JP2002542818A - ニューロンの発生に関連する材料及び方法 - Google Patents
ニューロンの発生に関連する材料及び方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞においてニューロンの運命を誘導することに関する。本発明者らは、神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるニューロンの運命を、該細胞内で基底レベルを超えるNurr1を発現させることにより誘導できることを見出した。Nurr1は、甲状腺ホルモン／レチノイン酸核受容体スーパーファミリーの転写因子である。本明細書においては、神経幹細胞又は神経前駆細胞における基底レベルを超えるNurr1の発現は、ニューロンの運命に向かって分化する細胞の割合を増加させることが示される。特に、神経幹細胞又は神経前駆細胞における基底レベルを超えるNurr1の発現、及び該細胞と、腹側中脳のタイプ1アストロサイトによって供給されるか又はそれから誘導される1種以上の因子との接触、を含むプロセスにより、ドーパミン作動性のニューロンの表現型が誘導されることが見出された。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるニューロンの運命の誘導に関
する。それは、特定のニューロンの表現型の誘導、及び特に中脳のドーパミン作
動性ニューロンの表現型の誘導に関する。
する。それは、特定のニューロンの表現型の誘導、及び特に中脳のドーパミン作
動性ニューロンの表現型の誘導に関する。
【０００２】発明の背景 神経幹細胞は、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトに分化
する能力を有する。神経幹細胞の生物学における最近の進歩は、そのような幹細
胞を、脳移植のための供給材料として単離し、増殖し、及び使用することができ
るということを示してきた(Snyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51 (1992); Rosentha
l, A. Neuron 20, 169-172 (1998); Gage, F.H.ら、Ann. Rev. Neurosci. 18, 1
59-192 (1995); Weiss, S.ら、Trends Neurosci. 19, 387-393 (1996); Snyder,
E.Y.ら、Clin. Neurosci. 3, 310-316 (1996); Martinez-Serrano, A.ら、Tren
ds Neurosci. 20, 530-538 (1997); McKay, R. Science 276, 66-71 (1997); St
uder, L.ら、Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998))。しかし、複数の研究が、
埋め込まれた神経幹細胞はうまく移植され、正規のニューロンの表現型を獲得す
ることを示しているが、無傷の成体の脳に移植された場合、これらの細胞はアス
トロサイト及びオリゴデンドロサイトの運命に偏るようである(Martinez-Serran
o, A.ら、Trends Neurosci. 20, 530-538 (1997); McKay, R. Science 276, 66-
71 (1997); Snyder, E.Y.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11663-11668 (1
997))。
する能力を有する。神経幹細胞の生物学における最近の進歩は、そのような幹細
胞を、脳移植のための供給材料として単離し、増殖し、及び使用することができ
るということを示してきた(Snyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51 (1992); Rosentha
l, A. Neuron 20, 169-172 (1998); Gage, F.H.ら、Ann. Rev. Neurosci. 18, 1
59-192 (1995); Weiss, S.ら、Trends Neurosci. 19, 387-393 (1996); Snyder,
E.Y.ら、Clin. Neurosci. 3, 310-316 (1996); Martinez-Serrano, A.ら、Tren
ds Neurosci. 20, 530-538 (1997); McKay, R. Science 276, 66-71 (1997); St
uder, L.ら、Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998))。しかし、複数の研究が、
埋め込まれた神経幹細胞はうまく移植され、正規のニューロンの表現型を獲得す
ることを示しているが、無傷の成体の脳に移植された場合、これらの細胞はアス
トロサイト及びオリゴデンドロサイトの運命に偏るようである(Martinez-Serran
o, A.ら、Trends Neurosci. 20, 530-538 (1997); McKay, R. Science 276, 66-
71 (1997); Snyder, E.Y.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11663-11668 (1
997))。
【０００３】 ほとんどの神経変性疾患は、ニューロンの集団に影響を及ぼす。さらに、損傷
のほとんどは、特定の神経化学的表現型に発生する。例えば、ヒトのパーキンソ
ン病においては、主要な細胞型の損失は、中脳のドーパミン作動性ニューロンで
ある。神経組織の移植を介する特定のニューロン集団の機能的置換は、神経変性
疾患の治療のための魅力的な治療戦略である(Rosenthal, A. Neuron 20, 169-17
2 (1998))。
のほとんどは、特定の神経化学的表現型に発生する。例えば、ヒトのパーキンソ
ン病においては、主要な細胞型の損失は、中脳のドーパミン作動性ニューロンで
ある。神経組織の移植を介する特定のニューロン集団の機能的置換は、神経変性
疾患の治療のための魅力的な治療戦略である(Rosenthal, A. Neuron 20, 169-17
2 (1998))。
【０００４】発明の概要 移植治療における使用のための理想的な材料は、分化の際に、ニューロンの表
現型、特に特定のニューロンの表現型を獲得するように指令され得る増殖可能な
細胞である。この戦略は、移植のためのヒト胎児組織の使用を取り巻く倫理学的
及び実用的な問題を回避し得る。特に、埋め込まれた胚細胞には限られた生存能
力しかなく、しばしば拒絶されてしまう。さらに、それぞれの胎児からは、少数
の細胞しか得られない。 多分化能を有する神経幹細胞又は神経前駆細胞における単一の特定ニューロン
の表現型の誘導は確認しにくいことがわかっている。
現型、特に特定のニューロンの表現型を獲得するように指令され得る増殖可能な
細胞である。この戦略は、移植のためのヒト胎児組織の使用を取り巻く倫理学的
及び実用的な問題を回避し得る。特に、埋め込まれた胚細胞には限られた生存能
力しかなく、しばしば拒絶されてしまう。さらに、それぞれの胎児からは、少数
の細胞しか得られない。 多分化能を有する神経幹細胞又は神経前駆細胞における単一の特定ニューロン
の表現型の誘導は確認しにくいことがわかっている。
【０００５】 第1の態様において、本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞においてニュー
ロンの運命を誘導する方法を提供し、この方法は、該細胞内で基底レベルを超え
るNurr1を発現させることを含む。
ロンの運命を誘導する方法を提供し、この方法は、該細胞内で基底レベルを超え
るNurr1を発現させることを含む。
【０００６】 Nurr1(Lawら、(1992) Mol Endocrinol 6, 2129-2135; Xingら、(1997) Mol Br
ain Res 47, 251-261; Castillo (1997) Genomics, 41, 250-257; GenBank番号S
53744, U72345, U86783)は、甲状腺ホルモン／レチノイン酸核受容体スーパーフ
ァミリーの転写因子である。本開示は、神経幹細胞又は神経前駆細胞における基
底レベルを超えるNurr1の発現は、ニューロンの運命に向かって分化する細胞の
割合を増加させることを示すものである。ニューロンの運命の誘導は、in vitro
又はin vivoにおいて実施することができる。移植の前後に、ニューロンの運命
に向かう神経幹細胞又は神経前駆細胞の分化を誘導する能力は、移植された幹細
胞のアストロサイト及びオリゴデンドロサイトへの偏りを改善する。
ain Res 47, 251-261; Castillo (1997) Genomics, 41, 250-257; GenBank番号S
53744, U72345, U86783)は、甲状腺ホルモン／レチノイン酸核受容体スーパーフ
ァミリーの転写因子である。本開示は、神経幹細胞又は神経前駆細胞における基
底レベルを超えるNurr1の発現は、ニューロンの運命に向かって分化する細胞の
割合を増加させることを示すものである。ニューロンの運命の誘導は、in vitro
又はin vivoにおいて実施することができる。移植の前後に、ニューロンの運命
に向かう神経幹細胞又は神経前駆細胞の分化を誘導する能力は、移植された幹細
胞のアストロサイト及びオリゴデンドロサイトへの偏りを改善する。
【０００７】 「神経幹細胞」とは、２回以上分裂し、最も原始的な型のニューロン、アスト
ロサイト及びオリゴデンドロサイトの表現型を示す細胞を生じ得る任意の細胞型
を意味する。神経幹細胞は、以下のマーカーのうちの1種以上を発現し得る：ネ
スティン、p75ニューロトロフィン受容体、Notch1。「神経前駆細胞」とは、神
経幹細胞の多分化能の娘細胞を意味し、この娘細胞は、その潜在的運命において
限定されており、及び／又は神経幹細胞と比較して低い増殖能力を有する。好ま
しい実施形態において、神経幹細胞又は神経前駆細胞は、自発的にも、分裂促進
剤(例えば、bFGF、EGF又は血清)の欠乏に際しても、チロシンヒドロキシラーゼ
を発現しない。
ロサイト及びオリゴデンドロサイトの表現型を示す細胞を生じ得る任意の細胞型
を意味する。神経幹細胞は、以下のマーカーのうちの1種以上を発現し得る：ネ
スティン、p75ニューロトロフィン受容体、Notch1。「神経前駆細胞」とは、神
経幹細胞の多分化能の娘細胞を意味し、この娘細胞は、その潜在的運命において
限定されており、及び／又は神経幹細胞と比較して低い増殖能力を有する。好ま
しい実施形態において、神経幹細胞又は神経前駆細胞は、自発的にも、分裂促進
剤(例えば、bFGF、EGF又は血清)の欠乏に際しても、チロシンヒドロキシラーゼ
を発現しない。
【０００８】 神経幹細胞又は神経前駆細胞は、神経系の任意の領域、例えば、小脳、脳室領
域、脳室下領域又は海馬から取得するか、又は誘導することができる。この細胞
は、脊椎を有する生物、例えば、ヒト又はウサギ、モルモット、ラット、マウス
もしくは他のげっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、又は霊
長類などの非ヒトであってもよい哺乳動物から、あるいはニワトリなどの鳥類か
ら取得するか、又は誘導することができる。
域、脳室下領域又は海馬から取得するか、又は誘導することができる。この細胞
は、脊椎を有する生物、例えば、ヒト又はウサギ、モルモット、ラット、マウス
もしくは他のげっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、又は霊
長類などの非ヒトであってもよい哺乳動物から、あるいはニワトリなどの鳥類か
ら取得するか、又は誘導することができる。
【０００９】 神経幹細胞又は神経前駆細胞が誘導されるニューロンの運命は、原始的なニュ
ーロンの表現型を示し得る。それは、複数の異なるニューロンの表現型を生じ得
る多分化能細胞であってよい。それは、特定のニューロンの運命に関連するマー
カー、例えば、チロシンヒドロキシラーゼを欠失していてもよい。
ーロンの表現型を示し得る。それは、複数の異なるニューロンの表現型を生じ得
る多分化能細胞であってよい。それは、特定のニューロンの運命に関連するマー
カー、例えば、チロシンヒドロキシラーゼを欠失していてもよい。
【００１０】 複数の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が基底レベルを超えるNurr1を発現
する本発明に従うニューロンの運命を誘導する方法においては、大部分の幹細胞
又は前駆細胞を、ニューロンの運命を獲得するように誘導することができる。好
ましい実施形態において、60％、70％、80％、90％を超える幹細胞及び／又は前
駆細胞を、ニューロンの運命に誘導することができる。
する本発明に従うニューロンの運命を誘導する方法においては、大部分の幹細胞
又は前駆細胞を、ニューロンの運命を獲得するように誘導することができる。好
ましい実施形態において、60％、70％、80％、90％を超える幹細胞及び／又は前
駆細胞を、ニューロンの運命に誘導することができる。
【００１１】 「細胞内で基底レベルを超えるNurr1を発現させる」とは、非病理学的条件下
のin vivoでの(非改変)細胞において発現されるものよりも高いレベルでNurr1を
発現させることを意味する。基底レベルを超える発現は、薬理学的、人工的なア
ップレギュレーション及び過剰発現を含む。
のin vivoでの(非改変)細胞において発現されるものよりも高いレベルでNurr1を
発現させることを意味する。基底レベルを超える発現は、薬理学的、人工的なア
ップレギュレーション及び過剰発現を含む。
【００１２】 基底レベルを超えるNurr1の発現は、当業者には公知の任意の方法によって達
成することができる。例えば、基底レベルを超える発現を、天然の遺伝子Nurr1
の調節をモジュレートすることにより誘導することができる。これは、例えば、
細胞と、Nurr1の転写をアップレギュレートする線維芽細胞増殖因子8(FGF8)(Ros
enthal, A. (1998) Cell, 93(5), 755-766)とを接触させることによって、及び
／又は異種調節配列を、天然のNurr1の調節領域の中もしくはその近くに導入す
ることによって、及び／又は、例えば、相同的組換えにより、天然のNurr1の調
節領域を、そのような異種調節配列で置換することによって、及び／又はNurr1
の転写、翻訳もしくは機能を負に調節し、阻害し、又はダウンレギュレートする
分子、例えば、Nurr2 (Ohkuraら、(1999) Biochim Biophys Acta 14444: 69-79)
を破壊するか、もしくはダウンレギュレートすることによって、Nurr1の転写及
び／又は翻訳を増加させることにより行うことができる。
成することができる。例えば、基底レベルを超える発現を、天然の遺伝子Nurr1
の調節をモジュレートすることにより誘導することができる。これは、例えば、
細胞と、Nurr1の転写をアップレギュレートする線維芽細胞増殖因子8(FGF8)(Ros
enthal, A. (1998) Cell, 93(5), 755-766)とを接触させることによって、及び
／又は異種調節配列を、天然のNurr1の調節領域の中もしくはその近くに導入す
ることによって、及び／又は、例えば、相同的組換えにより、天然のNurr1の調
節領域を、そのような異種調節配列で置換することによって、及び／又はNurr1
の転写、翻訳もしくは機能を負に調節し、阻害し、又はダウンレギュレートする
分子、例えば、Nurr2 (Ohkuraら、(1999) Biochim Biophys Acta 14444: 69-79)
を破壊するか、もしくはダウンレギュレートすることによって、Nurr1の転写及
び／又は翻訳を増加させることにより行うことができる。
【００１３】 増加したレベルの転写活性化因子を有する神経幹細胞又は神経前駆細胞を提供
