MXPA97002126A - Modelos in vitro de funcion y disfuncion del snc - Google Patents

Abstract

Se usan células nerviosas del encéfalo multipotentes proliferantes o proliferadas para producir un sistema modelo SNC(Sistema Nervioso Central) para el estudio del desarrollo y la función nervioso y para determinar los efectos en el SNC de agentes terapéuticos y otros novedosos agentes biológicos. Las células nerviosas del encéfalo se obtienen en pequeñas cantidades de tejido del SNC, ya sea normal o enfermo, de individuos pre y postnatales. La invención permite que grandes cantidades de tejido, que puede derivarse clónicamente para limitar la variabilidad, se generan a partir de una cantidad relativamente pequeña de tejido del SNC. La invención describe un sistema de modelo del SNC mediante el cual la progenie diferenciada de las células nerviosas del encéfalo incluye tipos múltiples de células del SNC, incluso neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Usándose este modelo, se puede realizar la selección de efectos de los agentes neurológicos u otros agentes biológicos y el análisis de la expresión de los genes en células nerviosas multipotentes del encéfalo y en la progenie derivada de la célula del encéfalo de un donador normal o enfermo.

Description

MODELOS IN VJTRO DE FUNCIÓN Y DISFUNCION DEL SNC Antecedentes de la invención El sistema nervioso humano maduro está compuesto por billones de células que se generan durante el desarrollo a partir de un pequeño número de precursoras localizadas en el tubo neural. El estudio de las vías de desarrollo del sistema nervioso central (SNC) , así como de las alteraciones que ocurren en el SNC del mamífero adulto debido a disfunciones han sido difíciles debido a la complejidad del SNC del mamífero. Dichos asuntos se estudiarían de mejor manera usando modelos relativamente sencillos de SNC en condiciones definidas. Generalmente, se han tomado dos enfoques para estudiar los cultivos de células : el uso de cultivos nerviosos primarios; y el uso de líneas de células nerviosas.. Los cultivos nerviosos primarios de mamíferos pueden generarse de casi todas las regiones del cerebro, a condición de que el material inicial se obtenga de animales fetales o postnatales tempranos. En general, pueden producirse tres tipos de cultivos, enriquecidos ya sea con neuronas, astrocitos u oligodendrocitos. Los cultivos primarios del vendedor han demostrado ser valiosos para descubrir muchos mecanismos de la función nerviosa y se usan para estudiar los efectos de agentes exógenos en células en desarrollo o maduras. Aunque los cultivos primarios de vendedor tienen muchas ventajas, padecen dos inconvenientes principales. Primero, debido a la limitada habilidad proliferativa de las células nerviosas primarias, deben generarse nuevos cultivos de varios animales distintos. Aunque se tiene por lo general gran cuidado para obtener tejidos en estados de desarrollo idénticos y de regiones idénticas del cerebro, es virtualmente imposible generar cultivos primarios que sean idénticos. Por lo tanto, existe un grado significativo de variabilidad de un cultivo a otro. Una segunda desventaja de los cultivos primarios es que el tejido debe obtenerse de fetos o animales postnatales tempranos. Si se han de efectuar cultivos primarios de manera regular, esto requiere la disponibilidad de una gran fuente de material inicial. Aunque este no es por lo general un problema para generar cultivos primarios de algunas especies (por ejemplo, roedores), lo es para otras (por ejemplo, primates). Debido al suministro limitado y a las preocupaciones éticas, no son prácticos los cultivos de células primarias de primates (tanto humanos como no humanos) . Debido a la limitada habilidad proliferativa de las células nerviosas primarias, no se ha logrado previamente la generación de un gran número de células homogéneas para estudios de función, disfunción y diseño/prueba de fármacos del y para la función nerviosa. Por lo tanto, se han estudiado poblaciones homogéneas de células que puedan generar un gran número de progenie para la investigación in vitro de la función del SNC a través del uso de líneas de células. La generación de líneas de células nerviosas puede dividirse en dos categorías: 1) tumores que ocurren espontáneamente, y 2) líneas de células diseñadas a la medida. De los tumores que ocurren espontáneamente, probablemente la línea de células más estudiada en neurobiología son las células de feocromocitoma de la rata (PC12) que pueden diferenciarse en neuronas de tipo simpático en respuesta al factor de crecimiento de nervios (FCN) . Estas células han demostrado ser un modelo útil para estudiar los mecanismos del desarrollo y las alteraciones nerviosos (moleculares y celulares) en respuesta a los factores de crecimiento. Se han usado líneas de células de neuroblastoma y glioma para estudiar el funcionamiento nervioso y glial (Lies, y colaboradores, 1987; Nister y colaboradores, 1988) . Las células del carcinoma embrionario (CE) se derivan de tumores de teratoma de células de gérmenes fetales y tienen la habilidad de diferenciarse en un gran número de tipos de células no nerviosas con algunas líneas (por ejemplo células P19, Jones-Villeneuve y colaboradores, 1982) que tienen la habilidad e diferenciarse en células nerviosas (McBurney y colaboradores, 1988) . Una línea de células derivada del teratocarcinoma humano, NT era2/cl.Dl, con un fenotipo semejante a las células nerviosas precursoras del SNC, puede ser inducida para diferenciarse en presencia de ácido retinoico. Sin embargo, las células diferenciadas se restringen al fenotipo nervioso [Pleasure y Lee (1993), J. Neurosci. Res. 35: 585-602]. Aunque estos tipos de líneas de células son capaces de generar un gran número de células para probar los efectos de agentes exógenos en la supervivencia o función de la célula, debido a su inmortalización, no son adecuadas para uso en el estudio de la apoptsosis, esto es, la muerte natural programada de las células de los mamíferos. Además, el número limitado de este tipo de líneas, el número limitado de fenotipos que son capaces de generar y la naturaleza desconocida de su inmortalización (que puede afectar la función de las células de manera indefinida) hacen de estos tipos de líneas de células menos que ideales para los modelos in vitro de la unción nerviosa y el descubrimiento de terapéutica novedosa. Un enfoque alternativo a las líneas de células que ocurren espontáneamente es la inmortalización intencional de una célula primaria introduciendo un oncógeno que altera la configuración genética de la célula induciendo así a la célula a proliferar indefinidamente. Este enfoque ha sido usado por muchos grupos para generar varias líneas de células nerviosas interesantes (Bartlett y colaboradores, 1988; Frederiksen y colaboradores, 1988; Trotter y colaboradores, 1989; Ryder y colaboradores, 1889; Murphy y colaboradores, 1991; Almazán y McKay, 1992) . Aunque estas líneas pueden demostrar ser útiles para estudiar las decisiones que ocurren durante la determinación y diferenciación celular, y para determinar los efectos de los agentes exógenos, padecen de varias desventajas. Primero, la adición de un oncógeno que altera el estado proliferativo de una célula puede afectar otras propiedades de la célula (los oncógenos pueden desempeñar otros papeles en las células además de regular el ciclo de la célula) . Esto queda bien ilustrado en un estudio de Almazán y McKay (1992) y su inmortalización de una precursora de oligodendrocito a partir del nervio óptico que es incapaz de diferenciarse en astrocitos de tipo II (algo que pueden hacer las precursoras de oligodendrocitos del nervio óptico normal) . Los autores sugieren que la presencia del antígeno inmortalizador puede alterar la habilidad de las células para diferenciarse en astrocitos. Otra desventaja al usar células inmortalizadas intencionalmente resulta del hecho que el sistema nervioso está compuesto por billones de células y posiblemente miles de tipos distintos de células, cada uno con patrones únicos de expresión de genes y sensibilidad a su medio ambiente. Una línea de células diseñada a la medida es el resultado de la inmortralización de una sola célula progenitura y su expansión clónica. Aunque puede generarse un gran suministro de un tipo de célula nerviosa, este enfoque no toma en consideración las interacciones celulares entre los distintos tipos de células. Además, aunque es posible inmortalizar células de una región dada del cerebro, no es posible la inmortalización de una célula deseada debido a la falta de control sobre cuáles células serán alteradas por el oncógeno. Por lo tanto, mientras las líneas de células diseñadas acostumbradas ofrecen pocas ventajas sobre los tumores que ocurren espontáneamente, ellas sufren de varias desventajas y no son ideales para entender la función y la disfunción del SNC.

Sumario de la Invención En vista de las deficiencias que se tienen con los métodos anteriores que proveían grandes cantidades de células neurales genéticamente inalteradas con el propósito de estudiar el desarrollo y la función del SNC y para determinar el efecto de agentes terapéuticos potenciales para la disfunción del SNC, ahí existe la necesidad de tener sistemas modelo de SNC que puedan ser utilizados para dichos propósitos. Por este motivo, es uno de los objetivos de la presente invención el proveer sistemas modelos de SNC para los estudios del desarrollo y la función neurales y para determinar los efectos en el SNC de sustancias nuevas terapéuticas y de otros agentes biológicos. Es el propósito de esta invención que dicho sistema de SNC permita generar una gran cantidad de células nerviosas a partir de una pequeña cantidad de material obtenido de diferentes especies, incluyendo humanos y extendiéndose sobre un rango amplio de edades, incluyendo adultos. Otro de los objetivos es el proveer un sistema de modelo de SNC que contenga células que no sean de tumores espontáneamente ocurridos o que hayan sido inmortalizadas intencionalmente por la inserción de un oncógeno para inducir una proliferación ilimitada, por lo tanto quitando cualquier duda de que la influencia de una alteración genérica sobre una función normal de las células . Otro objetivo es el proveer de sistemas modelo de SNC en donde las células estén derivadas clónicamente y por lo tanto representen una población de células que tengan un grado de variabilidad bajo del uso de un modelo para el siguiente uso. Otro objetivo de esta invención es el proveer un sistema modelo de SNC en donde las células proliferen en respuesta de una molécula señaladora extrínseca, o la combinación de moléculas, que pueden ser añadidas o eliminadas a voluntad. Otro objetivo es el proveer un sistema modelo de SNC en donde las células proliferadas puedan ser mantenidas en un estado indiferenciado que permita la diferenciación, cuando se desee, en los tres grupos principales de células de sistema SNC de mamíferos (neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos) . Es otro objetivo de la presente invención el proveer un sistema modelo de SNC en donde la diferenciación y el funcionamiento de células de SNC pueda ser estudiado de una manera controlada en un sistema compuesto por diferentes tipos de células - una situación similar que puede ocurrir in vivo. Otro objetivo más es el proveer un sistema modelo SNC en donde las células progenitoras puedan ser generadas de individuos pre y postnatales, incluyendo adultos, permitiendo hacer pruebas que puedan ser hechas en forma individual . Es un objetivo más de la presente invención el permitir para el análisis de la expresión de gen en el SNC de células progenitoras y progenia derivada de células progenitoras de un donador normal y de células de un paciente con algún trastorno neurológico. Objetivos adicionales y aspectos de la invención serán manifiestos aquellos versados en la técnica de una descripción detallada posterior y de reivindicaciones anexas. Es una incorporación, los objetivos están logrados por el método de prueba, los efectos de algún agente neurológico u biológico o la combinación de ambos y las células neurales o nerviosas comprometidas de un tejido neural de mamífero contenido por lo menos en una célula progenitora ultipotente, exponiendo dicha célula progenitora multipotente a un medio de cultivo que contenga por lo menos un factor de crecimiento que prolifere dicha célula progenitora para obtener un cultivo de células precursoras generadas celularmente, y combinando las células precursoras con agentes biológicos o la combinación de agentes, y midiendo los efectos que tengan dichos agentes a estas células precursoras dichas. En otra incorporación, las células progenitoras se proliferan en la presencia de agentes biológicos u otros agentes y se determinan los efectos de dichos agentes biológicos u otros agentes sobre estas células y determina su proliferación. En otra incorporación de la invención, tejido neuronal mamífero es obtenido de un donador afectado humano y con algún trastorno o padecimiento neurológico. En una siguiente incorporación, las células precursoras proliferadas son inducidas a que se diferencien en la presencia de agentes biológicos o la combinación de agentes. En otra incorporación más, la progenie de células progenitoras generadas celularmente son inducidas a diferenciarse primeramente a la adición de agentes biológicos o agentes.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Proliferación en las Células Sensibles al Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) : Después de dos años in vitro EFG las células sensibles empiezan a proliferar (Figura ÍA) . Después de 4 días in vitro pequeños grupos de células son aparentes (Figura IB) . Los grupos de células proliferadas continúan creciendo en tamaño (Figura 1C) hasta que éstas se despegan del substrato y flotan en la suspensión (Figura d) . En esta etapa, las esferas flotantes pueden ser quitadas fácilmente, disociadas en células solas y, en la presencia de EGF, la proliferación puede ser reiniciada. (Bar: 50 µm) . Figura 2. La diferenciación de Células a Partir de Esferas Generadas EGF en Neuronas, Astrocitos y Oligodendrocitos: Una triple etiqueta inmunocitoquímica con anticuerpos microtúbulos asociados a la proteína (MAP-2), la proteína acídica fibrilar glial (GFAP) , y 04 (una célula de superficie antigénica) son usadas para detectar la presencia de neuronas (Figura 2B) , astrocitos (Figura 2C) y oligodendrocitos (Figura 2D) , respectivamente, a partir de una simple esfera generada por EGF (Figura 2A) derivadas de un cultivo primario. (Bar: 50 µm) . Figura 3. Etiquetamiento de las Neuroesferas Co-cultivadas con Astrocitos Estríales: Una fase de puntos de vista de contraste del crecimiento de esferas de 8 días sobre una capa alimentadora de astrocitos se muestra en la Figura 3A. Etiquetas Brd-U de las células neuroesferas muestran que virtualmente que todas las células han incorporado Brd-U (Figura 3B) . El contraste de fase de esta capa alimentadora de células se muestra en la Figura 3C. La etiqueta GFAP de la capa células alimentadoras muestra que la mayoría de las células en la capa alimentadora son astrocitos (GFAP-IR) (Figura 3D) . Después de que ocurra la diferenciación, las neuronas etiquetadas BrdU (Figuras 3E y 3G) son inmunoreactivos para neuropéptido Y (NPY) (Figura 3F) o somatostatina (Figura 3H) , así como otros neurotransmisores como glutamato y metacefalina) (no se muestra) . Figura 4. Aumento de Neuronas Producidas de una Neuroesfera en la Presencia del Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF) : Cuantificación del número promedio de neuronas en 10 días in vitro (DIV) de una neuroesfera generada celularmente a partir de una célula progenitora sensible a EGF mostró que la ausencia de BDNF, se generaron 11.46 ± 1.21 neuronas por neuroesfera. Cuando el BDNF (10 ng/ml) estuvo presente en el medio de cultivo, un número significativo mayor de neuronas (p < 0.5) fue identificada (22.34 ± 2.33 neuronas por neuroesfera) . Figura 5. Base del Proceso Neuronal Mejorado en Presencia de BDNF: Las neuroesferas, crecidas en presencia de BDNF (Figura 5A) y en la presencia de BDNF (Figura 5B) por 10 DIV, fueron fijadas y procesadas por inmunocitoquímica indirecta con antisuero al ácido gama-amino butírico (GABA) . La mayoría de las neuronas crecidas en la presencia de BDNF se rayaron neuritas largas y mostraron un patrón de ramificación complejo y extensivo concordante con las neuroesferas no tratadas con BDNF. Figura 6. Respuesta a la BDNF por Poblaciones Selectivas de Células con Neuroesfera A: La inmunocitoquímica indirecta por el producto de gen inmediatamente temprano c-fos revela que casi todas las células derivadas clónicamente dentro de una sola neuroesfera son sensibles al EGF (20 ng/ml) , como se ensayó por el incremento de la inmunoreactividad de c-fos (Figura 6A) . Una doble etiqueta i munoquímica con antisuero al antígeno nuclear c-fos y un anticuerpo directo en contra del antígeno específico neuronal ß-tubulina, demuestra que la exposición después de 60 minutos al BDNF resulta en una expresión selectiva de c-fos (Figura 6B) , primeramente en la población neuronal como se determinó con el antisuero del ß-tubulina (Figura 6C) . Figura 7. Efecto del Factor Básico de Crecimiento de Fibroblastos (bFGF) y la Proteina 2 Morfogénica de Hueso (BMP-2) sobre la Proliferación de Neuroesferas Generadas por EGF: Las células aisladas de la estría de un embrión de 14 días de edad fue depositado en una placa de 96 pozos en una densidad de 25,000 células/mililitro en la presencia de EGF (20 ng/ml, EGF + bFGF (cada una de 20 ng/ml) o EGF + BMP-2 (20 y 10 ng/ml respectivamente) . Después de 10 DIV, la cuantificación de las colonias tratadas con EGF indicaron que 23 ± 1.33 neuroesferas fueron generadas por cada pozo (n = 8) . bFGF mejoraron con la proliferación de la estimulación a EGF dando un aumento de 54.5 ± 2.17 neuroesféras por pozo (n = 8), mientras BMP-2 detuvo la proliferación de las células progenitoras en la respuesta a EGF (n = 8) . Figura 8. Visualización del Gel Agarosa Etidio Vía la Transiluminación con Rayos Ultravioleta Mostraron la Detección de Transcripciones de Factor de Crecimiento en la Progenie de Células Progenitoras Derivadas Diferenciadas e Indiferenciadas : La primera banda y cada tablero mostró una escalera de peso molecular estándar de 1 kb. La segunda banda, etiquetada C, es el control negativo la cual representa PCR en la ausencia de cualquier cDNA templado. La tercera banda, etiquetada D, es el RT-PCR de neuroesféras indiferenciadas . La cuarta banda, etiquetada D, es el RT-PCR de la progenie derivada de células progenitoras diferenciadas. La presencia del receptor de factor de crecimiento epidérmico, el receptor del factor de crecimiento de firoblastos y el receptor de factor inhibitorio de leucemia, están indicados por EGF-R, FGF-R y FIF-R, respectivamente . Figura 9. Propiedades Electrofisiológicas de las Neuronas Generadas por bFGF: Una imagen digital de una supuesta neurona mostrando una morfología bipolar se muestra en la Figura 9A. La Figura 9B muestra una imagen digital fluorescente de la misma neurona, llena de 5-carboxifluorosceina, después del retiro del electrodo de parche. La Figura 9C ilustra potenciales de acción graduados evocados por la inyección de corriente, en la neurona generada por bFGF en las Figuras 9A y 9B.

Descripción Detallada de la Invención Las células progenitoras neurales del sistema nervioso central (SNC), conocidas como "células progenitoras SNC", han sido reportadas y su uso potencial descrito (Reynolds and Weiss, Science 255:1707 [1992]; Reynolds, y colaboradores, J. Neurosci. 12:4565 [1992]; Reynolds and Weiss, Restorative Neurology and Neuroscience 4:208 [1992]; Reynolds and Weiss, Neuronal Cell Death and Repair, ed. Cuello [1993]). El término "célula progenitora" se refiere a la célula indiferenciada relativamente la cual puede ser obtenida de tejido embriónico, juvenil o adulto que es capaz de la proliferación y un mantenimiento propio con la generación de una progenie de gran tamaño. La utilidad de las células progenitoras neurales es descrita en las solicitudes copendientes U.S.S.N 08/270,412; 07/961,813; 08/221,655; 08/010,829; y 08/149,508. Como se encontraron las células progenitoras en otros tejidos de mamíferos, y en las células progenitoras SNC que se exhiben en la célula progenitora de un aspecto crítico, de propio mantenimiento. El propio mantenimiento en las células implica que la célula es capaz de mejorar clonas de sí misma y de esta manera mantener un fenotipo sobre un período largo de tiempo. La progenie de las célula progenitora y la que aquí se describe como "célula precursora" y consiste de dos tipos de células: a) células progenitoras nuevas y b) células progenitoras que pueden diferenciarse en células funcionales. El término "célula progenitora" se refiere a las células indiferenciadas derivadas de una célula progenitora "SNC". La célula progenitora tiene una habilidad proliferativa limitada y no puede ser renovada por sí misma. Está condicionada a una vía particular de diferenciación y podrá bajo condiciones apropiadas, diferenciarse en un tipo de célula diferente en el SNC; éstas incluyen neuronas, y células guales. Los astrocitos y los oligodentrocitos están incluidos en células guales. El término "oligodendrocito" se refiere a la célula glial diferenciada la cual forma la mielina que rodea a los axones en el sistema nervioso central (SNC) . Los oligodendrocitos son galactocerebrósidos fenotípicamente (+) , y tienen proteína básica de mielina (+) , y no presentan proteína acídica fibrilar gial (-) [GalC(+), MBP(+), GFAP(-)]. El término "astrocito" se refiere a la célula glial diferenciada que es GFAP(+), GalC(-), y MBP(-) el cual puede tener una morfología plana parecida protoplástico/fibroblasto o la cual puede estar dispuesta en una morfología estrellada. El término "neurona" se refiere a la célula neuronal diferenciada que tiene un fenotipo neuronal específico y es positivo a la enolasa (+) , neurofilamento (+), proteínas asociadas a microtubulo (+) , Tau-1 (+) o ß-tubulina (+) [NSE(+), NF(+), MAP-2(+), Tau-1 (+ ) , o ß-tub (+) ] . De acuerdo a los términos "célula progenitora neural" o "célula progenitora SNC", como se han usado en la presente, se refieren a las células progenitoras multipotentes capaces de proliferación para inducir más células progenitoras multipotentes y células progenitoras que neuronas diferenciadas, astrocitos y oligodendrocitos. Las células progenitoras neurales pueden ser aisladas y cultivadas in vi tro el sistema nervioso central de mamíferos SNC por los métodos descritos en el Ejemplo 1 más adelante y por lo que ya se explicó anteriormente. En resumen, las células progenitoras, las cuales se han obtenido de tejidos de mamíferos (por ejemplo, humano, mono, rata, ratón, etc.), han crecido en medio de suero libre en la presencia de un factor de crecimiento por lo menos. Como se usó en este estudio, el término "factor de crecimiento" se refiere a una proteína, péptido u otra molécula que tiene el efecto de crecimiento, proliferación, diferenciación o trópico en las células progenitoras o en las células madre. Los factores de crecimiento los cuales pueden ser usados o que pueden inducir proliferación incluyen a cualquier factor que permita a las células proliferar, incluyendo cualquier molécula la cual enlaza a los receptores de una superficie de una célula para provocar un efecto inductor de crecimiento o un efecto de supervivencia de la célula. Dichas factores incluyen factores de crecimiento de fibroblasto básico y el factor acídico (aFGF y bFGF el cual es conocido como FGF-2) , el factor de crecimiento de plaquetas derivado (PDGF) , la hormona de liberación de tirotrofina (TRH) , el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , una seudoligadura (EGF) , amfiregulina, el factor alfa de crecimiento transformador (TGFa) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , el factor neurotrófico ciliar (CNTF) , el factor neurotrófico derivado glial (BDNF) , el factor de crecimiento parecido a la insulina (IGF-1) y similares. Un factor de crecimiento preferido es el EGF. También es preferido el bFGF o la combinación del primero con el segundo EGF y bFGF. Los factores de crecimiento usados para regular a las células progenitoras y a las células madres en su desarrollo, las cuales tienen acciones reguladoras sobre otras células que en la promoción de la liberación, se incluyen el factor beta de crecimiento transformador (TGFß) , ácido retinóico, activina, la proteína morfogénica de hueso (BMP) , el factor neurotrófico ciliar (CNTF) y la proteína inflamatoria del macrofago (MlP-la, MlP-lß, MIP-2) . En la presencia de un factor de crecimiento, la célula progenitora multipotente es inducida a dividirse dando por resultado un grupo de células indiferenciadas las cuales se conocen aquí como "neuroesfera" . La neuroesfera incluye a las células progenitoras multipotentes primarias y a las células progenitoras. Colectivamente, las células de la neuroesfera se le llama aquí como "células precursoras". In vitro, las células precursoras típicamente crecen en una forma de neuroesferas, pero ellas también muestran diferentes patrones de crecimiento dependiendo de las condiciones del cultivo y las técnicas. Inicialmente, las células de la neuroesfera no son inmunoreactivas al GFAP, NF, NSE o MBP. Sin embargo, estas células son de un fenotipo, nestina (+), una proteína de filamento intermedia se encontró indiferenciada en las células del SNC. El marcador de nestina fue caracterizado por escrito por Lehndahl y colaboradores, Cell 60:585-595 (1990) . Los fenotipos maduros asociados con los tipos de células las cuales pueden ser diferenciadas de una progenie de células de neuroesferas son negativas predominantemente al fenotipo de nestina.

En presencia continua de un mitógeno por ejemplo EGF o similar, las células precursoras dentro de la neuroesfera continúan dividiéndose resultando en un incremento del tamaño de la neuroesfera hasta que el número de las células indiferenciadas [nestina (+), GFAP(-), NF(-), NSE(-), MBP (-) ] . En esta etapa, las células no se adhieren y tienden a formar colonias que flotan libremente características de las neuroesferas. Después de 6 a 7 DIV, las células de la neuroesfera se disocian. Virtualmente, todas las células se adhieren a un substrato de cultivo de tejido. En presencia continua de factor de crecimiento, las células progenitoras empiezan a dividirse y forman un substrato libre de neuroesferas consistiendo células derivadas clónicamente. Por lo tanto, utilizando este método de proliferación, disociación, y reiniciación de proliferación, un número ilimitado de precursores clónicos derivados de células pueden ser generadas in vitro. Después de eliminar el factor de crecimiento motogénico, la proliferación de células progenitoras se suspende. La esfera de células indiferenciadas se puede adherir a un substrato como el poliornitino tratado con plástico o al vidrio donde las células comienzan a diferenciarse en neuronas o en células guales. Por lo tanto, el factor de crecimiento actúa como una molécula señaladora extrínseca que puede ser añadida o quitada a voluntad para controlar proliferación de la extensión. Cuando el factor de crecimiento mitogénico es retirado, la progenie del factor de crecimiento puede ser cultivado en una capa alimentadora. Se pueden utilizar varios tipos de capas alimentadoras, tales como fibroblastos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, líneas de células tumorales, líneas de células alteradas genéticamente o cualquier célula o substrato con propiedades bioactivas . La capa alimentadora generalmente produce un rango más amplio de fenotipos. En este punto, la capa alimentadora actúa como un substrato y una fuente de ligadura de membrana y factores solubles que inducen y alteran la diferenciación de la progenie de células progenitoras generadas celularmente. Comparando con una sustancia un poco más inerte, por ejemplo poli-L-ornitina, una capa alimentadora de astrocitos, por ejemplo, induce un rango más grande de fenotipos neuronales como se determinó por inmunocitoquímica indirecta en 7 DIV. Cuando se lograron diferencias sobre un substrato cubierto de poli-L-ornitina al suero de fetal bovino al 1%, los fenotipos neuronales son casi siempre exclusivamente GABAergico o Pérgicos a la Sustancia. Cuando son diferenciados sobre una capa alimentadora de astrocitos, en adición a neuronas GABAergicas o Pérgicas a la Sustancia, somatostatina, neuropéptido Y (NPY) , glutamato y metencefalina se encontraron neuronas que contenían estas sustancias. Los astrocitos pueden ser derivados de tejido obtenido varias regiones cerebrales por ejemplo el cuerpo estriado, la corteza y la médula espinal. Una vez que el factor de crecimiento es retirado, el medio de cultivo puede contener suero como por ejemplo 0.5 a 1.0% de suero bovino fetal (SBF) . El suero tiende a sostener el proceso de diferenciación y aumenta la supervivencia celular, especialmente cuando las células diferenciadas han crecido en una densidad baja. Dentro de 1 a 3 días después del retiro del factor de crecimiento y depositando la célula en condiciones que pueden sostener la diferenciación y la supervivencia, la mayoría de todas estas células precursoras empiezan a perder la inmunoreactividad a la nestina y empiezan a expresar antígenos específicos para neuronas, astrocitos y oligodentrocitos. La diferenciación neuronal se confirma usando inmunoreactividad para la NSE, NF, ß-tub, NeuN (a un antígeno nuclear) , MAP-2 y la proteína específica de la neurona Tau-1. Astrocitos y oligodendrocitos se identifican usando la inmunoreactividad para GFAP y GalC, respectivamente. Las células que no presentan antígenos específicos para las neuronas y los astrocitos, empiezan a expresar marcadores específicos para los oligodendrocitos y un etapa temporal correcta. Esto es, que las células primeramente se convierten inmunoreactivas para el 04 (una célula antígena de superficie) , GalC (un glucolípido de la mielina) y finalmente, MBP. Estas células también poseen una morfología oligodendrocítica característica. Las neuronas también pueden ser identificadas basándose en el fenotipo de neurotransmisor específico junto con el análisis de su morfología. Usando etiquetamientos simples, dobles o triples de inmunofluorescencia y métodos de inmunoperoxidasa, los cultivos de neuroesferas diferenciadas pueden ser analizadas por la expresión de neurotransmisores, o en algunos casos por enzimas responsables de la síntesis de neurotransmisor. Alternativamente, la hibridación histoquímica in situ puede realizarse usando pruebas específicas de cDNA o RNA al péptido neurotransmisor o a la enzima sintetizadora de neurotransmisor de mRNAs . Estas técnicas pueden ser combinadas y estos métodos inmunocitoquímicos para aumentar la identificación de fenotipos específicos. Si es necesario, las pruebas de anticuerpos y de moléculas discutidos arriba se pueden utilizar procedimientos de Western and Northern blot respectivamente para ayudar y la identificación celular. Además de ser capaces de aislar células progenitoras sensibles a EGF en cualquier región del SNC embriónico, células progenitoras del SNC pueden ser también aisladas de una gran variedad de regiones del SNC juvenil y adulto, usando procedimientos de biopsia de rutina, incluyendo del conus medularis, de la médula espinal cervical, torácica y lumbar del tallo cerebral, el hipotálamo y del cuerpo estriado. En cada uno de estos casos de células progenitoras del SNC aisladas se exhibe un mantenimiento propio y se genera un gran número de células progenitoras las cuales se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Por lo tanto, las células progenitoras multipotentes están presentes en múltiples regiones del SNC del mamífero adulto. Las células progenitoras del SNC pueden también ser aisladas del tejido del SNC disfuncional, por ejemplo tejido afectado por la Enfermedad de Alzheimer, la Enfermedad de Parkinson y el Síndrome de Down. Las células precursoras descritas anteriormente pueden ser usadas en métodos para determinar el efecto de agentes biológicos en células neurales. El término "agente biológico" se refiere a cualquier agente, tal como virus, proteína, péptido, aminoácido, lípido, carbohidrato, ácido nucleico, neuclótido, droga, pro-droga o cualquier sustancia que pueda tener un efecto en las células neurales ya sea este efecto dañino, benéfico o cualquier otro. Los agentes biológicos que son benéficos a las neuronas pueden ser referidos aquí como "agentes neurológicos", un término el cual comprende cualquier sustancia activa biológica o farmacológica que puede probar un uso potencial para la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y/o funcionamiento de las células del SNC o el tratamiento de alguna enfermedad o trastorno neurológico. Por ejemplo, el término puede comprender algunos neurotransmisores, receptores de neurotransmisores, factores de crecimiento, receptores de factor de crecimiento, y similares, así como las enzimas usadas en la síntesis de estos agentes . Para determinar el efecto de un agente biológico potencial sobre las células neurales, un cultivo de células precursoras derivadas de una célula progenitora multipotente es obtenida de un huésped afectado por algún trastorno o padecimiento del SNC o también puede ser obtenido de un tejido normal. La elección del cultivo depende de la sustancia a probar específica y de los efectos que uno desee encontrar. Una vez que las células se obtienen del tejido de un donador deseado, éstas proliferan in vitro en la presencia de un factor de crecimiento. Los efectos de los agentes biológicos en la proliferación y la supervivencia de las células progenitoras y las células madres se determina usando células crecidas de acuerdo al Ejemplo 1. Por ejemplo, usando estos métodos, es posible medir para los agentes biológicos que aumentan la habilidad de proliferación de células progenitoras, las cuales pueden ser útiles para generar grandes números de células para propósitos de trasplante. También es posible de medir los agentes biológicos los cuales inhiben la proliferación celular. En estos estudios de células precursoras están puestas en la presencia de factores biológicos de interés y se ensaya el grado de proliferación el cual ocurre (Ejemplo 4) . Los efectos de los agentes biológicos o combinación con agentes biológicos en la diferenciación y en la supervivencia de células progenitoras y su progene pueden ser determinadas (Ejemplo 3) . Es posible medir las células neurales, las cuales ya han inducido a la diferenciación antes de ser medidas. Es también posible de determinar los efectos de los agentes biológicos del proceso de proliferación y aplicarlos a las células precursoras antes de la diferenciación. Generalmente, los agentes biológicos se añaden y se solubilizan a un medio de cultivo en diferentes concentraciones para determinar el efecto del agente en cada dosis. Este cultivo puede ser rellenado con el agente biológico cada dos días en cantidades para que se pueda mantener la concentración de alguna manera constante. Usando estos métodos de medición, es posible medir las drogas potencialmente que tengan efectos colaterales antes o después de las células del SNC natales haciendo pruebas de los efectos de agentes biológicos en las células progenitoras y las células madre en su proliferación en la proliferización celular progenitora o en la supervivencia y en la función de las células del SNC diferenciadas. Las células precursoras proliferadas están típicamente colocadas en una densidad de alrededor de 5-10 x 106 células/mililitro. Si se desea probar el efecto de algún agente biológico en algún tipo de célula diferenciada o en algún tipo de célula hecha, la porción de las neuronas con las células guales obtenidas después de la diferenciación se puede manipular separando los diferentes tipos de células. Por ejemplo, el anticuerpo 04 (disponible por Borhinger Mannheim) ligado a oligodendrocitos y sus precursores. Usando un procedimiento panorámico, los oligodendrocitos se separan. Los astrocitos se pueden separar después con un procedimiento de ligadura al anticuerpo RAN 2 (disponible en ATCC) . La toxina tetánica (disponible en Boerhinger Mannheim) puede ser utilizada para seleccionar a las neuronas. Después de usar diferentes factores trópicos añadidos a los medios de cultivo durante la diferenciación es posible alterar las porciones fenotípicas. Se incluye a dichos factores trópicos tales como EGF, FGF, BDNF, CNTF, TGFa, GDNF, y similares. Por ejemplo, como se menciona en la Patente de los Estados Unidos U.S Número de Serie 08/221,655, FGF aumenta la porción de neuronas, y el CNTF aumenta la porción de los oligodendrocitos. Cuando el crecimiento de los cultivos se realiza sobre células gliales obtenidas de diferentes regiones del SNC esto afectará el curso de la diferenciación como se describió anteriormente. Pueden obtenerse también cultivos que estén enriquecidos en neuronas dopaminérgicas usando los métodos dispuestos en la solicitud copendiente conjunta de los Estados Unidos Número de Serie 08/482,079. Estos cultivos pueden usarse para probar los agentes biológicos que incluyen en la función celular dopaminérgica y la supervivencia. Las condiciones del cultivo se varían para aumentar el número de neuronas colinérgicas . Los cultivos diferenciados permanecen viables (con el fenotipo intacto) por lo menos durante un mes. Los cultivos obtenidos del tejido de SNC de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, el Síndrome de Down, y similares, pueden ser utilizados para probar el efecto de agentes biológicos en tejido normal. Por ejemplo, cultivos obtenidos de pacientes afectados con la enfermedad Parkinson pueden ser usados para probar la inducción de células dopaminérgicas. Los cultivos obtenidos de pacientes con las enfermedades de Alzheimer o Síndrome de Down pueden ser usados para medir los efectos de agentes biológicos en los niveles de proteína precursora de amiloide (APP) , el cual es anormalmente alto en esos pacientes. Además, el tejido obtenido de algún paciente con la enfermedad de Alzheimer, un trastorno clorinérgico, puede ser usado para probar el efecto de algún agente biológico en la inducción de neuronas colinérgicas .

Los efectos de agentes biológicos son medidos en diferentes intervalos de tiempo y son comparados con los patrones de crecimiento de cultivos control de una base de diferenciación significativa con respecto a criterios tales como porciones de fenotipos expresados (neuronas: células guales, o neurotransmisores u otros marcadores), viabilidad celular, proliferación, alteraciones en la expresión genética, y/o la extensión de la apoptosis. Se pueden analizar las características físicas de las células por observación celular observando la morfología de las neuritas y crecimiento con el microscopio. La inducción de la expresión de nuevos o aumentados niveles o proteínas tales como enzimas, receptores y otras moléculas de superficie celular, o de neurotransmisores, aminoácidos, neuropéptidos y aminas biogénicas que pueden ser analizadas con cualquier técnica conocida en la técnica, la cual puede identificar alteración de dichas moléculas. Estas técnicas incluyen inmunohistoquímica usando anticuerpos en contra de dichas moléculas, o análisis bioquímicos. Tales análisis bioquímicos incluyen ensayos de proteínas, ensayos enzimáticos, ensayos de ligaduras de receptor, ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , análisis electroforéticos, análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) , Western blots, y ensayos radioinmunes (RÍA) . El análisis de ácidos nucleicos tales como Northern blots y la reacción de cadena de polimerasa (PCR) pueden ser usadas para examinar los niveles de mRNA con códigos de dichas moléculas, o por enzimas las cuales sintetizan dichas moléculas. Se puede medir el DNA Genómico usando procedimientos estandarizados y realizados por métodos de escalera para DNA (por ejemplo, la ruptura de enzima específica para DNA), la cual es indicativa de apoptósis. Los factores involucrados en la proliferación de células progenitoras y en la proliferación, la diferenciación y la supervivencia de la progenie de células progenitoras, y/o la respuesta a los agentes biológicos puede ser aislada construyendo librerías de cDNA de células progenitoras o progenia de células progenitoras en diferentes etapas de su desarrollo utilizando técnicas conocidas. Las bibliotecas de células de alguna etapa de desarrollo son comparadas con aquellas de células en diferentes etapas de desarrollo para determinar la secuencia de expresión genética durante el desarrollo y para revelar los efectos de varios agentes biológicos para rectificar nuevos agentes biológicos que pueden alterar la expresión genérica de las células del SNC. Cuando las bibliotecas están preparadas del tejido disfuncional, los factores genéricos pueden identificarse el papel y la causa de la disfunción comparando a las bibliotecas de tejidos disfuncionales con aquellos de tejidos normales. La información puede usarse en el diseño de terapias para tratar estos padecimientos. Además, estos depósitos pueden ser identificados para el uso en diagnóstico de varios trastornos genéticos o para el uso de la identificación de células neurales en alguna etapa de desarrollo particular. Análisis electrofisiológicos pueden ser usados para determinar los efectos de agentes biológicos sobre las características neuronales tales como el potencial de membrana de reposo, potenciales evocados, la dirección y la naturaleza iónica del flujo de corriente y la dinámica de canales de iones. Estas mediciones pueden usando cualquier técnica conocida, incluyendo grabación de una unidad simple de voltaje extracelular, grabación de voltaje intracelular deslizamiento de voltaje y deslizamiento por parte. Se pueden utilizar transmisiones sensitivas al voltaje y electrodos sensibles a iones. Para que la invención descrita aquí pueda entenderse mejor, los siguientes ejemplos se describen a continuación.

Debería entenderse que estos ejemplos tendrán propósitos de ilustración solamente y no fueron hechos para limitar la visión de la invención en ninguna forma. Ejemplo 1 Propagación de células precursoras En el día embriónico 14 (E14) CDj. ratones albinos (Charles River) fueron decapitados y el cerebro y cuerpo estriado fueron sacados usando procedimientos estériles. El tejido fue disociado mecánicamente con una pipeta Pasteur pulida a fuego en un medio compuesto libre de suero por una mezcla de 1:1 de medio Dulbecco y medio Eagle modificado (DMEM) y una mezcla nutricional F-12 (Gibco) . Las células fueron centrifugadas a 800 revoluciones por minuto durante 5 minutos, y el supernatante aspirado, y las células se volvieron a suspender en DMEM/F-12 para su cuantificación. Las células fueron suspendidas en el medio libre de suero, también aquí llamado "medio completo", compuesto por DMEM/F-12 (1:1) el cual incluyó glucosa (0.6%), glutamina (2 mM) , bicarbonato de sodio (3 mM) , HEPES (4- [2-hidroxietil] -1-ácido piperazinetansulfónico) tampón (5 mM) y una mezcla de hormona definida y una mezcla salina (para reemplazar el suero) que incluye insulina (25 µg/ml) , transferrina (100 µg/ml) , progesterona (20 nM) , putrescina (60 µM) , y cloruro de selenio (30 nM) (todos de Sigma excepto glutamina [Gibco] ) . Además, el medio contenía 16-20 ng/ml EGF (un purificado del submaxilar del ratón, Collaborative Research) o TFGa (recombinante humano, Gibco) . Las células fueron distribuidas en 0.2 x 106 células/mililitro en 75 cm2 de cultivo de tejido en matraces (Corning) sin substrato pretratado y colocado en una incubadora a 37°C, 100% de humedad, 95% de aire/5% de C02.

Cuando las células proliferaron, dentro de las primeras 48 horas y por 3-4 días in vitro (DIV) , éstas formaron pequeños grupos, conocidos como neuroesferas, que ascendieron del substrato entre 4-6 DIV (Figura 1) . Las neuroesferas contenían células precursoras indiferenciadas, por ejemplo células progenitoras y células madre. Después de 7 DIV, las neuroesferas fueron retiradas, centrifugadas a 400 revoluciones por minuto por 2-5 minutos, y si el granulo fue disociado mecánicamente en células individuales con una pipeta Pasteur de vidrio pulida a fuego en 2 mis de medio completo. 1 x 106 células fueron desplazadas en 75 cm2 de cultivo de tejido en un matraz con 20 mililitros de EGF-de medio completo. La proliferación de células progenitoras y la formación de nuevas neuroesferas fue reiniciado. Este procedimiento puede repetirse cada 6-8 días. Ejemplo 2 Diferenciación de neuroesferas Las neuroesferas fueron diferenciadas usando los paradigmas siguientes. Al utilizar cualquiera de los siguientes paradigmas se pueden producir neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Sin embargo, al añadir ciertos factores de crecimiento o recombinación de factores de crecimiento se puede alterar las porciones fenotípicas obtenidos después de la diferenciación. Además, la utilización de camas alimentadoras guales pueden influenciar las porciones fenotípicas obtenidas. Las neuroesferas usadas por cada uno de los paradigmas siguientes fueron generados como se describe en el Ejemplo 1. Todas las neuroesferas usadas fueron aprobadas por lo menos una vez antes de su diferenciación. Paradigma 1 — Diferenciación rápida de neuroesferas De seis a 8 días después del primer paso, las neuroesferas fueron removidas y centrifugadas a 400 revoluciones por minuto. El EGF contenido en el supernatante fue desplazado y el granulo suspendido en el medio libre completamente de EGF conteniendo suero fetal bovino al 1% (FBS) . Las neuroesferas (aproximadamente 0.5-1.0 x 106 células/pozo) fueron colocadas en cubreobjetos de vidrio cubiertos por poli-L-ornitina (15 µg/ml) en un Nuclon de 24 pozos (1.0 ml/pozo) platos de cultivo. Después de 24 horas de cultivo, los cubreobjetos fueron transferidos a platos de cultivo de 12 pozos (Costar) conteniendo el medio completo al 0.5% FBS. El medio de cultivo fue cambiado cada 4-7 días. Este procedimiento de diferenciación es conocido como "Paradigma de Diferenciación Rápida" o RDP. Paradigma 2 — Diferenciación de las neuroesferas disociadas De seis a 8 días después del primer paso, las neuroesferas fueron retiradas y centrifugadas a 400 revoluciones por minuto. Se retiró el medio que contenía EGF y el granulo fue suspendido en un medio completo libre de EGF que contenía 1% de FBS. Las neuroesferas fueron disociadas mecánicamente en células sueltas con una pipeta Pasteur pulida al fuego y centrifugadas a 800 revoluciones por minuto durante 5 minutos. Entre 0.5 x 106 y 1.0 x 106 células fueron puestas en un cubreobjetos de vidrio envuelto en poli-L-ornitina (15 µg/ml) en un plato de cultivo de 24 pozos Nuclon (1.0 ml/pozo). El medio libre de EGF que contenía 1% FBS fue cambiado cada 4-7 días. Paradigma 3 — Diferenciación de neuroesferas simples Las neuroesferas fueron lavadas del EGF varias veces a través de cambios de medio libre de EGF. Las neuroesferas individuales fueron colocadas sobre un cubreobjetos de vidrio cubiertos por poli-L-ornitina (15 µg/ml) en una placa de 24 pozos. El medio de cultivo usado fue completado con o sin 1% FBS. El medio fue cambiado cada 4-7 días. El etiquetamiento triple inmunocitoquímico reveló que los tres tipos de células neurales, por ejemplo neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, se derivaron clónicamente de neuroesferas sencillas (Figura 2) . Paradigma 4 — Diferenciación de neuroesferas disociadas simples Las neuroesferas fueron lavadas del EGF a través de una serie de transferencias a través de cambios de medios de cultivo libres de EGF. Una neuroesfera simple fue disociada mecánicamente en tubo centrífugo Eppendorf a 0.5 mi y todas las células fueron colocadas sobre plato de cultivo cubierto de 35 milímetros de poli-L-ornitina. El medio completo fue usado con o sin 1% de FBS. Paradigma 5 — Diferenciación de las neuroesferas co-cultivadas con astrocitos estriatales Las neuroesferas, derivadas de las células estriatales como se describió en el Ejemplo 1 fueron etiquetadas con 5-bromodeoxiuridina (BrdU) y lavadas de EGF. Una cama alimentadora de astrocitos fue generada del tejido estriatal de ratones postnatales (0-24 horas) , y puestos sobre cubreobjetos de vidrio cubiertos con poli-L-ornitina en un plato de cultivo de 24 pozos. Cuando los astrocitos estuvieron efluentes, una neuroesfera disociada o intacta fue puesta sobre cada cama de astrocitos. El medio de cultivo completo fue cambiado después de las primeras 24 horas y entonces cada cuarenta y ocho horas . Cuando aparecieron neuronas que contenían glutamato metencefalina, aparecieron además neuronas con Substancia Pérgica y GABAergica, además de somatostatina y NPY (Figura 3) . Ejemplo 3 Presentación de Drogas y Otros Agentes Biológicos para Diferentes Efectos A. Efectos de BDNF sobre la Diferenciación y Supervivencia de Neuronas y Células Guales Las células precursoras fueron propagadas como se describió en el Ejemplo 1 y diferenciadas usando el Paradigma 3 descrito en el Ejemplo 2. En el momento de la colocación de las células generadas con el EGF, se añadió BDNF en una concentración de 10 ng/ml. A los 3, 7, 14, y 21 días in vitro (DIV) , las células fueron procesadas por inmunocitoquímica indirecta. El etiquetamiento BrdU se usó para monitorizar la proliferación de las células precursoras. Los efectos de BDNF sobre las neuronas, oligodendrocitos y astrocitos fue ensayado por pruebas hechas en los cultivos con anticuerpos que reconocían altígenos encontrados en las neuronas (MAP-2, NSE, NF) , oligodendrocitos (04, GalC, MBP) o astrocitos (GFAP). La supervivencia celular fue determinada contando el número de células inmunoreactivas en cada momento y se hicieron observaciones morfológicas. El BDNF aumentó significativamente la diferenciación y la supervivencia de neuronas sobre el número observado bajo condiciones de control (Figura 4). El número de astrocitos y oligodendrocitos no se alteraron significativamente los valores control. B. Efectos del BDNF en la Diferenciación de Fenotipos Neuronales Las células tratadas con BDNF de acuerdo a los métodos descritos en la Parte A fueron probados con anticuerpos que reconocen neurotransmisores o enzimas involucradas en la síntesis de transmisores neurales. Éstas incluían la hidroxilasa de tirosina (TH) , la cetiltransferasa de colina (ChAT) , la substancia P, GABA, somatostatina, y glutamato. En ambos el control y las condiciones de cultivo tratados con BDNF, salió positivo el resultado en las neuronas a la presencia de la sustancia P y GABA. (Figura 5) También como el aumento en el número de neuronas crecidas en BDNF mostró un incremento en la extensión de las neuritas y la ramificación cuando fueron comparadas con ejemplos de control (Figura 6) . C. Identificación del Factor de Crecimiento en Células Sensibles Las células que son sensibles al factor de crecimiento fueron identificadas por la diferenciación de la progene generada por EGF como se describió en el Ejemplo 2, paradigma 3 y en la adición de 1 DIV aproximadamente 100 ng/ml de BDNF. l, 3, 6, 12 y 24 horas después de la adición de BDNF las células se fijaron y fueron procesadas por un etiquetamiento doble de inmunocitoquímica. Se utilizaron anticuerpos que reconocen neuronas (MAP-2, NSE, NF) , oligodendrocitos (04, GalC, MBP) o astrocitos (GFAP) fueron usados en combinación con un anticuerpo que inmediatamente reconoce genes prematuros como el c-fos. La exposición al BDNF resultó en un incremento selectivo en la expresión de el c-fos en las células neuronales (Figura 6) .

D. Efectos del BDNF en la Expresión de los Marcadores y los Efectos Reguladores Durante la Diferenciación y la Proliferación Las células tratadas con BDNF de acuerdo a los métodos descritos en la Parte A son procesados por análisis de la expresión del FGF-R1, y descritos en el Ejemplo 5 u otros marcadores y factores reguladores, como descrito en el Ejemplo 6. E. Efectos de la Administración de BDNF Durante la Diferenciación en las Propiedades Electrofisiológicas de las Neuronas Las neuronas tratadas con BDNF durante la diferenciación, de acuerdo a los métodos descritos en la Parte A, son procesados para determinar las propiedades electrofisiológicas, descrito en el Ejemplo 7. F. Efectos de la Cloropromacina en la Proliferación, Diferenciación y Supervivencia de la Progenia Celular Generada por el Factor de Crecimiento La cloropromacina, un medicamento ampliamente usado en el tratamiento de enfermedades psiquiátricas, se usa en concentraciones que van desde los 10 ng/ml hasta los 1000 ng/ml en lugar de BDNF en los Ejemplos 3A hasta el 3E anteriores. Los efectos de este medicamento en diferentes concentraciones sobre la proliferaciones de células progenitoras en términos de diferenciación y supervivencia fueron monitorizados. Alteraciones en la expresión genética y las propiedades electrofisiológicas de la diferenciación neuronal fueron determinadas . G. Efectos del Deprenil sobre las Células Dopaminérgicas en su Diferenciación y Supervivencia Los primeros cultivos fueron preparados según los métodos en el Ejemplo 1. Las células se diferenciaron para aumentar el número de neuronas parminérgicas . Neuroesferas simples no disociadas de 6 días de edad fueron usadas en un cubreobjetos cubierto con poli-L-ornitina en un medio de cultivo completo con células guales de rata B-49 (75%) +20 ng/ml FGF-2, e incubados a 37°C, 100% de humedad, 95% de aire/5% de bióxido de carbono C02. El deprenil, un medicamento usado en el tratamiento sobre la enfermedad de Parkinson, se añadió a los cultivos en concentraciones que iban de 1 ng/ml a 1000 ng/ml hasta la aparición de la diferenciación y/o la diferenciación se había completado. El número de células dopaminérgicas supervivientes fueron contadas a intervalos y comparadas con cultivos control. Además, los ensayos bioquímicos para medir la expresión de los neurotransmisores y el análisis de los ácidos nucleicos fueron hechos. Ejemplo 4 Los Ensayos de Proliferación de Células Progenitoras Se obtuvieron células primarias de ratones E14 y se prepararon como se discutió en el Ejemplo 1. Se añadieron cualquiera de EGF, EGF y FGF o EGF y BMP-2 para completar el medio de cultivo a una concentración de 20 ng/ml sobre cada factor de crecimiento, con la excepción de BMP-2 el cual se añadió a concentraciones de 10 ng/ml. Se diluyó la concentración de células con cada medio de concentración de factor de crecimiento a una concentración de 25,000 células/ml. 200 µl de la combinación de célula/medio de cultivo son vertidos con una pipeta hacia el pozo (Nuclon) de 96 pozos sin ningún tratamiento previo en el substrato. Se incubaron las células bajo las mismas condiciones como fue descrito en el Ej emplo 1. Después de 8-10 DIV se contó el número de neuroesferas y se tabularon los resultados. Como se indicó en la Figura 7, crecieron las células en combinación con EGF y FGF y se produjeron mayor número de neuroesferas que de células crecidas en presencia de EGF. La combinación de EGF y BMP-2 inhibió el desarrollo de neuroesferas. Ejemplo 5 Comparación del Receptor y la Expresión del Factor de Crecimiento en la Progenie de Células Progenitoras Diferenciadas contra No Diferenciadas a Través de Reacción en Cadena Reversa de Transcripción-Polimerasa (RT-PCR) Se generaron neuroesferas como descrito en el Ejemplo 1, algunas fueron diferenciadas según el Paradigma 1, Ejemplo 2. Se aisló RNA de neuroesferas diferenciadas y de neuroesferas indiferenciadas de acuerdo al procedimiento de fenol ácido tiocianato guanidina de Chomzynski y Sacchi -Anal, Biochem. 162: 156-159 1987)]. El DNA complementario (cDNA) se sintetizó del RNA total usando la transcriptasa reversa preparado con oligo dT. Las preparaciones específicas de genes fueron diseñadas y sintetizadas para usarse en PCR para ampliar los cDNAs complementarios para diferentes factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento. El material amplificado fue depositado en geles de agarosa junto con marcadores de peso molecular para asegurar que los productos de PCR fueran del tamaño esperado, mientras que la identidad de los fragmentos de PCR se confirmó por la restricción del análisis enzi ático y mediciones secuenciales [Arcellana-Panlilio, Methods Enzymol. 225:303-328 (1993)]. La Figura 8 es una fotografía de una gel agarosa teñida con etidio visto con transiluminación vía de rayos ultravioleta mostrando tres receptores de factor de crecimiento, llamados EGF-R, FGF-R, y LIF-R, en células derivadas progenitoras diferenciadas e indiferenciadas. La Tabla I enlista las primeras muestras analizadas y sus resultados tanto de células diferenciadas o de células indiferenciadas .

TABLA I Primeras Muestras Analizadas Células Células Indiferencia .das Diferenciadas Actina + + NGF + nd EGFr-1 + + bFGFr + + LI r* + + hidroxilasa de tirosina + + acetiltransferasa de colina nd - colecistoquininam nd + encefalina" nd + quinasa rA de tirosina + + quinasa rB de tirosina + +++++ quinasa rC de tirosina + + r = receptor m = células derivadas de ratón nd = no hay datos disponibles Ejemplo 6 Aislamiento de Marcadores Novel y Factores de Regulación Involucrados en la Poliferación y la Diferenciación de Células Progenitoras Neurales Se generaron neuroesferas como se describió en el Ejemplo 1 usando tejido de ratones albinos CDX (Charles River) .

Algunas de las neuroesferas fueron seleccionadas para diferenciar de acuerdo al paradigma de diferenciación rápida del Ejemplo 2 produciendo cultivos ricos en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El RNA fue extraído en las neuroesferas indiferenciadas también como de los cultivos de células diferenciadas usando el método de fenol ácido tiocianato guanidinina descrito en el Ejemplo 5. RNA mensajero (mRNA) se aisló por explotación del poli tracto A que se extendía hasta U's hasta T's. La transcripción reversa del mRNA producido por la cDNA, se usa para usar las bibliotecas primarias y hacer vectores de fagos lambda o plásmidos [Rothstein y colaboradores, Methods in Enzymology 225: 587-610 (1993)]. Para aislar cDNA que son específicos de las células progenitoras diferenciadas como las indiferenciadas, cDNA complementario tanto como el RNA fueron hibridizados ambos. El cDNAs no hibridizado en cada caso fue utilizado para la construcción de bibliotecas de substrato [López-Fernández del Mazo, Biotechniques 15 (4) : 654-658 (1993)]. Las bibliotecas específicas de cDNA complementarios y de células diferenciadas tanto como de células indiferenciadas proveen una fuente de clones para marcadores novel y factores de regulación involucrados en la proliferación en la diferenciación de células progenitoras de SNC. Los cDNAs son estudiados por el análisis secuencial para detectar la secuencia específica como pistas para identificar la función, y una base de datos que busque transcripciones conocidas de homologías. Con el uso de cDNAs en la hibridización de varias muestras de RNA electroforésis sobre una gel de agarosa-formaldehído y transferido a una membrana de nilón, permitió la estimación del tamaño, la sustancia relativa, y la especificidad de las transcripciones. Todas las porciones de cDNAs fueron usadas para hacer visiones de otras bibliotecas y de manera que se pudiera obtener secuencias completas de mRNA en la información de secuencia genómica. Los anticuerpos específicos dirigidos contra las proteínas de fusión generados por cDNAs se usaron para detectar proteínas específicas hasta la población de células en particular, los métodos de inmunocitoquímica y por Western Blot analysis. La secuencia de genes específica se utilizó para aislar proteínas que interactúan con elementos regulatorios putativos que controlan la expresión genética. Estos elementos regulatorios se usan para conducir la expresión de un gen exógeno, tal como la beta-galactosidasa . Ejemplo 7 Análisis Electrofisiológico de las Neuronas Generadas por Factor de Crecimiento - Células Progenitoras Sencillas y Exposición a Agentes Biológicos Se generaron neuroesferas como se describió en el Ejemplo 1. Las neuroesferas fueron disociadas usando la técnica descrita en el paradigma 2, Ejemplo 2. Las células derivadas clónicamente fueron puestas en una densidad baja y diferenciadas en la presencia de bFGF. Las propiedades electrofisiológicas de las células con su morfología aparente de neuronas fueron determinadas como está descrito por Vescovi y colaboradores. [Neuron, 11; 951-966 (1993) ] . Bajo electrodo de pisamiento de corriente de célula completa, el potencial de reposo medio y la resistencia de entrada fue de -62 ± 9mV y 372 ± MO. LOS pasos de corriente de supraumbral rectangular, (~100 pA) redujeron potenciales de respuesta regenerativos en los cuales la amplitud y el curso del tiempo fueron dependientes del estímulo (Figura 9) . Después de completar los experimentos electrofisiológicos, la morfología de la célula fue vista por la excitación intracelular de 5-carboxifluorosceina. Ejemplo 8 Visión de los Efectos de Medicamentos y Otros Agentes Biológicos en el Factor de Crecimiento - Progene Celular de Células Progenitoras Sensibles de Tejidos Obtenidos a Pacientes con Trastornos Neurológicos Los efectos de BDNF sobre el EGF las células progenitoras sensibles generadas de tejido del CNS obtenida por biopsia de algún paciente con la enfermedad de Huntington y determinar el uso de los métodos descritos en el Ejemplo 3, A hasta E. El BDNF es un factor de diferenciación potente para las neuronas GABAerigcas y promueve el crecimiento neuronal extensivo (Figura 5B) . La Enfermedad de Hungtington se caracteriza por la pérdida de neuronas GABAergicas (entre otras) del cuerpo estriado. Ejemplo 9 Regulación de la Proteína Precursora de Amiloide (APP) y por Factores de Crecimiento Se obtuvo un tejido nervioso de un feto con Síndrome de Down de su SNC y se generaron neuroesferas usando el método del Ejemplo 1 y se obtuvieron el número de células requeridas. Se diferenciaron las células usando cualquiera de los paradigmas descritos en el Ejemplo 2. En el momento de su aislamiento, se utilizaron varias sustancias: CNTF, BMP-2, activina, FGF-2 y ácido retinóico al medio de cultivo en los pozos experimentales a una concentración de 10 ng/ml y añadidos cada dos días a una concentración de 2 ng/ml. Después de 3, 7 y 14 DIV, se determinaron los niveles de APP y mRNA así como de proteína. Para el análisis de Northern Blot, se extrajo el RNA con el método de isocianato de guanidina/cloruro de cesio [Goodison y colaboradores, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52(3): 192-198 (1993) ] . Las pruebas de Northern blots fueron corridas y probadas usando la codificación de cDNA humano en el dominio de inhibidor de proteasa de APPKPI o una base a prueba de una base de 30 pares oligonucleótidos específicos para APP695. Para análisis de Western Blot, se homogeneizaron células en una solución amortiguadora de Laemmli, hervido y sujeto a un gel de SDS-PAGE. El gel fue inmunoblotizado y probado con una dilución anti-APP de 1:1000. Los niveles de APP mRNA y la expresión de proteína se compararon con cultivos control . Ejemplo 10 Análisis de los Eventos Apopticos Utilizando la Progene Celular de Células Progenitoras Neurales Proliferadas A. Análisis de la Apoptósis Espontánea Se prepararon neuroesferas proliferadas de ratones usando los métodos del Ejemplo 1 y cosechadas después de 3, 5, 7, 9, 12 y 15 días de cultivo. Las neuroesferas de ratón fueron diferenciadas usando el método del Ejemplo 2, paradigma 1 y cosechadas después de 1, 4, 7, 10, 13 y 16 días de cultivo. Se produjo la lísis celular en 1 mi de DNAzol (Gibco/BRL) y DNA genómico fue vaciado después de la precipitación con 500 µl de etanol. El DNA genómico fue cuantificado por densidad óptica a 260 nm. La extensión de escalera del DNA indicativo de apoptosis fue detectada disolviendo 250 ng de DNA en 50 µl 100 nM de cacodilato de potasio (pH 7.2), 2 mM CoCl2, 0.2 nM DTT, 50 µCl [a32P]dATP y 25 unidades terminales de transferasa deoxinucleotidilo. La reacción se incubó de 60 minutos a 37°C. Los productos radioactivos fueron analizados por electroforesis en un gel al 2% y autoradiografiados. El análisis morfológico y bioquímico de la proliferación y del número de células en los cultivos de neuroesferas diferenciadas indican que las células que se encajaron activamente en una aptosis espontánea fueron menos del 20% a más del 50% con el incremento a partir de los días del cultivo. B. El Análisis de RT-PCR de Reguladores de Potencial de Apoptosis en Cultivos de Células Progenitoras Neuronales La actividad de moléculas reguladoras de apoptosis putativa conocida se estimó por análisis de RT-PCR. Se prepararon progenes de neuronas diferenciadas y proliferadas usando el método del Ejemplo 1 y 2. Se precisó la transcripción reversa del análisis de PCR de apoptosis putativa conocida a través de transcripciones de mRNA mensajero regulatorio. Las células fueron Usadas en una reacción de 1 mi de RNAzol (Gibco/BRL) , se separaron las bases acuosas y orgánicas añadiendo cloroformo a 0.2 volúmenes y el RNA total fue aislado de la fase acuosa por precipitación con la adición de un volumen igual de isopropanol. El RNA fue cuantificado por densidad óptica entre 260 y 280 nm. El análisis de Reacción de Cadena de polimerasa de 0.5 µl producto de la transcripción reversa fue precisado en 25 µL 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 50 mM KC1, 0.2 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 0.5 µM y 1.25 unidades de polimerasa. Los parámetros cíclicos típicos fueron de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto repitiendo esto por 30 ciclos. Se analizaron más de 30 reguladores de potencial en apoptosis neuronales incluyendo a los factores de crecimiento, los receptores de factor de crecimiento, los factores de transcripción, incluyendo miembros de la familia de proteínas Bcl-2 y a la familia de proteasas de las enzimas convertidoras interleucinas. Se detectaron miembros de expresión diferencial de cada familia de proteínas. C. Detección de Reguladores de Potencial Desconocido Clónico de Apoptosis Neuronal Se determinó la actividad del potencial regulatorio de las transcripciones conocidas y la apoptosis neuronal utilizando el análisis de huellas digitales para mRNA. Se prepararon cultivos de células progenitoras neuronales murinas diferencias y proliferadas y cosechadas como se describió anteriormente y se precisaron las moléculas reguladoras de apoptosis putativa desconocida por análisis de huellas digitales para RNA mensajero. Las células fueron usadas en 1 mi de RNAzol (Gibco/BRL) , se separaron las fases acuosas y orgánicas con la adición de cloroformo de 0.2 volúmenes y un total de RNA fue aislado de la fase acuosa por precipitación con la adición de un volumen igual de isopropanol. El RNA fue cuantificado por densidad óptica de 260 y 280 nm. Se precisó la transcripción reversa y el análisis de Reacción en Cadena de Polimerasa como descrito anteriormente. Se separaron los productos radioactivos en una gel secuencial de acrilamida al 8% y analizado por autoradiografía. Las bandas expresadas diferencialmente fueron separadas del gel, secuenciadas y se volvieron a ampliar. D. Establecimiento de Células Progenitoras Genéticamente Modificadas por Ensayos de Alta Transparencia de Compuestos Anti-Apoptosis Se modificaron genéticamente células progenitoras neuronales murinas y humanas para proveer un ensayo de alta transparencia para un uso terapéutico potencial de compuestos antiapoptosis. Utilizando un número directo de técnicas de tranfección, constructores DNA que contuvieran proteínas marcadoras citoplásticas (proteína fluorescente verde (GFP) o secretada (fosfatasa alcalina secretada (SEAP) ) producidas por la apoptosis regulatoria de promotores de moléculas (incluyendo Bcl-2, ICE y Nur-77) están transformadas establemente a células progenitoras neurales humanas y murinas. Para la transformación utilizando lipofectamina (BRL) , las células fueron sembradas en proporción 2-3 x 106 células por 35-mm plato de cultivo incubado con 200 µl de DNA de complejos de liposomas (3 µg DNA, 20 µl lipofectamina (BRL) en 200 µl medio) por 12 horas a 37°C. El efecto de la variedad de los compuestos de la apoptosis neuronal se determina mediante el efecto de la aplicación de los compuestos que tiene una expresión sobre el marcador de genes bajo el control de promotores genéticos reguladores de apoptosis por inmunofluorescencia (GFP) o la actividad de la fosfatansa alcalina secretada (SEAP) . Todas las referencias y solicitudes pendientes requeridas aquí incorporadas por referencia.

Claims (35)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para determinar el efecto por lo menos un agente biológico sobre las células precursoras neurales comprende : (a) la disociación de tejido neural de mamífero contenido por lo menos en una célula progenitora multipotente, (b) proliferar dichas células progenitoras potentes en un medio de cultivo que contenga por lo menos un factor de crecimiento para obtener un factor de crecimiento para obtener un cultivo de células precursoras proliferadas, (c) contactar dichas células precursoras proliferadas con algún agente biológico dados, y (d) determinar los efectos de dicho agente biológico o sobre las células precursoras dichas.
2. 2. El método de la reivindicación 1 en donde dicho factor de crecimiento es seleccionado del un grupo que consiste en EGF, bFGF, o la combinación de la EGF y bFGF.
3. 3. El método de la reivindicación 1 en donde se define dicho cultivo.
4. 4. El método de la reivindicación 1 en donde dicho tejido neural de mamíferos es obtenido desde un mamífero después del nacimiento.
5. 5. El método de la reivindicación 1 en donde dicho tejido neural del mamífero es obtenido de un donador humano.
6. 6. El método de la reivindicación 5 en donde un ser humano es afligido de algún trastorno o padecimiento neurológico.
7. 7. El método de la reivindicación 6 en donde dicho agente biológico es un agente terapéutico potencial para dicho trastorno o padecimiento neurológico.
8. 8. El método de la reivindicación 7 en donde trastorno neurológico o trastorno es seleccionado de un grupo que consiste de Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson o Síndrome de Down.
9. 9. El método de la reivindicación 1 ó 6 en donde dichos efectos del paso (d) son determinados por comparación de una biblioteca de genes de células precursoras proliferadas del paso (c) el cual ha sido puesto en contacto con dicho agente biológico con una biblioteca de genes de células precursoras proliferadas en el paso (b) el cual no ha sido puesto en contacto por dicho agente biológico.
10. 10. Un método para determinar el efecto o por lo menos un agente biológico en la diferenciación de células neurales comprende: (a) la disociación de tejido neural mamífero que contenga por lo menos una célula progenitora multipotente, (b) proliferar dicha célula progenitora multipotente en un medio de cultivo primario que contenga por lo menos un factor de crecimiento para obtener un cultivo de células precursoras proliferadas, (c) inducir a dichas células precursoras proliferadas a diferenciar en un segundo medio de cultivo en la presencia de algún agente biológico dado, y (d) determinar el efecto de dicho agente biológico sobre la diferenciación de dichas células precursoras.
11. 11. El método de la reivindicación 10 en donde dicho factor de crecimiento es seleccionado del grupo que consiste de EGF, bFGF o la combinación de EGF y bFGF.
12. 12. El método de la reivindicación 10 en donde dicho medio de cultivo primario es definido.
13. 13. El método de la reivindicación 10 en donde dicho tejido neural de mamífero es obtenido de un joven o adulto.
14. 14. El método de la reivindicación 10 en donde el tejido neural de mamífero es obtenido de un donador humano.
15. 15. El método de la reivindicación 16 en donde dicho humano es afligido de algún trastorno o padecimiento neurológico.
16. 16. El método de la reivindicación 16 en donde dicho agente biológico es un agente terapéutico potencial para algún trastorno o padecimiento neurológico.
17. 17. El método de la reivindicación 16 en donde el padecimiento neurológico trastorno seleccionado del grupo que consiste de Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, o Síndrome de Down.
18. 18. El método de la reivindicación 10 ó 15 en donde los pasos de los efectos (d) son determinados por la comparación de la biblioteca de genes de las células precursoras proliferadas en el paso (c) el cual ha sido puesto en contacto con dicho agente biológico con una librería de genes de las células precursoras proliferadas en el paso (b) el cual no ha estado en contacto con dicho agente biológico.
19. 19. El método de la reivindicación 10 en donde las células precursoras proliferadas son inducidas a diferenciarse en la presencia de factores trópicos para manipular el fenotipo de dichas células diferenciadas.
20. 20. El método de la reivindicación 10 en donde el medio de cultivo comprende una capa de células alimentadoras guales.
21. 21. Un método para determinar el efecto de por lo menos un agente biológico sobre las células neurales diferenciadas comprende: (a) disociación de tejido neural mamífero que contenga por lo menos una célula progenitora multipotente, (b) la proliferación de dicha célula progenitora multipotente del primer medio de cultivo que contenga por lo menos un factor de crecimiento para obtener cultivo de células precursoras proliferadas, (c) inducir a dichas células precursoras proliferadas a diferenciar el segundo medio de cultivo para obtener células neurales diferenciadas en otro cultivo, (d) poner en contacto a dichas células neurales diferenciadas con agentes biológicos, y (e) determinar los efectos de dichos agentes biológicos sobre dichas células neurales diferenciadas.
22. 22. El método de la reivindicación 21 en donde dicho factor de crecimiento es seleccionado desde un grupo que consiste de EGF, bFGF, o la combinación de EGF y bFGF.
23. 23. El método de la reivindicación 21 en donde dicho medio de cultivo es definido.
24. 24. El método de la reivindicación 21 en donde el tejido neural de mamífero es obtenido a partir de algún joven o adulto.
25. 25. El método de la reivindicación 21 en donde el tejido neural de mamífero es obtenido de algún donador humano.
26. 26. El método de la reivindicación 25 en donde dicho humano es afligido con algún trastorno o padecimiento neurológico.
27. 27. El método de la reivindicación 26 en donde dicho agente biológico es un agente terapéutico potencial para dicho trastorno o padecimiento neurológico.
28. 28. El método de la reivindicación 26 en donde el trastorno neurológico o padecimiento es seleccionado de un grupo que consista de la Enfermedad de Alzheimer, la Enfermedad de Parkinson o el Síndrome de Down.
29. 29. El método de la reivindicación 21 ó 26 en donde dichos efectos del paso (e) está determinado por la comparación de una biblioteca de genes de unas células neurales diferenciadas en el paso (d) el cual ha sido puesto en contacto con los agentes biológicos con una biblioteca de genes de las células neurales diferenciadas en el paso (c) el cual no ha sido puesto en contacto con dicho agente biológico.
30. 30. El método de la reivindicación 21 en donde las células precursoras proliferadas son inducidas a diferenciarse en la presencia de un factor trópico para manipular su fenotipo de dichas células diferenciadas.
31. 31. El método de la reivindicación 21 en donde dicho segundo medio de cultivo comprende una capa de células alimentadoras guales.
32. 32. Un biblioteca de cDNA preparada de células neurales.
33. 33. La biblioteca de cDNA de la reivindicación 32 en donde dichas células neurales son células progenitoras neurales .
34. 34. La biblioteca de cDNA de la reivindicación 32 y en donde dichas células neurales son células precursoras.
35. 35. La biblioteca de cDNA de la reivindicación 32 en donde dichas células neurales son células seleccionadas diferenciadas del grupo que consiste de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos . 36 La biblioteca de cDNA de la reivindicación 32 en donde dichas células neurales son derivadas de un ser humano afectado por algún trastorno o padecimiento neurológico.