DE69535300T2

DE69535300T2 - In-vitro-Musters für ZNS - Funktion und Dysfunktion

Info

Publication number: DE69535300T2
Application number: DE69535300T
Authority: DE
Inventors: Brent Salt Spring Island Reynolds; Samuel Calgary Weiss
Original assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Current assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2015-09-23
Also published as: FI971168A0; PT783693E; EP1130394B1; WO1996009543A1; DE69535300D1; ATE208495T1; CA2200709A1; AU3515295A; MX9702126A; FI971168A; AU714837B2; KR970706490A; NO971245D0; DK1130394T3; DK0783693T3; EP0783693A1; ATE345496T1; NO971245L; EP0783693B1; DE69523771D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Das voll entwickelte menschliche Nervensystem ist aus Milliarden von Zellen zusammengesetzt, die während der Entwicklung aus einer kleinen Anzahl von Vorläufern erzeugt werden, welche in dem Neuralrohr lokalisiert sind. Das Studium von Entwicklungswegen des zentralen Nervensystems (ZNS) wie auch von Veränderungen, die im ZNS von ausgewachsenen Säugetieren aufgrund einer Dysfunktion auftreten, war aufgrund der Komplexität des Säugetier-ZNS schwierig. Solche Dinge könnten besser untersucht werden, wenn relativ einfache Modelle des ZNS unter definierten Bedingungen verwendet würden.
Im Allgemeinen sind zwei Ansätze gemacht worden, um kultivierte ZNS-Zellen zu untersuchen: Die Verwendung primärer neuronaler Kulturen; und die Verwendung neuronaler Zelllinien. Primäre neuronale Kulturen von Säugetieren können aus nahezu allen Bereichen des Gehirns erzeugt werden, unter der Voraussetzung, dass das Ausgangsmaterial aus fötalen Tieren oder solchen kurz nach der Geburt erhalten wird. Im Allgemeinen können drei Typen von Kulturen erzeugt werden, die entweder mit Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten angereichert sind. Primäre ZNS-Kulturen haben sich als wertvoll erwiesen, um viele Mechanismen der neuronalen Funktion aufzudecken, und werden verwendet, um die Wirkungen exogener Agentien auf sich entwickelnde und reife Zellen zu untersuchen. Während primäre ZNS-Kulturen viele Vorteile haben, leiden sie an zwei Hauptnachteilen. Zuerst müssen aufgrund der begrenzten Proliferationsfähigkeit von primären neuronalen Zeilen neue Kulturen aus mehreren verschiedenen Tieren erzeugt werden. Während gewöhnlich sehr darauf geachtet wird, Gewebe in identischen Stadien der Entwicklung und aus identischen Bereichen des Gehirns zu erhalten, ist es praktisch unmöglich, primäre Kulturen zu erzeugen, die identisch sind. Somit existiert ein signifikanter Grad an Variabilität von Kultur zu Kultur.
Ein zweiter Nachteil der primären Kulturen besteht darin, dass das Gewebe aus Föten oder Tieren kurz nach der Geburt erhalten werden muss. Wenn primäre Kulturen auf einer regelmäßigen Basis durchgeführt werden sollen, erfordert dies die Verfügbarkeit einer großen Quelle von Ausgangsmaterial. Während dieses im Allgemeinen zur Erzeugung von primären Kulturen aus einigen Spezies (z. B. Nagern) kein Problem ist, ist es dieses für andere (z. B. Primaten). Aufgrund des begrenzten Vorrats und ethischer Bedenken ist das Kultivieren von primären Zellen aus Primaten (sowohl human als auch nicht human) nicht zweckmäßig.
Aufgrund des begrenzten Proliferationsvermögens von primären neuronalen Zellen ist die Erzeugung einer großen Anzahl von homogenen Zellen für Untersuchungen von neuronaler Funktion, Dysfunktion und Arzneimittelplanung/Screening zuvor nicht erreicht worden. Daher wurden homogene Populationen von Zellen, die eine große Anzahl von Nachkommen zur in-vitro-Untersuchung der ZNS-Funktion erzeugen können, unter Verwendung von Zelllinien untersucht. Die Erzeugung neuronaler Zelllinien kann in zwei Kategorien unterteilt werden: 1) spontan auftretende Tumore und 2) maßgeschneiderte Zelllinien.
Von den spontan auftretenden Tumoren ist wahrscheinlich die am häufigsten untersuchte Zelllinie für die Neurobiologie die von Pheochromocytom (PC12)-Zellen der Ratte, die sich als Reaktion auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF) zu sympathisch-ähnlichen Neuronen differenzieren können. Diese Zellen haben sich als ein nützliches Modell zur Untersuchung von Mechanismen der neuronalen Entwicklung und Veränderungen (molekular und zellulär) als Reaktion auf Wachstumsfaktoren erwiesen. Neuroblastom- und Gliomzelllinien sind verwendet worden, um die neuronale und gliale Funktionsweise zu untersuchen (Lies et al., 1987; Nister et al., 1988). Embryonale Karzinom (EC)-Zellen sind von Teratomtumoren fötaler Keimzellen abgeleitet und haben die Fähigkeit, sich zu einer großen Anzahl von nicht neuronalen Zelltypen zu differenzieren, wobei einige Linien (z. B. P19-Zellen, Jones-Villeneuve et al., 1982) die Fähigkeit haben, sich zu neuronalen Zellen zu differenzieren (McBurney et al., 1988). Eine humane von einem Teratokarzinom abgeleitete Zelllinie, NTera 2/cl.D1, mit einem Phänotyp, welcher neuronalen ZNS-Vorläuferzellen ähnelt, kann angeregt werden, sich in der Gegenwart von Retinsäure zu differenzieren. Jedoch sind die differenzierten Zellen auf einen neuronalen Phänotyp beschränkt [Pleasure und Lee (1993), J. Neurosci. Res. 35: 585–602]. Während diese Typen von Zelllinien in der Lage sind, eine große Anzahl von Zellen zum Screenen der Wirkungen von exogenen Agentien auf das Überleben der Zelle oder die Funktion zu erzeugen, sind sie aufgrund ihrer Immortalisierung nicht geeignet zur Verwendung bei der Untersuchung der Apoptose, d. h. des natürlichen programmierten Todes von Säugetierzellen. Zusätzlich macht die begrenzte Anzahl dieser Typen von Linien, die begrenzte Anzahl von Phänotypen, welche diese erzeugen können, und die unbekannte Natur ihrer Immortalisierung (welche die Funktion der Zellen in einer undefinierten Weise beeinflussen könnte) diese Typen von Zelllinien für in-vitro-Modelle der neuronalen Funktion und die Entdeckung neuer Therapeutika weniger ideal.
Ein alternativer Ansatz zu spontan auftretenden Zelllinien ist die beabsichtigte Immortalisierung einer primären Zelle durch Einführen eines Onkogens, welches die genetische Aufmachung der Zelle verändert, wodurch die Zelle angeregt wird, unbegrenzt zu proliferieren. Dieser Ansatz ist von vielen Gruppen verwendet worden, um eine Anzahl interessanter neuro naler Zelllinien zu erzeugen (Bartlett et al., 1988; Frederiksen et al., 1988; Trotter et al., 1989; Ryder et al., 1889; Murphy et al., 1991; Almazan und McKay, 1992). Während sich diese Zelllinien als nützlich erweisen können, um die Entscheidungen zu untersuchen, die während der Zelldetermination und -differenzierung auftreten, und zum Testen der Wirkungen exogener Agentien, leiden sie an mehreren Nachteilen. Zuerst kann die Zufügung eines Onkogens, weiches den proliferativen Status einer Zelle verändert, andere Eigenschaften der Zelle beeinträchtigen (Onkogene können in Zellen neben dem Regulieren des Zellzyklus andere Rollen spielen). Dieses wird gut dargestellt in einer Studie von Almazan und McKay (1992) und deren Immortalisierung eines Oligodendrozytenvorläufers aus dem Sehnerv, welcher nicht in der Lage ist, zu Astrozyten vom Typ II zu differenzieren (etwas, das normale Oligodendrozytenvorläufer des Sehnervs machen können). Die Autoren schlagen vor, dass das Vorliegen des immortalisierenden Antigens die Fähigkeit der Zellen, zu Astrozyten zu differenzieren, verändern könnte.
Ein anderer Nachteil der Verwendung von absichtlich immortalisierten Zellen resultiert aus der Tatsache, dass das Nervensystem aus Milliarden von Zellen und möglicherweise Tausenden von verschiedenen Zelltypen zusammengesetzt ist, die jeweils einzigartige Muster der Genexpression und des Ansprechverhaltens auf ihre Umgebung aufweisen. Eine maßgeschneiderte Zelllinie ist das Ergebnis der Immortalisierung einer einzelnen Progenitorzelle und deren klonaler Vermehrung. Während ein großer Vorrat von einem neuronalen Zelltyp erzeugt werden kann, berücksichtigt dieser Ansatz nicht die zellulären Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen. Zusätzlich ist, während es möglich ist, Zellen aus einem vorgegebenen Bereich des Gehirns zu immortalisieren, die Immortalisierung einer gewünschten Zelle aufgrund des Fehlens einer Kontrolle darüber, welche Zellen durch das Onkogen verändert werden, nicht möglich. Während maßgeschneiderte Zelllinien somit einige wenige Vorteile gegenüber spontan auftretenden Tumoren bieten, leiden sie an mehreren Nachteilen und sind zum Verstehen der ZNS-Funktion und Dysfunktion weniger ideal.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Lichte der Mängel, welche die Methoden des früheren Standes der Technik begleiten, große Mengen an genetisch unveränderten neuronalen Zellen zum Zweck der Untersuchung der ZNS-Entwicklung und Funktion und zur Verwendung bei der Bestimmung der Wirkungen von potentiellen therapeutischen Agentien für die ZNS-Dysfunktion bereitzustellen, besteht ein Bedarf für verbesserte ZNS-Modellsysteme, die für diese Zwecke verwendet werden können.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein ZNS-Modellsystem für die Untersuchungen der neuronalen Entwicklung und Funktion und zur Bestimmung der ZNS-Wirkungen von neuen Therapeutika und anderen biologischen Agentien bereitzustellen. Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, dass ein solches ZNS-System die Erzeugung einer großen Anzahl von Zellen aus einer relativ kleinen Menge an Ausgangsmaterial erlaubt, das aus einer Vielzahl von Spezies, einschließlich Menschen, erhalten wird und sich über einen weiten Altersbereich, der Erwachsene einschließt, erstreckt.
Es ist eine Aufgabe, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, welches Zellen umfasst, die nicht spontan auftretende Tumore sind oder absichtlich durch die Einfügung eines Onkogens immortalisiert wurden, um eine unbegrenzte Proliferation anzuregen, wodurch jegliche Fragen des Einflusses der genetischen Veränderung auf die normale Funktion der Zellen beseitigt werden.
Es ist eine weitere Aufgabe, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, worin die Zellen klonal abgeleitet sind und somit eine Population von Zellen darstellen, die einen geringen Grad an Variabilität von einer Verwendung des Modells zu der nächsten Verwendung aufweisen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, worin die Zellen als Reaktion auf ein extrinsisches Signalmolekül oder eine Kombination von Molekülen, die nach Wunsch zugegeben oder entfernt werden können, proliferieren.
Eine weitere Aufgabe ist es, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, worin die proliferierten Zellen in einem undifferenzierten Zustand gehalten werden können und nach Wunsch zu den drei Hauptzelltypen des Säugetiers-ZNS (Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) differenzieren gelassen werden können.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, wodurch die Differenzierung und Funktionsweise der ZNS-Zellen in einer kontrollierten Weise in einem System, das aus mehreren Zelltypen zusammengesetzt ist – eine Situation, die ähnlich ist zu der, die in vivo auftritt – untersucht werden können.
Es ist eine weitere Aufgabe, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, wodurch ZNS-Stammzellen aus Individuen vor und nach der Geburt, einschließlich Erwachsenen, erzeugt werden können, was ein Testen, das auf einer individuellen Basis durchgeführt wird, ermöglicht.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Analyse der Genexpression in den ZNS-Stammzellen und den von der Stammzelle abgeleiteten Nachkommen eines normalen Donors und in den Zellen eines Patienten mit einer neurologischen Störung zu ermöglichen.
Zusätzliche Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden den Fachleuten aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den angefügten Ansprüchen deutlich werden.
In einer Ausführungsform werden die Aufgaben gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von wenigstens einem biologischen Agens auf die Apoptose neuronaler Zellen, umfassend:

(a) Proliferieren lassen von wenigstens einer multipotenten neuronalen Stammzelle, welche aus neuronalem Gewebe eines Säugetiers erhältlich ist, unter der Voraussetzung, dass die neuronale Stammzelle nicht von einem humanen Embryo erhalten wird, in einem Kulturmedium, das wenigstens einen Wachstumsfaktor enthält, um eine Kultur von proliferierten neuronalen Zellen zu erhalten,
(b) Kontaktieren der proliferierten neuronalen Zellen mit dem biologischen Agens und
(c) Bestimmen der Wirkungen des biologischen Agens auf die apoptotischen Ereignisse, welche in den proliferierten neuronalen Zellen auftreten.

In einer weiteren Ausführungsform werden die proliferierten neuronalen Zellen angeregt, sich in einem zweiten Kulturmedium zu differenzieren.
Kurze Beschreibungen der Zeichnungen
1. Proliferation von auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ansprechenden Zellen: Nach 2 Tagen in vitro beginnen auf EGF ansprechende Zellen zu proliferieren (1A). Nach 4 Tagen in vitro sind kleine Cluster von Zellen sichtbar (1B). Die Cluster von kontinuierlich proliferierenden Zellen fahren fort, in der Größe zu wachsen (1C), bis sie sich von dem Substrat abheben und in der Suspension schweben (1D). In diesem Stadium können die schwebenden Spheres leicht entfernt werden, zu einzelnen Zellen dissoziiert werden, und in der Gegenwart von EGF kann erneut eine Proliferation eingeleitet werden (Balken: 50 μm).
2. Differenzierung von Zellen aus einzelnen mit EGF erzeugten Spheres zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten: Eine immunzytochemische Methode mit drei Markierungen mit Antikörpern gegen Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP-2), gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) und O4 (ein Zelloberflächenantigen) wird verwendet, um das Vorliegen von Neuronen (2B), Astrozyten (2C) bzw. Oligodendrozyten (2D) aus einer einzelnen mit EGF erzeugten Sphere (2A), die von einer primären Kultur abgeleitet ist, nachzuweisen (Balken: 50 μm).
3. Markierung von Neurospheres, die zusammen mit striären Astrozyten kultiviert wurden: Ein Phasenkontrastbild einer 8 Tage alten Neurosphere, die auf einer Astrozytenfutterschicht (feeder layer) wachsen gelassen wurde, ist in 3A gezeigt. Eine Markierung der Neurospherezellen mit Brd-U zeigt, dass praktisch alle Zellen Brd-U eingebaut haben (3B). Ein Phasenkontrast der Futterschichtzellen ist in 3C gezeigt. Eine GFAP-Markierung der Futterschichtzellen zeigt, dass die Mehrzahl der Zellen in der Futterschicht Astrozyten sind (GFAP-IR) (3D). Nachdem eine Differenzierung stattgefunden hat, sind mit Brd-U markierte Neuronen (3E und 3G) gegenüber Neuropeptid Y (NPY) (3F) oder Somatostatin (3H) wie auch anderen Neurotransmittern wie z. B. Glutamat und Metenkephalin immunreaktiv (nicht gezeigt).
4. Erhöhte Zahlen von Neuronen, die in Gegenwart des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) aus einer Neurosphere erzeugt wurden: Eine Quantifizierung der mittleren Anzahl von Neuronen nach 10 Tagen in vitro (DIV) aus einzelnen auf EGF ansprechenden aus Stammzellen erzeugten Neurospheres zeigte, dass in der Abwesenheit von BDNF 11,46 ± 1,21 Neuronen pro Neurosphere erzeugt wurden. Wenn BDNF (10 ng/ml) in dem Kulturmedium vorlag, wurde eine signifikant größere (p < 0,5) Anzahl von Neuronen identifiziert (22,34 ± 2,33 Neuronen pro Neurospheres).
5. Verstärkter neuronaler Auswuchs (process outgrowth) in Gegenwart von BDNF: Neurospheres, die in Abwesenheit von BDNF (5A) und in Gegenwart von BDNF (5B) für 10 DIV wachsen gelassen wurden, wurden fixiert und für eine indirekte immunzytochemische Methode mit Antiserum gegen γ-Aminosäure (GABA) aufbereitet. Die Mehrzahl der Neuronen, die in Gegenwart von BDNF wachsen gelassen wurden, streckten lange Neuriten aus und zeigten ein umfangreiches und komplexes Verzweigungsmuster in Bezug auf die nicht mit BDNF behandelten Neurospheres.
6. Reaktion auf BDNF von selektiven Populationen von Zellen innerhalb einer Neurosphere: Eine indirekte immunzytochemische Methode für das Immediate Early Gen produkt c-fos zeigt, dass nahezu alle Zellen innerhalb einer einzelnen klonal abgeleiteten Neurosphere auf eine EGF (20 ng/ml)-Stimulation ansprechen, wie durch eine erhöhte c-fos-Immunreaktivität getestet wurde (6A). Eine immunzytochemische Methode mit zwei Markierungen mit Antiserum gegen das Kernantigen c-fos und einem Antikörper, welcher gegen das neuronale spezifische Antigen β-Tubulin gerichtet war, zeigt, dass eine 60 Minuten-Exposition an BDNF hauptsächlich in der neuronalen Population zu einer selektiven Expression von c-fos führt (6B), wie durch das β-Tubulin-Antiserum bestimmt wurde (6C).
7. Wirkung des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) und des Bone Morphogenic Proteins 2 (BMP-2) auf die Proliferation von mit EGF erzeugten Neurospheres: Zellen, die aus dem Striatum von 14 Tage alten embryonalen Mäusen isoliert wurden, wurden bei einer Dichte von 25.000 Zellen/ml in der Gegenwart von EGF (20 ng/ml), EGF + bFGF (jeweils 20 ng/ml) oder EGF + BMP-2 (20 bzw. 10 ng/ml) auf einer Platte mit 96 Vertiefungen plattiert. Nach 10 DIV zeigte eine Quantifizierung der mit EGF behandelten Kulturen, dass 23 ± 1,33 Neurospheres pro Vertiefung (n = 8) erzeugt wurden. bFGF verstärkte die mit EGF stimulierte Proliferation, indem es einen Anstieg auf 54,5 ± 2,17 Neurospheres pro Vertiefung (n = 8) hervorrief, während BMP-2 die Stammzellenproliferation als Reaktion auf EGF (n = 8) verhinderte.
8. Ethidium-Agarosegel, sichtbar gemacht über UV-Beleuchtung, welches den Nachweis von Wachstumsfaktortranskripten in undifferenzierten und differenzierten von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen zeigt: Die erste Bahn in jeder Gruppe zeigt eine 1 kb Standard-Molekulargewichtsleiter. Die zweite Bahn, welche mit C markiert ist, ist die negative Kontrolle, welche eine PCR in der Abwesenheit irgendeines cDNA-Templates darstellt. Die dritte Bahn, welche mit U markiert ist, ist die RT-PCR von undifferenzierten Neurospheres. Die vierte Bahn, welche mit D markiert ist, ist die RT-PCR von differenzierten von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen. Das Vorliegen von epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor, Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptor und Leukämie-Inhibitorischer Faktor-Rezeptor sind durch EGF-R, FGF-R bzw. LIF-R angegeben.
9. Elektrophysiologische Eigenschaften von mit bFGF erzeugten Neuronen: Ein Digitalbild eines mutmaßlichen Neurons, das eine bipolare Morphologie zeigt, vor der Patch-Aufzeichnung ist in 9A gezeigt. 9B zeigt ein Fluoreszenzdigitalbild desselben Neurons, gefüllt mit 5-Carboxyfluorescein, nach Entfernung der Patch-Elektrode. 9C stellt abgestufte Aktionspotentiale dar, welche durch die Zuführung von Strom in dem mit bFGF erzeugten Neuron, das in den 9A und 9B dargestellt wird, hervorgerufen wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Von neuronalen Stammzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), welche hierin als "ZNS-Stammzellen" bezeichnet werden, ist berichtet worden und deren potentielle Anwendung ist beschrieben worden (Reynolds und Weiss, Science 255:1707 [1992]; Reynolds et al., J. Neurosci, 12:4565 [1992]; Reynolds und Weiss, Restorative Neurology and Neuroscience 4:208 [1992]; Reynolds und Weiss, Neuronal Cell Death and Repair, Herausg. Cuello [1993]). Der Ausdruck "Stammzelle" bezieht sich auf eine relativ ruhende undifferenzierte Zeile, weiche aus embryonalem, juvenilem oder adultem Gewebe erhalten werden kann, die zu einer Poliferation und Selbsterhaltung durch die Erzeugung einer großen Anzahl von Nachkommen fähig ist. Der Nutzen von neuronalen Stammzellen wird in den parallelen Anmeldungen U.S.S.N. 08/270,412; 07/961,813; 08/221,655; 08/010,829; und 08/149,508 beschrieben. Wie Stammzellen, die in anderen Säugetiergeweben gefunden werden, zeigt die ZNS-Stammzelle das kritische Merkmal einer Stammzelle, die Selbsterhaltung. Selbsterhaltung bei einer Zelle impliziert, dass die Zelle in der Lage ist, Klone von sich selbst zu erzeugen und somit ihren Phänotyp über einen ausgedehnten Zeitraum zu erhalten.
Die Stammzellennachkommen werden hierin als "Vorläuferzellen" bezeichnet und bestehen aus zwei Typen von Zellen: a) neuen Stammzellen und b) Progenitorzellen, die sich zu funktionalen Zellen differenzieren können.
Der Ausdruck "Progenitorzelle" bezieht sich auf eine undifferenzierte Zelle, die von einer ZNS-Stammzelle abgeleitet ist. Die Progenitorzelle hat ein beschränktes Proliferationsvermögen und kann sich nicht selbst erneuern. Sie ist auf einen bestimmten Differenzierungsweg festgelegt und wird sich unter geeigneten Bedingungen zu den verschiedenen Zelltypen differenzieren, die im ZNS vorliegen; diese beinhalten Neurone und Gliazellen. Gliazelltypen beinhalten Astrozyten und Oligodendrozyten.
Der Ausdruck "Oligodendrozyt" bezieht sich auf eine differenzierte Gliazelle, welche das Myelin bildet, das Axone im zentralen Nervensystem (ZNS) umgibt. Oligodendrozyten gehören zu dem Phänotyp Galactocerebrosid (+), basisches Myelinprotein (+) und gliales fibrilläres saures Protein (–) [GalC (+), MBP (+), GFAP (–)]. Der Ausdruck "Astrozyt" bezieht sich auf eine differenzierte Gliazelle, die GFAP (+), GalC (–) und MBP (–) ist, welche eine flache protoplasmatische/fibroblastenähnliche Morphologie haben kann oder welche eine sternförmige (stellate process bearing) Morphologie zeigen kann. Der Ausdruck "Neuron" bezieht sich auf eine differenzierte neuronale Zelle mit dem neuronenspezifischen Phänotyp Enolase (+), Neurofilament (+), Mikrotubuli-assoziiertes Protein (+), Tau-1 (+) oder β-Tubulin (+) [NSE (+), NF (+), MAP-2 (+), Tau-1 (+) oder β-Tub (+)]. Demgemäß beziehen sich die Ausdrücke "Neuronale Stammzelle" oder "ZNS-Stammzelle", wie sie hierin verwendet werden, auf multipotente Stammzellen, die zur Proliferation fähig sind, um weitere multipotente Stammzellen und Progenitorzellen zu erzeugen, die sich zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren können.
Neuronale Stammzellen können durch die in Beispiel 1 unten und den parallelen Anmeldungen, auf die oben Bezug genommen wurde, beschriebenen Methoden isoliert und in vitro aus Säugetier-ZNS kultiviert werden. Kurz gesagt werden die Stammzellen, welche aus Säugetiergewebe (z. B. Mensch, Affe, Ratte, Maus usw.) erhalten wurden, in einem definierten serumfreien Medium in Gegenwart von wenigstens einem Wachstumsfaktor wachsen gelassen. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Wachstumsfaktor" auf ein Protein, ein Peptid oder ein anderes Molekül, welches auf die Stammzellen und/oder Progenitorzellen eine wachstumsfördernde, proliferative, differenzierende oder trophische Wirkung ausübt. Wachstumsfaktoren, die verwendet werden können, um die Proliferation anzuregen, beinhalten jeden Faktor, welcher den Zellen erlaubt zu proliferieren, einschließlich jedem Molekül, das an einen Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle bindet, um eine wachstumsanregende oder das Überleben fördernde Wirkung auf die Zelle auszuüben. Solche Faktoren beinhalten saure und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (aFGF und bFGF, welcher ebenfalls als FGF-2 bekannt ist), Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF), Thyrotropin freisetzendes Hormon (TRH), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), einen EGF-ähnlichen Liganden, Amphiregulin, transformierenden Wachstumsfaktor alpha (TGF-α), aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF), ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF), glialen neurotrophen Faktor (GDNF), insulinähnlichem Wachstumsfaktor (IGF-1) und dergleichen. Ein bevorzugter Wachstumsfaktor ist EGF. Ebenfalls bevorzugt ist bFGF oder die Kombination von EGF und bFGF. Wachstumsfaktoren, die verwendet werden, um die Stamm- und Progenitorzellentwicklung zu regulieren, welche regulatorische Wirkungen auf die Zellen aufweisen, die von der Förderung der Proliferation verschieden sind, beinhalten transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGFβ), Retinsäure, Activin, Bone Morphogenic Protein (BMP), ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) und Makrophagen-Entzündungsproteine (MIP-1α, MIP-1β, MIP-2).
In der Gegenwart eines Wachstumsfaktors wird eine multipotente Stammzelle angeregt, sich zu teilen, was ein Cluster undifferenzierter Zellen hervorruft, welches hierin als eine "Neurosphere" bezeichnet wird. Die Neurosphere ist hauptsächlich aus multipotenten Stammzellen und Progenitorzellen zusammengesetzt. Zusammen werden die Zellen der Neurosphere hierin als "Vorläuferzellen" bezeichnet. In vitro wachsen Vorläuferzellen typischerweise in der Form von Neurospheres, sie können aber unterschiedliche Wachstumsmuster zeigen, was von den Kultivierungsbedingungen und -techniken abhängt. Anfangs sind die Zellen der Neurosphere nicht gegenüber GFAP, NF, NSE oder MBP immunreaktiv. Jedoch gehören die Zellen zu dem Nestin (+)-Phänotyp, welches ein intermediäres Filamentprotein ist, das in undifferenzierten ZNS-Zellen gefunden wird. Der Nestinmarker wurde von Lehndahl et al., Cell 60: 585–595 (1990) charakterisiert. Die reifen Phänotypen, welche mit den Zelltypen verbunden sind, die sich aus den Nachkommen der Zellen der Neurosphere differenzieren können, sind vorwiegend im Hinblick auf den Nestin-Phänotyp negativ.
Bei dem fortgesetzten Vorliegen eines Mitogens wie z. B. EGF oder dergleichen fahren die Vorläuferzellen innerhalb der Neurosphere fort, sich zu teilen, was zu einer Zunahme bei der Größe der Neurosphere und der Anzahl an undifferenzierten Zellen [Nestin (+), GFAP (–), NF (–), NSE (–), MBP (–)] führt. In diesem Stadium sind die Zellen nicht adhärent und neigen dazu, die frei schwebenden Cluster zu bilden, die für Neurospheres charakteristisch sind. Nach 6 bis 7 DIV können die Zellen der Neurosphere dissoziiert werden. Praktisch alle Zellen haften an dem Gewebekultursubstrat. Bei dem fortgesetzten Vorliegen eines Wachstumsfaktors beginnen die Stammzellen sich zu teilen und von dem Substrat abzuheben, wobei sie neue frei schwebende Neurospheres bilden, die aus klonal abgeleiteten Zellen bestehen. Somit kann unter Verwendung dieser Methode der Proliferation, Dissoziation und erneuten Einleitung der Proliferation eine unbegrenzte Anzahl von klonal abgeleiteten Vorläuferzellen in vitro erzeugt werden.
Beim Entfernen des mitogenen Wachstumsfaktors hört die Proliferation der Stammzelle auf. Die Sphere mit undifferenzierten Zellen kann an einem Substrat wie z. B. mit poly-Ornithin behandeltem Kunststoff oder Glas anhaften, wo die Zellen beginnen, sich zu Neuronen und Gliazellen zu differenzieren. Somit wirkt der Wachstumsfaktor als ein extrinsisches Signalmolekül, das nach Wunsch zugegeben oder entfernt werden kann, um das Ausmaß der Proliferation zu steuern.
Wenn der mitogene Wachstumsfaktor entfernt wurde, können die auf den Wachstumsfaktor ansprechenden Stammzellennachkommen zusammen auf einer Futterschicht kultiviert werden. Viele Typen von Futterschichten wie z. B. Fibroblasten, Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Tumorzelllinien, genetisch veränderte Zelllinien oder irgendwelche Zellen oder ein Substrat mit bioaktiven Eigenschaften können verwendet werden. Die Futterschicht erzeugt im Allgemeinen einen größeren Bereich an Phänotypen. In diesem Fall wirkt die Futterschicht als ein Substrat und als eine Quelle von sowohl membrangebundenen als auch löslichen Faktoren, welche die Differenzierung der von der Stammzelle erzeugten Nachkommen anregen und verändern. Im Vergleich zu einer inerteren Substanz wie z. B. poly-L-Ornithin induziert beispielsweise eine Astrozytenfutterschicht einen größeren Bereich von neuronalen Phänotypen, wie durch eine indirekte immunzytochemische Methode nach 7 DIV bestimmt wird. Wenn sie auf einem mit poly-L-Ornithin beschichteten Substrat mit 1 % fötalem Rinderserum differenziert werden, sind neuronale Phänotypen fast ausschließlich GABAerg oder Substanz Perg (auf Substanz P reagierend). Wenn sie auf einer Astrozytenfutterschicht differenziert werden, liegen zusätzlich zu GABAergen und Substanz Pergen Neuronen, Somatostatin, Neuropeptid Y (NPY), Glutamat und Met-Enkephalin-enthaltende Neurone vor. Die Astrozyten können aus Gewebe stammen, das aus verschiedenen Bereichen des Gehirns erhalten wurde, wie z. B. dem Striatum, Cortex und Rückenmark.
Wenn der Wachstumsfaktor einmal entfernt wurde, kann das Kulturmedium Serum wie z. B. 0,5 bis 1,0% fötales Rinderserum (FBS) enthalten. Das Serum neigt dazu, den Differenzierungsprozess zu unterstützen und das Überleben der Zellen zu verstärken, insbesondere wenn die differenzierenden Zellen bei einer niedrigen Dichte wachsen gelassen werden.
Innerhalb von 1–3 Tagen nach der Entfernung des Wachstumsfaktors und dem Setzen der Zelle unter Bedingungen, welche eine Differenzierung und das Überleben unterstützen, beginnen die meisten oder alle Vorläuferzellen die Immunreaktivität für Nestin zu verlieren und beginnen, Antigene zu exprimieren, die für Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten spezifisch sind. Die Identifizierung von Neuronen wird bestätigt, indem eine Immunreaktivität für NSE, NF, β-Tub, NeuN (ein Kernantigen), MAP-2 und das neuronenspezifische Protein Tau-1 verwendet wird. Astrozyten und Oligodendrozyten werden identifiziert, indem eine Immunreaktivität für GFAP bzw. GalC verwendet wird. Zellen die keine Antigene exprimieren, die für Neuronen oder für Astrozyten spezifisch sind, beginnen in einer korrekten zeitlichen Weise Marker zu exprimieren, die für Oligodendrozyten spezifisch sind: Das heißt, die Zellen werden zuerst immunreaktiv für O4 (ein Zelloberflächenantigen), GalC (ein Myelinglycolipid) und schließlich MBP. Diese Zellen besitzen ebenfalls eine charakteristische Oligodendrozytenmorphologie.
Neuronen können ebenfalls auf der Basis ihres spezifischen Neurotransmitter-Phänotyps zusammen mit einer Analyse ihrer Morphologie identifiziert werden. Unter Verwendung von Immunfluoreszenz mit einer, zwei oder drei Markierungen und Immunperoxidasemethoden können differenzierte Neurospherekulturen im Hinblick auf die Expression von Neurotransmittern, oder in manchen Fällen im Hinblick auf die Enzyme, die für die Neurotransmittersynthese verantwortlich sind, analysiert werden. Alternativ kann eine in situ-Hybridisierungs histochemie durchgeführt werden, indem cDNA- oder RNA-Sonden verwendet werden, welche für die mRNAs des Peptidneurotransmitters oder des Neurotransmitter synthetisierenden Enzyms spezifisch sind. Diese Techniken können mit immunzytochemischen Methoden kombiniert werden, um die Identifizierung spezifischer Phänotypen zu verbessern. Wenn nötig können die oben diskutierten Antikörper und molekularen Sonden in Western- bzw. Northern-Blot-Verfahren angewendet werden, um bei der Zellidentifizierung zu helfen.
Zusätzlich dazu, dass auf EGF-ansprechende Stammzellen aus jedem Bereich in dem embryonalen ZNS isoliert werden können, können ZNS-Stammzellen ebenfalls aus einer Vielzahl von juvenilen und adulten ZNS-Bereichen, einschließlich des Conus Medullaris, des zervikalen, Brust- und Lendenrückenmarks, des Gehirnstamms, des Hypothalamus und des Striatums, isoliert werden, indem routinemäßige Biopsieverfahren verwendet werden. In jedem dieser Fälle zeigt die isolierte ZNS-Stammzelle eine Selbsterhaltung und erzeugt eine große Anzahl von Progenitorzellen, welche zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Somit sind multipotente Stammzellen in mehreren Bereiche des adulten Säugetier-ZNS vorhanden. ZNS-Stammzellen können ebenfalls aus dysfunktionalem ZNS-Gewebe, beispielsweise aus Gewebe, das von der Alzheimer Krankheit, der Parkinson Krankheit oder dem Down-Syndrom betroffen ist, isoliert werden.
Die oben beschriebenen Vorläuferzellen können in Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von biologischen Agentien auf die Apoptose von neuronalen Zellen verwendet werden. Der Ausdruck "biologisches Agens" bezieht sich auf jedes Agens wie z. B. einen Virus, ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure, ein Nukleotid, ein Arzneimittel, ein Pro-Drug oder eine andere Substanz, die eine Wirkung auf neuronale Zellen haben kann, egal ob eine solche Wirkung schädlich, nützlich oder andersartig ist.
Biologische Agentien, die für neuronale Zellen nützlich sind, werden hierin als "neurologische Agentien" bezeichnet, ein Ausdruck, welcher jede biologisch oder pharmazeutisch aktive Substanz umfasst, die sich für die Proliferation, das Überleben, die Differenzierung und/oder das Funktionieren von ZNS-Zellen oder die Behandlung einer neurologischen Krankheit oder Störung als potentiell nützlich erweisen kann. Beispielsweise kann der Ausdruck gewisse Neurotransmitter, Neurotransmitterrezeptoren, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren und dergleichen wie auch Enzyme, die bei der Synthese dieser Agentien verwendet werden, umfassen.
Um die Wirkung eines potentiellen biologischen Agens auf die Apoptose von neuronalen Zellen zu bestimmen, kann eine Kultur von Vorläuferzellen, die von multipotenten Stamm zellen abgeleitet sind, die aus einem Wirt erhalten wurden, welcher von einer ZNS-Krankheit oder Störung betroffen ist, verwendet werden, oder es kann eine Kultur verwendet werden, die aus normalem Gewebe erhalten wurde. Die Auswahl der Kultur wird von dem bestimmten Agens, das getestet wird, und den Wirkungen, die man erzielen möchte, abhängen. Wenn die Zellen einmal aus dem gewünschten Donorgewebe erhalten wurden, werden sie in vitro in der Gegenwart eines Wachstumsfaktors proliferieren gelassen.
Die Wirkungen des biologischen Agens auf die Apoptose von neuronalen Zellen kann durch Messen des Ausmaßes der DNA-Leiterbildung, welche ein Anzeichen für die Apoptose ist, oder durch RT-PCR-Analyse im Hinblick auf bekannte potentiell Apoptose regulierende Moleküle oder durch mRNA-Fingerprint-Analyse im Hinblick auf unbekannte potentiell Apoptose regulierende Moleküle bestimmt werden.
Die Wirkungen der biologischen Agentien werden in Zeitintervallen überwacht und werden auf der Grundlage eines signifikanten Unterschieds in Bezug auf Kontrollkulturen bezogen auf Kriterien wie z. B. das Ausmaß der Apoptose bewertet. Physikalische Charakteristika der Zellen können analysiert werden, indem die Morphologie der Zelle und der Neuriten und das Wachstum mit dem Mikroskop beobachtet werden. Die Induktion der Expression von neuen oder erhöhten Spiegeln von Proteinen wie z. B. Enzymen, Rezeptoren und anderen Zelloberflächenmolekülen oder von Neurotransmittern, Aminosäuren, Neuropeptiden und biogenen Aminen kann durch irgendeine Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, welche die Veränderung des Spiegels solcher Moleküle identifizieren kann, analysiert werden. Diese Techniken beinhalten die Immunhistochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen solche Moleküle oder die biochemische Analyse. Eine solche biochemische Analyse beinhaltet Proteinassays, enzymatische Assays, Rezeptorbindungsassays, enzymverknüpfte Immunsorbensassays (ELISA), eine elektrophoretische Analyse, eine Analyse mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Western-Blots und Radioimmunassays (RIA). Eine Nukleinsäureanalyse wie z. B. Northern-Blots und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) können verwendet werden, um die Spiegel von mRNA zu untersuchen, die für diese Moleküle oder für Enzyme, welche diese Moleküle synthetisieren, codiert. Genomische DNA kann quantifiziert werden, indem Standardverfahren verwendet werden, und im Hinblick auf das Ausmaß der DNA-Leiterbildung (d. h. den enzymspezifischen Abbau von DNA), welche ein Anzeichen für Apoptose ist, analysiert werden.
Die Faktoren, die an der Proliferation von Stammzellen und der Proliferation, Differenzierung und dem Überleben von Stammzellennachkommen und/oder deren Reaktionen auf biologische Agentien beteiligt sind, können isoliert werden, indem cDNA-Bibliotheken aus Stamm zellen oder Stammzellennachkommen in unterschiedlichen Stufen ihrer Entwicklung konstruiert werden, wobei Techniken verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Bibliotheken aus Zellen in einem Entwicklungsstadium werden mit denen von Zellen in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung verglichen, um die Folge der Genexpression während der Entwicklung zu bestimmen und die Wirkungen von verschiedenen biologischen Agentien aufzuzeigen oder neue biologische Agentien aufzuzeigen, welche die Genexpression in ZNS-Zellen verändern. Wenn die Bibliotheken aus dysfunktionalem Gewebe hergestellt werden, können genetische Faktoren identifiziert werden, die eine Rolle bei der Ursache der Dysfunktion spielen, indem die Bibliotheken aus dem dysfunktionalen Gewebe mit denen aus normalem Gewebe verglichen werden. Diese Information kann bei der Planung von Therapien verwendet werden, um die Störungen zu behandeln. Zusätzlich können Sonden zur Verwendung bei der Diagnose von verschiedenen genetischen Störungen oder zur Verwendung beim Identifizieren neuronaler Zellen in einem bestimmten Stadium der Entwicklung identifiziert werden.
Eine elektrophysiologische Analyse kann verwendet werden, um die Wirkungen von biologischen Agentien auf neuronale Charakteristika wie z. B. das Ruhemembranpotential, evozierte Potentiale, Richtung und ionische Natur des Stromflusses und die Dynamik von Ionenkanälen zu bestimmen. Diese Messungen können durchgeführt werden, indem irgendeine Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich der Aufzeichnung der extrazellulären Einzeleinheitsspannung, der Aufzeichnung der intrazellulären Spannung, Spannungs-Clamping und Patch-Clamping, verwendet wird. Spannungssensitive Farbstoffe und ionensensitive Elektroden können ebenfalls verwendet werden.
Damit die hierin beschriebene Erfindung besser verstanden wird, werden die folgenden Beispiele und Beschreibungen angegeben. Man sollte verstehen, dass diese Beispiele nur der Veranschaulichung dienen und nicht als den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend ausgelegt werden sollen.
Beschreibung 1
Vermehrung von Vorläuferzellen
Embryonale 14 Tage alte (E14) CD₁-Albino-Mäuse (Charles River) wurden enthauptet, und das Gehirn und die Striata wurden entfernt, indem ein steriles Verfahren verwendet wurde. Das Gewebe wurde mechanisch mit einer feuerpolierten Pasteurpipette in serumfreiem Medium, das aus einer 1:1-Mischung von Dulbecco's modifizierten Eagle-Medium (DMEM) und F-12-Nährmischung (Gibco) zusammengesetzt war, dissoziiert. Die Zellen wurden bei 800 Upm für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen zum Zählen in DMEM/F-12-Medium resuspendiert.
Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium suspendiert, das im Folgenden als "vollständiges Medium" bezeichnet wird, das aus DMEM/F-12 (1:1) zusammengesetzt war, welches Glucose (0,6%), Glutamin (2 mM), Natriumbicarbonat (3 mM), HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure)-Puffer (5 mM) und eine definierte Hormonmischung und Salzmischung (um das Serum zu ersetzen) beinhaltete, die Insulin (25 μg/ml), Transferrin (100 μg/ml), Progesteron (20 nM), Putrescin (60 μm) und Selenchlorid (30 nM) (alle von Sigma, außer Glutamin [Gibco]) einschloss. Zusätzlich enthielt das Medium 16–20 ng/ml EGF (gereinigt aus der Maus, submaxillär, Collaborative Research) oder TGFα (human rekombinant, Gibco). Die Zellen wurden bei 0,2 × 10⁶ Zellen/ml in 75 cm²-Gewebekulturkolben (Corning) ohne eine Substratvorbehandlung plattiert und in einem Inkubator bei 37°C, 100% Feuchtigkeit, 95% Luft/5% Co₂ angeordnet.
Wenn die Zellen proliferiert hatten, bildeten sie innerhalb der ersten 48 Stunden und nach 3–4 Tagen in vitro (DIV) kleine Cluster, welche als Neurospheres bekannt sind, die sich zwischen 4–6 DIV von dem Substrat ablösten (1). Neurospheres enthalten undifferenzierte Vorläuferzellen, d. h. Stammzellen und Progenitorzellen.
Nach 7 DIV wurden die Neurospheres entfernt, bei 400 Upm für 2–5 Minuten zentrifugiert, und das Pellet wurde mechanisch mit einer feuerpolierten Glaspasteurpipette in 2 ml vollständigem Medium dissoziiert. 1 × 10⁶-Zellen wurden erneut in einem 75 cm²-Gewebekulturkolben mit 20 ml EGF-enthaltendem vollständigem Medium plattiert. Die Proliferation der Stammzellen und die Bildung neuer Neurospheres wurden wieder eingeleitet. Dieser Vorgang kann alle 6–8 Tage wiederholt werden.
Beschreibung 2
Differenzierung von Neurospheres
Neurospheres wurden differenziert, indem die folgenden Musterbeispiele verwendet wurden. Eine Verwendung von irgendeinem der folgenden Musterbeispiele erzeugt Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Jedoch kann die Zugabe gewisser Wachstumsfaktoren oder Kombinationen von Wachstumsfaktoren die Phänotypverhältnisse, die nach der Differenzierung erhalten werden, verändern. Zusätzlich kann die Verwendung glialer Futterbetten die erhaltenen Phänotypverhältnisse beeinflussen. Die Neurospheres, welche für jedes der folgenden Musterbeispiele verwendet wurden, wurden wie in Beschreibung 1 umschrieben erzeugt. Alle verwendeten Neurospheres wurden vor ihrer Differenzierung wenigstens einmal passagiert (passed).
Musterbeispiel 1 – Schnelle Differenzierung von Neurospheres
6 bis 8 Tage nach der ersten Passage wurden die Neurospheres entfernt und bei 400 Upm zentrifugiert. Der EGF-haltige Überstand wurde entfernt und das Pellet in EGF-freiem vollständigen Medium, welches 1 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt, suspendiert.
Neurospheres (ungefähr 0,5–1,0 × 10⁶ Zellen/Vertiefung) wurden auf poly-L-Ornithinbeschichteten (15 μg/ml) Glasdeckgläschen in Nuclon-Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (1,0 ml/Vertiefung) plattiert. Nach 24 Stunden in Kultur wurden die Deckgläschen in Kulturschalen mit 12 Vertiefungen (Costar) überführt, welche vollständiges Medium, das 0,5% FBS enthielt, enthielten. Das Medium wurde alle 4–7 Tage ausgetauscht. Dieser Differenzierungsvorgang wird als das "Musterbeispiel schnelle Differenzierung" oder RDP bezeichnet.
Musterbeispiel 2 – Differenzierung von dissoziierten Neurospheres
6 bis 8 Tage nach der ersten Passage, wurden die Neurospheres entfernt und bei 400 Upm zentrifugiert. Das EGF-enthaltende Medium wurde entfernt, und das Pellet wurde in EGF-freiem vollständigem Medium, das 1 % FBS enthielt, suspendiert. Die Neurospheres wurden mechanisch mit einer feuerpolierten Pasteurpipette zu einzelnen Zellen dissoziiert und bei 800 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Zwischen 0,5 × 10⁶ und 1,0 × 10⁶ Zellen wurden auf poly-L-Ornithin-beschichteten (15 μg/ml) Glasdeckgläschen in Nuclon-Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (1,0 ml/Vertiefung) plattiert. Das EGF-freie Kulturmedium, das 1% FBS enthielt, wurde alle 4–7 Tage ausgetauscht.
Musterbeispiel 3 – Differenzierung von einzelnen Neurospheres
Neurospheres wurden mit Serientransfers durch Austausch mit EGF-freiem Medium von EGF freigewaschen. Einzelne Neurospheres wurden auf poly-L-Ornithin-beschichteten (15 μg/ml) Glasdeckgläschen in einer Platte mit 24 Vertiefungen plattiert. Das verwendete Kulturmedium war vollständiges Medium mit oder ohne 1 % FBS. Das Medium wurde alle 4–7 Tage ausgetauscht. Eine immunzytochemische Methode mit drei Markierungen zeigte, dass alle drei neuronalen Zelltypen, d. h. Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten, klonal von einer einzigen Neurosphere abgeleitet sind (2).
Musterbeispiel 4 – Differenzierung von einzelnen dissoziierten Neurospheres
Neurospheres wurden mit Serientransfers durch Austausch mit EGF-freiem Medium von EGF freigewaschen. Eine einzelne Neurosphere wurde mechanisch in ein 0,5 ml-Eppendorf-Zentrifugenröhrchen dissoziiert, und alle Zellen wurden auf einer poly-L-Ornithin-beschichteten 35 mm-Kulturschale plattiert. Vollständiges Medium wurde mit oder ohne 1 % FBS verwendet.
Musterbeispiel 5 – Differenzierung von Neurospheres, die zusammen mit striären Astrozyten kultiviert wurden
Neurospheres, die wie in Beispiel 1 beschrieben von striären Zellen abgeleitet waren, wurden mit 5-Bromdeoxyuridin (BrdU) markiert und von EGF freigewaschen. Eine Astrozyten-Futterschicht wurde aus dem striären Gewebe von Mäusen nach der Geburt (0–24 Stunden) erzeugt und auf poly-L-Ornithin-beschichteten Glasdeckgläschen in einer Kulturschale mit 24 Vertiefungen plattiert. Wenn die Astrozyten konfluent waren, wurde auf jedem Astrozytenbett eine dissoziierte oder intakte Neurosphere angeordnet. Vollständiges Medium wurde nach den ersten 24 Stunden und dann alle 48 Stunden ausgetauscht. Wenn auf einer Astrozytenfutterschicht differenziert wurde, waren zusätzlich zu GABAergen und Substanz Pergen Neuronen Somatostatin, NPY, Glutamat und Metenkephalin enthaltende Neurone vorhanden (3).
Beschreibung 3
Screenen von Arzneimitteln oder anderen biologischen Agentien auf verschiedene Wirkungen
A. Wirkungen von BDNF auf die Differenzierung und das Überleben von neuronalen und glialen Zellen
Vorläuferzellen wurden wie in Beschreibung 1 beschrieben vermehrt und unter Verwendung von Musterbeispiel 3, das in Beschreibung 2 beschrieben wird, differenziert. Zur Zeit der Plattierung der mit EGF erzeugten Zellen wurde BDNF in einer Konzentration von 10 ng/ml zugegeben. Nach 3, 7, 14 und 21 Tagen in vitro (DIV) wurden die Zellen für eine indirekte immunzytochemische Methode aufbereitet. Eine BrdU-Markierung wurde verwendet, um die Proliferation der Vorläuferzellen zu überwachen. Die Wirkungen von BDNF auf Neurone, Oligodendrozyten und Astrozyten wurden getestet, indem die Kulturen mit Antikörpern sondiert wurden, die Antigene erkennen, welche auf Neuronen (MAP-2, NSE, NF), Oligodendrozyten (O4, GalC, MBP) oder Astrozyten (GFAP) gefunden werden. Das Überleben der Zellen wurde bestimmt, indem die Anzahl von immunreaktiven Zellen zu jedem Zeitpunkt gezählt wurde und morphologische Beobachtungen durchgeführt wurden. BDNF erhöhte signifikant die Differenzierung und das Überleben von Neuronen gegenüber der Anzahl, die unter Kontrollbedingungen beobachtet wurde (4). Die Zahlen von Astrozyten und Oligodendrozyten waren gegenüber den Kontrollwerten nicht signifikant verändert.
B. Wirkungen von BDNF auf die Differenzierung neuronaler Phänotypen
Zellen, die gemäß den Methoden, die in Teil A beschrieben werden, mit BDNF behandelt wurden, wurden mit Antikörpern, welche neuronale Transmitter oder Enzyme, die an der Synthese von neuronalen Transmittern beteiligt sind, erkennen, sondiert. Diese beinhalteten Tyrosinhydroxylase (TH), Cholinacetyltransferase (ChAT), Substanz P, GABA, Somatostatin und Glutamat. Sowohl bei Kontrollbedingungen als auch bei einer BDNF-behandelten Kultur wurden die Neuronen positiv im Hinblick auf das Vorliegen von Substanz P und GABA getestet (5). Neben einem Anstieg bei den Zahlen zeigten die Neurone, die in BDNF wachsen gelassen wurden, einen dramatischen Anstieg bei der Verlängerung der Neuriten und der Verzweigung, wenn sie mit Kontrollbeispielen verglichen wurden (6).
C. Identifizierung von auf Wachstumsfaktor ansprechenden Zellen
Zeilen, die auf eine Behandlung mit Wachstumsfaktor ansprechen, wurden identifiziert, indem die mit EGF erzeugten Nachkommen wie in Beschreibung 2, Musterbeispiel 3 beschrieben differenziert wurden und nach 1 DIV ungefähr 100 ng/ml BDNF zugegeben wurden. Nach 1, 3, 6, 12 und 24 Stunden nach der Zugabe von BDNF wurden die Zellen fixiert und für eine immunzytochemische Methode mit zwei Markierungen aufbereitet. Antikörper, welche Neurone (MAP-2, NSE, NF), Oligodendrozyten (O4, GalC, MBP) oder Astrozyten (GFAP) erkennen, wurden in Kombination mit einem Antikörper, welcher c-fos und/oder andere Immediate Early Gene erkennt, verwendet. Eine Exposition an BDNF führt zu einem selektiven Anstieg bei der Expression von c-fos in neuronalen Zellen (6).
D. Wirkungen von BDNF auf die Expression von Markern und regulatorischen Faktoren während der Proliferation und Differenzierung
Zellen, die gemäß den in Teil A beschriebenen Methoden mit BDNF behandelt wurden, werden zur Analyse der Expression von FGF-R1 wie in Beschreibung 5 beschrieben oder anderen Markern und regulatorischen Faktoren wie in Beschreibung 6 beschrieben aufbereitet.
E. Wirkungen der Verabreichung von BDNF während der Differenzierung auf die elektrophysiologischen Eigenschaften der Neurone
Neurone, die gemäß den Methoden, die in Teil A beschrieben werden, während der Differenzierung mit BDNF behandelt wurden, werden zur Bestimmung ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften wie in Beschreibung 7 beschrieben aufbereitet.
F. Wirkungen von Chlorpromazin auf die Proliferation, Differenzierung und das Überleben von mit Wachstumsfaktor erzeugten Stammzellennachkommen
Chlorpromazin, ein Arzneimittel, welches weithin bei der Behandlung von psychischen Krankheiten verwendet wird, wird in Konzentrationen, die von 10 ng/ml bis 1000 ng/ml reichen, anstelle von BDNF in den Beschreibungen 3A bis 3E oben verwendet. Die Wirkungen des Arzneimittels in verschiedenen Konzentrationen auf die Stammzellenproliferation und auf die Differenzierung und das Überleben der Stammzellennachkommen werden überwacht. Veränderungen bei der Genexpression und den elektrophysiologischen Eigenschaften der differenzierten Neurone werden bestimmt.
G. Wirkungen von Deprenyl auf die Differenzierung und das Überleben dopaminerger Zellen
Primärkulturen werden unter Verwendung der Methoden in Beschreibung 1 hergestellt. Die Zellen werden differenziert, um die Anzahl dopaminerger Neuronen zu erhöhen. Einzelne undissoziierte 6 Tage alte primär erzeugte Neurospheres werden auf poly-L-Ornithinbeschichteten Glasdeckgläschen in vollständigem Medium mit konditioniertem Medium, das von der Ratten B-49-Gliazelllinie abgeleitet ist (75%), + 20 ng/ml FGF-2 plattiert und bei 37°C, 100% Feuchtigkeit, 95% Luft/5% CO₂ inkubiert. Deprenyl, ein Arzneimittel, welches bei der Behandlung der Parkinson Krankheit verwendet wird, wird beim Einsetzen der Differenzierung und/oder wenn eine Differenzierung stattgefunden hat zu den Kulturen in Konzentrationen zugegeben, die von 1 ng/ml bis 1000 ng/ml reichen. Die Anzahl an überlebenden dopaminergen Zellen wird in Intervallen gezählt und mit Kontrollkulturen verglichen. Zusätzlich werden biochemische Assays, um die Neurotransmitterexpression zu messen, und eine Nukleinsäureanalyse unternommen.
Beschreibung 4
Stammzellenproliferationsassay
Primärzellen wurden aus E14-Mäusen erhalten und wie in Beispiel 1 umschrieben vorbereitet. Entweder EGF, EGF und FGF oder EGF und BMP-2 wurden zu vollständigem Medium in einer Konzentration von 20 ng/ml von jedem Wachstumsfaktor, mit der Ausnahme von BMP-2, welcher in einer Konzentration von 10 ng/ml zugegeben wurde, zugegeben. Zellen wurden mit einem der vorbereiteten Wachstumsfaktor enthaltenden Medien auf eine Konzentration von 25.000 Zellen/ml verdünnt. 200 μl der Zellen/Medium-Kombination wurden ohne Vorbehandlung des Substrats in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Nuclon) pipettiert. Die Zellen wurden unter denselben Bedingungen wie in Beschreibung 1 umschrieben inkubiert.
Nach 8–10 DIV wurde die Anzahl an Neurospheres gezählt und die Ergebnisse tabellarisch angeordnet. Wie in 7 gezeigt ist, erzeugten Zellen, die in einer Kombination von EGF und FGF wachsen gelassen wurden, signifikant mehr Neurospheres als Zellen, die in Gegenwart von EGF allein wachsen gelassen wurden. Die Kombination von EGF und BMP-2 inhibierte die Neurosphere-Entwicklung.
Beschreibung 5
Vergleich der Rezeptor- und Wachstumsfaktorexpression in undifferenzierten gegenüber differenzierten von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen durch reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
Neurospheres wurden wie in Beschreibung 1 beschrieben erzeugt, und einige wurden wie in Musterbeispiel 1, Beschreibung 2, differenziert. RNA aus sowohl undifferenzierten als auch differenzierten Neurospheres wurde gemäß dem Guanidin-Thiocyanatsäure-Phenol-Verfahren von Chomzynski und Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156–159 1987)] isoliert. Komplementäre DNA (cDNA) wurde aus der Gesamt-RNA synthetisiert, indem reverse Transkriptase, die mit Oligo dT geprimed wurde, verwendet wurde. Genspezifische Primer wurden entworfen und synthetisiert, und diese Primer wurden in einer PCR verwendet, um cDNAs für verschiedene Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktorrezeptoren zu amplifizieren. Amplifiziertes Material wurde auf Agarosegelen zusammen mit Molekulargewichtsmarkern laufen gelassen, um sicher zu stellen, dass die PCR-Produkte die erwartete Größe aufwiesen, wäh rend die Identität der PCR-Fragmente durch Restriktionsenzymanalyse und durch Sequenzierung bestätigt wurde [Arcellana-Panlilio, Methods Enzymol. 225: 303–328 (1993)]. 8 ist eine Fotografie eines mit Ethidium gefärbten Agarosegels, das durch eine UV-Beleuchtung sichtbar gemacht wurde, welches den Nachweis von drei Wachstumsfaktorrezeptortranskripten nämlich EGF-R, FGF-R und LIF-R in undifferenzierten und differenzierten von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen zeigt. Tabelle I listet die analysierten Primersätze und die Ergebnisse der undifferenzierten und differenzierten Zellen auf. TABELLE I Analysierte Primersätze

r = Rezeptor
m = aus Mäusen stammend
nd = keine Daten verfügbar

Beschreibung 6
Isolierung neuer Marker und regulatorischer Faktoren, die an der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen beteiligt sind
Neurospheres werden wie in Beschreibung 1 beschrieben erzeugt, indem ZNS-Gewebe aus CD-Albinomäusen (Charles River) verwendet wird. Einige dieser Neurospheres werden ent sprechend dem Musterbeispiel der schnellen Differenzierung von Beschreibung 2 differenzieren gelassen, was Kulturen erzeugt, die mit Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten angereichert sind. Die gesamte RNA wird aus den undifferenzierten Neurospheres wie auch den differenzierten Zellkulturen extrahiert, indem das Guanidin-Thiocyanatsäure-Phenol-Verfahren verwendet wird, auf welches in Beschreibung 5 Bezug genommen wird. Boten-RNA (mRNA) wird isoliert, indem die Affinität ihres Poly-A-Teils zu Strängen von entweder Us oder Ts ausgenutzt wird. Die reverse Transkription der über mRNA erzeugten cDNA wird dann verwendet, um primäre Bibliotheken in entweder Plasmid- [Rothstein et al., Methods in Enzymology 225: 587–610 (1993)] oder Lambdaphagenvektoren zu erzeugen. Um cDNAs zu isolieren, die entweder für undifferenzierte oder differenzierte von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen spezifisch sind, wird cDNA aus dem Einen mit RNA aus dem Anderen hybridisiert und umgekehrt. Die unhybridisierten und somit für den Kulturtyp spezifischen cDNAs werden in jedem Fall dann verwendet, um subtrahierte Bibliotheken zu konstruieren [Lopez-Fernandez und del Mazo, Biotechniques 15(4): 654–658 (1993)], oder verwendet, um die primären Bibliotheken zu screenen.
Von Stammzellen abgeleitete für undifferenzierte Zellen spezifische und für differenzierte Zellen spezifische cDNA-Bibliotheken liefern eine Quelle von Klonen für neue Marker und regulatorische Faktoren, die an der ZNS-Stammzellenproliferation und -differenzierung beteiligt sind. Spezifische cDNAs werden durch Sequenzierungsanalyse, um spezifische Sequenzmotive als Hinweise auf die Identität oder Funktion nachzuweisen, und durch Datenbanksuchen im Hinblick auf Homologien mit bekannten Transkripten untersucht. Die Verwendung von cDNAs in einer Hybridisierung mit verschiedenen RNA-Proben, die auf einem Agarose-Formaldehyd-Gel einer Elektrophorese unterzogen wurden und auf eine Nylonmembran überführt wurden, erlaubt die Abschätzung der Größe, der relativen Häufigkeit und der Spezifität der Transkripte. Die gesamten oder Teile der cDNA-Sequenzen werden verwendet, um andere Bibliotheken zu screenen, um entweder vollständige mRNA-Sequenzen oder eine genomische Sequenzinformation zu erhalten. Antikörper, die gegen Fusionsproteine gerichtet sind, welche aus spezifischen cDNAs erzeugt wurden, werden verwendet, um entweder durch Immunzytochemie oder durch Western-Blot-Analyse Proteine nachzuweisen, die für eine bestimmte Zellpopulation spezifisch sind. Spezifische Gensequenzen werden verwendet, um Proteine zu isolieren, die mit mutmaßlichen regulatorischen Elementen wechselwirken, welche die Genexpression steuern. Diese regulatorischen Elemente werden dann verwendet, um die Expression eines exogenen Gens wie beispielsweise beta-Galactosidase zu steuern.
Beschreibung 7
Elektrophysiologische Analyse von Neuronen, die aus auf Wachstumsfaktor ansprechenden Stammzellen erzeugt wurden und an ein biologisches Agens exponiert wurden
Neurospheres wurden wie in Beschreibung 1 beschrieben erzeugt. Neurospheres wurden unter Verwendung der Technik, die in Musterbeispiel 2, Beschreibung 2, beschrieben wird, dissoziiert. Die klonal abgeleiteten Zellen wurden in geringer Dichte plattiert und in der Gegenwart von bFGF differenziert. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen mit dem morphologischen Erscheinungsbild von Neuronen wurden bestimmt, wie von Vescovi et al. [Neuron 11: 951–968 (1993)] beschrieben wird. Bei einer Ganzzellenstromklammer (whole cell current clamp) betrugen das mittlere Ruhepotential und der Eingangswiderstand –62 ± 9 mV und 372 ± MΩ. Rechtwinklige überschwellige Stromstufen (~ 100 pA) riefen regenerative Potentialantworten hervor, bei welchen die Amplitude und der Zeitverlauf vom Reiz abhängig waren (9). Nach dem Abschluss der elektrophysiologischen Experimente wurde die Zellmorphologie durch intrazelluläre Anregung von 5-Carboxyfluorescein sichtbar gemacht.
Beschreibung 8
Screenen auf die Wirkungen von Arzneimitteln oder anderen biologischen Agentien auf auf Wachstumsfaktor ansprechende Stammzellennachkommen, die aus einem Gewebe erzeugt wurden, das von einem Patienten mit einer neurologischen Störung erhalten wurde
Die Wirkungen von BDNF auf die auf EGF ansprechenden Stammzellennachkommen, die aus ZNS-Gewebe erzeugt wurden, das bei einer Biopsie von einem Patienten mit der Huntington-Krankheit erhalten wurde, werden unter Verwendung der Methoden, die in Beschreibung 3, A bis E, umschrieben werden, bestimmt. BDNF ist ein potenter Differenzierungsfaktor für GABAerge Neuronen und fördert einen ausgedehnten Auswuchs von Neuronen (5B). Die Huntington-Krankheit ist charakterisiert durch den Verlust von GABAergen Neuronen (unter anderem) aus dem Striatum.
Beschreibung 9
Regulation des Amyloid Precursor Proteins (APP) durch Wachstumsfaktoren
ZNS-Gewebe wird aus einem Fötus mit Down-Syndrom erhalten, und Neurospheres werden unter Verwendung der Methoden von Beschreibung 1 erzeugt und passagiert, um die benötigte Anzahl von Zellen zu erhalten. Die Zellen werden differenziert, indem irgendeiner der Musterbeispiele, die in Beschreibung 2 beschrieben werden, verwendet wird. Zur Zeit der Plattierung werden CNTF, BMP-2, Activin, FGF-2 oder Retinsäure zu dem Kulturmedium in den experimentellen Vertiefungen in einer Konzentration von 10 ng/ml zugegeben, und werden an jedem anderen Tag in einer Konzentration von 2 ng/ml zugegeben. Nach 3, 7 und 14 DIV werden die Spiegel von APP-mRNA und -Protein bestimmt. Zur Northern-Blot-Analyse wird RNA extrahiert, indem das Guanidin-Isothiocyanat/Cäsiumchlorid-Verfahren verwendet wird [Goodison et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52(3): 192–198 (1993)]. Northern-Blots werden laufen gelassen und sondiert, indem eine humane cDNA verwendet wird, welche die Proteaseinhibitordomäne von APP_KPI oder eine Oligonukleotidsonde mit 30 Basenpaaren, die für APP₆₉₅ spezifisch ist, codiert. Zur Western-Blot-Analyse werden die Zellen in Laemmli-Puffer homogenisiert, aufgekocht und einer SDS-PAGE auf Gel unterzogen. Das Gel wird immungeblottet und mit anti-APP, der 1:1000 verdünnt ist, sondiert. Die Spiegel der APP-mRNA- und -Proteinexpression werden mit Kontrollkulturen verglichen.
Beispiel 1
Analyse von apoptotischen Ereignissen unter Verwendung proliferierter neuronaler Stammzellennachkommen
A. Analyse der spontanen Apoptose
Proliferierende Maus-Neurospheres wurden hergestellt, indem die Methoden von Beschreibung 1 verwendet wurden, und nach 3, 5, 7, 9, 12 und 15 Tagen der Kultivierung geerntet. Maus-Neurospheres wurden differenziert, indem die Methode von Beschreibung 2, Musterbeispiel 1, verwendet wurde, und nach 1, 4, 7, 10, 13 und 16 Tagen der Kultivierung geerntet. Zellen wurden in 1 ml DNAzol-Reagens (Gibco/BRL) lysiert, und genomische DNA wurde aus der Lösung nach Ausfällen mit 500 μl Ethanol gepoolt. Genomische DNA wurde durch die optische Dichte bei 260 nm quantifiziert. Das Ausmaß der DNA-Leiterbildung, welche ein Anzeichen der Apoptose ist, wurde nachgewiesen, indem 250 ng DNA in 50 μl 100 mM Kaliumcacodylat (pH 7,2), 2 mM CoCl₂, 0,2 mM DTT, 50 μCi [α³²P]dATP und 25 Einheiten termi naler Deoxynukleotidyltransferase gelöst wurden. Die Reaktion wurde für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die radioaktiven Produkte wurden durch eine 2% Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert. Eine morphologische und biochemische Analyse der proliferierenden und differenzierten Neurospherekulturen zeigte, dass die Anzahl an Zellen, die aktiv an der spontanen Apoptose beteiligt waren, von weniger als 20% mit zunehmenden Kultivierungstagen bis zu größer als 50% reichte.
B. RT-PCR-Analyse von potentiellen Regulatoren der Apoptose in neuronalen Stammzellkulturen
Die Aktivität von bekannten mutmaßlichen Apoptose regulierenden Molekülen wurde durch RT-PCR-Analyse ermittelt. Proliferierende und differenzierte Nachkommen der neuronalen Stammzellkulturen von Mäusen wurden unter Verwendung der Methoden von Beschreibung 1 und 2 hergestellt. Eine reverse Transkription-PCR-Analyse von bekannten mutmaßlichen Apoptose regulierenden mRNA-Transkripten wurde unternommen. Zellen wurden in 1 ml RNAzol-Reagens (Gibco/BRL) lysiert, organische und wässrige Phasen wurden durch Zugabe von 0,2 Volumina Chloroform getrennt, und die Gesamt-RNA wurde aus der wässrigen Phase durch Ausfällung unter Zugabe eines gleichen Volumens an Isopropanol isoliert. RNA wurde durch die optische Dichte bei 260 und 280 nm quantifiziert. Eine Analyse durch Polymerase-Kettenreaktion von 0,5 μl Produkt der reversen Transkription wurde in 25 μl 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 μM Primer und 1,25 Einheiten Taq-Polymerase unternommen. Typische Zyklusparameter waren 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute, wiederholt für 30 Zyklen. Über 30 potentielle Regulatoren der neuronalen Apoptose wurden analysiert, einschließlich Mitgliedern der Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Transkriptionsfaktoren, Mitgliedern der Bcl-2-Proteinfamilie und der Familie von Proteasen der Interleukin konvertierenden Enzyme. Unterschiedlich exprimierte Mitglieder jeder Proteinfamilie wurden nachgewiesen.
C. Nachweis und Klonierung unbekannter potentieller Regulatoren der neuronalen Apoptose
Die Aktivität von unbekannten Transkripten, welche möglicherweise die neuronale Apoptose regulierten, wurde festgestellt, indem die mRNA-Fingerprint-Analyse benutzt wurde. Proliferierende und differenzierte Nachkommen von neuronalen Stammzellkulturen aus Mäusen wurden hergestellt und wie oben beschrieben geerntet, und eine mRNA-Fingerprint-Analyse von unbekannten mutmaßlichen Apoptose regulierenden Molekülen wurde unternommen. Die Zellen wurden in 1 ml RNAzol-Reagens (Gibco/BRL) lysiert, organische und wässrige Phasen wurden durch die Zugabe von 0,2 Volumina Chloroform getrennt, und die Gesamt- RNA wurde aus der wässrigen Phase durch Ausfällung unter Zugabe eines gleichen Volumens an Isopropanol isoliert. RNA wurde durch die optische Dichte bei 260 und 280 nm quantifiziert. Eine reverse Transkriptions- und Polymerase-Kettenreaktionsanalyse wurde wie oben beschrieben unternommen. Radioaktive Produkte wurden auf 8% Acrylamid-Sequenziergelen getrennt und durch Autoradiografie analysiert. Unterschiedlich exprimierte Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten, wieder amplifiziert und sequenziert.
D. Schaffung von genetisch modifizierten Stammzellen für einen Hochdurchsatzassay von Anti-Apoptose-Verbindungen
Humane und aus Mäusen stammende neuronale Stammzellen werden genetisch modifiziert, um ein Hochdurchsatzassaysystem für potentiell therapeutische Anti-Apoptose-Verbindungen bereitzustellen. Unter Verwendung einer Anzahl von direkten Transfizierungstechniken werden DNA-Konstrukte, welche cytoplasmatische (Grün Flureszierendes Protein (GFP) oder sezernierte (sezermierte alkalische Phosphatase (SEAP)) Markerproteine enthalten, welche durch Promotoren eines Apoptose regulierenden Moleküls (einschließlich Bcl-2, ICE und Nur-77) angetrieben werden, stabil in aus Mäusen stammende und humane neuronale Stammzellen transformiert. Zur Transformation unter Benutzung von Lipofectamin (BRL) werden die Zellen mit 2–3 × 10⁶ Zellen pro 35 mm Kulturplatte angeimpft und mit 200 μl DNA-Liposomenkomplexen (3 μg DNA, 20 μl Lipofectamin (BRL) in 200 μl Medium) für 12 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Wirkung einer Vielzahl von Verbindungen auf die neuronale Apoptose wird durch die Wirkung, welche die Anwendung der Verbindung auf die Expression der Markergene unter der Kontrolle der bekannten Apoptose regulierenden Genpromotoren hat, durch Fluoreszenz (GFP) oder sezernierte alkalische Phosphataseaktivität (SEAP) festgestellt.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von wenigstens einem biologischen Agens auf die Apoptose neuronaler Zellen, umfassend: (a) Proliferieren lassen von wenigstens einer multipotenten neuronalen Stammzelle, welche aus neuronalem Gewebe eines Säugetiers erhältlich ist, unter der Voraussetzung, dass die neuronale Stammzelle nicht von einem humanen Embryo erhalten wird, in einem Kulturmedium, das wenigstens einen Wachstumsfaktor enthält, um eine Kultur von proliferierten neuronalen Zellen zu erhalten, (b) Kontaktieren der proliferierten neuronalen Zellen mit dem biologischen Agens und (c) Bestimmen der Wirkungen des biologischen Agens auf die apoptotischen Ereignisse, welche in den proliferierten neuronalen Zellen auftreten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die Wirkungen des biologischen Agens durch Messen des Ausmaßes der DNA-Leiterbildung, welche ein Anzeichen von Apoptose ist, oder durch RT-PCR-Analyse im Hinblick auf bekannte potentiell Apoptose regulierende Moleküle oder durch mRNA-Fingerprint-Analyse im Hinblick auf unbekannte potentiell Apoptose regulierende Moleküle bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die bekannten potentiell Apoptose regulierenden Moleküle ausgewählt werden aus Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Transkriptionsfaktoren, Mitgliedern der Bcl-2-Proteinfamilie und der Familie von Proteasen der Interleukin konvertierenden Enzyme.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die neuronalen Stammzellen von Schritt (a) genetisch mit einem DNA-Konstrukt modifiziert werden, welches ein Gen für ein cytoplasmatisches oder sezerniertes Markerprotein enthält, welches durch einen Promoter eines Apoptose regulierenden Moleküls angetrieben wird, und Schritt (c) bestimmt wird, indem der Expressionsspiegel des cytosplasmatischen oder sezernierten Markerproteins gemessen wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei nach Schritt (a) die proliferierten neuronalen Zellen angeregt werden, in einem zweiten Kulturmedium zu differenzieren, um eine Kultur differenzierter neuronaler Zellen zu erhalten.