することによって、例えば、該細胞と、そのような活性化因子とを接触させるこ
とにより、又は該活性化因子をコードする核酸を用いて細胞を形質転換すること
により、転写を増加させることができる。あるいは、該細胞を、Nurr1の転写イ
ンヒビターに対するアンチセンス核酸を用いて形質転換することによって、転写
を増加させることもできる。
することによって、例えば、該細胞と、そのような活性化因子とを接触させるこ
とにより、又は該活性化因子をコードする核酸を用いて細胞を形質転換すること
により、転写を増加させることができる。あるいは、該細胞を、Nurr1の転写イ
ンヒビターに対するアンチセンス核酸を用いて形質転換することによって、転写
を増加させることもできる。
【００１４】 従って、神経幹細胞又は神経前駆細胞においてニューロンの運命を誘導する本
発明の方法は、該細胞をFGF8と接触させることを含んでもよい。
発明の方法は、該細胞をFGF8と接触させることを含んでもよい。
【００１５】 内因性Nurr1の転写及び／又は翻訳を増加させることの代替もしくは追加とし
て、Nurr1の1個以上の追加コピーを神経幹細胞又は神経前駆細胞に導入すること
により、基底レベルを超えるNurr1の発現を引き起こすことができる。
て、Nurr1の1個以上の追加コピーを神経幹細胞又は神経前駆細胞に導入すること
により、基底レベルを超えるNurr1の発現を引き起こすことができる。
【００１６】 従って、さらなる態様において、本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞にお
いてニューロンの運命を誘導する方法を提供し、該方法は、Nurr1を用いて該細
胞を形質転換することを含む。神経幹細胞又は神経前駆細胞の形質転換は、in v
itroでもin vivoでも行うことができる。神経幹細胞又は神経前駆細胞が誘導さ
れるニューロンの運命は、本明細書で考察される型のものであってよく、例えば
、それは原始的なニューロンの表現型を示し、特定のニューロンの運命と関連す
るマーカーを欠失していてもよい。本発明はさらに、Nurr1で形質転換された神
経幹細胞又は神経前駆細胞を提供する。
いてニューロンの運命を誘導する方法を提供し、該方法は、Nurr1を用いて該細
胞を形質転換することを含む。神経幹細胞又は神経前駆細胞の形質転換は、in v
itroでもin vivoでも行うことができる。神経幹細胞又は神経前駆細胞が誘導さ
れるニューロンの運命は、本明細書で考察される型のものであってよく、例えば
、それは原始的なニューロンの表現型を示し、特定のニューロンの運命と関連す
るマーカーを欠失していてもよい。本発明はさらに、Nurr1で形質転換された神
経幹細胞又は神経前駆細胞を提供する。
【００１７】 形質転換されたNurr1は、ゲノム外のベクター上に含まれていてもよく、又は
ゲノム中に、好ましくは安定的に組み込まれていてもよい。以下により詳細に考
察するように、形質転換されたNurr1は、神経幹細胞又は神経前駆細胞における
基底レベルを超えるその発現を誘導するプロモーターに機能し得る形で連結され
ていてもよい。
ゲノム中に、好ましくは安定的に組み込まれていてもよい。以下により詳細に考
察するように、形質転換されたNurr1は、神経幹細胞又は神経前駆細胞における
基底レベルを超えるその発現を誘導するプロモーターに機能し得る形で連結され
ていてもよい。
【００１８】 「機能し得る形で連結された」とは、プロモーターから開始される転写のため
に適切に位置づけられかつ方向づけられた、同じ核酸分子の部分として結合され
ていることを意味する。
に適切に位置づけられかつ方向づけられた、同じ核酸分子の部分として結合され
ていることを意味する。
【００１９】 遺伝子を細胞に導入する方法は、当業者には公知である。Nurr1がベクター上
に保持されるにしても、ゲノム中に組み込まれるにしても、ベクターを用いてNu
rr1を神経幹細胞又は神経前駆細胞に導入することができる。プロモーター配列
、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列などの適当な調
節配列を含む好適なベクターを選択するか、又は構築することができる。ベクタ
ーは、適当にマーカー遺伝子及びその他の配列を含んでもよい。この調節配列は
、神経幹細胞又は神経前駆細胞内のNurr1の発現を誘導することができる。例え
ば、該ベクターは、ゲノム外発現ベクターであってもよく、又は該調節配列はNu
rr1と共にゲノム中に組み込まれてもよい。ベクターは、プラスミド又はウイル
スであってもよい。
に保持されるにしても、ゲノム中に組み込まれるにしても、ベクターを用いてNu
rr1を神経幹細胞又は神経前駆細胞に導入することができる。プロモーター配列
、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列などの適当な調
節配列を含む好適なベクターを選択するか、又は構築することができる。ベクタ
ーは、適当にマーカー遺伝子及びその他の配列を含んでもよい。この調節配列は
、神経幹細胞又は神経前駆細胞内のNurr1の発現を誘導することができる。例え
ば、該ベクターは、ゲノム外発現ベクターであってもよく、又は該調節配列はNu
rr1と共にゲノム中に組み込まれてもよい。ベクターは、プラスミド又はウイル
スであってもよい。
【００２０】 Nurr1を外部的に誘導性の遺伝子プロモーターの制御下に置いて、Nurr1を使用
者の制御下に置くことができる。プロモーターに適用される用語「誘導性」は、
当業者にはよく理解されている。本質的には、誘導性プロモーターの制御下での
発現は、適用された刺激に応答して「スイッチが入る」か、又は増加する。その
ような刺激の性質は、プロモーター間で変化する。いくつかの誘導性プロモータ
ーは、適当な刺激がない場合、ほとんど発現されないか、又は検出不可能なレベ
ルの発現しかもたらさない(又は全く発現されない)。刺激の非存在下での発現レ
ベルがどんなものであっても、全ての誘導性プロモーターからの発現は、正確な
刺激の存在下では増加する。誘導性プロモーターの例としては、遺伝子発現をテ
トラサイクリン類似体によって調節するテトラサイクリンON/OFF系(Gossenら、(
1995) Science, 268, 1766-1769)がある。
者の制御下に置くことができる。プロモーターに適用される用語「誘導性」は、
当業者にはよく理解されている。本質的には、誘導性プロモーターの制御下での
発現は、適用された刺激に応答して「スイッチが入る」か、又は増加する。その
ような刺激の性質は、プロモーター間で変化する。いくつかの誘導性プロモータ
ーは、適当な刺激がない場合、ほとんど発現されないか、又は検出不可能なレベ
ルの発現しかもたらさない(又は全く発現されない)。刺激の非存在下での発現レ
ベルがどんなものであっても、全ての誘導性プロモーターからの発現は、正確な
刺激の存在下では増加する。誘導性プロモーターの例としては、遺伝子発現をテ
トラサイクリン類似体によって調節するテトラサイクリンON/OFF系(Gossenら、(
1995) Science, 268, 1766-1769)がある。
【００２１】 さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual
:第2版、Sambrookら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照され
たい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、DNAの細胞への導
入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの
公知の技術及びプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Au
subelら(編)、John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
:第2版、Sambrookら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照され
たい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、DNAの細胞への導
入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの
公知の技術及びプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Au
subelら(編)、John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
【００２２】 当業界で公知のように、目的の核酸を含むクローンの同定においては、抗生物
質耐性又は感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いることができる。結合試験
、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、クローンを同定す
るか、又はさらに調べることもできる。
質耐性又は感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いることができる。結合試験
、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、クローンを同定す
るか、又はさらに調べることもできる。
【００２３】 Nurr1を含む核酸を、宿主の神経幹細胞又は神経前駆細胞のゲノム中に組み込
むことができる。標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する形質転換
された核酸配列に含有させることにより、組込みを促進することができる。組み
込まれる核酸は、神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるNurr1遺伝子の発現を誘
導することができる調節配列を含んでもよい。この核酸は、ゲノム中の部位への
この核酸の組込みを指令する配列を含んでもよく、Nurr1をコードする配列は神
経幹細胞又は神経前駆細胞内のNurr1の発現を誘導し、及び／又は制御し得る調
節エレメントの存在下に置かれる。本明細書に考察されるように、組み込まれる
核酸を、Nurr1を神経幹細胞又は神経前駆細胞中に形質転換するのに用いられる
ベクターから誘導することができる。
むことができる。標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する形質転換
された核酸配列に含有させることにより、組込みを促進することができる。組み
込まれる核酸は、神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるNurr1遺伝子の発現を誘
導することができる調節配列を含んでもよい。この核酸は、ゲノム中の部位への
この核酸の組込みを指令する配列を含んでもよく、Nurr1をコードする配列は神
経幹細胞又は神経前駆細胞内のNurr1の発現を誘導し、及び／又は制御し得る調
節エレメントの存在下に置かれる。本明細書に考察されるように、組み込まれる
核酸を、Nurr1を神経幹細胞又は神経前駆細胞中に形質転換するのに用いられる
ベクターから誘導することができる。
【００２４】 Nurr1を含む核酸の導入は、その核酸が線状、分枝状又は環状であっても、一
般的には、例外なく「形質転換」と呼ぶことができる。形質転換には任意の利用
可能な技術を用いることができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロイ
ンジェクションなどの機械的技術、直接的DNA取込み、受容体を介するDNA導入、
レトロウイルス又は他のウイルスを用いる形質導入及びリポソームを介するトラ
ンスフェクションが挙げられる。選択した遺伝子構築物を細胞に導入する場合に
は、当業者には公知のように、特別な配慮をする必要がある。神経幹細胞又は神
経前駆細胞中にNurr1を導入するための形質転換の方法の特定の選択は本発明に
とって本質的なものではなく、また本発明を限定するものでもないことは当業者
には明らかであろう。
般的には、例外なく「形質転換」と呼ぶことができる。形質転換には任意の利用
可能な技術を用いることができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロイ
ンジェクションなどの機械的技術、直接的DNA取込み、受容体を介するDNA導入、
レトロウイルス又は他のウイルスを用いる形質導入及びリポソームを介するトラ
ンスフェクションが挙げられる。選択した遺伝子構築物を細胞に導入する場合に
は、当業者には公知のように、特別な配慮をする必要がある。神経幹細胞又は神
経前駆細胞中にNurr1を導入するための形質転換の方法の特定の選択は本発明に
とって本質的なものではなく、また本発明を限定するものでもないことは当業者
には明らかであろう。
【００２５】 Nurr1を用いる神経幹細胞又は神経前駆細胞のin vivoにおける形質転換のため
の好適なベクター及び技術は、当業者には公知である。好適なベクターとしては
、アデノウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス及
びレトロウイルスが挙げられる。感染性ウイルス粒子の産生に必要とされる遺伝
子を発現するヘルパー細胞系中で、無力なウイルスを産生することができる。好
適なヘルパー細胞系は、当業者には公知である。例えば、Fallaux, F.J.ら、(19
96) Hum Gene Ther 7(2), 215-222; Willenbrink, W.ら、(1994) J Virol 68(12
), 8413-8417; Cosset, F.L.ら、(1993) Virology 193(1), 385-395; Highkin,
M.K.ら、(1991) Poult Sci 70(4), 970-981; Dougherty, J.P.ら、(1989) J Vir
ol 63(7), 3209-3212; Salmons, B.ら、(1989) Biochem Biophys Res Commun 15
9(3), 1191-1198; Sorge, J.ら、(1984) Mol Cell Biol 4(9), 1730-1737; Wang
, S.ら、(1997) Gene Ther 4(11), 1132-1141; Moore, K.W.ら、(1990) Science
248(4960), 1230-1234; Reiss, C.S.ら、(1987) J Immunol 139(3), 711-714を
参照されたい。一般的には、ヘルパー細胞系は、ウイルスのゲノムをパッケージ
ングする機構によって認識される配列を欠いている。これらの細胞系は、核酸を
含まないビリオンを産生する。送達すべき(Nurr1)遺伝子又は他の配列と共に無
傷のパッケージングシグナルを含むウイルスベクターを、ヘルパー細胞中で感染
性ビリオン粒子中にパッケージングした後、神経幹細胞又は神経前駆細胞への遺
伝子送達のために用いる。
の好適なベクター及び技術は、当業者には公知である。好適なベクターとしては
、アデノウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス及
びレトロウイルスが挙げられる。感染性ウイルス粒子の産生に必要とされる遺伝
子を発現するヘルパー細胞系中で、無力なウイルスを産生することができる。好
適なヘルパー細胞系は、当業者には公知である。例えば、Fallaux, F.J.ら、(19
96) Hum Gene Ther 7(2), 215-222; Willenbrink, W.ら、(1994) J Virol 68(12
), 8413-8417; Cosset, F.L.ら、(1993) Virology 193(1), 385-395; Highkin,
M.K.ら、(1991) Poult Sci 70(4), 970-981; Dougherty, J.P.ら、(1989) J Vir
ol 63(7), 3209-3212; Salmons, B.ら、(1989) Biochem Biophys Res Commun 15
9(3), 1191-1198; Sorge, J.ら、(1984) Mol Cell Biol 4(9), 1730-1737; Wang
, S.ら、(1997) Gene Ther 4(11), 1132-1141; Moore, K.W.ら、(1990) Science
248(4960), 1230-1234; Reiss, C.S.ら、(1987) J Immunol 139(3), 711-714を
参照されたい。一般的には、ヘルパー細胞系は、ウイルスのゲノムをパッケージ
ングする機構によって認識される配列を欠いている。これらの細胞系は、核酸を
含まないビリオンを産生する。送達すべき(Nurr1)遺伝子又は他の配列と共に無
傷のパッケージングシグナルを含むウイルスベクターを、ヘルパー細胞中で感染
性ビリオン粒子中にパッケージングした後、神経幹細胞又は神経前駆細胞への遺
伝子送達のために用いる。
【００２６】 さらなる態様において、本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞において特定
のニューロンの運命を誘導する方法を提供し、ここで該幹細胞又は前駆細胞は基
底レベルを超えるNurr1を発現し、該方法は、該細胞と、タイプ1アストロサイト
によって供給されるか、またはそれから誘導される1種以上の因子とを接触させ
ることを含む。この方法は、in vitroでもin vivoでも行うことができる。基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞は、Nurr1を用いて
該細胞を形質転換することにより作製することができる。
のニューロンの運命を誘導する方法を提供し、ここで該幹細胞又は前駆細胞は基
底レベルを超えるNurr1を発現し、該方法は、該細胞と、タイプ1アストロサイト
によって供給されるか、またはそれから誘導される1種以上の因子とを接触させ
ることを含む。この方法は、in vitroでもin vivoでも行うことができる。基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞は、Nurr1を用いて
該細胞を形質転換することにより作製することができる。
【００２７】 上記因子は、不死化アストロサイトによって供給するか、又はそれから誘導す
ることができる。この因子を、アストロサイト細胞系、例えば、アストロサイト
中脳細胞系によって供給するか、又はそれから誘導することができる。細胞系は
均一な細胞集団を提供する。
ることができる。この因子を、アストロサイト細胞系、例えば、アストロサイト
中脳細胞系によって供給するか、又はそれから誘導することができる。細胞系は
均一な細胞集団を提供する。
【００２８】 本開示は、タイプ1アストロサイトが特定のニューロンの運命の決定に関与す
るという第1の証拠を提供する。本明細書に示されるデータは、複数の脳構造に
おいて領域的に適当なニューロンの表現型を誘導するのに必要なシグナルの供給
源として、異なる脳領域に由来するアストロサイトを用いることができることを
示唆している。
るという第1の証拠を提供する。本明細書に示されるデータは、複数の脳構造に
おいて領域的に適当なニューロンの表現型を誘導するのに必要なシグナルの供給
源として、異なる脳領域に由来するアストロサイトを用いることができることを
示唆している。
【００２９】 本発明の重要な態様は、多分化能神経幹細胞又は神経前駆細胞における基底レ
ベルを超えるNurr1の発現、及び該細胞と、腹側中脳のタイプ1アストロサイトに
よって供給されるか、又はそれから誘導される1種以上の因子との接触を含むプ
ロセスによって、ドーパミン作動性ニューロンを、in vitroで該細胞から作製す
ることができるという知見に基づいている。
ベルを超えるNurr1の発現、及び該細胞と、腹側中脳のタイプ1アストロサイトに
よって供給されるか、又はそれから誘導される1種以上の因子との接触を含むプ
ロセスによって、ドーパミン作動性ニューロンを、in vitroで該細胞から作製す
ることができるという知見に基づいている。
【００３０】 従って、特定のニューロンの運命は、好ましくはドーパミン作動性ニューロン
の運命であり、タイプ1アストロサイトは、好ましくは腹側中脳のタイプ1アスト
ロサイトである。
の運命であり、タイプ1アストロサイトは、好ましくは腹側中脳のタイプ1アスト
ロサイトである。
【００３１】 本発明により、多数のドーパミン作動性ニューロンの作製が可能となる。これ
らのドーパミン作動性ニューロンを、パーキンソン病において損傷されているか
、又は失われている細胞を置換するための供給材料として用いることができる。
らのドーパミン作動性ニューロンを、パーキンソン病において損傷されているか
、又は失われている細胞を置換するための供給材料として用いることができる。
【００３２】 好ましくは、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細
胞は、タイプ1アストロサイトによって供給されるか、又はそれから誘導される1
種以上の因子と接触させたとき、有糸分裂する。
胞は、タイプ1アストロサイトによって供給されるか、又はそれから誘導される1
種以上の因子と接触させたとき、有糸分裂する。
【００３３】 神経幹細胞又は神経前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を誘導する際、
該細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖因子(EGF)、及びレチノ
イドX受容体(RXR)の活性化因子、例えば、合成レチノイド類似体であるSR11237
(Gendimenico, G.J.ら、(1994) J Invest Dermatol 102(5), 676-80)、又は9−
シスレチノールからなる群より選択される１種以上の薬剤にさらに接触させるこ
とができる。以下に実験的に証明するように、基底レベルを超えるNurr1を発現
する神経幹細胞又は神経前駆細胞と、タイプ１アストロサイトとの共培養物の、
１種以上のこれらの薬剤による処理を用いて、ドーパミン作動性の運命を獲得す
る幹細胞又は前駆細胞の割合を高めることができる。本発明に従うドーパミン作
動性の運命を誘導する方法は、神経幹細胞又は神経前駆細胞を、FGFファミリー
の増殖因子のメンバー、例えば、FGF4、FGF8に接触させることを含んでもよい。
該細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖因子(EGF)、及びレチノ
イドX受容体(RXR)の活性化因子、例えば、合成レチノイド類似体であるSR11237
(Gendimenico, G.J.ら、(1994) J Invest Dermatol 102(5), 676-80)、又は9−
シスレチノールからなる群より選択される１種以上の薬剤にさらに接触させるこ
とができる。以下に実験的に証明するように、基底レベルを超えるNurr1を発現
する神経幹細胞又は神経前駆細胞と、タイプ１アストロサイトとの共培養物の、
１種以上のこれらの薬剤による処理を用いて、ドーパミン作動性の運命を獲得す
る幹細胞又は前駆細胞の割合を高めることができる。本発明に従うドーパミン作
動性の運命を誘導する方法は、神経幹細胞又は神経前駆細胞を、FGFファミリー
の増殖因子のメンバー、例えば、FGF4、FGF8に接触させることを含んでもよい。
【００３４】 有利には、この細胞を、2種以上の上記薬剤に接触させることができる。本発
明者らは、bFGF又はEGF及びSR11237の有益な効果が、飽和用量で付加されること
を予期せず見出した。この知見は、これらの薬剤が異なる機構を介して働くこと
を示唆している。
明者らは、bFGF又はEGF及びSR11237の有益な効果が、飽和用量で付加されること
を予期せず見出した。この知見は、これらの薬剤が異なる機構を介して働くこと
を示唆している。
【００３５】 ドーパミン作動性の表現型を誘導する方法は、神経幹細胞又は神経前駆細胞を
、bFGF及び／又はEGFで予備処理した後、腹側中脳のタイプ１アストロサイトに
よって供給されるか、又はそれから誘導される１種以上の因子に、この細胞を接
触させること、例えば、この細胞と腹側中脳のタイプ１アストロサイトとを共培
養すること、を含んでもよい。
、bFGF及び／又はEGFで予備処理した後、腹側中脳のタイプ１アストロサイトに
よって供給されるか、又はそれから誘導される１種以上の因子に、この細胞を接
触させること、例えば、この細胞と腹側中脳のタイプ１アストロサイトとを共培
養すること、を含んでもよい。
【００３６】 任意の予備処理工程が、(i)基底レベルを超えるNurr1を発現し、高い増殖を示
す神経幹細胞系は、腹側中脳のタイプ１アストロサイトと共培養したとき、ドー
パミン作動性の運命への誘導が上昇することを証明し、及び(ii) 無血清培地(SF
M)中でbFGF又はEGFで処理すると、基底レベルを超えるNurr1を発現するほとんど
の幹細胞系の基底線増殖は、SFMのみにおける継代後にも上昇した状態を維持す
る、という２つのさらに予期せぬ本発明者らの知見から生じる。ドーパミン作動
性の表現型を誘導する方法は、神経幹細胞又は神経前駆細胞を、FGFファミリー
の増殖因子のメンバー、例えば、FGF4、FGF8で予備処理することを含んでもよい
。
す神経幹細胞系は、腹側中脳のタイプ１アストロサイトと共培養したとき、ドー
パミン作動性の運命への誘導が上昇することを証明し、及び(ii) 無血清培地(SF
M)中でbFGF又はEGFで処理すると、基底レベルを超えるNurr1を発現するほとんど
の幹細胞系の基底線増殖は、SFMのみにおける継代後にも上昇した状態を維持す
る、という２つのさらに予期せぬ本発明者らの知見から生じる。ドーパミン作動
性の表現型を誘導する方法は、神経幹細胞又は神経前駆細胞を、FGFファミリー
の増殖因子のメンバー、例えば、FGF4、FGF8で予備処理することを含んでもよい
。
【００３７】 多分化能を有する神経幹細胞又は神経前駆細胞においてニューロンの運命を誘
導する本発明による方法は、該ニューロンの運命のマーカーを検出することを含
んでもよい。β−チューブリンIII(TuJ1)は、ニューロンの運命のマーカーの一
つである(Menezes, J.R.ら、(1994) J Neurosci 14(9), 5399-5416)。特定のニ
ューロンの表現型を誘導する場合、マーカーはその表現型に特異的なものである
べきである。ドーパミン作動性の運命については、チロシンヒドロキシラーゼ(T
H)の発現並びに／又はドーパミン及び／もしくはDOPACの放出を、例えば、免疫
反応性によって検出することができる(Cooper, J.R.ら、The Biochemical Basis
of Neuropharmacology (第7版) (1996) Oxford University Press)。また、(TH
／ドーパミン／DOPACの存在下における)ドーパミンβヒドロキシラーゼの非存在
も、ドーパミン作動性の運命を示す。
導する本発明による方法は、該ニューロンの運命のマーカーを検出することを含
んでもよい。β−チューブリンIII(TuJ1)は、ニューロンの運命のマーカーの一
つである(Menezes, J.R.ら、(1994) J Neurosci 14(9), 5399-5416)。特定のニ
ューロンの表現型を誘導する場合、マーカーはその表現型に特異的なものである
べきである。ドーパミン作動性の運命については、チロシンヒドロキシラーゼ(T
H)の発現並びに／又はドーパミン及び／もしくはDOPACの放出を、例えば、免疫
反応性によって検出することができる(Cooper, J.R.ら、The Biochemical Basis
of Neuropharmacology (第7版) (1996) Oxford University Press)。また、(TH
／ドーパミン／DOPACの存在下における)ドーパミンβヒドロキシラーゼの非存在
も、ドーパミン作動性の運命を示す。
【００３８】 マーカーの検出は、当業者には公知の任意の方法に従って行うことができる。
この検出方法は、該マーカーをコードする核酸配列に結合し得る特異的結合メン
バー、該配列にハイブリダイズし得る核酸プローブを含む特異的結合メンバー、
又はそれによってコードされる核酸配列もしくはポリペプチドに対する特異性を
有する免疫グロブリン／抗体ドメイン、該配列もしくはポリペプチドに対する特
異的結合メンバーの結合を検出し得るように標識された該特異的結合メンバーを
用いることができる。「特異的結合メンバー」は、マーカーに対する特定の特異
性を有し、通常の条件下で、他の種よりも優先的に該マーカーに結合する。ある
いは、このマーカーが特異的mRNAである場合、特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーに対する結合及び例えば、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅によって検出
することができる。
この検出方法は、該マーカーをコードする核酸配列に結合し得る特異的結合メン
バー、該配列にハイブリダイズし得る核酸プローブを含む特異的結合メンバー、
又はそれによってコードされる核酸配列もしくはポリペプチドに対する特異性を
有する免疫グロブリン／抗体ドメイン、該配列もしくはポリペプチドに対する特
異的結合メンバーの結合を検出し得るように標識された該特異的結合メンバーを
用いることができる。「特異的結合メンバー」は、マーカーに対する特定の特異
性を有し、通常の条件下で、他の種よりも優先的に該マーカーに結合する。ある
いは、このマーカーが特異的mRNAである場合、特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーに対する結合及び例えば、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅によって検出
することができる。
【００３９】 核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェントな条件下で、該マーカーに
ハイブリダイズし得る。好適な条件としては、例えば、約80〜90％同一であるマ
ーカー配列の検出については、0.25M Na2HPO4、pH7.2、6.5％ SDS、10％硫酸デ
キストラン中で42℃にて一晩のハイブリダイゼーション及び0.1X SSC、0.1％ SD
S中で55℃にて最終の洗浄が挙げられる。約90％を超える同一性を有するマーカ
ー配列の検出については、好適な条件としては、0.25M Na2HPO4、pH7.2、6.5％
SDS、10％硫酸デキストラン中で65℃にて一晩のハイブリダイゼーション及び0.1
X SSC、0.1％ SDS中で60℃にて最終の洗浄が挙げられる。
ハイブリダイズし得る。好適な条件としては、例えば、約80〜90％同一であるマ
ーカー配列の検出については、0.25M Na2HPO4、pH7.2、6.5％ SDS、10％硫酸デ
キストラン中で42℃にて一晩のハイブリダイゼーション及び0.1X SSC、0.1％ SD
S中で55℃にて最終の洗浄が挙げられる。約90％を超える同一性を有するマーカ
ー配列の検出については、好適な条件としては、0.25M Na2HPO4、pH7.2、6.5％
SDS、10％硫酸デキストラン中で65℃にて一晩のハイブリダイゼーション及び0.1
X SSC、0.1％ SDS中で60℃にて最終の洗浄が挙げられる。
【００４０】 さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示される方法のうちのいずれ
か１つに従って作製されるニューロンを提供する。このニューロンは、原始的な
ニューロンの表現型を有してもよい。それは、複数の異なるニューロンの表現型
を生じ得る。このニューロンは、特定のニューロンの表現型を有し、この表現型
は、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞に接触す
る因子を供給するか、もしくは誘導するアストロサイトのタイプによって影響さ
れるか、又は該幹細胞又は前駆細胞と共培養するアストロサイトのタイプによっ
て影響される。好ましい実施形態において、このニューロンは、ドーパミン作動
性の表現型を有する。
か１つに従って作製されるニューロンを提供する。このニューロンは、原始的な
ニューロンの表現型を有してもよい。それは、複数の異なるニューロンの表現型
を生じ得る。このニューロンは、特定のニューロンの表現型を有し、この表現型
は、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞に接触す
る因子を供給するか、もしくは誘導するアストロサイトのタイプによって影響さ
れるか、又は該幹細胞又は前駆細胞と共培養するアストロサイトのタイプによっ
て影響される。好ましい実施形態において、このニューロンは、ドーパミン作動
性の表現型を有する。
【００４１】 このニューロンは、該ニューロンにおいて神経保護的又は神経発生的な特性を
有する分子の発現を誘導し得るプロモーターに機能し得る形で連結された、該分
子をコードする核酸を含んでもよい。このプロモーターは、いかなる損傷を与え
る過剰発現をも防止するような誘導性プロモーター、例えば、TetONキメラプロ
モーターであってもよい。このプロモーター、例えばTHプロモーターは、特定の
ニューロンの表現型に関連していてもよい。
有する分子の発現を誘導し得るプロモーターに機能し得る形で連結された、該分
子をコードする核酸を含んでもよい。このプロモーターは、いかなる損傷を与え
る過剰発現をも防止するような誘導性プロモーター、例えば、TetONキメラプロ
モーターであってもよい。このプロモーター、例えばTHプロモーターは、特定の
ニューロンの表現型に関連していてもよい。
【００４２】 コードされる分子は、その発現が該ニューロンをその環境に依存しないように
するもの、すなわち、該ニューロンの生存が、例えば、それが埋め込まれる神経
的環境における１種以上の因子又は条件の存在に依存しないようなものであり得
る。例えば、該ニューロンは、該ニューロンにおいて神経保護的又は神経発生的
な分子の発現を誘導し得るプロモーターに機能し得る形で連結された、以下に記
載する１種以上の該分子をコードする核酸を含んでもよい。
するもの、すなわち、該ニューロンの生存が、例えば、それが埋め込まれる神経
的環境における１種以上の因子又は条件の存在に依存しないようなものであり得
る。例えば、該ニューロンは、該ニューロンにおいて神経保護的又は神経発生的
な分子の発現を誘導し得るプロモーターに機能し得る形で連結された、以下に記
載する１種以上の該分子をコードする核酸を含んでもよい。
【００４３】 さらに、又はあるいは、このコードされる分子の発現は、ニューロンを取り巻
く細胞環境の神経保護又は神経発生において機能し得る。このように、このニュ
ーロンを、細胞治療と遺伝子治療の組合せの手法に用いて、神経保護的及び神経
発生的な特性を有する分子を送達することができる。
く細胞環境の神経保護又は神経発生において機能し得る。このように、このニュ
ーロンを、細胞治療と遺伝子治療の組合せの手法に用いて、神経保護的及び神経
発生的な特性を有する分子を送達することができる。
【００４４】 神経保護的及び神経発生的特性を有する分子の例としては、以下のものが挙げ
られる： (i) 神経変性を相殺するか、又は防止することができる神経栄養因子。一例とし
て、潜在的な神経生存因子であるグリア由来神経栄養増殖因子(GDNF)があり、こ
れはドーパミン作動性ニューロンからの発生を促進し、チロシンヒドロキシラー
ゼの発現を増加させる(Tomacら、(1995) Nature, 373, 335-339; Arenasら、(19
95) Neuron, 15, 1465-1473)。軸索の伸長を増強することにより、GDNFはニュー
ロンの局所環境を刺激する能力を増加させ得る。GDNFファミリーの他の神経栄養
分子としては、Neurturin、Persephin及びArteminが挙げられる。ニューロトロ
ピンファミリーの神経栄養分子としては、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養
因子(BDNF)、並びにニューロトロピン−3、−4／5及び−6が挙げられる。
られる： (i) 神経変性を相殺するか、又は防止することができる神経栄養因子。一例とし
て、潜在的な神経生存因子であるグリア由来神経栄養増殖因子(GDNF)があり、こ
れはドーパミン作動性ニューロンからの発生を促進し、チロシンヒドロキシラー
ゼの発現を増加させる(Tomacら、(1995) Nature, 373, 335-339; Arenasら、(19
95) Neuron, 15, 1465-1473)。軸索の伸長を増強することにより、GDNFはニュー
ロンの局所環境を刺激する能力を増加させ得る。GDNFファミリーの他の神経栄養
分子としては、Neurturin、Persephin及びArteminが挙げられる。ニューロトロ
ピンファミリーの神経栄養分子としては、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養
因子(BDNF)、並びにニューロトロピン−3、−4／5及び−6が挙げられる。
【００４５】 (ii) 抗アポトーシス分子。Bc12は、細胞死において中心的な役割を果たす。Bc1
2の過剰発現は、自然に起こる細胞死及び虚血からニューロンを保護する(Martin
ouら、(1994) Neuron, 1017-1030)。別の抗アポトーシス分子は、Bclx-Lである
。
2の過剰発現は、自然に起こる細胞死及び虚血からニューロンを保護する(Martin
ouら、(1994) Neuron, 1017-1030)。別の抗アポトーシス分子は、Bclx-Lである
。
【００４６】 (iii) ニューロンがその環境との結合を刺激し、形成させるのを援助する、軸索
を再生及び／又は伸長及び／又は誘導する分子、例えば、エフリン(ephrin)。エ
フリンは、チロシンキナーゼ受容体を活性化し得る膜結合型リガンドのクラスと
して定義されている。エフリンは、神経の発生に関与している(Irvingら、(1996
) Dev. Biol., 173, 26-38; Krullら、(1997) Curr. Biol. 7, 571-580; Frisen
ら、(1998) Neuron, 20, 235-243; Gaoら、(1996) PNAS, 93, 11161-11166; Tor
resら、(1998) Neuron, 21, 1453-1463; Winslowら、(1995) Neuron, 14, 973-9
81; Yueら、(1999) J Neurosci 19(6), 2090-2101)。
を再生及び／又は伸長及び／又は誘導する分子、例えば、エフリン(ephrin)。エ
フリンは、チロシンキナーゼ受容体を活性化し得る膜結合型リガンドのクラスと
して定義されている。エフリンは、神経の発生に関与している(Irvingら、(1996
) Dev. Biol., 173, 26-38; Krullら、(1997) Curr. Biol. 7, 571-580; Frisen
ら、(1998) Neuron, 20, 235-243; Gaoら、(1996) PNAS, 93, 11161-11166; Tor
resら、(1998) Neuron, 21, 1453-1463; Winslowら、(1995) Neuron, 14, 973-9
81; Yueら、(1999) J Neurosci 19(6), 2090-2101)。
【００４７】 (iv) 分化を誘導する分子、例えば、ホメオボックスドメインタンパク質Ptx3 (S
midt, M.P.ら、(1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94(24), 13305-13310)。
midt, M.P.ら、(1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94(24), 13305-13310)。
【００４８】 本発明によるニューロン、又は本発明で使用するためのニューロンは、実質的
に1種以上の他の細胞型、例えば、神経幹細胞又は神経前駆細胞を含まない。当
業者に公知の任意の技術を用いて、神経幹細胞又は神経前駆細胞から、ニューロ
ンを分離することができる。例えば、神経幹細胞又は神経前駆細胞上には認めら
れるが、ニューロン上には認められない細胞外領域の分子に対する抗体を用いる
ことができる。そのような分子としては、Notch1及びグリア細胞系由来神経栄養
因子受容体GFRα2が挙げられる。抗体に結合した幹細胞を、補体への曝露により
溶解するか、又は磁気的選別により分離することができる(Johanssonら、(1999)
Cell, 96, 25-34)。ニューロンの意図されるレシピエントに対して異種移植性
である抗体を用いる場合、例えば、そのような細胞選別法を回避する神経幹細胞
又は神経前駆細胞を、異種抗体で標識し、レシピエントの免疫系の最初の標的と
する。
に1種以上の他の細胞型、例えば、神経幹細胞又は神経前駆細胞を含まない。当
業者に公知の任意の技術を用いて、神経幹細胞又は神経前駆細胞から、ニューロ
ンを分離することができる。例えば、神経幹細胞又は神経前駆細胞上には認めら
れるが、ニューロン上には認められない細胞外領域の分子に対する抗体を用いる
ことができる。そのような分子としては、Notch1及びグリア細胞系由来神経栄養
因子受容体GFRα2が挙げられる。抗体に結合した幹細胞を、補体への曝露により
溶解するか、又は磁気的選別により分離することができる(Johanssonら、(1999)
Cell, 96, 25-34)。ニューロンの意図されるレシピエントに対して異種移植性
である抗体を用いる場合、例えば、そのような細胞選別法を回避する神経幹細胞
又は神経前駆細胞を、異種抗体で標識し、レシピエントの免疫系の最初の標的と
する。
【００４９】 様々な態様において、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれか１つに
従って作製されたニューロンだけではなく、そのようなニューロンを含む医薬組
成物、薬剤、薬物又はその他の組成物、例えば、パーキンソン病又はその他の(
例えば、神経変性)疾患の治療のために(予防的治療を含んでもよい)、そのよう
なニューロン又は組成物を患者に投与することを含む医学的治療方法におけるそ
のようなニューロン又は組成物の使用、例えば、パーキンソン病又はその他の(
例えば、神経変性)疾患の治療のための投与のための組成物の製造におけるその
ようなニューロンの使用、並びにそのようなニューロンと、製薬上許容し得る賦
形剤、ビヒクル又は担体、及び場合によっては１種以上の他の成分、例えば、神
経保護分子、神経発生分子、レチノイド、増殖因子、アストロサイト、抗アポト
ーシス因子、又は、神経幹細胞もしくは神経前駆細胞又は宿主の脳における遺伝
子発現を調節する因子とを混合することを含む医薬組成物の製造方法にまで拡張
される。そのような任意成分は、このニューロンを、その環境に依存しないよう
にする、すなわち、その生存が、その環境において１種以上の因子又は条件の存
在に依存しないようにすることができる。例えば、医薬組成物の製造方法は、こ
のニューロンを、発生中の腹側中脳に見出される１種以上の因子と混合すること
を含む。このニューロンを、GDNF及び／又はneurturin(NTN)と混合してもよい。
従って作製されたニューロンだけではなく、そのようなニューロンを含む医薬組
成物、薬剤、薬物又はその他の組成物、例えば、パーキンソン病又はその他の(
例えば、神経変性)疾患の治療のために(予防的治療を含んでもよい)、そのよう
なニューロン又は組成物を患者に投与することを含む医学的治療方法におけるそ
のようなニューロン又は組成物の使用、例えば、パーキンソン病又はその他の(
例えば、神経変性)疾患の治療のための投与のための組成物の製造におけるその
ようなニューロンの使用、並びにそのようなニューロンと、製薬上許容し得る賦
形剤、ビヒクル又は担体、及び場合によっては１種以上の他の成分、例えば、神
経保護分子、神経発生分子、レチノイド、増殖因子、アストロサイト、抗アポト
ーシス因子、又は、神経幹細胞もしくは神経前駆細胞又は宿主の脳における遺伝
子発現を調節する因子とを混合することを含む医薬組成物の製造方法にまで拡張
される。そのような任意成分は、このニューロンを、その環境に依存しないよう
にする、すなわち、その生存が、その環境において１種以上の因子又は条件の存
在に依存しないようにすることができる。例えば、医薬組成物の製造方法は、こ
のニューロンを、発生中の腹側中脳に見出される１種以上の因子と混合すること
を含む。このニューロンを、GDNF及び／又はneurturin(NTN)と混合してもよい。
【００５０】 本発明は、本発明に従って作製されたニューロンと、１種以上の追加成分とを
含有する組成物を提供する。本発明による医薬組成物、及び本発明に従う使用の
ための医薬組成物は、このニューロンに加えて、製薬上許容し得る賦形剤、担体
、バッファー、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、又は当業者には公知の他の物質を
含んでもよい。そのような物質は、非毒性であるべきであり、ニューロンの活性
を妨害するべきではない。担体又はその他の物質の正確な性質は、投与経路に依
存するであろう。該組成物は、１種以上の神経保護分子、神経発生分子、レチノ
イド、増殖因子、アストロサイト、又は神経幹細胞もしくは神経前駆細胞におけ
る遺伝子発現を調節する因子を含んでもよい。上記のように、そのような物質は
、ニューロンをその環境に依存しないようにすることができる。液体の医薬組成
物は、一般的には、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱物油又は合成油を含む
。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液又はエチレングリコール、プ
ロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有さ
せることができる。
含有する組成物を提供する。本発明による医薬組成物、及び本発明に従う使用の
ための医薬組成物は、このニューロンに加えて、製薬上許容し得る賦形剤、担体
、バッファー、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、又は当業者には公知の他の物質を
含んでもよい。そのような物質は、非毒性であるべきであり、ニューロンの活性
を妨害するべきではない。担体又はその他の物質の正確な性質は、投与経路に依
存するであろう。該組成物は、１種以上の神経保護分子、神経発生分子、レチノ
イド、増殖因子、アストロサイト、又は神経幹細胞もしくは神経前駆細胞におけ
る遺伝子発現を調節する因子を含んでもよい。上記のように、そのような物質は
、ニューロンをその環境に依存しないようにすることができる。液体の医薬組成
物は、一般的には、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱物油又は合成油を含む
。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液又はエチレングリコール、プ
ロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有さ
せることができる。
【００５１】 この組成物は、発熱物質を含まず、好適なpH、等張性及び安定性を有する非経
口的に許容し得る水性溶液の形態であってもよい。当業者であれば、例えば、塩
化ナトリウム、リンