基づいて判断した。

【００７６】増殖及び自己回復（基準（１）−（３））: 高ＥＧＦ（４０ng/ml）の条件下で、細胞はＫｉ−６７で標識する球体を形成し
てネスチンを発現し、単一細胞に分解された時に新しい球体を形成する。これは
少なくとも体外で５ケ月間示された。

【００７７】多能性（基準（４））:１０％血清で処理時、これらの細胞は全て３種類の神
経血統に分化される:ニューロン（ＮＦ−２００及びＭＡＰ−２発現）、星状細
胞（ＧＦＡＰ発現）及び希突起膠細胞（ＧａｌＣ）。

【００７８】網膜内への合体及び移植（基準（４）及び（５））:細胞は宿主網膜と合体後
、病んでいる網膜に対して体内移植または体外培養することができる（図６−１
２参照）。

【００７９】網膜特異分化（基準（４）及び（５））:網膜血統のホールマークは網膜特異
マーカーの発現である。前述した幹細胞とは違い、これらの細胞は病んでいる成
熟した目に移植された時に光受容体で分化できる。これは移植されたＮＲＳＣｓ
発現ロドプシン（図５、６、９、１０参照）、リカバリン（図７、８、１１、１
２）等により示される。

【００８０】実験結果の検討実験結果を、図面を参照して検討する。

【００８１】図１は単一細胞懸濁液で分離した後、３日目（上部パネル）及び６日目（下部
パネル）に確認した神経網膜幹細胞球体の位相差図（左側、Ａ）及び緑色−蛍
光蛋白質（ＧＦＰ）照度（右側、Ｂ）を示す。このパネルは単一細胞からＧＦＰ
マーカー（緑色）の高密度の発現、漸進的で急速な球体の成長を示すものである
。

【００８２】図２は体外で網膜幹細胞による幹細胞マーカーの発現を示す。球体は多数の細
胞がＫｉ−６７、すなわち有糸分裂する細胞のマーカーにより染色されることを
示す（左側、Ａ）。また、これらの球体は神経幹細胞及び未成熟ニューロン内の
中間のフィラメント蛋白質を発現する（右側、Ｂ）。

【００８３】図３に示すように、血清（例えば、１０％のウシ胎仔血清）に露出時及びＥＧ
Ｆ除去時、本発明の網膜幹細胞球体が基質（例、ラミニン）上に付着され、また
神経及び星状細胞の分化作用を経る。これはＧＦＡＰ（左側、Ａ: グリア繊維性
酸性蛋白質、星状細胞マーカー）及びＮＦ−２００（右側、Ｂ;神経フィラメン
ト、２００Ｋｄ、成熟ニューロンマーカー）の発現により表示される。

【００８４】図４）体外で７日間培養した網膜幹細胞球体と共同培養した生後１日目の網膜
の体外培養移植者組織の４種類の例である。７日間、ＧＦＰ陽性細胞（緑色）は
網膜の中に移動して神経構成体となり、複雑な過程を経て宿主網膜内に入ると予
測される。

【００８５】図５）成熟したｒｄ−２マウスの目に移植された網膜幹細胞により光受容体特
異マーカーロドプシン（抗ロドプシンにより赤色標識された）の発現に関する２
種類の例である。ここで、移植から２週間後、２個の細胞が高レベルのロドプシ
ンを発現することで示されており、光受容体の形態的特性が発展した。

【００８６】図６−８は移植環境の影響を表す:ＮＲＳＣの網膜部位内の移植は光受容体細
胞（例、成熟した光受容体のマーカーとして知られているロドプシンとリカバリ
ンを発現する細胞）を含む網膜細胞への分化を促進する。図６は網膜部位内に移
植された神経網膜由来の網膜幹細胞が、そのままロドプシンが発現できることを
示す。図７は外眼環境で移植されるＮＲＳＣｓが、移植された網膜幹細胞自体に
よりリカバリンが発現できることを示す。図８は網膜環境内に移植されたＮＲＳ
Ｃｓによりリカバリンが発現することを示す。

【００８７】図９−１２はＮＲＳＣｓが、病んでいるかまたは病変のあるものとしてＮＲＳ
Ｃが移植される、成熟した移植動物の網膜部位でも成熟した網膜内に合体できる
ことを示す。

【００８８】図９Ａ−Ｂは移植から２週間後、ＲＤ−２マウス硝子体内でのＧＦＰ（緑色）
及びロドプシン（赤色）発現を表す光顕微鏡写真を示す。病んでいる成熟した網
膜の硝子体に対して移植された神経由来の網膜幹細胞がロドプシンを発現するこ
とができる。

【００８９】図１０Ａ−１０Ｃの光顕微鏡写真は移植から２週間後Ｂ６マウスで、病変のあ
る成熟した網膜内のサブ網膜空間に移植されたＧＦＰ−発現ＮＲＳＣが、また病
変のあるＢ６マウスサブ網膜空間内でリカバリンを発現することを示す。図１０
ＡはＧＦＰ発現（緑色）を、図１０Ｂはリカバリン発現（赤色）をそれぞれ示し
、図１０Ｃは図１０Ａと１０Ｂの重複または組合された写真を示して、重複また
は組合された状態を示す（黄色は移植されたＲＳＣｓによるＧＦＰ及びリカバリ
ンの共同発現を示す）。

【００９０】図１１Ａ−Ｃ及び図１２Ａ−Ｃは成熟した宿主網膜（例、病変のあるＢ６マウ
ス）に移植された“緑色”のマウス神経網膜由来の網膜幹細胞と、これらの合体
部位を示す光顕微鏡写真を示す。これらの緑色神経網膜由来のＲＳＣｓはＧＦＰ
−発現マウスから分離されたものであり、自己回復型神経球体を形成し、またＦ
ＩＴＣ照明下で均一な緑色蛍光発光を示しており、したがって成熟したマウス網
膜に移植した後に容易に確認される（図１１Ａ−１１Ｃ及び図１２Ａ−１２Ｃ）
。成熟した網膜のサブ網膜空間内へ移植されたＮＲＳＣはリカバリンが発現でき
る（図１１Ａ−１１Ｃ）。また、リカバリン及びＧＦＰ共同発現は物理的に傷を
つけるか、または病変のあるＢ６マウス網膜の外核層で示され（図１２Ａ−１２
Ｃ）、その上に本発明の神経網膜由来のＲＳＣが移植される。これは発育異常の
大人のマウス網膜に移植される時、ＮＲＳＣが網膜血統細胞に分化されることを
立証する。

【００９１】図１３−１９は培養時、本発明の人体ＮＲＳＣｓの光顕微鏡写真である。これ
らの細胞は本発明の方法によって体外増殖が可能であった。ウシ胎仔血清に長期
間露出時、これらのｈＮＲＳＣｓは各種の神経細胞に分化することができる。

【００９２】図１３は培養された人体神経網膜由来の幹細胞（ｈＮＲＳＣｓ）の底倍率の光
顕微鏡写真で両極性、多極性及び円形細胞を神経突起の形成段階と共に示す。

【００９３】図１４は細胞分裂を行うｈＮＲＳＣｓの光顕微鏡写真である。

【００９４】図１５は培養されたｈＮＲＳＣｓの底倍率の光顕微鏡写真であり、細胞及び前
駆細胞の分裂を示す。この細胞は染色していない他の序列で観測される。

【００９５】図１６は培養されたｈＮＲＳＣｓの底倍率の光顕微鏡写真であり、長期間の神
経突起の形成段階が行われるものである。

【００９６】図１７は培養されたｈＮＲＳＣｓの有糸分裂プロファイルを示す位相光顕微鏡
写真である。

【００９７】図１８は染色していない状態を示す培養されたｈＮＲＳＣｓの明るい領域の光
顕微鏡写真である。

【００９８】図１９Ａ−１９Ｃは同一培養されたｈＮＲＳＣｓ標本を時間順に示す光顕微鏡
写真であり、細胞分裂を行う網膜幹または前駆細胞を示す。図１９Ａは有糸分裂
前の幹/前駆細胞を;図１９Ｂは有糸分裂過程を;図１９Ｃは有糸分裂直後の前記
細胞を（２個の娘核と共に）示す。また、図１９Ｃは初期の神経幹/前駆細胞の
典型的なプロファイルも示す。

【００９９】用途

【０１００】本発明の神経網膜由来の網膜幹細胞は網膜及び目の発育、及びこの発育に良い
かまたは悪い影響を及ぼす因子を研究するために使われる。更に、この応用分野
は向上した緑色蛍光蛋白質−発現ＮＲＳＣ、例えば形質転換ドナー動物から得た
ＮＲＳＣを利用すれば部分的に可能である。これらの細胞によれば、体内で宿主
移植者に移植された神経網膜由来の網膜幹細胞の移動、合体及び発育の経路を追
跡することも可能である。

【０１０１】本発明の神経網膜由来の網膜幹細胞は目の発育障害のある哺乳類の移植者に移
植するのに有用である。これらの細胞は発育異常の眼球組織を再集合または保護
するのに有利に用いることができる。網膜の機能障害は疾病、物理的または化学
的な傷、または移植者の網膜の変性症性または病理的過程による正常網膜機能の
欠乏または損失を伴う。ＮＲＳＣは注射するか、その他の公知の方法で網膜部位
、サブ網膜の空間、硝子体腔または視神経等に供給する。これは生物分解性に優
れた界面活性制をＲＳＣｓの担体として使用することも含む。

【０１０２】有利には、前記ロドプシン及びリカバリン発現により支持されるように、本発
明のＮＲＳＣｓは光受容体細胞機能の欠乏や弱化を補償するために使用する場合
もある。網膜幹細胞群により治療できる網膜の機能障害及び本発明の方法の例は
特に限定するものではなく;光受容体の変性症（例えば、網膜色素変性症、錐体
ジストロフィー、円錐体−杆状体及び/または杆状体−錐体ジストロフィー、及
び黄斑変性症等）;網膜分離及び網膜外傷;レーザーや日光による光学病変; 黄斑
円孔; 黄斑浮腫;夜盲症及び色盲; 糖尿病や血管閉塞による虚血性網膜症; 未熟
児/早産児網膜症;感染性条件、例えば、ＣＭＶ網膜炎及びトキソプラズマ症;虹
彩の炎症のような炎症性条件; 網膜芽細胞腫や眼球黒色腫のような腫瘍;また緑
内障、外傷性網膜症、放射線視神経障害及び網膜症等を含む眼球網膜症の影響を
受ける内部網膜ニューロンの代替のためのものである。

【０１０３】当業者ならば、幹細胞を用いて本発明の方法によって治療する網膜の機能障害
の他の例を公知技術により分かるはずであり、例えばｖａｎｄｅｒＫｏｏｙ等
の米国特許第６、１１７、６７５号（２０００年９月特許取得）またはＰＣＴ国
際出願ＰＣＴ/ＵＳ００/０３５３４に開示したように、無網膜の起源の移植され
た神経前駆細胞を発育障害のある未成熟の移植体の神経組織に組み合わせる方法
が公知された。これらの公知文献を参照として収録する。特に重要なことは神経
幹細胞、網膜疾患及びその他の機能障害、幹細胞の培養及び用途に関する内容で
ある。

【０１０４】ＮＲＳＣｓを用いて網膜の機能障害を治療する場合、ＮＲＳＣｓを移植者の目
に供給すると共に、神経網膜由来の幹細胞の光受容体細胞またはその他網膜細胞
の種類（例えば、両極性細胞、神経節細胞、水平細胞、無軸索細胞、ミュラー細
胞等）への分化を刺激する物質を投与することもある。ＮＲＳＣｓを視神経の機
能障害を治療するために供給する時、神経網膜由来の幹細胞をニューロン、星状
細胞または希突起膠細胞への分化を促進する物質（または物質の組合せ）を活用
する場合もある。

【０１０５】本発明の細胞はリポーター形質転換（ＧＦＰ）の構成性発現を示す。更に、本
発明の細胞は治療的遺伝子生成物を含む他の対象遺伝子を構成的にまたは誘導方
式で発現するように修正することもできる。

【０１０６】本発明の治療方法は成熟または未成熟/成人の可否に関わらず人、マウス、ラ
ットまたは眼疾患、特に網膜の機能障害を有する家畜を含む哺乳類の移植者を対
象とする。ＮＲＳＣドナー及び移植者は同一または異なる種である場合もある。
交差種ドナー及び移植者の双を例示すれば;ラットドナーとマウス移植者;マウス
ドナーとラット移植者;豚ドナーと人間移植者等がある。ドナーと移植者は異質
遺伝子型または同質遺伝子型である。

【０１０７】前述した内容において、本発明の特定の具現例を例示の目的で記述したが、

【０１０８】添付した特許請求の範囲で説明したように、本発明の精神と範囲から外れるこ
となく多様な変形が可能であることが分かる。

【０１０９】ここに記述した全ての公知特許と文献及び特許出願を次のように参考として収
録した。

【０１１０】参照文献

【図面の簡単な説明】

【図１】単一細胞の懸濁液で分離した後、３日目（上部パネル）及び６日目（
下部パネル）に確認したＧＦＰ−発現、神経網膜由来の網膜幹細胞具体の位相差
図（左側、Ａ）、及び緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の照明図（右側、Ｂ）である
。

【図２Ａ及び２Ｂ】網膜幹細胞のマーカーに対する抗体で標識された、体外Ｎ
ＲＳＣｓの光顕微鏡写真であり、有糸分裂細胞により発現されたＫｉ−６７（左
側、図２Ａ）及び神経幹細胞及び未成熟ニューロン内の中間フィラメント蛋白質
であるネスチン（右側、図２Ｂ）を示す。

【図３Ａ及び３Ｂ】星状細胞マーカーとして、グリア繊維系酸性蛋白質に対す
る抗体（抗ＧＦＡＰ、左側、図３Ａ）及び成熟ニューロンに対するマーカーとし
て、２００ｋＤの神経フィラメントに対する抗体（抗ＮＦ２００、右側、図３Ｂ
）で標識された血清に対して露出された後の体外神経網膜由来の幹細胞の光顕微
鏡写真である。

【図４Ａないし４Ｄ】マウスの網膜幹細胞具体と、体外で７日間培養したマウ
スの網膜切除受容体組織（生後１日目に得た）に関する４種類の実施例の緑色蛍
光蛋白質（ＧＦＰ）の照明光顕微鏡写真である。

【図５Ａ及び５Ｂ】宿主である成熟したｒｄ−２マウスの目に移植して、光受
容体−特異マーカーであるロドプシン特異赤色−ラベル抗体で標識されてから２
週間後、“緑色”神経網膜由来の網膜幹細胞（ＧＦＰ−発現形質転換マウスから
得た）の２種の実際光顕微鏡写真である。

【図６Ａ−Ｆ】各網膜部位内に移植された“緑色”ＮＲＳＣｓを移植してから
２週間後の光顕微鏡写真であり、図６Ａないし６Ｃ及び図６Ｄ及び６Ｆはそれぞ
れ異なる照明下に同一な網膜部位を示す、ＧＦＰ照明（図６Ａ及び６Ｄ）、赤色
標識された抗ロドプシン抗体（図６Ｂ及び６Ｅ）、一般の光顕微鏡写真（図６Ｆ
）である。

【図７】眼球部位の外に移植及び移植から２週後の赤色標識化抗リカバリン抗
体で標識された“緑色”ＮＲＳＣｓの共焦点光顕微鏡写真である。

【図８】網膜部位に移植及び移植から２週後の抗リカバリンで標識された“緑
色”ＮＲＳＣｓの共焦点光顕微鏡写真である。

【図９Ａ及び９Ｂ】移植から２週後、ＲＤ−２マウスの硝子質内でのＧＦＰ（
緑色、図９Ａ）及びロドプシン（赤色、図９Ｂ）の発現を示す光顕微鏡写真であ
る。

【図１０Ａ−１０Ｃ】同一移植部位、移植から２週後、導入遺伝子ＧＦＰ−発
現マウスから得た成熟体の網膜“緑色”ＮＲＳＣのサブ網膜空間に移植及び病変
のあるＢ６マウスサブ網膜空間内の成熟体網膜のサブ網膜空間に移植された網膜
幹細胞の光顕微鏡写真であり、図１０ＡはＧＦＰ発現（緑色照明）;図１０Ｂは
リカバリン発現（赤色−標識された抗リカバリン抗体で細胞染色）;及び図１０
Ｃは図１０Ａ及び１０Ｂの重複または組合わされた写真である。

【図１１Ａ−１１Ｃ】同一移植部位、移植から２週後、病変のあるＢ６マウス
サブ網膜空間内の成熟体網膜のサブ網膜空間に移植された形質転換ＧＦＰ−発現
マウスから得た“緑色” ＮＲＳＣの共焦点光顕微鏡写真であり、図１１ＡはＧ
ＦＰ発現（緑色照明）;図１１Ｂはリカバリン発現（赤色標識された抗リカバリ
ン抗体で細胞染色）;及び図１１Ｃは図１１Ａ及び１１Ｂの重複または組合わさ
れた写真である。

【図１２Ａ−１２Ｃ】同一移植部位、移植から４週後、病変のあるＢ６マウス
サブ網膜空間内に移植された“緑色” ＮＲＳＣの共焦点光顕微鏡写真であり、
図１２Ａはリカバリン発現（赤色標識された抗リカバリン抗体で細胞染色）;図
１２ＢはＧＦＰ発現（緑色照明）;及び図１２Ｃは図１２Ａ及び１２Ｂの重複ま
たは組合わされた写真である。

【図１３】神経突起の形成過程において両極性、多極性及び円状細胞を示す、
培養された人体の神経網膜由来の幹細胞（ｈＮＲＳＣｓ）の底倍率の光顕微鏡写
真を示す。

【図１４】細胞分割時のｈＮＲＳＣｓの光顕微鏡写真である。

【図１５】分割細胞及び前駆細胞を示す培養されたｈＮＲＳＣｓの底倍率の光
顕微鏡写真であり、これらの細胞は染色していない他の序列で観測される。

【図１６】神経突起を長期間進行させて培養したｈＮＲＳＣｓの底倍率光顕微
鏡写真である。

【図１７】ｈＮＲＳＣｓの有糸分裂プロファイルを示す位相光顕微鏡写真であ
る。

【図１８】染色していないｈＮＲＳＣｓの明るい領域の光顕微鏡写真である。

【図１９Ａ−１９Ｃ】細胞分裂下の網膜幹または前駆細胞を示す同一培養され
たｈＮＲＳＣｓ標本の時間に対する順次の光顕微鏡写真であり、図１９Ａは有糸
分裂前;図１９Ｂは有糸分裂する間;及び図１９Ｃは有糸分裂直後の（娘核２つを
含む）幹/前駆細胞を示し、また図１９Ｃは初期、神経幹/前駆細胞の典型的なプ
ロファイルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 27/02 29/00 29/00 31/00 31/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｎ 5/10 Ｂ (72)発明者シャトス，マリー，エー．アメリカ合衆国 01331 マサチューセッツ州アーソルフェルンストリート 92 (72)発明者水本桂子北海道旭川市東４条５丁目Ｆターム(参考） 4B065 AA90 AB01 AC20 BA01 BA23 BB15 BB25 BB34 BD50 CA44 4C084 AA19 MA58 MA65 NA14 ZA021 ZA022 ZA331 ZA332 ZA961 ZA962 ZB112 ZB312 ZC611 ZC612 4C087 AA02 BB56 BB64 MA02 MA58 MA65 NA14 ZA02 ZA33 ZA96 ZB11 ZB31 ZC61 4C097 AA20 AA24 AA30 BB01 DD15 MM04 MM05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ドナー哺乳類の神経網膜から分離された網膜幹細胞。
【請求項２】ａ）体外で自体回復が可能であり、ｂ）ニューロン、星状細胞及び希突起膠細胞から構成される群のいずれかの細
胞類に分化することができ、ｃ）神経網膜内に合体して宿主の後眼部に移植することができ、及びｄ）網膜体外培養体上に移植された光受容体で分化または移植動物の目に分化す
ることができる、ドナー哺乳類の神経網膜から分離された網膜幹細胞。
【請求項３】網膜幹細胞はネスチンを発現して無色素である請求項１また
は２に記載の網膜幹細胞。
【請求項４】体外培養時、増殖のために培地内に少なくとも一つの外因性
の成長因子が存在するべく請求項１または２に記載の網膜幹細胞。
【請求項５】少なくとも一つの外因性の成長因子は上皮細胞成長因子（Ｅ
ＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦとＥＧＦの組合体、
及びＥＧＦ、ｂＦＧＦと、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）の組合体で構成さ
れる群から選択される成分である請求項５に記載の網膜幹細胞。
【請求項６】神経フィラメント蛋白質ＮＦ−２００の発現により証拠され
るようにニューロンに分化できる請求項１または２に記載の網膜幹細胞。
【請求項７】グリア繊維酸性蛋白質ＧＦＡＰの発現により証拠されるよう
に星状細胞に分化できる請求項１または２に記載の網膜幹細胞。
【請求項８】網膜上、網膜の体外培養体上、または成熟体の目の中に移植
された場合、ロドプシン、リカバリンまたは両方を全て発現する光受容体に分化
される請求項１または２に記載の網膜幹細胞。
【請求項９】病んでいる網膜中に組合せ及び再群集化できる請求項８に記
載の網膜幹細胞。
【請求項１０】哺乳類は胎児、新生児または成長した哺乳類である請求項
１または２に記載の網膜幹細胞。
【請求項１１】哺乳類は霊長類、鋸歯類または家畜である請求項１または
２に記載の網膜幹細胞。
【請求項１２】哺乳類は人、マウス、ラット、猫、犬、豚、牛、馬、猿、
または類人猿である請求項１または２に記載の網膜幹細胞。
【請求項１３】ａ）神経網膜組織をドナーの目から分離し、分離された神
経網膜組織は実質的に硝子体液や視神経頭組織、硝子体上皮組織、及び網膜色素
上皮組織等が存在する段階と、ｂ）神経網膜組織を細胞に分裂する段階と、ｃ）分裂された神経網膜由来の細胞を培養器内においける血清を含む１次培地
内で哺乳類細胞培養条件下に２４時間間培養する段階と、ｄ）培養器で１次培地を除去する段階と、ｅ）前記培養した神経網膜誘導の細胞を血清及びゲンタマイシンを含まれなく
て、少なくとも一つの成長因子を含む２次培地内で哺乳類の細胞培養条件の下に
維持する段階と、を含むドナー哺乳類の神経網膜からの網膜幹細胞の分離及び培
養方法。
【請求項１４】ａ）神経網膜組織をドナーの目から分離し、分離された神
経網膜組織は実質的に硝子体液や視神経頭組織、硝子体上皮組織、及び網膜色素
上皮組織等が存在する段階と、ｂ）分離された神経網膜組織を約１００マイクロ毛穴の大きさのナイロンメッ
シュスクリーンに通過して細胞に分裂させる段階と、ｃ）段階（ｂ）からの細胞の分取液を蛋白質層で被覆された培養器に入れる段
階と、ｄ）細胞分取液は所定量の１次細胞培地内で培養して約３５−３９℃で約２４
時間、また約４−６％ＣＯ_２雰囲気下で約１０００−１、０００、０００細胞/m
l範囲の細胞濃度を提供し、１次細胞培地はＤ−グルコースの含有量が約０.５−
２mg/リットルである平衡食塩水及び約５−１５％のウシ胎仔血清を含む段階と
、ｅ）２４時間後、１次培地を培養器から除去する段階と、ｆ）血清及びゲンタマイシンを含有しない２次培地を培養器に添加し、２次培
地はＤ−グルコース含有量が約０.５−２mg/リットルの生理学的平衡食塩水、成
長因子当たり３０−５０ng/mlの濃度を有する少なくとも一つの成長因子、有効
量の０.５−３mML−グルタミン、及びゲンタマイシンでない少なくとも一つの抗
生剤を有効量で含有する段階と、を含むドナー哺乳類の神経網膜からの網膜幹細
胞の分離及び培養方法。
【請求項１５】２−７日間隔で、培養器から死んだ細胞及び２次培地の一
部を定期的に除去し、除去された部分と同一な量の新しい２次培地に代替する段
階を更に含む請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】哺乳類は胎児、新生児または成長した哺乳類である請求項
１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】哺乳類は老化した哺乳類である請求項１３または１４に記
載の方法。
【請求項１８】培養器はプラスチック組織培養フラスコである請求項１３
または１４に記載の方法。
【請求項１９】蛋白質層はフィブロネクチンまたはラミニンで覆われたポ
リオルニチンを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】蛋白質層は網膜幹細胞が誘導される神経網膜組織として同
一な哺乳類がその起源である請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】生理学的平衡食塩水はダルベッコの必要最小培地Ｆ−１２
（Dulbecco's Minimal Essential Medium、ＤＭＥＭ/Ｆ−１２）である請求項１
４に記載の方法。
【請求項２２】神経前駆細胞−ならし培地はＮ２補充液である請求項１４
に記載の方法。
【請求項２３】少なくとも一つの外因性の成長因子は上皮細胞成長因子（
ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦとＥＧＦの組合体
、及びＥＧＦとｂＦＧＦの組合体と、また血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）か
ら構成される群から選択される成分である請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項２４】抗生剤は有効量のペニシリン、ストレプトマイシン、また
は両方である請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】哺乳類は緑色蛍光蛋白質を発現する形質転換マウスである
請求項１または２に記載の網膜幹細胞。
【請求項２６】クローン的に誘導される請求項１または２に記載の網膜幹
細胞。
【請求項２７】神経網膜由来の網膜幹細胞を哺乳類受容体の目に導入する
ことを含む発育異常の目の再集合化または治療方法。
【請求項２８】神経網膜由来の網膜幹細胞が網膜部位、サブ網膜空間、視
神経、硝子体腔、脳または脊髄の中に導入される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】哺乳類受容体に神経網膜由来の幹細胞の光受容体細胞への
分化を刺激させる物質を投与することを更に含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】哺乳類受容体に神経網膜由来の幹細胞のニューロンへの分
化を刺激させる物質を投与することをより含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】哺乳類受容体に神経網膜由来の幹細胞の星状細胞への分化
を刺激させる物質を投与することを更に含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】哺乳類受容体に神経網膜由来のあれた幹細胞の希突起膠細
胞への分化を刺激させる物質を投与することを更に含む請求項２７に記載の方法
。
【請求項３３】神経網膜由来の幹細胞がクローン的に誘導される請求項２
７に記載の方法。
【請求項３４】受容体は未成熟哺乳類または成熟した哺乳類からなる群か
ら選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】受容体が人、マウス、ラット、猫、犬、豚、牛、馬、猿、
または類人猿から構成される群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】前記ドナー及び受容体が異なる種類である請求項２７に記
載の方法。
【請求項３７】前記ドナー及び受容体の双がラットドナー及びマウス受容
体;マウスドナー及びラット受容体;豚ドナー及び人受容体の双から構成される群
から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】ドナー及び受容体が同一種類の請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】ドナー及び受容体が異質遺伝子型である請求項２７に記載
の方法。
【請求項４０】ドナー及び受容体が同質遺伝子型の請求項２７に記載の方
法。
【請求項４１】発育異常の網膜組織は光受容体の変性症;網膜分離;網膜外
傷; 光学病変; 黄斑円孔; 黄斑浮腫;夜盲症;色盲;虚血性網膜症;早産児網膜症;
感染;炎症性条件;及び視神経炎から構成される群れから選択される少なくとも一
つの結果である請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】前記発育異常の網膜組織は視神経障害の結果である請求項
２７に記載の方法。
【請求項４３】緑色蛍光蛋白質−発現性神経網膜由来の網膜幹細胞を受容
体哺乳類に移植することを含む網膜幹細胞の組合せ及び発育の体内研究方法。
【請求項４４】緑色蛍光蛋白質−発現性神経網膜由来の網膜幹細胞は緑色
蛍光蛋白質を発現した形質転換ドナーから得た請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】緑色蛍光蛋白質−発現性神経網膜由来の網膜幹細胞は緑色
蛍光蛋白質を発現する導入遺伝子をクローン的に得た、神経網膜由来の網膜幹細
胞株に挿入することによって誘導される請求項４３に記載の方法。