JPH10505754A

JPH10505754A - Ｃｎｓ機能及び機能障害インビトロモデル

Info

Publication number: JPH10505754A
Application number: JP8510484A
Authority: JP
Inventors: サミュエルワイス; ブレントレイノルズ
Original assignee: ニューロスフィアーズホウルディングスリミテッド
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 1998-06-09
Also published as: FI971168A; NO971245D0; FI971168A0; MX9702126A; AU3515295A; EP0783693A1; WO1996009543A1; DE69523771D1; ATE208495T1; CA2200709A1; ATE345496T1; EP0783693B1; ES2167461T3; DK0783693T3; DK1130394T3; DE69535300T2; AU714837B2; KR970706490A; EP1130394A1; EP1130394B1

Abstract

(57)【要約】増殖した多能性幹細胞及びそのプロゲニーを、神経の発達及び機能の研究並びに新規な治療剤及び他の生物学的薬剤のＣＮＳ効果の測定のためのＣＮＳモデルシステムを作成するために使用する。神経幹細胞は、出生前及び出生直後の個体の少量の正常または疾病に罹患したＣＮＳ組織から得られる。本発明は、多様性を制限するためにクローン的に誘導される大量の組織を比較的少量のＣＮＳ組織から得ることを可能にする。本発明は、ＣＮＳモデルシステム及び神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞を含むＣＮＳ細胞の多型を含む神経幹細胞の分化したプロゲニーについて述べる。このモデルを使用して、神経学的または他の生物学的薬剤の効果並びに正常または疾病にに罹患したドナーの多能性幹細胞及び幹細胞由来プロゲニーにおける遺伝子発現の分析を行ってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＮＳ機能及び機能障害インビトロモデル発明の背景成熟ヒト神経系は、発達時期において、神経管内にある少量の前駆体から発生する何兆個もの細胞から成る。中枢神経系（ＣＮＳ）の発達経路及び機能障害による成体哺乳類ＣＮＳに生じる変化の研究は、哺乳類ＣＮＳの複雑さのために困難であった。所定の条件下における比較的単純なＣＮＳモデルを使用して、そのような問題をより十分に研究することができる。一般に、培養ＣＮＳ細胞の研究には２種類の方法がとられていた。一つは一次神経培養の使用によるものであり、もう一つは神経細胞株を使用する方法である。一次哺乳類神経培養は、原料が胎児または出生後間もない動物から得られたものである場合には、ほとんど全ての脳領域から発生させることが可能である。一般に、神経細胞、星状膠細胞、または乏突起膠細胞のいずれかが豊富である、三種類の培養を得ることが可能である。一次ＣＮＳ培養は、神経機能の多くのメカニズムの発見に有用であることが知られ、発達及び成熟細胞において外から与える薬剤の影響を研究するために使用されている。一次ＣＮＳ培養は非常に多くの利点を有するが、欠点が二つある。第一に、第一神経細胞の抑制された増殖能のために、新しい培養を幾つかの異なる動物から発生させなければならない。組織を、同一の脳領域から発達の同一段階で得るには、通常細心の注意を必要とするが、同一の一次培養を得るのはほとんど不可能である。従って、培養間には多様性がかなりの割合で存在する。第二の一次培養の欠点は、組織を胎児または出生後間もない動物から得なければならないということである。もし、一次培養が定期的に行われるとすると、原料を大量に入手する必要がでてくる。これは、ある種（例えば齧歯類）の動物から一次培養を発生させる場合には通常問題ないが、ある場合（例えば霊長類）には問題である。制限された供給と倫理上の問題から、霊長類（ヒト及びヒトでない場合の両者を含む）からの一次細胞の培養は実際的ではない。一次神経細胞の制限された増殖能のため、神経機能、機能障害及び薬剤の設計／スクリーニングの研究のための大量の均一細胞の発生は行われていなかった。そのため、ＣＮＳ機能のインビトロ研究のための大量のプロゲニー(progeny)を発生し得る均一細胞の増殖が、細胞系を使用して研究された。神経細胞系の発生は、二種類のカテゴリーに分類することができる。即ち、１）自然発生ガン、及び２）慣習的にデザインされた(custom-designed)細胞系、である。自然発生ガンのうち、神経生物学において恐らく最も研究された細胞系は、神経成長因子（ＮＧＦ）に応答して交感神経様神経細胞に分化することができるラットクロム親和細胞腫(pheochromocytoma)（ＰＣ１２）細胞である。これらの細胞は、成長因子に応答して神経の発達及び変化（分子及び細胞）のメカニズムを研究するのに有用なモデルであることが判明した。神経芽細胞腫及びグリオーム細胞腫が、神経細胞及びグリア細胞機能を研究するために使用された(Lies，et al.，1987; Nister et al.，1988)。胚腫瘍(embryonal carcinoma)(ＥＣ) 細胞は、胎児生殖細胞の奇形腫瘍から誘導され、多数の非神経細胞型に分化する能力を有し (例えば、Ｐ１９細胞、Jones-Villeneuve et al.，1982)、幾つかの系は神経細胞に分化する能力を有する(McBurney et al.，1988)。ＣＮＳ神経前駆細胞に相似する表現型を有するヒト奇形腫瘍−由来細胞系（NTera 2/cl.D1）は、レチノイン酸の存在下において分化するように誘導することができる。しかし、分化した細胞は神経細胞表現型に限定される[Pleasure and Lee（1993），J．Ne urosci．Res．35: 585-602]。細胞系のこれらの型は、外与薬剤が細胞の生存または機能に与える効果をスクリーニングするための多数の細胞を発生することが可能であるが、その不滅化(immortalization)のため、アポトーシス（例えば、哺乳類細胞の自然にプログラムされた死）の研究への使用には適していない。さらに、これらの細胞系の型数の限定、発生することができる表現型数の限定及びこれらの不滅化の未知の性質（これは細胞の機能に不特定の方法で影響しえる）により、これらの細胞系の型は、神経機能のインビトロモデル及び新規な治療法の発見のための理想のものとはならない。他の自然発生細胞系へのアプローチは、細胞の遺伝子的作成(make-up)を変化させる発癌遺伝子を挿入し、それにより細胞を無制限に増殖させるように誘導することにより、一次細胞を意図的に不滅化する方法である。このアプローチは多数のグループにより、多数の興味ある神経細胞系を発生するのに使用されてきた (Bartlett et al.，1988; Frederiksen et al.，1988; Trotter et al.，1989; Ryder et al., 1889; Murphy et al.,1991; Almazan and McKay, 1992)。これらの細胞系は、細胞の決定及び分化の間に起こる決定(decision)の研究、及び外与薬剤の効果の試験に有効であることがわかったが、幾つかの欠点を有している。第一に、細胞の増殖状態を変化させる発癌遺伝子の添加は、細胞の他の性質に影響を与え得る（発癌遺伝子は、細胞周期の調整以外に細胞内で他の役割を果し得る）。これはAlmazan 及びMcKay(1992)の研究においてよく示されており、また（通常の視神経乏突起膠細胞前駆体がすることができる）II型の星状膠細胞に分化することができない視神経からの乏突起膠細胞前駆体の不滅化も記載されている。筆者らは星状膠細胞に分化するように細胞能を変化させ得る不滅化抗体の存在を示唆している。意図的に不滅化した細胞の使用による他の欠点は、神経系が何兆個もの細胞から成り、かつ何千もの異なる細胞型の可能性があり、各々が固有パターンの遺伝子発現及び環境に対する応答の固有の型を示していることに起因する。慣習的にデザインされた(custom-designed) 細胞系は、単一の前駆細胞の不滅化及びそのクローン的な拡張の結果である。一種の神経細胞型の大量の供給を行うことができるが、このアプローチは異なる細胞型間の細胞相互作用を考慮にいれない。さらに、所定の脳領域からの細胞を不滅化することは可能であるが、どの細胞が発癌遺伝子により変化を受けるかについてコントロールできないため、目的の細胞の不滅化は不可能である。そのため、慣習的にデザインされた細胞系は、自然発生腫瘍に対して２、３の利点を与えるが、幾つかの欠点を有しており、ＣＮＳ機能及び機能障害を理解するには理想的ではない。本願発明の要約ＣＮＳの発達及び機能の研究並びにＣＮＳ機能障害の可能性のある治療薬剤の効果の測定における使用のために、大量の遺伝的に改変されていない神経細胞を提供する従来技術の方法に伴う欠点のため、これらの目的に使用可能な改良されたＣＮＳモデルシステムが求められている。従って、本願発明の目的は、神経の発達及び機能の研究並びに新規な治療薬及び他の生物学的な薬剤のＣＮＳ効果の測定のためのＣＮＳモデルシステムを提供することにある。本願発明の目的は、そのようなＣＮＳシステムにより、ヒトを含みかつ成体を含む広範な年齢範囲に及ぶ様々な種から得られる比較的少量の原料から大量の細胞を産生させることを可能にすることである。本願発明の目的は、自然発生腫瘍ではなく、または無制限の増殖を誘導するために発癌遺伝子の挿入により意図的に不滅化した細胞ではない細胞を含むＣＮＳモデルシステムを提供することであり、それにより細胞の正常な機能における遺伝的改変の影響へのいかなる疑問点も除去することができる。他の目的は、細胞がクローン的に誘導され、従って、モデルの一つの使用から次の使用において(from one use of the model to the next use)変化の度合いが低い細胞集団であるようなＣＮＳモデルシステムを提供することである。本願発明の他の目的は、目的によって添加または除去することができる、外因性シグナル分子または分子の組み合わせに応答して細胞が増殖するＣＮＳモデルシステムを提供することである。他の目的は、増殖した細胞が未分化状態で維持され、及び望む時に、哺乳類ＣＮＳの３種類の主な細胞型（神経細胞、星状膠細胞、及び乏突起膠細胞）に分化させることができる、ＣＮＳモデルシステムを提供することである。本願発明の目的は、ＣＮＳ細胞の分化及び機能を複数の細胞型からなるシステム内でコントロールして研究することができる（インビボでおこる状況と同様である）、ＣＮＳモデルシステムを提供することである。本願発明のさらなる目的は、ＣＮＳ幹細胞が、成体を含む出生前及び出生直後の個体から産生することができ、個体ベースで試験を行うことを可能とする、ＣＮＳモデルシステムを提供することである。本願発明の目的は、ＣＮＳ幹細胞内及び正常ドナーの幹細胞−由来プロゲニー内並びに神経学的な疾患を患った患者の細胞内での遺伝子発現の分析を可能とすることである。さらに本願発明の目的及び特徴は、下記の詳細な記載及び特許請求の範囲から当業者らに明らかであろう。一つの実施態様において、本願発明の目的は、神経学的または他の生物学的な薬剤または神経学的及び／または他の生物学的な薬剤の組み合わせの、神経細胞への効果をスクリーニングする方法により達せられ、該方法は、少なくとも一種の多能性幹細胞を含む哺乳類の神経組織を分離すること、該分離多能性幹細胞を、幹細胞−産生前駆細胞の培養を得るために幹細胞を増殖する少なくとも一種の成長因子を含む培養とを接触させること、前駆細胞を生物学的な薬剤または薬剤の組み合わせと混合すること、及び該前駆細胞への生物学的薬剤の効果を測定することを含む。他の態様において、幹細胞を生物学的な薬剤の存在下に増殖し、幹細胞及びその増殖に対する生物学的な薬剤の効果を測定した。本願発明の他の態様において、哺乳類の神経組織は、神経学的な疾患または障害を患っているヒトドナーから得られたものである。本願発明のさらなる態様では、生物学的な薬剤または薬剤の組み合わせの存在下において、増殖した前駆細胞は分化するように誘導される。さらに、他の態様においては、幹細胞−産生プロゲニーは、生物学的な薬剤の添加の前に分化するように誘導される。図面の簡単な説明図１．上皮成長因子（ＥＧＦ）応答細胞の増殖：２日後、インビトロにおいてＥＧＦ−応答細胞は増殖を開始する（図１Ａ）。４日後、インビトロにおいて細胞の小さな塊（クラスター）が現れる（図１Ｂ）。継続して増殖する細胞の塊は大きくなり(grow in size)（図１Ｃ）、基質 (substrate)を持ち上げ、懸濁液中に浮かぶ（図１Ｄ）。この段階において、浮かんでいる球体は容易に除去することができ、単一の細胞に分離することができ、及びＥＧＦ存在下に、増殖を再度始めることがきる（棒線：５０μｍ）。図２．単−ＥＧＦ−産生球体由来の細胞の、神経細胞、星状膠細胞、及び乏突起膠細胞への分化：タンパク（ＭＡＰ−２）、グリア繊維状酸性タンパク（ＧＦＡＰ）及び０４（細胞表面抗体）を伴う微小管に対する抗体を伴う三重ラベル免疫細胞化学を、神経細胞（図２Ｂ）、星状膠細胞（図２Ｃ）及び乏突起膠細胞（図２Ｄ）の存在を、一次培養から誘導した単−ＥＧＦ−産生球体(図２Ａ) から検出するのに使用した（棒線：５０μｍ）。図３．線条体の星状膠細胞と共培養を行った神経球体(neurospheres)のラベリング：星状膠細胞のフィーダー層上に成育した８日後の神経球体の相コントラストが図３Ａに示されている。神経球体細胞のBrd-Uラベル化は、ほとんど全ての細胞がBrd-Uを取り込んだことを示している(図３Ｂ)。フィーダー層細胞の相コントラストストは図３Ｃに示されている。フィーダー層細胞のＧＦＡＰラベル化は、フィーダー層の大半の細胞が星状膠細胞であることを示している（ＧＦＡＰ −ＩＲ）（図３Ｄ）。分化が起こった後は、Brd-Uラベル化神経細胞（図３Ｅ及び図３Ｇ）は、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）（図３Ｆ）またはソマトスタチン（図３Ｈ）並びにグルタメート及びメセンケファリン（図には示されていない）のような他の神経伝達物質に対して免疫反応性である。図４．脳由来神経栄養性因子(Brain-derived Neurotrophic Factor)(ＢＤＮＦ )存在下における神経球体から産生される神経細胞数の増加：インビトロで１０日後における(ＤＩＶ)、単一のＥＧＦ応答幹細胞−産生神経球体からの神経細胞の平均数の定量化は、ＢＤＮＦが存在しない場合には、一つの神経球体当たり11 .46±1.21個の神経細胞が産生されたことを示した。ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）が培地に存在した場合には、有意に（ｐ＜0.5）多数の神経細胞が確認された（一つの神経球体当たり22.34±2.33個の神経細胞）。図５．ＢＤＮＦの存在下における増強された神経細胞外殖プロセス：１０ＤＩＶにおけるＢＤＮＦの非存在下（図５Ａ）及びＢＤＮＦの存在下（図５Ｂ）において成育した神経球体を固定し、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の抗血清による間接的な免疫細胞化学により処理を行った。ＢＤＮＦの存在下に成育した神経細胞の大多数は長い神経突起を伸長し、かつＢＤＮＦ非処理神経球体と比較して、長大で複雑な分岐パターンを示した。図６．神経球体内の選択的細胞個体群によるＢＤＮＦへの応答：即時−初期(i mmediate-early)遺伝子産物であるシー−フォス(c-fos)の間接的免疫細胞化学から、増加したc-fos免疫反応性をアッセイすることにより、単一クローン由来神経球体内の殆ど全ての細胞がＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）刺激に対して応答性であることが明らかである（図６Ａ）。核抗原c-fosへの抗血清及び神経細胞特異的抗原β−チューブリンに対する抗体による二重ラベル免疫細胞化学は、ＢＤＮＦに６０分間接触させると、主にβチューブリン抗血清により決定された神経細胞個体群内に、c-fosの選択的発現を起こすことを示している（図６Ｂ及び６Ｃ）。図７．ＥＧＦ−産生神経球体の増殖における塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び骨形態発生タンパク（Bone Morphogenic Protein）２（ＢＭＰ−２）の効果：１４日後の胚性マウスの線条体から単離した細胞を９６ウェルプレート内に、25,000細胞／ｍｌの密度で、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ＋ｂＦＧＦ（各２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ＋ＢＭＰ−２（各々２０及び１０ｎｇ／ｍｌ）存在下にプレートした。１０ＤＩＶ後、ＥＧＦ処理培養の定量化を行ったところ、１ウェル中23±1.33神経球体が産生した（ｎ＝８）ことを示した。ｂＦＧＦにより増強されたＥＧＦ刺激による増殖により、１ウェル中54.5±2.17神経球体に増加した（ｎ＝８）。一方、ＢＭＰ−２はＥＧＦに応答する幹細胞の増殖を阻害した（ｎ＝８）。図８．未分化及び分化幹細胞−由来プロゲニーにおける成長因子転写物の検出を示すＵＶ透過法により視覚化したエチジウムアガロースゲル：各パネルの第一レーンは１ｋｂの標準分子量ラダー（ladder）を示している。Ｃでラベルされた第二のレーンは、ｃＤＮＡテンプレートが存在しないＰＣＲを示すネガティブコントロールである。Ｕでラベルされた第三のレーンは、未分化の神経球体のＲＴ −ＰＣＲである。Ｄでラベルされた第四のレーンは、分化した幹細胞由来プロゲニーのＲＴ−ＰＣＲである。上皮成長因子受容体、繊維芽細胞成長因子受容体及び白血病抑制因子受容体の存在は、それぞれＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ及びＬＩＦ −Ｒにより示される。図９．ｂＦＧＦ−産生神経細胞の電気生理学的性質：パッチレコーディング(p atch recording)前の二極形態(bipolar morphology)を示す推定神経細胞のデジタル画像が図９Ａに示されている。図９Ｂは同じ神経細胞の、パッチ電極を停止する前の５−カルボキシフルオレセインで満たした蛍光デジタル画像を示している。図９Ｃは、図９Ａ及び図９Ｂに示されるｂＦＧＦ−産生神経細胞における、電流注入により引き起こされた勾配のついた作用ポテンシャル(graded action p otential）を示す。発明の詳細な説明中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞（ここでは“ＣＮＳ幹細胞”と呼ぶ）が報告されており、その可能性のある使用が記載されている（Reynolds and Weiss,S cience 255:1707[1992]; Reynolds et al.，J．Neurosci．12:4565[1992]; Reyn olds and Weiss，Restorative Neurology and Neuroscience 4:208[1992]; Reyn olds and Weiss，Neuronal Cell Death and Repair，ed．Cuello[1993];）。“ 幹細胞”という用語は、胚組織、幼年組織、または成体組織から得ることができる比較的静止の未分化の細胞を意味し、大量のプロゲニーの産生と共に増殖及び自己保存が可能なものである。神経幹細胞の有用性は次の出願特許に記載されている(U.S.S.N．08/270,412; 07/961,813; 08/221,655; 08/010,829;及び08/149, 508）。他の哺乳類組織において見いだされる幹細胞と同様に、ＣＮＳ幹細胞は幹細胞の重要な性質である自己保存を示す。細胞内での自己保存とは、細胞がそのクローンを産生することができ、そのため、延長した期間を越えて表現型を維持できることを意味する。幹細胞プロゲニー（stem cell progeny）という用語はここでは、“前駆細胞 ”を意味し、二種類の型の細胞からなる。即ち、ａ）新しい幹細胞、及びｂ）機能細胞に分化することができる前駆細胞、である。 “前駆細胞(progenitor cell)”という用語はここでは、ＣＮＳ幹細胞から誘導された未分化の細胞を意味する。前駆細胞は制限された増殖能を有し、自己更新をすることはできない。これは分化の特定経路に関連し、適当な条件において、ＣＮＳ内に存在する異なる細胞型に分化する；これらは神経細胞及びグリア細胞を含む。グリア細胞型は星状膠細胞及び乏突起膠細胞を含む。 “乏突起膠細胞(oligodendrocyte)”という用語は、中枢神経系（ＣＮＳ）において軸索を取り囲むミエリンを形成する、分化したグリア細胞を意味する。乏突起膠細胞はガラクトセレブロシド（＋）、ミエリン塩基性タンパク（＋）及びグリア繊維芽細胞産生タンパク(−)〔ＧｌａＣ（＋）、ＭＢＰ（＋）、ＧＦＡＰ（−）〕である。“星状膠細胞(astrocyte)”という用語は、フラットな原形質／繊維芽細胞一様の形態を有することができ、または星状突起を有する形態を示す、ＧＦＡＰ（＋）、ＧａｌＣ（−）及びＭＢＰ（−）である分化したグリア細胞を意味する。“神経細胞”という用語は、神経細胞特異的エノラーゼ（＋）、神経フィラメント（＋）、微小管を伴うタンパク（＋）、Ｔａｕ−１（＋）、またはβ−チューブリン (＋)〔ＮＳＥ (＋)、ＮＦ (＋)、ＭＡＰ−２ (＋)、Ｔａｕ−１ (＋)またはβ−Ｔｕｂ (＋)〕の表現型を有する分化した神経細胞を意味する。従って、この明細書において“神経幹細胞”または“ＣＮＳ幹細胞”という用語は、増殖してより多くの多能性幹細胞並びに神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞に分化する前駆細胞を産生することのできる多能性幹細胞を意味する。神経幹細胞は、下記の実施例１及び上記に記載した出願特許に記載された方法で、哺乳類ＣＮＳからインビトロにおいて、単離及び培養することができる。簡単に述べると、哺乳類（例えば、ヒト、サル、ラット、マウス等）組織から得られた幹細胞を、所定の血清を含まない培地で少なくとも一種の成長因子の存在下に成育させる。“成長因子”という用語はタンパク、ペプチドまたは幹細胞及び／または前駆細胞に対して成長、増殖、分化または異化作用を有する他の分子を意味する。増殖を誘導するために使用されてもよい成長因子としては、細胞を増殖する全ての因子が挙げられ、細胞表面の受容体に結合して細胞の成長−誘導または生存効果を及ぼす全ての分子が挙げられる。そのような因子としては、酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びＦＧＦ−２として知られるｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ−様リガンド、アンフィレグリン(amphiregu lin)、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦα）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、繊毛(cillary)栄養性因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来栄養性因子（ＧＤＮＦ）、インスリン−様成長因子（ＩＧＦ−１）等が挙げられる。好ましい成長因子はＥＧＦである。また、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びbＦＧＦの組み合わせも好ましい。増殖の促進以外の細胞における調整作用を有する、幹細胞及び前駆細胞の発達を調整するために使用される成長因子としては、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、レチノイン酸、アクチビン(activin)、骨形態発生タンパク（ＢＭＰ）、繊毛栄養性因子（ＣＮＴＦ）及びマクロファージ炎症性タンパク（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ− ２）が挙げられる。成長因子存在下において、多能性幹細胞は分断されるように誘導され、ここで “神経球体”と呼んでいる未分化の細胞のクラスターを生じる。神経球体は第一に多能性幹細胞及び前駆細胞からなる。一まとめにして、神経球体の細胞をここでは“前駆細胞”と呼ぶ。インビトロにおいて、前駆細胞は典型的には神経球体の形状で成育するが、培養の条件及び技術によって異なる成育パターンを示してもよい。第一に、神経球体細胞はＧＦＡＰ、ＮＦ、ＮＳＥまたはＭＢＰに対して免疫反応性ではない。しかし、細胞は、未分化ＣＮＳ細胞において見いだされる中間フィラメントタンパクである、ネスチン (＋)表現型である。ネスチンマーカーは、レーンダール等(Lehndahl et al.，Cell 60: 585-595(1990))により報告された。神経球体細胞のプロゲニーから分化し得る細胞型を伴う成熟表現型はネスチン表現型に対して陰性であり、優位である。ＥＧＦ等のようなマイトジェンの継続的な存在下において、神経球体内の前駆細胞は継続して分裂し、神経球体のサイズ及び未分化細胞〔ネスチン (＋)、ＧＦＡＰ（−）、ＮＦ (−)、ＮＳＥ (−)、ＭＢＰ (−)〕の数が増加する。この段階において、細胞は非接着性であり、及び神経球体のフリー−フローティングクラスター(free-floating clusters)を形成する傾向にある。６〜７ＤＩＶ後、神経球体細胞は解離することができる。ほとんど全ての細胞が組織培養基に付着する。成長因子の継続した存在下において、幹細胞は分裂を始め、クローン性由来細胞からなる新しいフリー−フローティング神経球体を形成する基体を持ち上げる(lift off)。従って、この増殖、解離及び増殖の再開始の方法を使用して、無制限数のクローン由来前駆細胞をインビトロで発生させることができる。マイトジェン成長因子の除去によって、幹細胞の増殖は停止する。未分化の細胞の球体は、ポリオルニチン処理プラスチックまたはガラスからなるような基体に接着することができ、そこで細胞は神経細胞及びグリア細胞に分化し始める。このように、成長因子は、増殖限度をコントロールする目的によって添加または除去することができる外因性シグナル分子として作用する。マイトジェン成長因子を除去すると、成長因子応答幹細胞プロゲニーはフィーダー層上で共培養することができる。繊維芽細胞、神経細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、癌細胞系、遺伝子的改変細胞系または生物活性な性質の如何なる細胞または基体(substrate)のような、フィーダー層の多くの型を使用してもよい。フィーダー層は一般により広範な表現型を生産する。この例として、フィーダー層は、結合する両方の膜の基体及び起源並びに幹細胞−産生プロゲニーの分化を誘導及び改変する溶解因子として作用する。ポリ−Ｌ−オルニチンのようなより不活性の物質と比較して、例えば、星状膠細胞フィーダー層は、７ＤＩＶにおける間接的な免疫細胞化学法により決定されるように、より広範な神経細胞表現型を誘導する。１％胎児ウシ血清を含むポリ−Ｌ−オルニチン被膜化基体上で分化した場合には、神経細胞表現型はほとんどＧＡＢＡergicまたはSubstance Pergi cである。星状膠細胞フィーダー層上で分化した場合には、ＧＡＢＡergicまたは Substance Pergic神経細胞に加えて、ソマトスタチン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、グルタメート及びメット−エンケファリン（met-enkephalin）含有神経細胞が存在する。星状膠細胞は、線条体、皮質及び脊髄のような様々な脳領域から得られる組織から誘導することができる。成長因子を一旦除去したならば、培地は0.5−1.0％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）のような血清を含んでいてもよい。血清は、特に分化細胞が低密度で成育する場合に、分化のプロセスを支持し、かつ細胞の生存を増強する傾向にある。成長因子を除去し、細胞を分化及び生存を支持する条件に置いた後１〜３日以内に、ほとんどまたは全ての前駆細胞はネスチンに対する免疫応答性を喪失し、神経細胞、星状膠細胞または乏突起膠細胞に特異的な抗原を発現し始める。神経細胞の同定は、ＮＳＥ、ＮＦ、β-tub、ＮｅｕＮ（核抗原）、ＭＡＰ−２及び神経細胞特異的タンパクＴａｕ−１に対する免疫反応性を用いて確認した。星状膠細胞及び乏突起膠細胞は、ＧＦＡＰ及びＧａｌｃ各々に対する免疫反応性を用いて同定した。神経細胞または星状膠細胞に特異的な抗原を発現しない細胞は、乏突起膠細胞に特異的なマーカーを、一時的に(in a correct temporal fashion) 発現し始める。即ち、細胞は最初にＯ４（細胞表面抗原）、Ｇａｌｃ（ミエリングリコリピッド）及び最後にＭＢＰに対して免疫反応性となる。これらの細胞はまた、特徴的な乏突起膠細胞形態を有している。神経細胞はまた、その特異的な神経伝達物質表現型とその形態分析に基づいて同定することができる。単一、二重または三重ラベル化した免疫蛍光法及び免疫パーオキシダーゼ法を使用して、分化した神経球体培養を神経伝達物質の発現について、またはある場合においては神経伝達物質の合成に関与する酵素について分析することができる。または、in situハイブリダイゼーション組織化学（法）を、ペプチド神経伝達物質に特異的なｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブまたは神経伝達物質合成酵素ｍＲＮＡを使用して行うことができる。特異的表現型の同定を増強するためにこれらの技術と免疫細胞化学法とを組み合わせることが可能である。もし必要な場合には、上記に述べた抗体及び分子プローブを、細胞同定のために、ウエスタンまたはノザンブロット法にそれぞれ適用することが可能である。胚ＣＮＳの領域からＥＧＦ−応答性幹細胞を単離することが可能であることに加えて、ＣＮＳ幹細胞はまた、様々な幼若及び成体ＣＮＳ領域から、定常のバイオプシー法を使用して単離することができる。上記バイオプシー法としては、脊髄円錐、頸部、胸部及び腰部脊髄、脳幹、視床下部及び線条体を含む。これらのそれぞれのケースにおいて、単離されたＣＮＳ幹細胞は自己保存を示し、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞に分化する大量の前駆細胞を産生する。このように、多能性幹細胞は成体哺乳類ＣＮＳの複数の領域に存在する。ＣＮＳ幹細胞はまた、機能障害ＣＮＳ組織（例えばアルツハイマー症、パーキンソン病またはダウン症候群に罹患した組織）から単離することができる。上記に述べた前駆細胞は、神経細胞への生物学的薬剤の効果を測定する方法において使用することができる。“生物学的薬剤”という用語は、ウィルス、タンパク、ペプチド、アミノ酸、リピッド、炭化水素化合物、核酸、ヌクレオチド、薬剤、プロドラッグまたは他の物質で、神経細胞に効果を有する（その効果が危険であるか、有用であるかまたはその他の場合でも）ような薬剤である。神経細胞に有用な生物学的薬剤をここでは“神経系薬剤(neurological agents)”と呼び、この用語は、ＣＮＳ細胞の増殖、生存、分化及び／または機能または神経系疾病または障害に非常に有効である可能性のある生物学的または薬学的に活性な全ての物質を含む。例えば、この用語は、特定の神経伝達物質、神経伝達物質受容体、成長因子、成長因子受容体等及びこれらの薬剤の合成に使用される酵素を含んでもよい。神経細胞に対して可能性のある生物学的薬剤の効果を測定するために、ＣＮＳ疾病または障害に罹患するホストから得られた多機能幹細胞由来の前駆細胞の培養、または正常組織から得られる培養を使用することができる。培養の選択は、試験される薬剤及び達成すべき効果に依存する。目的のドナー組織から細胞が得られたならば、これらは成長因子の存在下においてインビトロで増殖される。生物学的薬剤の、幹細胞及び前駆細胞の増殖及び生存における効果は、実施例１に従って成育させた細胞を使用して測定される。例えば、これらの方法を使用して、移植目的のための大量の細胞の産生に有用である前駆細胞の増殖能を増加させる生物学的薬剤のスクリーニングを行うことが可能である。また、前駆細胞の増殖を抑制する生物学的薬剤のスクリーニングを行うことも可能である。これらの研究において、前駆細胞を目的の生物学的薬剤の存在下に置き、その増殖の割合をアッセイする（実施例４）。生物学的薬剤またはその組み合わせの、前駆細胞及びそのプロゲニーの分化及び生存における効果を測定することができる（実施例３）。スクリーニングを行う前に、分化をすでに誘導した神経細胞のスクリーニングを行うことが可能である。また、分化する前に前駆細胞に適用することにより、分化プロセスにおける生物学的薬剤の効果を測定することも可能である。一般に、生物学的薬剤は、溶解して、各投与量における薬剤の効果を測定するために様々な濃度で培地に添加される。培地は、薬剤の濃度を一定に維持するように２、３日毎に薬剤を補充してもよい。これらのスクリーニング法を使用して、幹細胞及び前駆細胞の増殖並びに前駆細胞の分化または分化したＣＮＳ細胞の生存及び機能における効果を試験することにより、出生前及び出生直後のＣＮＳ細胞における薬剤の副作用の可能性をスクリーニングすることが可能である。増殖した前駆細胞を典型的には約５〜１０ ×１０⁶細胞／ｍｌの密度でプレート(plate)する。特定の分化した細胞型または特定の細胞の構成(make-up)における生物学的薬剤の効果を試験することが望ましい場合には、分化の後に得られたグリア細胞に対する神経細胞の割合を異なる細胞型を分離することにより操作することができる。例えば、Ｏ４抗体（ベーリンガーマンハイムから入手可能である）は乏突起膠細胞及びその前駆体に結合する。選り分け(panning)工程を使用して、乏突起膠細胞を分離する。ＲＡＮ２抗体を使用して結合工程の後、星状膠細胞を選別することができる（ＡＴＣＣから入手可能である）。破傷風毒素（ベーリンガーマンハイムから入手可能である）を神経細胞の選択に使用することができる。分化の期間に使用される培地に添加される栄養因子を変化させることにより、表現型の比率を意図的に変化させることが可能である。そのような栄養因子としてはＥＧＦ、ＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦα、ＧＤＮＦ等が挙げられる。例えば、出願中の米国特許出願(U .S.Ser.No.08/221,655)に記載されているように、ＦＧＦは神経細胞の比率を増加させ、及びＣＮＴＦは乏突起膠細胞の比率を増加させる。異なるＣＮＳ領域から得られたグリア細胞層上の培養の成育は、上記に述べたように、分化の工程にも影響する。出願中の米国特許出願(U.S.Ser.No.08/482,079)に記載される方法を使用してドーパミン様神経細胞が豊富な培養を得ることもできる。これらの培養は、ドーパミン様細胞の機能及び生存に影響を与える生物学的薬剤を試験するために使用することができる。培養条件はまた、コリン作動性神経細胞の数を増加するために使用することができる。分化した培養は、少なくとも１ヶ月は生存する（表現型はそのまま残存する）。アルツハイマー症、パーキンソン病、ダウン症候群等に罹患した患者由来の異常ＣＮＳ組織から得られた培養は、異常組織における生物学的薬剤の効果を試験するために使用することができる。例えば、パーキンソン病に罹患した患者から得られた培養はドーパミン作動性細胞の誘導試験に使用できる。アルツハイマー病またはダウン症候群の患者から得られた培養は、これらの患者において異常に高いアミロイド前駆プロテイン（ＡＰＰ）レベルへの生物学的薬剤の影響を測定するために使用することができる。さらに、コリン作動性関連障害であるアルツハイマー病の患者から得られた組織は、コリン作動性神経細胞の誘導における生物学的薬剤の効果を試験するために使用することができる。生物学的薬剤の効果を時間間隔をおいてモニターし、発現された表現型の比率（神経細胞：グリア細胞、または神経伝達物質または他のマーカー）、細胞生存度（cell viability）、増殖、遺伝子発現における改変、及び／またはアポトーシスの限度のような基準に関する培養のコントロールに関連した重要な差異をベースとして評価する。細胞の物理的性質は、細胞及び神経突起の形態及び成育を顕微鏡で観察することにより分析することができる。酵素、受容体及び他の細胞表面分子のようなタンパク或いは神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド及び生体アミンの新規なまたは増加したレベルの発現の誘導を、そのような分子のレベルの改変を同定し得る既知の当業技術によって分析することができる。これらの技術としては、そのような分子に対する抗体を使用した免疫組織化学または生化学的分析を含む。そのような生化学的分析としては、タンパクアッセイ、酵素的アッセイ、受容体結合アッセイ、酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）、ウェスタンブロット法及びラジオイムノ法（ＲＩＡ）が挙げられる。ノザンブロット及びポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸分析法は、これらの分子またはこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを測定するために使用することができる。ゲノミックＤＮＡを、標準の方法を用いて定量化し、アポトーシスの兆候であるＤＮＡラダリング(laddering)の範囲を分析することができる（例えば、酵素特異的ＤＮＡ分断）。幹細胞の増殖並びに幹細胞プロゲニーの増殖、分化及び生存、及び／または生物学的薬剤への応答に関する因子を、既知の当業技術を用いて、発達の異なる段階における幹細胞または幹細胞プロゲニーからのｃＤＮＡライブラリーを構築することにより単離することができる。一つの発達段階における細胞からのライブラリーを、発達の異なる段階の細胞のそれと比較して、発達の期間における遺伝子発現の過程を決定し、様々な生物学的薬剤の効果またはＣＮＳ細胞における遺伝子発現を改変する新しい生物学的薬剤を明らかにする。ライブラリーが機能障害組織から得られた場合には、遺伝子的因子は、正常組織由来と機能障害組織由来のライブラリーを比較することにより機能障害の原因における役割を同定してもよい。この情報を障害治療の治療法設計に使用することができる。さらに、プローブを様々な遺伝的障害の診断における使用または発達における特定の段階の神経細胞の同定における使用のために同定することができる。電気生理学的分析を、生物学的薬剤の神経細胞特性（例えば静止膜電位、誘発電位、電流の方向及びイオン的性質並びにイオンチャンネルの動力学）における効果を決定するために使用することができる。これらの測定は、細胞外単一ユニット電圧記録、細胞内電圧記録、電圧固定(voltage clamping)及びパッチクランプ(patch clamping)を含む当業技術を使用して行うことができる。また、電圧感受性色素、及びイオン感受性電極を使用してもよい。本願発明のより完全な理解のために、以下の実施例を記載する。これらの実施例が単に例示する目的のためのものであって、本願発明の観点を制限するものではないことは理解されるべきである。実施例１前駆細胞の増殖１４日の胚（Ｅ１４）ＣＤ₁アルビノマウス（チャールズリバー）を断頭し、脳及び線条体(striata)を無菌方法を用いて除去した。組織を、口焼きしたパスツールピペットを用いて、血清を含まない、ダルベコ改質イーグルス培地（ＤＥＭＥ）及びＦ−１２栄養混合物（ギブコ）の１：１混合物からなる培地に機械的に分離した。細胞を８００r.p.mで５分間遠心分離を行い、上澄み液を吸引し、細胞を計測するために、再びＤＭＥＭ／Ｆ−１２に懸濁した。細胞を血清を含まず、グルコース（0.6％）、グルタミン（２ｍＭ）、炭酸水素ナトリウム（３ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（４−〔２−ヒドロキシエチル〕−１−ピペラジンエタンスルホン酸）バッファー（５ｍＭ）及びインスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレスシン（６０μＭ）及びセレニウムクロリド(３０ｎＭ)(グルタミン〔ギブコ〕を除き全てシグマから得られる)を含む所定のホルモン混合物及び塩混合物（血清を置換する）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）からなる培地（以下“完全培地”と呼ぶ）に懸濁した。さらに、培地は、１６〜２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ(マウスの下顎腺から精製したもの、コラボレイティブリサーチ(Collabor ative Reserach))またはＴＧＦα（ヒト組み換え体、ギブコ）を含有した。細胞は0.2×１０⁶細胞／ｍｌの密度で７５cm²の組織培養フラスコ（コーニング）内に、前処理した物質は何も加えず、プレートし、３７℃、湿度１００％、９５％空気／５％ＣＯ₂の条件下のインキュベーター内においた。細胞が、インビトロにおいて最初の４８時間以内及び３〜４日（ＤＩＶ）後迄に増殖した時、それらは神経球体として知られる小さなクラスターを形成しており、これは４〜６ＤＩＶの間に基質を持ち上げた（図１）。神経球体は未分化の前駆細胞（例えば、幹細胞及び前駆細胞(progenitor cell)）を含む。７ＤＩＶ後、神経球体を除去し、４００r.p.m.で２〜５分間遠心分離を行い、ペレットを、口焼きしたガラス製のパスツールピペットを使用して機械的に個々の細胞に２ｍｌの完全培地中に分離した。１×１０⁶個の細胞を２０ｍｌのＥＧＦ含有完全培地を含んだ７５cm²の組織培養フラスコ内に再度プレートした。幹細胞の増殖及び新しい神経球体の形成が再び始まった。この工程を６〜８日毎に繰り返すことができる。実施例２神経球体の分化神経球体を以下の方法を用いて分化した。以下のパラダイムを使用することにより、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞が産生される。しかし、特定の成長因子または成長因子の組み合わせは分化の後に得られる表現型の比率を改変する。さらに、グリアフィーダー層の使用は得られる表現型の比率に影響を与えることができる。以下の各パラダイムにおいて使用される神経球体は実施例１に述べられたように産生された。使用される全ての神経球体は分化の前に少なくとも一回継代(pass)された。パラダイム１…神経球体の迅速な分化第一の継代の後６〜８日後に、神経球体を除去し、４００r.p.m.で遠心分離を行った。ＥＧＦ−含有上澄み液を除去し、ＥＧＦを含まず、１％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含む完全培地内にペレットを懸濁した。神経球体（およそ0.5-1.0×１０⁶細胞／ウェル）を、２４ウェルヌクロン（Nu clon）（1.0ｍｌ／ウェル）培養皿内のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化（１５μｇ／ｍｌ）カバーガラス上にプレートした。２４時間培養後、カバーガラスを、0. 5％ＦＢＳを含む完全培地を含有する１２ウェル(コスター(Costar))培養皿に移動した。培地を４〜７日毎に変えた。この分化方法を“迅速分化パラダイム” またはＲＤＰと呼ぶ。パラダイム２…解離した神経球体の分化第一の継代の後６〜８日後に、神経球体を除去し、４００r.p.m.で遠心分離を行った。ＥＧＦ−含有培地を除去し、ＥＧＦを含まず、１％ＦＢＳを含む完全培地内にペレットを懸濁した。神経球体を機械的に、口焼きしたガラス製のパスツールピペットを使用して単一の細胞に分離し、８００r.p.m.で５分間遠心分離を行った。0.5×１０⁶〜1.0×１０⁶個の細胞を、２４ウェルヌクロン(Nuclon)（1. 0ｍｌ／ウェル）培養皿内のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化（１５μｇ／ｍｌ）カバーガラス上にプレートした。ＥＧＦを含まない、１％ＦＢＳを含む培地を４〜７日毎に変えた。パラダイム３…単一神経球体の分化神経球体をＥＧＦがフリーとなるように、継続的にＥＧＦを含まない培地を取り替えることにより洗浄した。各々の神経球体を、２４ウェルプレート内のポリ −Ｌ−オルニチン被膜化（１５μｇ／ｍｌ）カバーガラス上にプレートした。使用された培地は、１％ＦＢＳを含む完全培地かまたは含まない完全培地であった。