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Hintergrund
der Erfindung
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Das
voll entwickelte menschliche Nervensystem ist aus Milliarden von
Zellen zusammengesetzt, die während
der Entwicklung aus einer kleinen Anzahl von Vorläufern erzeugt
werden, welche in dem Neuralrohr lokalisiert sind. Das Studium von
Entwicklungswegen des zentralen Nervensystems (ZNS) wie auch von
Veränderungen,
die im ZNS von ausgewachsenen Säugetieren
aufgrund einer Dysfunktion auftreten, war aufgrund der Komplexität des Säugetier-ZNS
schwierig. Solche Dinge könnten
besser untersucht werden, wenn relativ einfache Modelle des ZNS
unter definierten Bedingungen verwendet würden.
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Im
Allgemeinen sind zwei Ansätze
gemacht worden, um kultivierte ZNS-Zellen zu untersuchen: Die Verwendung
primärer
neuronaler Kulturen; und die Verwendung neuronaler Zelllinien. Primäre neuronale
Kulturen von Säugetieren
können
aus nahezu allen Bereichen des Gehirns erzeugt werden, unter der
Voraussetzung, dass das Ausgangsmaterial aus fötalen Tieren oder solchen kurz
nach der Geburt erhalten wird. Im Allgemeinen können drei Typen von Kulturen
erzeugt werden, die entweder mit Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten
angereichert sind. Primäre
ZNS-Kulturen haben sich als wertvoll erwiesen, um viele Mechanismen
der neuronalen Funktion aufzudecken, und werden verwendet, um die
Wirkungen exogener Agentien auf sich entwickelnde und reife Zellen
zu untersuchen. Während
primäre
ZNS-Kulturen viele Vorteile haben, leiden sie an zwei Hauptnachteilen.
Zuerst müssen
aufgrund der begrenzten Proliferationsfähigkeit von primären neuronalen
Zeilen neue Kulturen aus mehreren verschiedenen Tieren erzeugt werden.
Während
gewöhnlich sehr
darauf geachtet wird, Gewebe in identischen Stadien der Entwicklung
und aus identischen Bereichen des Gehirns zu erhalten, ist es praktisch
unmöglich,
primäre
Kulturen zu erzeugen, die identisch sind. Somit existiert ein signifikanter
Grad an Variabilität
von Kultur zu Kultur.
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Ein
zweiter Nachteil der primären
Kulturen besteht darin, dass das Gewebe aus Föten oder Tieren kurz nach der
Geburt erhalten werden muss. Wenn primäre Kulturen auf einer regelmäßigen Basis
durchgeführt werden
sollen, erfordert dies die Verfügbarkeit
einer großen
Quelle von Ausgangsmaterial. Während
dieses im Allgemeinen zur Erzeugung von primären Kulturen aus einigen Spezies
(z. B. Nagern) kein Problem ist, ist es dieses für andere (z. B. Primaten).
Aufgrund des begrenzten Vorrats und ethischer Bedenken ist das Kultivieren
von primären
Zellen aus Primaten (sowohl human als auch nicht human) nicht zweckmäßig.
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Aufgrund
des begrenzten Proliferationsvermögens von primären neuronalen
Zellen ist die Erzeugung einer großen Anzahl von homogenen Zellen
für Untersuchungen
von neuronaler Funktion, Dysfunktion und Arzneimittelplanung/Screening
zuvor nicht erreicht worden. Daher wurden homogene Populationen
von Zellen, die eine große
Anzahl von Nachkommen zur in-vitro-Untersuchung
der ZNS-Funktion erzeugen können, unter
Verwendung von Zelllinien untersucht. Die Erzeugung neuronaler Zelllinien
kann in zwei Kategorien unterteilt werden: 1) spontan auftretende
Tumore und 2) maßgeschneiderte
Zelllinien.
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Von
den spontan auftretenden Tumoren ist wahrscheinlich die am häufigsten
untersuchte Zelllinie für die
Neurobiologie die von Pheochromocytom (PC12)-Zellen der Ratte, die
sich als Reaktion auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF) zu sympathisch-ähnlichen
Neuronen differenzieren können.
Diese Zellen haben sich als ein nützliches Modell zur Untersuchung
von Mechanismen der neuronalen Entwicklung und Veränderungen
(molekular und zellulär)
als Reaktion auf Wachstumsfaktoren erwiesen. Neuroblastom- und Gliomzelllinien sind
verwendet worden, um die neuronale und gliale Funktionsweise zu
untersuchen (Lies et al., 1987; Nister et al., 1988). Embryonale
Karzinom (EC)-Zellen sind von Teratomtumoren fötaler Keimzellen abgeleitet
und haben die Fähigkeit,
sich zu einer großen
Anzahl von nicht neuronalen Zelltypen zu differenzieren, wobei einige
Linien (z. B. P19-Zellen, Jones-Villeneuve et al., 1982) die Fähigkeit
haben, sich zu neuronalen Zellen zu differenzieren (McBurney et
al., 1988). Eine humane von einem Teratokarzinom abgeleitete Zelllinie,
NTera 2/cl.D1, mit einem Phänotyp,
welcher neuronalen ZNS-Vorläuferzellen ähnelt, kann
angeregt werden, sich in der Gegenwart von Retinsäure zu differenzieren.
Jedoch sind die differenzierten Zellen auf einen neuronalen Phänotyp beschränkt [Pleasure
und Lee (1993), J. Neurosci. Res. 35: 585–602]. Während diese Typen von Zelllinien
in der Lage sind, eine große
Anzahl von Zellen zum Screenen der Wirkungen von exogenen Agentien auf
das Überleben
der Zelle oder die Funktion zu erzeugen, sind sie aufgrund ihrer
Immortalisierung nicht geeignet zur Verwendung bei der Untersuchung
der Apoptose, d. h. des natürlichen
programmierten Todes von Säugetierzellen.
Zusätzlich
macht die begrenzte Anzahl dieser Typen von Linien, die begrenzte
Anzahl von Phänotypen,
welche diese erzeugen können,
und die unbekannte Natur ihrer Immortalisierung (welche die Funktion
der Zellen in einer undefinierten Weise beeinflussen könnte) diese
Typen von Zelllinien für
in-vitro-Modelle der neuronalen Funktion und die Entdeckung neuer
Therapeutika weniger ideal.
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Ein
alternativer Ansatz zu spontan auftretenden Zelllinien ist die beabsichtigte
Immortalisierung einer primären
Zelle durch Einführen
eines Onkogens, welches die genetische Aufmachung der Zelle verändert, wodurch
die Zelle angeregt wird, unbegrenzt zu proliferieren. Dieser Ansatz
ist von vielen Gruppen verwendet worden, um eine Anzahl interessanter
neuro naler Zelllinien zu erzeugen (Bartlett et al., 1988; Frederiksen
et al., 1988; Trotter et al., 1989; Ryder et al., 1889; Murphy et
al., 1991; Almazan und McKay, 1992). Während sich diese Zelllinien
als nützlich
erweisen können,
um die Entscheidungen zu untersuchen, die während der Zelldetermination
und -differenzierung auftreten, und zum Testen der Wirkungen exogener
Agentien, leiden sie an mehreren Nachteilen. Zuerst kann die Zufügung eines
Onkogens, weiches den proliferativen Status einer Zelle verändert, andere
Eigenschaften der Zelle beeinträchtigen
(Onkogene können
in Zellen neben dem Regulieren des Zellzyklus andere Rollen spielen).
Dieses wird gut dargestellt in einer Studie von Almazan und McKay
(1992) und deren Immortalisierung eines Oligodendrozytenvorläufers aus
dem Sehnerv, welcher nicht in der Lage ist, zu Astrozyten vom Typ
II zu differenzieren (etwas, das normale Oligodendrozytenvorläufer des Sehnervs
machen können).
Die Autoren schlagen vor, dass das Vorliegen des immortalisierenden
Antigens die Fähigkeit
der Zellen, zu Astrozyten zu differenzieren, verändern könnte.
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Ein
anderer Nachteil der Verwendung von absichtlich immortalisierten
Zellen resultiert aus der Tatsache, dass das Nervensystem aus Milliarden
von Zellen und möglicherweise
Tausenden von verschiedenen Zelltypen zusammengesetzt ist, die jeweils
einzigartige Muster der Genexpression und des Ansprechverhaltens
auf ihre Umgebung aufweisen. Eine maßgeschneiderte Zelllinie ist
das Ergebnis der Immortalisierung einer einzelnen Progenitorzelle
und deren klonaler Vermehrung. Während
ein großer
Vorrat von einem neuronalen Zelltyp erzeugt werden kann, berücksichtigt
dieser Ansatz nicht die zellulären
Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen. Zusätzlich ist,
während
es möglich
ist, Zellen aus einem vorgegebenen Bereich des Gehirns zu immortalisieren,
die Immortalisierung einer gewünschten
Zelle aufgrund des Fehlens einer Kontrolle darüber, welche Zellen durch das
Onkogen verändert
werden, nicht möglich.
Während
maßgeschneiderte
Zelllinien somit einige wenige Vorteile gegenüber spontan auftretenden Tumoren
bieten, leiden sie an mehreren Nachteilen und sind zum Verstehen
der ZNS-Funktion und Dysfunktion weniger ideal.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Im
Lichte der Mängel,
welche die Methoden des früheren
Standes der Technik begleiten, große Mengen an genetisch unveränderten
neuronalen Zellen zum Zweck der Untersuchung der ZNS-Entwicklung
und Funktion und zur Verwendung bei der Bestimmung der Wirkungen
von potentiellen therapeutischen Agentien für die ZNS-Dysfunktion bereitzustellen,
besteht ein Bedarf für
verbesserte ZNS-Modellsysteme, die für diese Zwecke verwendet werden
können.
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Demgemäß ist es
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein ZNS-Modellsystem für die Untersuchungen
der neuronalen Entwicklung und Funktion und zur Bestimmung der ZNS-Wirkungen von neuen
Therapeutika und anderen biologischen Agentien bereitzustellen.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, dass ein solches ZNS-System
die Erzeugung einer großen
Anzahl von Zellen aus einer relativ kleinen Menge an Ausgangsmaterial
erlaubt, das aus einer Vielzahl von Spezies, einschließlich Menschen,
erhalten wird und sich über
einen weiten Altersbereich, der Erwachsene einschließt, erstreckt.
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Es
ist eine Aufgabe, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, welches
Zellen umfasst, die nicht spontan auftretende Tumore sind oder absichtlich
durch die Einfügung
eines Onkogens immortalisiert wurden, um eine unbegrenzte Proliferation
anzuregen, wodurch jegliche Fragen des Einflusses der genetischen
Veränderung auf
die normale Funktion der Zellen beseitigt werden.
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Es
ist eine weitere Aufgabe, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen,
worin die Zellen klonal abgeleitet sind und somit eine Population
von Zellen darstellen, die einen geringen Grad an Variabilität von einer
Verwendung des Modells zu der nächsten
Verwendung aufweisen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen,
worin die Zellen als Reaktion auf ein extrinsisches Signalmolekül oder eine
Kombination von Molekülen,
die nach Wunsch zugegeben oder entfernt werden können, proliferieren.
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Eine
weitere Aufgabe ist es, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen, worin
die proliferierten Zellen in einem undifferenzierten Zustand gehalten
werden können
und nach Wunsch zu den drei Hauptzelltypen des Säugetiers-ZNS (Neuronen, Astrozyten
und Oligodendrozyten) differenzieren gelassen werden können.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein ZNS-Modellsystem
bereitzustellen, wodurch die Differenzierung und Funktionsweise
der ZNS-Zellen in einer kontrollierten Weise in einem System, das
aus mehreren Zelltypen zusammengesetzt ist – eine Situation, die ähnlich ist
zu der, die in vivo auftritt – untersucht werden
können.
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Es
ist eine weitere Aufgabe, ein ZNS-Modellsystem bereitzustellen,
wodurch ZNS-Stammzellen aus Individuen vor und nach der Geburt,
einschließlich
Erwachsenen, erzeugt werden können,
was ein Testen, das auf einer individuellen Basis durchgeführt wird,
ermöglicht.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Analyse der Genexpression
in den ZNS-Stammzellen
und den von der Stammzelle abgeleiteten Nachkommen eines normalen
Donors und in den Zellen eines Patienten mit einer neurologischen
Störung
zu ermöglichen.
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Zusätzliche
Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden den Fachleuten aus der
folgenden detaillierten Beschreibung und den angefügten Ansprüchen deutlich
werden.
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In
einer Ausführungsform
werden die Aufgaben gelöst
durch ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von wenigstens einem
biologischen Agens auf die Apoptose neuronaler Zellen, umfassend:
- (a) Proliferieren lassen von wenigstens einer
multipotenten neuronalen Stammzelle, welche aus neuronalem Gewebe
eines Säugetiers
erhältlich
ist, unter der Voraussetzung, dass die neuronale Stammzelle nicht von
einem humanen Embryo erhalten wird, in einem Kulturmedium, das wenigstens
einen Wachstumsfaktor enthält,
um eine Kultur von proliferierten neuronalen Zellen zu erhalten,
- (b) Kontaktieren der proliferierten neuronalen Zellen mit dem
biologischen Agens und
- (c) Bestimmen der Wirkungen des biologischen Agens auf die apoptotischen
Ereignisse, welche in den proliferierten neuronalen Zellen auftreten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden die proliferierten neuronalen Zellen angeregt, sich in einem zweiten
Kulturmedium zu differenzieren.
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Kurze Beschreibungen
der Zeichnungen
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1. Proliferation von auf epidermalen Wachstumsfaktor
(EGF) ansprechenden Zellen: Nach 2 Tagen in vitro beginnen auf EGF
ansprechende Zellen zu proliferieren (1A). Nach
4 Tagen in vitro sind kleine Cluster von Zellen sichtbar (1B).
Die Cluster von kontinuierlich proliferierenden Zellen fahren fort,
in der Größe zu wachsen
(1C), bis sie sich von dem Substrat abheben und
in der Suspension schweben (1D). In
diesem Stadium können
die schwebenden Spheres leicht entfernt werden, zu einzelnen Zellen dissoziiert
werden, und in der Gegenwart von EGF kann erneut eine Proliferation
eingeleitet werden (Balken: 50 μm).
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2. Differenzierung von Zellen aus einzelnen
mit EGF erzeugten Spheres zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten:
Eine immunzytochemische Methode mit drei Markierungen mit Antikörpern gegen
Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP-2), gliales fibrilläres saures
Protein (GFAP) und O4 (ein Zelloberflächenantigen) wird verwendet,
um das Vorliegen von Neuronen (2B), Astrozyten
(2C) bzw. Oligodendrozyten (2D) aus
einer einzelnen mit EGF erzeugten Sphere (2A), die
von einer primären
Kultur abgeleitet ist, nachzuweisen (Balken: 50 μm).
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3. Markierung von Neurospheres, die zusammen
mit striären
Astrozyten kultiviert wurden: Ein Phasenkontrastbild einer 8 Tage
alten Neurosphere, die auf einer Astrozytenfutterschicht (feeder
layer) wachsen gelassen wurde, ist in 3A gezeigt.
Eine Markierung der Neurospherezellen mit Brd-U zeigt, dass praktisch
alle Zellen Brd-U eingebaut haben (3B). Ein
Phasenkontrast der Futterschichtzellen ist in 3C gezeigt.
Eine GFAP-Markierung der Futterschichtzellen zeigt, dass die Mehrzahl
der Zellen in der Futterschicht Astrozyten sind (GFAP-IR) (3D).
Nachdem eine Differenzierung stattgefunden hat, sind mit Brd-U markierte
Neuronen (3E und 3G) gegenüber Neuropeptid
Y (NPY) (3F) oder Somatostatin (3H)
wie auch anderen Neurotransmittern wie z. B. Glutamat und Metenkephalin
immunreaktiv (nicht gezeigt).
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4.
Erhöhte
Zahlen von Neuronen, die in Gegenwart des aus dem Gehirn stammenden
neurotrophen Faktors (BDNF) aus einer Neurosphere erzeugt wurden:
Eine Quantifizierung der mittleren Anzahl von Neuronen nach 10 Tagen
in vitro (DIV) aus einzelnen auf EGF ansprechenden aus Stammzellen
erzeugten Neurospheres zeigte, dass in der Abwesenheit von BDNF
11,46 ± 1,21
Neuronen pro Neurosphere erzeugt wurden. Wenn BDNF (10 ng/ml) in
dem Kulturmedium vorlag, wurde eine signifikant größere (p < 0,5) Anzahl von
Neuronen identifiziert (22,34 ± 2,33
Neuronen pro Neurospheres).
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5. Verstärkter neuronaler Auswuchs (process
outgrowth) in Gegenwart von BDNF: Neurospheres, die in Abwesenheit
von BDNF (5A) und in Gegenwart von BDNF
(5B) für
10 DIV wachsen gelassen wurden, wurden fixiert und für eine indirekte
immunzytochemische Methode mit Antiserum gegen γ-Aminosäure (GABA) aufbereitet. Die
Mehrzahl der Neuronen, die in Gegenwart von BDNF wachsen gelassen
wurden, streckten lange Neuriten aus und zeigten ein umfangreiches
und komplexes Verzweigungsmuster in Bezug auf die nicht mit BDNF
behandelten Neurospheres.
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6. Reaktion auf BDNF von selektiven Populationen
von Zellen innerhalb einer Neurosphere: Eine indirekte immunzytochemische
Methode für
das Immediate Early Gen produkt c-fos zeigt, dass nahezu alle Zellen
innerhalb einer einzelnen klonal abgeleiteten Neurosphere auf eine
EGF (20 ng/ml)-Stimulation ansprechen, wie durch eine erhöhte c-fos-Immunreaktivität getestet
wurde (6A). Eine immunzytochemische
Methode mit zwei Markierungen mit Antiserum gegen das Kernantigen
c-fos und einem Antikörper,
welcher gegen das neuronale spezifische Antigen β-Tubulin gerichtet war, zeigt,
dass eine 60 Minuten-Exposition an BDNF hauptsächlich in der neuronalen Population
zu einer selektiven Expression von c-fos führt (6B), wie
durch das β-Tubulin-Antiserum
bestimmt wurde (6C).
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7.
Wirkung des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) und des
Bone Morphogenic Proteins 2 (BMP-2) auf die Proliferation von mit
EGF erzeugten Neurospheres: Zellen, die aus dem Striatum von 14
Tage alten embryonalen Mäusen
isoliert wurden, wurden bei einer Dichte von 25.000 Zellen/ml in
der Gegenwart von EGF (20 ng/ml), EGF + bFGF (jeweils 20 ng/ml)
oder EGF + BMP-2 (20 bzw. 10 ng/ml) auf einer Platte mit 96 Vertiefungen
plattiert. Nach 10 DIV zeigte eine Quantifizierung der mit EGF behandelten Kulturen,
dass 23 ± 1,33
Neurospheres pro Vertiefung (n = 8) erzeugt wurden. bFGF verstärkte die
mit EGF stimulierte Proliferation, indem es einen Anstieg auf 54,5 ± 2,17
Neurospheres pro Vertiefung (n = 8) hervorrief, während BMP-2
die Stammzellenproliferation als Reaktion auf EGF (n = 8) verhinderte.
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8.
Ethidium-Agarosegel, sichtbar gemacht über UV-Beleuchtung, welches
den Nachweis von Wachstumsfaktortranskripten in undifferenzierten
und differenzierten von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen zeigt:
Die erste Bahn in jeder Gruppe zeigt eine 1 kb Standard-Molekulargewichtsleiter.
Die zweite Bahn, welche mit C markiert ist, ist die negative Kontrolle,
welche eine PCR in der Abwesenheit irgendeines cDNA-Templates darstellt.
Die dritte Bahn, welche mit U markiert ist, ist die RT-PCR von undifferenzierten
Neurospheres. Die vierte Bahn, welche mit D markiert ist, ist die
RT-PCR von differenzierten von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen.
Das Vorliegen von epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor, Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptor
und Leukämie-Inhibitorischer
Faktor-Rezeptor
sind durch EGF-R, FGF-R bzw. LIF-R angegeben.
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9. Elektrophysiologische Eigenschaften
von mit bFGF erzeugten Neuronen: Ein Digitalbild eines mutmaßlichen
Neurons, das eine bipolare Morphologie zeigt, vor der Patch-Aufzeichnung ist
in 9A gezeigt. 9B zeigt
ein Fluoreszenzdigitalbild desselben Neurons, gefüllt mit
5-Carboxyfluorescein, nach Entfernung der Patch-Elektrode. 9C stellt
abgestufte Aktionspotentiale dar, welche durch die Zuführung von Strom
in dem mit bFGF erzeugten Neuron, das in den 9A und 9B dargestellt
wird, hervorgerufen wurden.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Von
neuronalen Stammzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), welche
hierin als "ZNS-Stammzellen" bezeichnet werden,
ist berichtet worden und deren potentielle Anwendung ist beschrieben
worden (Reynolds und Weiss, Science 255:1707 [1992]; Reynolds et
al., J. Neurosci, 12:4565 [1992]; Reynolds und Weiss, Restorative
Neurology and Neuroscience 4:208 [1992]; Reynolds und Weiss, Neuronal
Cell Death and Repair, Herausg. Cuello [1993]). Der Ausdruck "Stammzelle" bezieht sich auf
eine relativ ruhende undifferenzierte Zeile, weiche aus embryonalem,
juvenilem oder adultem Gewebe erhalten werden kann, die zu einer
Poliferation und Selbsterhaltung durch die Erzeugung einer großen Anzahl
von Nachkommen fähig
ist. Der Nutzen von neuronalen Stammzellen wird in den parallelen
Anmeldungen U.S.S.N. 08/270,412; 07/961,813; 08/221,655; 08/010,829;
und 08/149,508 beschrieben. Wie Stammzellen, die in anderen Säugetiergeweben
gefunden werden, zeigt die ZNS-Stammzelle das kritische Merkmal
einer Stammzelle, die Selbsterhaltung. Selbsterhaltung bei einer
Zelle impliziert, dass die Zelle in der Lage ist, Klone von sich
selbst zu erzeugen und somit ihren Phänotyp über einen ausgedehnten Zeitraum
zu erhalten.
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Die
Stammzellennachkommen werden hierin als "Vorläuferzellen" bezeichnet und bestehen
aus zwei Typen von Zellen: a) neuen Stammzellen und b) Progenitorzellen,
die sich zu funktionalen Zellen differenzieren können.
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Der
Ausdruck "Progenitorzelle" bezieht sich auf
eine undifferenzierte Zelle, die von einer ZNS-Stammzelle abgeleitet
ist. Die Progenitorzelle hat ein beschränktes Proliferationsvermögen und
kann sich nicht selbst erneuern. Sie ist auf einen bestimmten Differenzierungsweg
festgelegt und wird sich unter geeigneten Bedingungen zu den verschiedenen
Zelltypen differenzieren, die im ZNS vorliegen; diese beinhalten
Neurone und Gliazellen. Gliazelltypen beinhalten Astrozyten und
Oligodendrozyten.
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Der
Ausdruck "Oligodendrozyt" bezieht sich auf
eine differenzierte Gliazelle, welche das Myelin bildet, das Axone
im zentralen Nervensystem (ZNS) umgibt. Oligodendrozyten gehören zu dem
Phänotyp
Galactocerebrosid (+), basisches Myelinprotein (+) und gliales fibrilläres saures
Protein (–)
[GalC (+), MBP (+), GFAP (–)].
Der Ausdruck "Astrozyt" bezieht sich auf
eine differenzierte Gliazelle, die GFAP (+), GalC (–) und MBP
(–) ist,
welche eine flache protoplasmatische/fibroblastenähnliche
Morphologie haben kann oder welche eine sternförmige (stellate process bearing)
Morphologie zeigen kann. Der Ausdruck "Neuron" bezieht sich auf eine differenzierte
neuronale Zelle mit dem neuronenspezifischen Phänotyp Enolase (+), Neurofilament
(+), Mikrotubuli-assoziiertes Protein (+), Tau-1 (+) oder β-Tubulin
(+) [NSE (+), NF (+), MAP-2 (+), Tau-1 (+) oder β-Tub (+)]. Demgemäß beziehen
sich die Ausdrücke "Neuronale Stammzelle" oder "ZNS-Stammzelle", wie sie hierin verwendet
werden, auf multipotente Stammzellen, die zur Proliferation fähig sind,
um weitere multipotente Stammzellen und Progenitorzellen zu erzeugen,
die sich zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren
können.
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Neuronale
Stammzellen können
durch die in Beispiel 1 unten und den parallelen Anmeldungen, auf die
oben Bezug genommen wurde, beschriebenen Methoden isoliert und in
vitro aus Säugetier-ZNS
kultiviert werden. Kurz gesagt werden die Stammzellen, welche aus
Säugetiergewebe
(z. B. Mensch, Affe, Ratte, Maus usw.) erhalten wurden, in einem
definierten serumfreien Medium in Gegenwart von wenigstens einem
Wachstumsfaktor wachsen gelassen. Wie hierin verwendet bezieht sich
der Ausdruck "Wachstumsfaktor" auf ein Protein,
ein Peptid oder ein anderes Molekül, welches auf die Stammzellen
und/oder Progenitorzellen eine wachstumsfördernde, proliferative, differenzierende
oder trophische Wirkung ausübt.
Wachstumsfaktoren, die verwendet werden können, um die Proliferation
anzuregen, beinhalten jeden Faktor, welcher den Zellen erlaubt zu
proliferieren, einschließlich
jedem Molekül,
das an einen Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle bindet, um eine
wachstumsanregende oder das Überleben
fördernde
Wirkung auf die Zelle auszuüben.
Solche Faktoren beinhalten saure und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
(aFGF und bFGF, welcher ebenfalls als FGF-2 bekannt ist), Thrombozyten-Wachstumsfaktor
(PDGF), Thyrotropin freisetzendes Hormon (TRH), epidermalen Wachstumsfaktor
(EGF), einen EGF-ähnlichen
Liganden, Amphiregulin, transformierenden Wachstumsfaktor alpha
(TGF-α),
aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF), ziliaren neurotrophen Faktor
(CNTF), glialen neurotrophen Faktor (GDNF), insulinähnlichem
Wachstumsfaktor (IGF-1) und dergleichen. Ein bevorzugter Wachstumsfaktor
ist EGF. Ebenfalls bevorzugt ist bFGF oder die Kombination von EGF und
bFGF. Wachstumsfaktoren, die verwendet werden, um die Stamm- und
Progenitorzellentwicklung zu regulieren, welche regulatorische Wirkungen
auf die Zellen aufweisen, die von der Förderung der Proliferation verschieden
sind, beinhalten transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGFβ), Retinsäure, Activin,
Bone Morphogenic Protein (BMP), ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF)
und Makrophagen-Entzündungsproteine (MIP-1α, MIP-1β, MIP-2).
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In
der Gegenwart eines Wachstumsfaktors wird eine multipotente Stammzelle
angeregt, sich zu teilen, was ein Cluster undifferenzierter Zellen
hervorruft, welches hierin als eine "Neurosphere" bezeichnet wird. Die Neurosphere ist
hauptsächlich
aus multipotenten Stammzellen und Progenitorzellen zusammengesetzt.
Zusammen werden die Zellen der Neurosphere hierin als "Vorläuferzellen" bezeichnet. In vitro
wachsen Vorläuferzellen
typischerweise in der Form von Neurospheres, sie können aber
unterschiedliche Wachstumsmuster zeigen, was von den Kultivierungsbedingungen
und -techniken abhängt.
Anfangs sind die Zellen der Neurosphere nicht gegenüber GFAP,
NF, NSE oder MBP immunreaktiv. Jedoch gehören die Zellen zu dem Nestin (+)-Phänotyp, welches
ein intermediäres
Filamentprotein ist, das in undifferenzierten ZNS-Zellen gefunden wird.
Der Nestinmarker wurde von Lehndahl et al., Cell 60: 585–595 (1990)
charakterisiert. Die reifen Phänotypen,
welche mit den Zelltypen verbunden sind, die sich aus den Nachkommen
der Zellen der Neurosphere differenzieren können, sind vorwiegend im Hinblick
auf den Nestin-Phänotyp
negativ.
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Bei
dem fortgesetzten Vorliegen eines Mitogens wie z. B. EGF oder dergleichen
fahren die Vorläuferzellen
innerhalb der Neurosphere fort, sich zu teilen, was zu einer Zunahme
bei der Größe der Neurosphere und
der Anzahl an undifferenzierten Zellen [Nestin (+), GFAP (–), NF (–), NSE
(–), MBP
(–)] führt. In
diesem Stadium sind die Zellen nicht adhärent und neigen dazu, die frei
schwebenden Cluster zu bilden, die für Neurospheres charakteristisch
sind. Nach 6 bis 7 DIV können
die Zellen der Neurosphere dissoziiert werden. Praktisch alle Zellen
haften an dem Gewebekultursubstrat. Bei dem fortgesetzten Vorliegen
eines Wachstumsfaktors beginnen die Stammzellen sich zu teilen und
von dem Substrat abzuheben, wobei sie neue frei schwebende Neurospheres
bilden, die aus klonal abgeleiteten Zellen bestehen. Somit kann
unter Verwendung dieser Methode der Proliferation, Dissoziation
und erneuten Einleitung der Proliferation eine unbegrenzte Anzahl
von klonal abgeleiteten Vorläuferzellen
in vitro erzeugt werden.
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Beim
Entfernen des mitogenen Wachstumsfaktors hört die Proliferation der Stammzelle
auf. Die Sphere mit undifferenzierten Zellen kann an einem Substrat
wie z. B. mit poly-Ornithin behandeltem Kunststoff oder Glas anhaften,
wo die Zellen beginnen, sich zu Neuronen und Gliazellen zu differenzieren.
Somit wirkt der Wachstumsfaktor als ein extrinsisches Signalmolekül, das nach
Wunsch zugegeben oder entfernt werden kann, um das Ausmaß der Proliferation
zu steuern.
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Wenn
der mitogene Wachstumsfaktor entfernt wurde, können die auf den Wachstumsfaktor
ansprechenden Stammzellennachkommen zusammen auf einer Futterschicht
kultiviert werden. Viele Typen von Futterschichten wie z. B. Fibroblasten,
Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Tumorzelllinien, genetisch
veränderte
Zelllinien oder irgendwelche Zellen oder ein Substrat mit bioaktiven
Eigenschaften können
verwendet werden. Die Futterschicht erzeugt im Allgemeinen einen
größeren Bereich
an Phänotypen.
In diesem Fall wirkt die Futterschicht als ein Substrat und als
eine Quelle von sowohl membrangebundenen als auch löslichen
Faktoren, welche die Differenzierung der von der Stammzelle erzeugten
Nachkommen anregen und verändern. Im
Vergleich zu einer inerteren Substanz wie z. B. poly-L-Ornithin induziert
beispielsweise eine Astrozytenfutterschicht einen größeren Bereich
von neuronalen Phänotypen,
wie durch eine indirekte immunzytochemische Methode nach 7 DIV bestimmt
wird. Wenn sie auf einem mit poly-L-Ornithin beschichteten Substrat
mit 1 % fötalem
Rinderserum differenziert werden, sind neuronale Phänotypen
fast ausschließlich
GABAerg oder Substanz Perg (auf Substanz P reagierend). Wenn sie
auf einer Astrozytenfutterschicht differenziert werden, liegen zusätzlich zu
GABAergen und Substanz Pergen Neuronen, Somatostatin, Neuropeptid
Y (NPY), Glutamat und Met-Enkephalin-enthaltende Neurone vor. Die
Astrozyten können
aus Gewebe stammen, das aus verschiedenen Bereichen des Gehirns
erhalten wurde, wie z. B. dem Striatum, Cortex und Rückenmark.
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Wenn
der Wachstumsfaktor einmal entfernt wurde, kann das Kulturmedium
Serum wie z. B. 0,5 bis 1,0% fötales
Rinderserum (FBS) enthalten. Das Serum neigt dazu, den Differenzierungsprozess
zu unterstützen
und das Überleben
der Zellen zu verstärken,
insbesondere wenn die differenzierenden Zellen bei einer niedrigen
Dichte wachsen gelassen werden.
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Innerhalb
von 1–3
Tagen nach der Entfernung des Wachstumsfaktors und dem Setzen der
Zelle unter Bedingungen, welche eine Differenzierung und das Überleben
unterstützen,
beginnen die meisten oder alle Vorläuferzellen die Immunreaktivität für Nestin
zu verlieren und beginnen, Antigene zu exprimieren, die für Neuronen,
Astrozyten oder Oligodendrozyten spezifisch sind. Die Identifizierung
von Neuronen wird bestätigt, indem
eine Immunreaktivität
für NSE,
NF, β-Tub,
NeuN (ein Kernantigen), MAP-2 und das neuronenspezifische Protein
Tau-1 verwendet wird. Astrozyten und Oligodendrozyten werden identifiziert,
indem eine Immunreaktivität
für GFAP
bzw. GalC verwendet wird. Zellen die keine Antigene exprimieren,
die für
Neuronen oder für
Astrozyten spezifisch sind, beginnen in einer korrekten zeitlichen
Weise Marker zu exprimieren, die für Oligodendrozyten spezifisch
sind: Das heißt,
die Zellen werden zuerst immunreaktiv für O4 (ein Zelloberflächenantigen),
GalC (ein Myelinglycolipid) und schließlich MBP. Diese Zellen besitzen
ebenfalls eine charakteristische Oligodendrozytenmorphologie.
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Neuronen
können
ebenfalls auf der Basis ihres spezifischen Neurotransmitter-Phänotyps zusammen mit
einer Analyse ihrer Morphologie identifiziert werden. Unter Verwendung
von Immunfluoreszenz mit einer, zwei oder drei Markierungen und
Immunperoxidasemethoden können
differenzierte Neurospherekulturen im Hinblick auf die Expression
von Neurotransmittern, oder in manchen Fällen im Hinblick auf die Enzyme,
die für die
Neurotransmittersynthese verantwortlich sind, analysiert werden.
Alternativ kann eine in situ-Hybridisierungs histochemie durchgeführt werden,
indem cDNA- oder RNA-Sonden verwendet werden, welche für die mRNAs
des Peptidneurotransmitters oder des Neurotransmitter synthetisierenden
Enzyms spezifisch sind. Diese Techniken können mit immunzytochemischen
Methoden kombiniert werden, um die Identifizierung spezifischer
Phänotypen
zu verbessern. Wenn nötig
können
die oben diskutierten Antikörper
und molekularen Sonden in Western- bzw. Northern-Blot-Verfahren
angewendet werden, um bei der Zellidentifizierung zu helfen.
-
Zusätzlich dazu,
dass auf EGF-ansprechende Stammzellen aus jedem Bereich in dem embryonalen ZNS
isoliert werden können,
können
ZNS-Stammzellen ebenfalls aus einer Vielzahl von juvenilen und adulten ZNS-Bereichen,
einschließlich
des Conus Medullaris, des zervikalen, Brust- und Lendenrückenmarks,
des Gehirnstamms, des Hypothalamus und des Striatums, isoliert werden,
indem routinemäßige Biopsieverfahren verwendet
werden. In jedem dieser Fälle
zeigt die isolierte ZNS-Stammzelle eine Selbsterhaltung und erzeugt eine
große
Anzahl von Progenitorzellen, welche zu Neuronen, Astrozyten und
Oligodendrozyten differenzieren. Somit sind multipotente Stammzellen
in mehreren Bereiche des adulten Säugetier-ZNS vorhanden. ZNS-Stammzellen
können
ebenfalls aus dysfunktionalem ZNS-Gewebe, beispielsweise aus Gewebe, das
von der Alzheimer Krankheit, der Parkinson Krankheit oder dem Down-Syndrom
betroffen ist, isoliert werden.
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Die
oben beschriebenen Vorläuferzellen
können
in Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von biologischen Agentien
auf die Apoptose von neuronalen Zellen verwendet werden. Der Ausdruck "biologisches Agens" bezieht sich auf
jedes Agens wie z. B. einen Virus, ein Protein, ein Peptid, eine
Aminosäure,
ein Lipid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure, ein Nukleotid, ein Arzneimittel,
ein Pro-Drug oder eine andere Substanz, die eine Wirkung auf neuronale
Zellen haben kann, egal ob eine solche Wirkung schädlich, nützlich oder
andersartig ist.
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Biologische
Agentien, die für
neuronale Zellen nützlich
sind, werden hierin als "neurologische
Agentien" bezeichnet,
ein Ausdruck, welcher jede biologisch oder pharmazeutisch aktive
Substanz umfasst, die sich für
die Proliferation, das Überleben,
die Differenzierung und/oder das Funktionieren von ZNS-Zellen oder
die Behandlung einer neurologischen Krankheit oder Störung als
potentiell nützlich
erweisen kann. Beispielsweise kann der Ausdruck gewisse Neurotransmitter,
Neurotransmitterrezeptoren, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren
und dergleichen wie auch Enzyme, die bei der Synthese dieser Agentien
verwendet werden, umfassen.
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Um
die Wirkung eines potentiellen biologischen Agens auf die Apoptose
von neuronalen Zellen zu bestimmen, kann eine Kultur von Vorläuferzellen,
die von multipotenten Stamm zellen abgeleitet sind, die aus einem
Wirt erhalten wurden, welcher von einer ZNS-Krankheit oder Störung betroffen
ist, verwendet werden, oder es kann eine Kultur verwendet werden,
die aus normalem Gewebe erhalten wurde. Die Auswahl der Kultur wird
von dem bestimmten Agens, das getestet wird, und den Wirkungen,
die man erzielen möchte,
abhängen.
Wenn die Zellen einmal aus dem gewünschten Donorgewebe erhalten
wurden, werden sie in vitro in der Gegenwart eines Wachstumsfaktors
proliferieren gelassen.
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Die
Wirkungen des biologischen Agens auf die Apoptose von neuronalen
Zellen kann durch Messen des Ausmaßes der DNA-Leiterbildung,
welche ein Anzeichen für
die Apoptose ist, oder durch RT-PCR-Analyse im Hinblick auf bekannte
potentiell Apoptose regulierende Moleküle oder durch mRNA-Fingerprint-Analyse
im Hinblick auf unbekannte potentiell Apoptose regulierende Moleküle bestimmt
werden.
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Die
Wirkungen der biologischen Agentien werden in Zeitintervallen überwacht
und werden auf der Grundlage eines signifikanten Unterschieds in
Bezug auf Kontrollkulturen bezogen auf Kriterien wie z. B. das Ausmaß der Apoptose
bewertet. Physikalische Charakteristika der Zellen können analysiert
werden, indem die Morphologie der Zelle und der Neuriten und das
Wachstum mit dem Mikroskop beobachtet werden. Die Induktion der
Expression von neuen oder erhöhten
Spiegeln von Proteinen wie z. B. Enzymen, Rezeptoren und anderen
Zelloberflächenmolekülen oder
von Neurotransmittern, Aminosäuren,
Neuropeptiden und biogenen Aminen kann durch irgendeine Technik,
die im Stand der Technik bekannt ist, welche die Veränderung
des Spiegels solcher Moleküle
identifizieren kann, analysiert werden. Diese Techniken beinhalten
die Immunhistochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen solche Moleküle oder
die biochemische Analyse. Eine solche biochemische Analyse beinhaltet
Proteinassays, enzymatische Assays, Rezeptorbindungsassays, enzymverknüpfte Immunsorbensassays
(ELISA), eine elektrophoretische Analyse, eine Analyse mit Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC), Western-Blots und Radioimmunassays (RIA). Eine Nukleinsäureanalyse
wie z. B. Northern-Blots und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
können
verwendet werden, um die Spiegel von mRNA zu untersuchen, die für diese
Moleküle
oder für
Enzyme, welche diese Moleküle
synthetisieren, codiert. Genomische DNA kann quantifiziert werden,
indem Standardverfahren verwendet werden, und im Hinblick auf das
Ausmaß der
DNA-Leiterbildung (d. h. den enzymspezifischen Abbau von DNA), welche
ein Anzeichen für
Apoptose ist, analysiert werden.
-
Die
Faktoren, die an der Proliferation von Stammzellen und der Proliferation,
Differenzierung und dem Überleben
von Stammzellennachkommen und/oder deren Reaktionen auf biologische
Agentien beteiligt sind, können
isoliert werden, indem cDNA-Bibliotheken aus Stamm zellen oder Stammzellennachkommen
in unterschiedlichen Stufen ihrer Entwicklung konstruiert werden,
wobei Techniken verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt
sind. Die Bibliotheken aus Zellen in einem Entwicklungsstadium werden
mit denen von Zellen in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung
verglichen, um die Folge der Genexpression während der Entwicklung zu bestimmen
und die Wirkungen von verschiedenen biologischen Agentien aufzuzeigen
oder neue biologische Agentien aufzuzeigen, welche die Genexpression
in ZNS-Zellen verändern.
Wenn die Bibliotheken aus dysfunktionalem Gewebe hergestellt werden,
können
genetische Faktoren identifiziert werden, die eine Rolle bei der
Ursache der Dysfunktion spielen, indem die Bibliotheken aus dem
dysfunktionalen Gewebe mit denen aus normalem Gewebe verglichen
werden. Diese Information kann bei der Planung von Therapien verwendet
werden, um die Störungen
zu behandeln. Zusätzlich
können
Sonden zur Verwendung bei der Diagnose von verschiedenen genetischen
Störungen
oder zur Verwendung beim Identifizieren neuronaler Zellen in einem
bestimmten Stadium der Entwicklung identifiziert werden.
-
Eine
elektrophysiologische Analyse kann verwendet werden, um die Wirkungen
von biologischen Agentien auf neuronale Charakteristika wie z. B.
das Ruhemembranpotential, evozierte Potentiale, Richtung und ionische
Natur des Stromflusses und die Dynamik von Ionenkanälen zu bestimmen.
Diese Messungen können
durchgeführt
werden, indem irgendeine Technik, die im Stand der Technik bekannt
ist, einschließlich der
Aufzeichnung der extrazellulären
Einzeleinheitsspannung, der Aufzeichnung der intrazellulären Spannung, Spannungs-Clamping und Patch-Clamping,
verwendet wird. Spannungssensitive Farbstoffe und ionensensitive
Elektroden können
ebenfalls verwendet werden.
-
Damit
die hierin beschriebene Erfindung besser verstanden wird, werden
die folgenden Beispiele und Beschreibungen angegeben. Man sollte
verstehen, dass diese Beispiele nur der Veranschaulichung dienen und
nicht als den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend ausgelegt
werden sollen.
-
Beschreibung 1
-
Vermehrung von Vorläuferzellen
-
Embryonale
14 Tage alte (E14) CD1-Albino-Mäuse (Charles
River) wurden enthauptet, und das Gehirn und die Striata wurden
entfernt, indem ein steriles Verfahren verwendet wurde. Das Gewebe
wurde mechanisch mit einer feuerpolierten Pasteurpipette in serumfreiem
Medium, das aus einer 1:1-Mischung von Dulbecco's modifizierten Eagle-Medium (DMEM) und
F-12-Nährmischung
(Gibco) zusammengesetzt war, dissoziiert. Die Zellen wurden bei
800 Upm für
5 Minuten zentrifugiert, der Überstand
abgesaugt und die Zellen zum Zählen
in DMEM/F-12-Medium resuspendiert.
-
Die
Zellen wurden in einem serumfreien Medium suspendiert, das im Folgenden
als "vollständiges Medium" bezeichnet wird,
das aus DMEM/F-12 (1:1) zusammengesetzt war, welches Glucose (0,6%),
Glutamin (2 mM), Natriumbicarbonat (3 mM), HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure)-Puffer
(5 mM) und eine definierte Hormonmischung und Salzmischung (um das
Serum zu ersetzen) beinhaltete, die Insulin (25 μg/ml), Transferrin (100 μg/ml), Progesteron
(20 nM), Putrescin (60 μm)
und Selenchlorid (30 nM) (alle von Sigma, außer Glutamin [Gibco]) einschloss.
Zusätzlich
enthielt das Medium 16–20
ng/ml EGF (gereinigt aus der Maus, submaxillär, Collaborative Research)
oder TGFα (human
rekombinant, Gibco). Die Zellen wurden bei 0,2 × 106 Zellen/ml
in 75 cm2-Gewebekulturkolben (Corning) ohne
eine Substratvorbehandlung plattiert und in einem Inkubator bei
37°C, 100%
Feuchtigkeit, 95% Luft/5% Co2 angeordnet.
-
Wenn
die Zellen proliferiert hatten, bildeten sie innerhalb der ersten
48 Stunden und nach 3–4
Tagen in vitro (DIV) kleine Cluster, welche als Neurospheres bekannt
sind, die sich zwischen 4–6
DIV von dem Substrat ablösten
(1). Neurospheres enthalten undifferenzierte
Vorläuferzellen,
d. h. Stammzellen und Progenitorzellen.
-
Nach
7 DIV wurden die Neurospheres entfernt, bei 400 Upm für 2–5 Minuten
zentrifugiert, und das Pellet wurde mechanisch mit einer feuerpolierten
Glaspasteurpipette in 2 ml vollständigem Medium dissoziiert.
1 × 106-Zellen wurden erneut in einem 75 cm2-Gewebekulturkolben mit 20 ml EGF-enthaltendem
vollständigem Medium
plattiert. Die Proliferation der Stammzellen und die Bildung neuer
Neurospheres wurden wieder eingeleitet. Dieser Vorgang kann alle
6–8 Tage
wiederholt werden.
-
Beschreibung 2
-
Differenzierung von Neurospheres
-
Neurospheres
wurden differenziert, indem die folgenden Musterbeispiele verwendet
wurden. Eine Verwendung von irgendeinem der folgenden Musterbeispiele
erzeugt Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Jedoch kann die
Zugabe gewisser Wachstumsfaktoren oder Kombinationen von Wachstumsfaktoren
die Phänotypverhältnisse,
die nach der Differenzierung erhalten werden, verändern. Zusätzlich kann
die Verwendung glialer Futterbetten die erhaltenen Phänotypverhältnisse
beeinflussen. Die Neurospheres, welche für jedes der folgenden Musterbeispiele
verwendet wurden, wurden wie in Beschreibung 1 umschrieben erzeugt. Alle
verwendeten Neurospheres wurden vor ihrer Differenzierung wenigstens
einmal passagiert (passed).
-
Musterbeispiel 1 – Schnelle
Differenzierung von Neurospheres
-
6
bis 8 Tage nach der ersten Passage wurden die Neurospheres entfernt
und bei 400 Upm zentrifugiert. Der EGF-haltige Überstand wurde entfernt und
das Pellet in EGF-freiem vollständigen
Medium, welches 1 % fötales
Rinderserum (FBS) enthielt, suspendiert.
-
Neurospheres
(ungefähr
0,5–1,0 × 106 Zellen/Vertiefung) wurden auf poly-L-Ornithinbeschichteten
(15 μg/ml)
Glasdeckgläschen
in Nuclon-Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (1,0 ml/Vertiefung)
plattiert. Nach 24 Stunden in Kultur wurden die Deckgläschen in
Kulturschalen mit 12 Vertiefungen (Costar) überführt, welche vollständiges Medium,
das 0,5% FBS enthielt, enthielten. Das Medium wurde alle 4–7 Tage
ausgetauscht. Dieser Differenzierungsvorgang wird als das "Musterbeispiel schnelle
Differenzierung" oder
RDP bezeichnet.
-
Musterbeispiel 2 – Differenzierung
von dissoziierten Neurospheres
-
6
bis 8 Tage nach der ersten Passage, wurden die Neurospheres entfernt
und bei 400 Upm zentrifugiert. Das EGF-enthaltende Medium wurde
entfernt, und das Pellet wurde in EGF-freiem vollständigem Medium, das 1 % FBS
enthielt, suspendiert. Die Neurospheres wurden mechanisch mit einer
feuerpolierten Pasteurpipette zu einzelnen Zellen dissoziiert und
bei 800 Upm für
5 Minuten zentrifugiert. Zwischen 0,5 × 106 und 1,0 × 106 Zellen wurden auf poly-L-Ornithin-beschichteten
(15 μg/ml)
Glasdeckgläschen
in Nuclon-Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (1,0 ml/Vertiefung)
plattiert. Das EGF-freie Kulturmedium, das 1% FBS enthielt, wurde alle
4–7 Tage
ausgetauscht.
-
Musterbeispiel 3 – Differenzierung
von einzelnen Neurospheres
-
Neurospheres
wurden mit Serientransfers durch Austausch mit EGF-freiem Medium
von EGF freigewaschen. Einzelne Neurospheres wurden auf poly-L-Ornithin-beschichteten
(15 μg/ml)
Glasdeckgläschen
in einer Platte mit 24 Vertiefungen plattiert. Das verwendete Kulturmedium
war vollständiges
Medium mit oder ohne 1 % FBS. Das Medium wurde alle 4–7 Tage
ausgetauscht. Eine immunzytochemische Methode mit drei Markierungen
zeigte, dass alle drei neuronalen Zelltypen, d. h. Neuronen, Astrozyten
und Oligodendrozyten, klonal von einer einzigen Neurosphere abgeleitet
sind (2).
-
Musterbeispiel 4 – Differenzierung
von einzelnen dissoziierten Neurospheres
-
Neurospheres
wurden mit Serientransfers durch Austausch mit EGF-freiem Medium
von EGF freigewaschen. Eine einzelne Neurosphere wurde mechanisch
in ein 0,5 ml-Eppendorf-Zentrifugenröhrchen dissoziiert,
und alle Zellen wurden auf einer poly-L-Ornithin-beschichteten 35
mm-Kulturschale plattiert. Vollständiges Medium wurde mit oder
ohne 1 % FBS verwendet.
-
Musterbeispiel 5 – Differenzierung
von Neurospheres, die zusammen mit striären Astrozyten kultiviert wurden
-
Neurospheres,
die wie in Beispiel 1 beschrieben von striären Zellen abgeleitet waren,
wurden mit 5-Bromdeoxyuridin (BrdU) markiert und von EGF freigewaschen.
Eine Astrozyten-Futterschicht
wurde aus dem striären
Gewebe von Mäusen
nach der Geburt (0–24
Stunden) erzeugt und auf poly-L-Ornithin-beschichteten Glasdeckgläschen in
einer Kulturschale mit 24 Vertiefungen plattiert. Wenn die Astrozyten
konfluent waren, wurde auf jedem Astrozytenbett eine dissoziierte
oder intakte Neurosphere angeordnet. Vollständiges Medium wurde nach den
ersten 24 Stunden und dann alle 48 Stunden ausgetauscht. Wenn auf
einer Astrozytenfutterschicht differenziert wurde, waren zusätzlich zu
GABAergen und Substanz Pergen Neuronen Somatostatin, NPY, Glutamat
und Metenkephalin enthaltende Neurone vorhanden (3).
-
Beschreibung 3
-
Screenen von
Arzneimitteln oder anderen biologischen Agentien auf verschiedene
Wirkungen
-
A. Wirkungen von BDNF
auf die Differenzierung und das Überleben
von neuronalen und glialen Zellen
-
Vorläuferzellen
wurden wie in Beschreibung 1 beschrieben vermehrt und unter Verwendung
von Musterbeispiel 3, das in Beschreibung 2 beschrieben wird, differenziert.
Zur Zeit der Plattierung der mit EGF erzeugten Zellen wurde BDNF
in einer Konzentration von 10 ng/ml zugegeben. Nach 3, 7, 14 und
21 Tagen in vitro (DIV) wurden die Zellen für eine indirekte immunzytochemische
Methode aufbereitet. Eine BrdU-Markierung wurde verwendet, um die
Proliferation der Vorläuferzellen
zu überwachen.
Die Wirkungen von BDNF auf Neurone, Oligodendrozyten und Astrozyten
wurden getestet, indem die Kulturen mit Antikörpern sondiert wurden, die
Antigene erkennen, welche auf Neuronen (MAP-2, NSE, NF), Oligodendrozyten
(O4, GalC, MBP) oder Astrozyten (GFAP) gefunden werden. Das Überleben
der Zellen wurde bestimmt, indem die Anzahl von immunreaktiven Zellen
zu jedem Zeitpunkt gezählt
wurde und morphologische Beobachtungen durchgeführt wurden. BDNF erhöhte signifikant
die Differenzierung und das Überleben
von Neuronen gegenüber
der Anzahl, die unter Kontrollbedingungen beobachtet wurde (4).
Die Zahlen von Astrozyten und Oligodendrozyten waren gegenüber den
Kontrollwerten nicht signifikant verändert.
-
B. Wirkungen von BDNF
auf die Differenzierung neuronaler Phänotypen
-
Zellen,
die gemäß den Methoden,
die in Teil A beschrieben werden, mit BDNF behandelt wurden, wurden
mit Antikörpern,
welche neuronale Transmitter oder Enzyme, die an der Synthese von
neuronalen Transmittern beteiligt sind, erkennen, sondiert. Diese
beinhalteten Tyrosinhydroxylase (TH), Cholinacetyltransferase (ChAT),
Substanz P, GABA, Somatostatin und Glutamat. Sowohl bei Kontrollbedingungen
als auch bei einer BDNF-behandelten Kultur wurden die Neuronen positiv
im Hinblick auf das Vorliegen von Substanz P und GABA getestet (5). Neben einem Anstieg bei den Zahlen
zeigten die Neurone, die in BDNF wachsen gelassen wurden, einen
dramatischen Anstieg bei der Verlängerung der Neuriten und der
Verzweigung, wenn sie mit Kontrollbeispielen verglichen wurden (6).
-
C. Identifizierung von
auf Wachstumsfaktor ansprechenden Zellen
-
Zeilen,
die auf eine Behandlung mit Wachstumsfaktor ansprechen, wurden identifiziert,
indem die mit EGF erzeugten Nachkommen wie in Beschreibung 2, Musterbeispiel
3 beschrieben differenziert wurden und nach 1 DIV ungefähr 100 ng/ml
BDNF zugegeben wurden. Nach 1, 3, 6, 12 und 24 Stunden nach der
Zugabe von BDNF wurden die Zellen fixiert und für eine immunzytochemische Methode
mit zwei Markierungen aufbereitet. Antikörper, welche Neurone (MAP-2,
NSE, NF), Oligodendrozyten (O4, GalC, MBP) oder Astrozyten (GFAP)
erkennen, wurden in Kombination mit einem Antikörper, welcher c-fos und/oder
andere Immediate Early Gene erkennt, verwendet. Eine Exposition
an BDNF führt
zu einem selektiven Anstieg bei der Expression von c-fos in neuronalen
Zellen (6).
-
D. Wirkungen von BDNF
auf die Expression von Markern und regulatorischen Faktoren während der
Proliferation und Differenzierung
-
Zellen,
die gemäß den in
Teil A beschriebenen Methoden mit BDNF behandelt wurden, werden
zur Analyse der Expression von FGF-R1 wie in Beschreibung 5 beschrieben
oder anderen Markern und regulatorischen Faktoren wie in Beschreibung
6 beschrieben aufbereitet.
-
E. Wirkungen der Verabreichung
von BDNF während
der Differenzierung auf die elektrophysiologischen Eigenschaften
der Neurone
-
Neurone,
die gemäß den Methoden,
die in Teil A beschrieben werden, während der Differenzierung mit
BDNF behandelt wurden, werden zur Bestimmung ihrer elektrophysiologischen
Eigenschaften wie in Beschreibung 7 beschrieben aufbereitet.
-
F. Wirkungen von Chlorpromazin
auf die Proliferation, Differenzierung und das Überleben von mit Wachstumsfaktor
erzeugten Stammzellennachkommen
-
Chlorpromazin,
ein Arzneimittel, welches weithin bei der Behandlung von psychischen
Krankheiten verwendet wird, wird in Konzentrationen, die von 10
ng/ml bis 1000 ng/ml reichen, anstelle von BDNF in den Beschreibungen
3A bis 3E oben verwendet. Die Wirkungen des Arzneimittels in verschiedenen
Konzentrationen auf die Stammzellenproliferation und auf die Differenzierung
und das Überleben
der Stammzellennachkommen werden überwacht. Veränderungen
bei der Genexpression und den elektrophysiologischen Eigenschaften
der differenzierten Neurone werden bestimmt.
-
G.
Wirkungen von Deprenyl auf die Differenzierung und das Überleben
dopaminerger Zellen
-
Primärkulturen
werden unter Verwendung der Methoden in Beschreibung 1 hergestellt.
Die Zellen werden differenziert, um die Anzahl dopaminerger Neuronen
zu erhöhen.
Einzelne undissoziierte 6 Tage alte primär erzeugte Neurospheres werden
auf poly-L-Ornithinbeschichteten Glasdeckgläschen in vollständigem Medium
mit konditioniertem Medium, das von der Ratten B-49-Gliazelllinie
abgeleitet ist (75%), + 20 ng/ml FGF-2 plattiert und bei 37°C, 100% Feuchtigkeit,
95% Luft/5% CO2 inkubiert. Deprenyl, ein
Arzneimittel, welches bei der Behandlung der Parkinson Krankheit
verwendet wird, wird beim Einsetzen der Differenzierung und/oder wenn
eine Differenzierung stattgefunden hat zu den Kulturen in Konzentrationen
zugegeben, die von 1 ng/ml bis 1000 ng/ml reichen. Die Anzahl an überlebenden
dopaminergen Zellen wird in Intervallen gezählt und mit Kontrollkulturen
verglichen. Zusätzlich
werden biochemische Assays, um die Neurotransmitterexpression zu messen,
und eine Nukleinsäureanalyse
unternommen.
-
Beschreibung 4
-
Stammzellenproliferationsassay
-
Primärzellen
wurden aus E14-Mäusen
erhalten und wie in Beispiel 1 umschrieben vorbereitet. Entweder
EGF, EGF und FGF oder EGF und BMP-2 wurden zu vollständigem Medium
in einer Konzentration von 20 ng/ml von jedem Wachstumsfaktor, mit
der Ausnahme von BMP-2,
welcher in einer Konzentration von 10 ng/ml zugegeben wurde, zugegeben.
Zellen wurden mit einem der vorbereiteten Wachstumsfaktor enthaltenden
Medien auf eine Konzentration von 25.000 Zellen/ml verdünnt. 200 μl der Zellen/Medium-Kombination
wurden ohne Vorbehandlung des Substrats in jede Vertiefung einer
Platte mit 96 Vertiefungen (Nuclon) pipettiert. Die Zellen wurden
unter denselben Bedingungen wie in Beschreibung 1 umschrieben inkubiert.
-
Nach
8–10 DIV
wurde die Anzahl an Neurospheres gezählt und die Ergebnisse tabellarisch
angeordnet. Wie in 7 gezeigt ist, erzeugten Zellen,
die in einer Kombination von EGF und FGF wachsen gelassen wurden,
signifikant mehr Neurospheres als Zellen, die in Gegenwart von EGF
allein wachsen gelassen wurden. Die Kombination von EGF und BMP-2
inhibierte die Neurosphere-Entwicklung.
-
Beschreibung 5
-
Vergleich der Rezeptor-
und Wachstumsfaktorexpression in undifferenzierten gegenüber differenzierten
von Stammzellen abgeleiteten Nachkommen durch reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR)
-
Neurospheres
wurden wie in Beschreibung 1 beschrieben erzeugt, und einige wurden
wie in Musterbeispiel 1, Beschreibung 2, differenziert. RNA aus
sowohl undifferenzierten als auch differenzierten Neurospheres wurde
gemäß dem Guanidin-Thiocyanatsäure-Phenol-Verfahren
von Chomzynski und Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156–159 1987)]
isoliert. Komplementäre
DNA (cDNA) wurde aus der Gesamt-RNA synthetisiert, indem reverse
Transkriptase, die mit Oligo dT geprimed wurde, verwendet wurde.
Genspezifische Primer wurden entworfen und synthetisiert, und diese
Primer wurden in einer PCR verwendet, um cDNAs für verschiedene Wachstumsfaktoren
und Wachstumsfaktorrezeptoren zu amplifizieren. Amplifiziertes Material
wurde auf Agarosegelen zusammen mit Molekulargewichtsmarkern laufen
gelassen, um sicher zu stellen, dass die PCR-Produkte die erwartete
Größe aufwiesen,
wäh rend
die Identität
der PCR-Fragmente durch Restriktionsenzymanalyse und durch Sequenzierung
bestätigt
wurde [Arcellana-Panlilio, Methods Enzymol. 225: 303–328 (1993)].
8 ist
eine Fotografie eines mit Ethidium gefärbten Agarosegels, das durch
eine UV-Beleuchtung sichtbar gemacht wurde, welches den Nachweis
von drei Wachstumsfaktorrezeptortranskripten nämlich EGF-R, FGF-R und LIF-R
in undifferenzierten und differenzierten von Stammzellen abgeleiteten
Nachkommen zeigt. Tabelle I listet die analysierten Primersätze und
die Ergebnisse der undifferenzierten und differenzierten Zellen
auf. TABELLE
I Analysierte
Primersätze
- r = Rezeptor
- m = aus Mäusen
stammend
- nd = keine Daten verfügbar
-
Beschreibung 6
-
Isolierung neuer Marker
und regulatorischer Faktoren, die an der Proliferation und Differenzierung
neuronaler Stammzellen beteiligt sind
-
Neurospheres
werden wie in Beschreibung 1 beschrieben erzeugt, indem ZNS-Gewebe
aus CD-Albinomäusen
(Charles River) verwendet wird. Einige dieser Neurospheres werden
ent sprechend dem Musterbeispiel der schnellen Differenzierung von
Beschreibung 2 differenzieren gelassen, was Kulturen erzeugt, die
mit Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten angereichert sind.
Die gesamte RNA wird aus den undifferenzierten Neurospheres wie
auch den differenzierten Zellkulturen extrahiert, indem das Guanidin-Thiocyanatsäure-Phenol-Verfahren verwendet
wird, auf welches in Beschreibung 5 Bezug genommen wird. Boten-RNA (mRNA) wird isoliert,
indem die Affinität
ihres Poly-A-Teils zu Strängen
von entweder Us oder Ts ausgenutzt wird. Die reverse Transkription
der über
mRNA erzeugten cDNA wird dann verwendet, um primäre Bibliotheken in entweder
Plasmid- [Rothstein et al., Methods in Enzymology 225: 587–610 (1993)]
oder Lambdaphagenvektoren zu erzeugen. Um cDNAs zu isolieren, die
entweder für
undifferenzierte oder differenzierte von Stammzellen abgeleiteten
Nachkommen spezifisch sind, wird cDNA aus dem Einen mit RNA aus
dem Anderen hybridisiert und umgekehrt. Die unhybridisierten und
somit für
den Kulturtyp spezifischen cDNAs werden in jedem Fall dann verwendet,
um subtrahierte Bibliotheken zu konstruieren [Lopez-Fernandez und del
Mazo, Biotechniques 15(4): 654–658
(1993)], oder verwendet, um die primären Bibliotheken zu screenen.
-
Von
Stammzellen abgeleitete für
undifferenzierte Zellen spezifische und für differenzierte Zellen spezifische
cDNA-Bibliotheken liefern eine Quelle von Klonen für neue Marker
und regulatorische Faktoren, die an der ZNS-Stammzellenproliferation
und -differenzierung beteiligt sind. Spezifische cDNAs werden durch
Sequenzierungsanalyse, um spezifische Sequenzmotive als Hinweise
auf die Identität
oder Funktion nachzuweisen, und durch Datenbanksuchen im Hinblick
auf Homologien mit bekannten Transkripten untersucht. Die Verwendung
von cDNAs in einer Hybridisierung mit verschiedenen RNA-Proben,
die auf einem Agarose-Formaldehyd-Gel einer Elektrophorese unterzogen
wurden und auf eine Nylonmembran überführt wurden, erlaubt die Abschätzung der
Größe, der
relativen Häufigkeit
und der Spezifität
der Transkripte. Die gesamten oder Teile der cDNA-Sequenzen werden
verwendet, um andere Bibliotheken zu screenen, um entweder vollständige mRNA-Sequenzen oder eine
genomische Sequenzinformation zu erhalten. Antikörper, die gegen Fusionsproteine
gerichtet sind, welche aus spezifischen cDNAs erzeugt wurden, werden
verwendet, um entweder durch Immunzytochemie oder durch Western-Blot-Analyse
Proteine nachzuweisen, die für
eine bestimmte Zellpopulation spezifisch sind. Spezifische Gensequenzen
werden verwendet, um Proteine zu isolieren, die mit mutmaßlichen
regulatorischen Elementen wechselwirken, welche die Genexpression
steuern. Diese regulatorischen Elemente werden dann verwendet, um
die Expression eines exogenen Gens wie beispielsweise beta-Galactosidase
zu steuern.
-
Beschreibung 7
-
Elektrophysiologische
Analyse von Neuronen, die aus auf Wachstumsfaktor ansprechenden
Stammzellen erzeugt wurden und an ein biologisches Agens exponiert
wurden
-
Neurospheres
wurden wie in Beschreibung 1 beschrieben erzeugt. Neurospheres wurden
unter Verwendung der Technik, die in Musterbeispiel 2, Beschreibung
2, beschrieben wird, dissoziiert. Die klonal abgeleiteten Zellen
wurden in geringer Dichte plattiert und in der Gegenwart von bFGF
differenziert. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen
mit dem morphologischen Erscheinungsbild von Neuronen wurden bestimmt,
wie von Vescovi et al. [Neuron 11: 951–968 (1993)] beschrieben wird.
Bei einer Ganzzellenstromklammer (whole cell current clamp) betrugen
das mittlere Ruhepotential und der Eingangswiderstand –62 ± 9 mV und
372 ± MΩ. Rechtwinklige überschwellige
Stromstufen (~ 100 pA) riefen regenerative Potentialantworten hervor,
bei welchen die Amplitude und der Zeitverlauf vom Reiz abhängig waren
(9). Nach dem Abschluss der elektrophysiologischen
Experimente wurde die Zellmorphologie durch intrazelluläre Anregung
von 5-Carboxyfluorescein sichtbar gemacht.
-
Beschreibung 8
-
Screenen auf die Wirkungen
von Arzneimitteln oder anderen biologischen Agentien auf auf Wachstumsfaktor ansprechende
Stammzellennachkommen, die aus einem Gewebe erzeugt wurden, das
von einem Patienten mit einer neurologischen Störung erhalten wurde
-
Die
Wirkungen von BDNF auf die auf EGF ansprechenden Stammzellennachkommen,
die aus ZNS-Gewebe erzeugt wurden, das bei einer Biopsie von einem
Patienten mit der Huntington-Krankheit erhalten wurde, werden unter
Verwendung der Methoden, die in Beschreibung 3, A bis E, umschrieben
werden, bestimmt. BDNF ist ein potenter Differenzierungsfaktor für GABAerge
Neuronen und fördert
einen ausgedehnten Auswuchs von Neuronen (5B). Die
Huntington-Krankheit ist charakterisiert durch den Verlust von GABAergen
Neuronen (unter anderem) aus dem Striatum.
-
Beschreibung 9
-
Regulation des Amyloid
Precursor Proteins (APP) durch Wachstumsfaktoren
-
ZNS-Gewebe
wird aus einem Fötus
mit Down-Syndrom erhalten, und Neurospheres werden unter Verwendung
der Methoden von Beschreibung 1 erzeugt und passagiert, um die benötigte Anzahl
von Zellen zu erhalten. Die Zellen werden differenziert, indem irgendeiner
der Musterbeispiele, die in Beschreibung 2 beschrieben werden, verwendet
wird. Zur Zeit der Plattierung werden CNTF, BMP-2, Activin, FGF-2
oder Retinsäure
zu dem Kulturmedium in den experimentellen Vertiefungen in einer
Konzentration von 10 ng/ml zugegeben, und werden an jedem anderen
Tag in einer Konzentration von 2 ng/ml zugegeben. Nach 3, 7 und
14 DIV werden die Spiegel von APP-mRNA und -Protein bestimmt. Zur
Northern-Blot-Analyse wird RNA extrahiert, indem das Guanidin-Isothiocyanat/Cäsiumchlorid-Verfahren
verwendet wird [Goodison et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52(3):
192–198
(1993)]. Northern-Blots werden laufen gelassen und sondiert, indem
eine humane cDNA verwendet wird, welche die Proteaseinhibitordomäne von APPKPI oder eine Oligonukleotidsonde mit 30 Basenpaaren,
die für
APP695 spezifisch ist, codiert. Zur Western-Blot-Analyse
werden die Zellen in Laemmli-Puffer
homogenisiert, aufgekocht und einer SDS-PAGE auf Gel unterzogen.
Das Gel wird immungeblottet und mit anti-APP, der 1:1000 verdünnt ist,
sondiert. Die Spiegel der APP-mRNA-
und -Proteinexpression werden mit Kontrollkulturen verglichen.
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Beispiel 1
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Analyse von
apoptotischen Ereignissen unter Verwendung proliferierter neuronaler
Stammzellennachkommen
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A. Analyse der spontanen
Apoptose
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Proliferierende
Maus-Neurospheres wurden hergestellt, indem die Methoden von Beschreibung
1 verwendet wurden, und nach 3, 5, 7, 9, 12 und 15 Tagen der Kultivierung
geerntet. Maus-Neurospheres wurden differenziert, indem die Methode
von Beschreibung 2, Musterbeispiel 1, verwendet wurde, und nach
1, 4, 7, 10, 13 und 16 Tagen der Kultivierung geerntet. Zellen wurden
in 1 ml DNAzol-Reagens (Gibco/BRL) lysiert, und genomische DNA wurde
aus der Lösung
nach Ausfällen
mit 500 μl
Ethanol gepoolt. Genomische DNA wurde durch die optische Dichte
bei 260 nm quantifiziert. Das Ausmaß der DNA-Leiterbildung, welche
ein Anzeichen der Apoptose ist, wurde nachgewiesen, indem 250 ng
DNA in 50 μl
100 mM Kaliumcacodylat (pH 7,2), 2 mM CoCl2,
0,2 mM DTT, 50 μCi
[α32P]dATP und 25 Einheiten termi naler Deoxynukleotidyltransferase
gelöst wurden.
Die Reaktion wurde für
60 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die radioaktiven Produkte wurden durch eine 2% Gelelektrophorese
und Autoradiographie analysiert. Eine morphologische und biochemische
Analyse der proliferierenden und differenzierten Neurospherekulturen
zeigte, dass die Anzahl an Zellen, die aktiv an der spontanen Apoptose
beteiligt waren, von weniger als 20% mit zunehmenden Kultivierungstagen
bis zu größer als
50% reichte.
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B. RT-PCR-Analyse von
potentiellen Regulatoren der Apoptose in neuronalen Stammzellkulturen
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Die
Aktivität
von bekannten mutmaßlichen
Apoptose regulierenden Molekülen
wurde durch RT-PCR-Analyse ermittelt. Proliferierende und differenzierte
Nachkommen der neuronalen Stammzellkulturen von Mäusen wurden
unter Verwendung der Methoden von Beschreibung 1 und 2 hergestellt.
Eine reverse Transkription-PCR-Analyse von bekannten mutmaßlichen
Apoptose regulierenden mRNA-Transkripten wurde unternommen. Zellen
wurden in 1 ml RNAzol-Reagens (Gibco/BRL) lysiert, organische und
wässrige
Phasen wurden durch Zugabe von 0,2 Volumina Chloroform getrennt,
und die Gesamt-RNA wurde aus der wässrigen Phase durch Ausfällung unter
Zugabe eines gleichen Volumens an Isopropanol isoliert. RNA wurde
durch die optische Dichte bei 260 und 280 nm quantifiziert. Eine
Analyse durch Polymerase-Kettenreaktion von 0,5 μl Produkt der reversen Transkription
wurde in 25 μl
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 0,5 μM
Primer und 1,25 Einheiten Taq-Polymerase unternommen. Typische Zyklusparameter
waren 94°C
für 30
Sekunden, 60°C
für 30
Sekunden und 72°C
für 1 Minute,
wiederholt für
30 Zyklen. Über
30 potentielle Regulatoren der neuronalen Apoptose wurden analysiert,
einschließlich
Mitgliedern der Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Transkriptionsfaktoren,
Mitgliedern der Bcl-2-Proteinfamilie und der Familie von Proteasen
der Interleukin konvertierenden Enzyme. Unterschiedlich exprimierte
Mitglieder jeder Proteinfamilie wurden nachgewiesen.
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C. Nachweis und Klonierung
unbekannter potentieller Regulatoren der neuronalen Apoptose
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Die
Aktivität
von unbekannten Transkripten, welche möglicherweise die neuronale
Apoptose regulierten, wurde festgestellt, indem die mRNA-Fingerprint-Analyse
benutzt wurde. Proliferierende und differenzierte Nachkommen von
neuronalen Stammzellkulturen aus Mäusen wurden hergestellt und
wie oben beschrieben geerntet, und eine mRNA-Fingerprint-Analyse
von unbekannten mutmaßlichen
Apoptose regulierenden Molekülen
wurde unternommen. Die Zellen wurden in 1 ml RNAzol-Reagens (Gibco/BRL)
lysiert, organische und wässrige
Phasen wurden durch die Zugabe von 0,2 Volumina Chloroform getrennt,
und die Gesamt- RNA
wurde aus der wässrigen
Phase durch Ausfällung
unter Zugabe eines gleichen Volumens an Isopropanol isoliert. RNA
wurde durch die optische Dichte bei 260 und 280 nm quantifiziert.
Eine reverse Transkriptions- und Polymerase-Kettenreaktionsanalyse
wurde wie oben beschrieben unternommen. Radioaktive Produkte wurden auf
8% Acrylamid-Sequenziergelen getrennt und durch Autoradiografie
analysiert. Unterschiedlich exprimierte Banden wurden aus dem Gel
ausgeschnitten, wieder amplifiziert und sequenziert.
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D. Schaffung von genetisch
modifizierten Stammzellen für
einen Hochdurchsatzassay von Anti-Apoptose-Verbindungen
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Humane
und aus Mäusen
stammende neuronale Stammzellen werden genetisch modifiziert, um
ein Hochdurchsatzassaysystem für
potentiell therapeutische Anti-Apoptose-Verbindungen bereitzustellen.
Unter Verwendung einer Anzahl von direkten Transfizierungstechniken
werden DNA-Konstrukte, welche cytoplasmatische (Grün Flureszierendes
Protein (GFP) oder sezernierte (sezermierte alkalische Phosphatase
(SEAP)) Markerproteine enthalten, welche durch Promotoren eines
Apoptose regulierenden Moleküls
(einschließlich Bcl-2,
ICE und Nur-77) angetrieben werden, stabil in aus Mäusen stammende
und humane neuronale Stammzellen transformiert. Zur Transformation
unter Benutzung von Lipofectamin (BRL) werden die Zellen mit 2–3 × 106 Zellen pro 35 mm Kulturplatte angeimpft
und mit 200 μl
DNA-Liposomenkomplexen
(3 μg DNA,
20 μl Lipofectamin
(BRL) in 200 μl
Medium) für
12 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Wirkung einer Vielzahl von Verbindungen auf die neuronale
Apoptose wird durch die Wirkung, welche die Anwendung der Verbindung
auf die Expression der Markergene unter der Kontrolle der bekannten
Apoptose regulierenden Genpromotoren hat, durch Fluoreszenz (GFP)
oder sezernierte alkalische Phosphataseaktivität (SEAP) festgestellt.