培地を４〜７日毎に変化させた。三重ラベル免疫細胞化学により、全ての３種類の神経細胞型（即ち、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞）は、単一の神経球体からクローン的に誘導されることが明らかになった（図２）。パラダイム４…単一解離神経球体の分化神経球体をＥＧＦがフリーとなるように、継続的にＥＧＦを含まない培地を取り替えることにより洗浄した。単一の神経球体を、0.5ｍｌのエッペンドルフ遠沈管内に分離し、全ての細胞をポリ−Ｌ−オルニチン被膜化３５ｍｍ培養皿内にプレートした。１％ＦＢＳを含む完全培地かまたは含まない完全培地を使用した。パラダイム５…線条体星状膠細胞と共に培養した神経球体の分化実施例１に記載した線条体細胞由来の神経球体を５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）でラベル化し、ＥＧＦを含まないように洗浄した。星状膠細胞フィーダー層が出生直後のマウス（0-24時間）の線条体組織から産生され、２４ウェル培養皿内のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化カバーガラス上にプレートした。星状膠細胞が融合性である場合には、解離または無傷神経球体を各星状膠細胞層上に置いた。完全培地を最初の２４時間後に変え、次に４８時間毎に変えた。星状膠細胞フィーダー層上で分化した場合には、ＧＡＢＡergic及びSubstance Pergic 神経細胞に加えて、ソマトスタチン、ＮＰＹ、グルタメート及びメセンケファリン−含有神経細胞が存在した（図３）。実施例３様々な効果に対する薬剤または他の生物学的薬剤のスクリーニングＡ．ＢＤＮＦの神経細胞及びグリア細胞の分化及び生存における効果前駆細胞を実施例１に記載したように増殖させ、実施例２に記載のパラダイム３を用いて分化した。ＥＧＦ産生細胞をプレートする際に、ＢＤＮＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。インビトロにおいて３、７、１４及び２１日後（ＤＩＶ）に細胞の間接的な免疫細胞化学を行った。ＢｒｄＵラベル化を前駆細胞の増殖をモニターするために使用した。ＢＤＮＦの神経細胞、乏突起膠細胞及び星状膠細胞に対する効果を、神経細胞（ＭＡＰ−２、ＮＳＥ、ＮＦ）、乏突起膠細胞（Ｏ４、ＧａｌＣ、ＭＢＰ）または星状膠細胞（ＧＦＡＰ）上で見られる抗原を認識する抗体を用いて培養をプローブ(probing)することによりアッセイした。細胞の生存を各時間点の免疫反応細胞の数を計測することにより測定し、及び形態学的観察を行った。ＢＤＮＦは、コントロール条件下における観測数に対して、有意に神経細胞の分化及び生存を増加させた（図４）。星状膠細胞及び乏突起膠細胞数はコントロールの値から有意に変化しなかった。Ｂ．ＢＤＮＦの神経表現型の分化における効果Ａ部に記載される方法に従いＢＤＮＦにより処理された細胞を、神経伝達物質または神経伝達物質の合成に関与する酵素を認識する抗体によりプローブした。これらはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、サブスタンスＰ、ＧＡＢＡ、ソマトスタチン及びグルタメートを含む。コントロール及びＢＤＮＦ−処理培養条件の両方において、試験を行った神経細胞はサブスタンスＰ及びＧＡＢＡの存在に対し陽性であった（図５）。個数が増加すると同時に、ＢＤＮＦ内で成育した神経細胞は、コントロール実施例と比較して神経突起の伸長及び分岐において劇的に増加を示した（図６）。Ｃ．成長因子応答細胞の同定成長因子処理に応答性の細胞を、実施例２のパラダイム３の記載に従い、かつＩＤＩＶにおいておよそ１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを添加することによってＥＧＦ産生プロゲニーを分化して同定した。神経細胞（ＭＡＰ−２、ＮＳＥ、ＮＦ）、乏突起膠細胞（Ｏ４、ＧａｌＣ、ＭＢＰ）または星状膠細胞（ＧＦＡＰ）を認識する抗体をｃ−ｆｏｓ及び／または他の即時−初期(immediate early)遺伝子を認識する抗体と組み合わせて使用した。ＢＤＮＦへの接触は、神経細胞内のｃ−ｆｏｓの発現における選択的増加を起こす（図６）。Ｄ．増殖及び分化の間のマーカー及び調整因子の発現におけるＢＤＮＦの効果Ａ部に記載される方法に従いＢＤＮＦにより処理された細胞を、実施例５に記載されるようにＦＧＦ−Ｒ１の発現の分析、または実施例６に記載されるように他のマーカーまたは調整因子の発現の分析を行った。Ｅ．分化の間における、神経細胞の電気生理学的性質へのＢＤＮＦ投与の効果Ａ部に記載の方法に従い、分化の間にＢＤＮＦ処理を行った神経細胞を実施例７に記載されたようにその電気生理学的性質の測定を行った。Ｆ．成長因子産生幹細胞プロゲニーの増殖、分化及び生存におけるクロルプロマジンの影響精神病の治療に広く使用されるクロルプロマジンを上記の実施例３Ａ〜３ＥにおけるＢＤＮＦの代わりに、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。薬剤の様々な濃度における、幹細胞の増殖及び幹細胞プロゲニーの分化及び生存に対する効果を計測する。遺伝子発現の変化及び分化した神経細胞の電気生理学的性質を測定する。Ｇ．ドーパミン様細胞の分化及び生存におけるデプレニルの影響一次培養を実施例１に記載の方法に従い調製する。細胞を分化しドーパミン様神経細胞の数を増加させる。単一の未解離６日後の一次産生神経球体を、ラットＢ−４９グリア細胞系誘導調製培地（７５％）＋２０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ−２を含む完全培地中のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化カバーガラス上にプレートし、３７ ℃、湿度１００％、９５％空気／５％ＣＯ₂という条件下で培養した。パーキンソン病の治療に使用されるデプレニルを、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、分化の始め及び／または一度分化が起こった段階で培養に加える。生存するドーパミン様細胞数を間隔をおいて計測し、コントロール培養と比較する。さらに、神経伝達物質発現を測定する生化学的アッセイ及び核酸分析を行う。実施例４幹細胞増殖アッセイ一次細胞をＥ１４マウスから得て、実施例１の記載に従い調製した。ＥＧＦ、ＥＧＦ及びＦＧＦ、またはＦＧＦ及びＢＭＰ−２のいずれかを、各成長因子２０ｎｇ／ｍｌの濃度において、完全培地に加えた（ただし、ＢＭＰ−２は１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。）。細胞を、調製した成長因子含有培地の一つで、25,0 00細胞／ウェルの濃度となるように希釈した。２００μｌの細胞／培地の混合物を前処理をしていない９６−ウェルプレース(Nuclon)の各ウェル内ピペットで加えた。細胞を実施例１の記載と同じ条件下で培養した。８−１０ＤＩＶ後に神経球体数を計測し、結果を表に示した。図７に示されるように、ＥＧＦ及びＦＧＦの組み合わせの存在下成育した細胞は、ＥＧＦのみの存在下において成育した細胞よりも有意に多数の神経球体を産生した。ＥＧＦ及びＢＭＰ−２の組み合わせは神経球体の発達を阻害した。実施例５逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による、未分化及び分化幹細胞− 由来プロゲニーにおける受容体及び成長因子発現の比較神経球体を実施例１の記載に従い産生し、幾つかを実施例２のパラダイム１に従い分化した。未分化または分化神経球体由来のＲＮＡをChomzynski及びSacchi (Anal.Biochem．162:156-159(1987))のグアニジニウムチオシアネート酸フェノール法に従い単離した。相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をオリゴｄＴをプライマーとして逆転写酵素を使用して全ＲＮＡから合成した。遺伝子特異的プライマーを設計して合成し、及びこれらのプライマーをＰＣＲ法において使用して異なる成長因子及び成長因子受容体に対するｃＤＮＡを増幅した。増幅した物質を分子量マーカーと共にアガロースゲル上で展開し、ＰＣＲ生成物が目的のサイズであるかどうか確認した。一方、ＰＣＲフラグメントの同定は制限酵素分析及び配列決定法によって確認した（Arcellana-Panlilio，Methods Enzymol．225: 303-328(19 93)）。図８は、ＵＶ照射により視覚化したエチジウム染色アガロースゲルの写真であり、未分化及び分化幹細胞由来プロゲニーにおける三種類の成長因子受容体転写物、即ちＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ及びＬＩＦ−Ｒの検出を示している。表１は分析されたプライマーセット及び未分化及び分化細胞の結果を示している。実施例６神経幹細胞増殖及び分化に関連する新規なマーカー及び調整因子の単離ＣＤ₁アルビノマウス(Charles River)由来のＣＮＳ組織を使用して実施例１の記載に従い神経球体を産生した。この神経球体の幾つかを実施例２における迅速分化パラダイムに従い分化させ、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞が豊富な培養を生成した。全ＲＮＡを未分化神経球体及び分化細胞培養から実施例５に記載のグアニジニウムチオシアネート酸フェノール法を使用して、抽出した。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をＵまたはＴのストレッチ(stretch)に対するポリＡトラクト(tract)の親和性を利用して単離する。ｃＤＮＡから生成したｍＲＮＡの逆転写を、プラスミド[Rothstein et al.，Methods in Enzymology 225 : 587-610(1993)]またはラムダファージベクターのいずれかの一次ライブラリーを作成するために使用する。未分化または分化幹細胞由来プロゲニーのいずれかに特異的なｃＤＮＡを単離するために、一方のｃＤＮＡを、他由来のＲＮＡとハイブリダイズし、逆も同様にする。各々のケースにおいて、ハイブリダイズしていない、従って培養型特異的なｃＤＮＡをサブトラクトされた(subtracted)ライブラリー[Lopez-Fernandez and del Mazo，Biotechniques 15(4): 654-658(1993 )]の構築に使用するか、または一次ライブラリーのスクリーニングに使用する。幹細胞由来未分化細胞特異的及び分化細胞特異的ｃＤＮＡライブラリーは、ＣＮＳ幹細胞増殖及び分化に関連する、新規なマーカー及び調整因子のためのクローン源を提供する。特異的ｃＤＮＡを、同定または機能の手掛かりである特異的配列モチーフを検出するために配列決定法により、及び既知の転写物に対する相同性のデータベース検索により研究する。アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、ナイロン膜に移動した様々なＲＮＡ試料に対してハイブリダイズするｃＤＮＡの使用により、転写物のサイズ、比発生量、及び特異性の測定が可能である。ｃＤＮＡ配列の全てまたは一部を、完全なｍＲＮＡ配列またはゲノミック配列情報のどちらかを得るために他のライブラリーのスクリーニングに使用する。特異的なｃＤＮＡから産生された融合タンパクに対する抗体を、免疫細胞化学またはウエスタンブロット法のどちらかにより、特定の細胞個体群に特異的なタンパクを検出するために使用する。特異的遺伝子配列は、遺伝子発現をコントロールする推定調整エレメントに特異的なタンパクを検出するために使用される。これらの調整エレメントは、ベーターガラクトシダーゼのような外因性遺伝子の発現をするために使用される。実施例７成長因子応答幹細胞由来であり、生物学的薬剤に接触させた神経細胞の電気生理学的分析神経球体を実施例１に従い産生した。神経球体を実施例２のパラダイム２の記載の技術を用いて解離した。クローン性誘導細胞を低密度でプレートしｂＦＧＦの存在下において分化した。形態学的に神経細胞の外観を有する細胞の電気生理学的性質を、Vescovi［Neuron，11: 951-966(1993)］らにより報告された方法に従い測定した。全ての細胞電流クランプにおいて、平均静止電位及び入力抵抗は −62±9ｍＶ及び372±ＭΩであった。長方形電流閾上ステップ(rectangular sup rathreshold current steps）（〜１００ｐＡ）は、再生成電位応答を誘導し、その応答における振幅及び時間コースは刺激に依存性（図９）であった。電気生理学的実験の後、細胞形態を５−カルボキシフルオレセインの誘導により視覚化した。実施例８薬剤または他の生物学的薬剤の、神経的障害に罹患する患者から得られた組織由来の成長因子−応答性幹細胞プロゲニーにおける効果のスクリーニングハンチントン病の患者からのバイオプシー（生検）から得られるＣＮＳ組織由来のＥＧＦ−応答性幹細胞プロゲニーに対するＢＤＮＦの効果を実施例３のＡ〜Ｅに記載の方法を使用して測定する。ＢＤＮＦはＧＡＢＡergic 神経細胞の可能性のある分化因子であり、広範囲の神経細胞の外殖を促進する（図５Ｂ）。ハンチントン病は線条体からのＧＡＢＡergic神経細胞（他の中で）の喪失により特徴付けられる。実施例９成長因子によるアミロイド前駆タンパク（ＡＰＰ）の調整ＣＮＳ組織をダウン症候群胎児から得て、神経球体を実施例１に記載の方法に従い産生して継代し、目的の数の細胞を得る。細胞を実施例２に記載されたいずれかのパラダイムを使用して分化する。プレートする際に、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ− ２、アクチビン、ＦＧＦ−２またはレチノイン酸を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で実験用ウェル内の培地に加え、２ｎｇ／ｍｌの濃度で毎日加える。３、７及び１４ＤＩＶ後にＡＰＰｍＲＮＡの及びタンパクのレベルを測定した。ノザンブロット分析のため、ＲＮＡをグアニジウムイソチオシアネート／セシウムクロリド法[Goo dison et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52(3): 192-198(1993)]を用いてＲＮＡを抽出する。ノザンブロットを行って、ＡＰＰ_KPIのプロテアーゼ抑制ドメインをコードするヒトｃＤＮＡまたはＡＰＰ₆₉₅に特異的な３０塩基対オリゴヌクレオチドプローブを用いて探査を行う。ウエスタンブロット分析のため、細胞をLaemmliバッファー内でホモジナイズし、煮沸を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せる。ゲルをイムノブロットし、１：１０００に希釈した抗ＡＰＰを用いて探査する。ＡＰＰｍＲＮＡ及びタンパク発現のレベルをコントロール培養と比較する。実施例１０増殖した神経幹細胞プロゲニーの使用による細胞自滅(apoptotic)イベントの分析Ａ．自然発生的細胞自滅の分析増殖マウス神経球体を実施例１に記載の方法を用いて調整し、３、５、７、９、１２及び１５日後の培養を収穫した。マウス神経球体を実施例２、パラダイム１の方法を用いて分化し、１、４、７、１０、１３及び１６日後の培養を収穫した。細胞を１ｍｌのＤＮＡｚｏｌ試薬（ギブコ／ＢＲＬ）で分解し、及びゲノミックＤＮＡを、５００μｌのエタノールで沈殿させた後、溶液からプールした。ゲノミックＤＮＡを２６０ｎｍにおける光学濃度により定量化した。アポトーシスを示すＤＮＡラダリング (laddering)の範囲を、２５０ｎｇのＤＮＡを５０μ ｌ１００ｍＭカリウムカコダイレート(cacodylate)(ｐＨ7.2)、２ｍＭＣｏＣｌ₂ 、0.2ｍＭＤＴＴ、５０μＣｉ〔α³²Ｐ〕ｄＡＴＰ及び２５ユニット末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ中に溶解することにより、検出した。反応を６０分間、３７℃で培養した。放射線活性な生成物を２％ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより分析した。増殖及び分化した神経球体培養の形態学的及び生化学的分析は、自然発生的アポトーシスに実際に関係する細胞の数が培養の日数が進むにつれて２０％より低い範囲から５０％より高い範囲に及ぶことを示している。Ｂ．神経幹細胞培養における可能性のあるアポトーシス調整のＲＴ−ＰＣＲ分析既知の推定アポトーシス調整分子の活性をＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した。マウスの神経幹細胞培養の増殖及び分化したプロゲニーを実施例１及び２の方法を用いて調製した。既知の推定アポトーシス調節ｍＲＮＡ転写物の逆転写−ＰＣＲ分析を行った。細胞を１ｍｌＲＮＡｚｏｌ試薬（ギブコ／ＢＲＬ）内で分解し、有機相及ぴ水相を0.2体積のクロロホルムを添加することにより分離し、同体積のイソプロパノールを添加して固形化することにより水相から全ＲＮＡを分離した。ＲＮＡを２６０及び２８０ｎｍにおける光学濃度によって定量化した。0. 5μｌ逆転写生成物のポリメラーゼ鎖反応分析を、２５μｌ２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.0）、５０ｍＭＫＣｌ、0.2ｍＭｄＮＴＰ、1.5mMMgＣｌ₂、0.5μＭプライマー及び1.25ユニットtaqポリメラーゼ中で行った。典型的なサイクリング(cycling)パラメーターは、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１分間の３０サイクル繰り返しであった。成長因子、成長因子受容体、転写因子、Ｂｃｌ−２タンパクファミリーメンバー及びプロテアーゼのインターロイキン変換酵素ファミリーのメンバーを含む、神経細胞のアポトーシスの３０を越える可能性のある調節剤の分析を行った。各タンパクファミリーの分化して発現されたメンバーが検出された。Ｃ．神経細胞アポトーシスの未知の潜在的調節剤の検出及びクローニング神経細胞のアポトーシスの未知の転写物潜在的調節剤の活性をｍＲＮＡのフィンガープリンティング法により確認した。マウス神経幹細胞培養の増殖及び分化プロゲニーを調製し、上記に述べたように収穫し、未知の推定アポトーシス調節分子のｍＲＮＡフィンガープリンティング分析を行った。細胞を１ｍｌＲＮＡｚｏｌ試薬（ギブコ／ＢＲＬ）内で分解し、有機及び水相を0.2体積のクロロホルムを添加することにより分離し、同体積のイソプロパノールを添加して固形化することにより水相から全ＲＮＡを分離した。ＲＮＡを２６０及び２８０ｎｍにおける光学濃度によって定量化した。逆転写及びポリメラーゼ鎖反応分析を上記に述べたように行った。逆転写生成物を８％アクリルアミド配列決定ゲル上で分離し、オートラジオグラフィーにより分析を行った。分化して発現したバンドをゲルから切断し、再増幅及び配列決定を行った。Ｄ．抗アポトーシス化合物の高スルーアウトアッセイ（throughout assay）のための遺伝学的改変幹細胞の確立ヒト及びマウス神経幹細胞を、潜在的抗アポトーシス治療化合物のための高スルーアウトアッセイシステムを提供するために、遺伝的に改変する。多数の直接形質移入技術を使用して、アポトーシス調節分子プロモーター（Ｂｃｌ−２、ＩＣＥ及びＮｕｒ−７７）により駆動される（driven）細胞形質（緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）または分泌（分泌アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ））マーカータンパク含有ＤＮＡ構築物は安定に、マウス及びヒト神経幹細胞内にトランスフォームされる。形質転換のため、リポフェクタミン(ＢＲＬ)を使用して、細胞を３５−ｍｍ培養プレートにつき２〜３×１０⁶細胞の割合で接種し、２００μ ｌＤＮＡ−リポソーム複合体（２００μｌ培地中３μｇＤＮＡ、２０μｌリポフェクタミン（ＢＲＬ））と共に３７℃で１２時間培養した。神経細胞のアポトーシスにおける様々な化合物の効果を、蛍光（ＧＦＰ）または分泌アルカリホスファターゼ活性（ＳＥＡＰ）による既知のアポトーシス調節遺伝子プロモーターのコントロール下におけるマーカー遺伝子の発現に対する化合物の適用効果により確認した。全ての文献及び出願中の特許出願をここに参考として記載する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レイノルズブレントカナダアルバータティ２エヌ１エックス９カルガリーエイストリート 235−11

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を含む、神経前駆細胞への少なくとも一種の生物学的薬剤の効果を測定する方法。 (a) 少なくとも一種の多能性幹細胞を含む哺乳類神経組織を分離する工程、 (b) 該多能性幹細胞を少なくとも一種の成長因子を含む培地内で増殖させ、増殖した前駆細胞の培養を得る工程、 (c) 該増殖前駆細胞を該生物学的薬剤に接触させる工程、及び (d) 該前駆細胞への該生物学的薬剤の効果を測定する工程。２．該成長因子がＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。３．該培地が限定される、請求項１に記載の方法。４．該哺乳類神経組織が出生直後の哺乳類から得られる、請求項１に記載の方法。５．該哺乳類神経組織がヒトドナーから得られる、請求項１に記載の方法。６．該ヒトが神経学的疾患または障害に罹患している、請求項５に記載の方法。７．該生物学的薬剤が該神経学的疾患または障害のための潜在的治療薬剤である、請求項６に記載の方法。８．該神経学的疾患または障害がアルツハイマー病、パーキンソン病及びダウン症候群からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。９．該工程(d)の効果を、該生物学的薬剤と接触させた工程(c)の増殖させた前駆細胞の遺伝子ライブラリーと、該生物学的薬剤と接触させていない工程(b)の増殖させた前駆細胞の遺伝子ライブラリーとを比較することにより測定する、請求項１または６に記載の方法。 10．以下の工程を含む、神経細胞の分化における少なくとも一種の生物学的薬剤の効果を測定する方法。 (a) 少なくとも一種の多能性幹細胞を含む哺乳類神経組織を分離する工程、 (b) 該多能性幹細胞を少なくとも一種の成長因子を含む第一培地内で増殖させ、増殖した前駆細胞の培養を得る工程、 (c) 第二培地内で該生物学的薬剤の存在下に該増殖前駆細胞の分化を誘導する工程、 (d) 該前駆細胞の分化への該生物学的薬剤の効果を測定する工程。 11．該成長因子がＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。 12．該第一培地が限定される、請求項１０に記載の方法。 13．該哺乳類神経組織が幼体または成体から得られる、請求項１０に記載の方法。 14．該哺乳類神経組織がヒトドナーから得られる、請求項１０に記載の方法。 15．該ヒトが神経学的疾患または障害に罹患している、請求項１６に記載の方法。 16．該生物学的薬剤が該神経学的疾患または障害のための潜在的治療薬剤である、請求項１６に記載の方法。 17．該神経学的疾患または障害がアルツハイマー病、パーキンソン病及びダウン症候群からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。 18．該工程(d)の効果を、該生物学的薬剤と接触させた工程(c)の増殖させた前駆細胞の遺伝子ライブラリーと、該生物学的薬剤と接触させていない工程(b)の増殖させた前駆細胞の遺伝子ライブラリーとを比較することにより測定する、請求項１０または１５に記載の方法。 19．栄養因子の存在下に該増殖前駆細胞の分化を誘導し、該分化細胞の表現型を操作する、請求項１０に記載の方法。 20．該第二培地がグリアフィーダー細胞相を含む、請求項１０に記載の方法。 21．以下の工程を含む、分化した神経細胞への少なくとも一種の生物学的薬剤の効果を測定する方法。 (a) 少なくとも一種の多能性幹細胞を含む哺乳類神経組織を分離する工程、 (b) 該多能性幹細胞を少なくとも一種の成長因子を含む第一培地内で増殖させ、増殖した前駆細胞の培養を得る工程、 (c) 第二培地内で該増殖前駆細胞の分化を誘導し、分化した神経細胞の培養を得る工程、 (d) 該分化神経細胞を生物学的薬剤と接触させる工程、及び (e) 該分化神経細胞への該生物学的薬剤の効果を測定する工程。 22．該成長因子がＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。 23．該第一培地が限定される、請求項２２に記載の方法。 24．該哺乳類神経組織が幼体または成体から得られる、請求項２１に記載の方法。 25．該哺乳類神経組織がヒトドナーから得られる、請求項２１に記載の方法。 26．該ヒトが神経学的疾患または障害に罹患している、請求項２５に記載の方法。 27．該生物学的薬剤が該神経学的疾患または障害のための潜在的治療薬剤である、請求項２６に記載の方法。 28．該神経学的疾患または障害がアルツハイマー病、パーキンソン病及びダウン症候群からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。 29．該工程(e)の効果を、該生物学的薬剤と接触させた工程(d)の分化させた神経細胞の遺伝子ライブラリーと、該生物学的薬剤と接触させていない工程(c)の分化させた神経細胞の遺伝子ライブラリーとを比較することにより測定する、請求項２１または２６に記載の方法。 30．栄養因子の存在下に該増殖前駆細胞の分化を誘導し、該分化細胞の表現型を操作する、請求項２１に記載の方法。 31．該第二培地がグリアフィーダー細胞相を含む、請求項２１に記載の方法。 32．神経細胞から調製されるｃＤＮＡライブラリー。 33．該神経細胞が神経幹細胞である、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー。 34．該神経細胞が前駆細胞である、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー。 35．該神経細胞が神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞からなる群から選択される分化細胞である、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー。 36．該神経細胞が神経学的疾患または障害に罹患しているヒト由来のものである、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー。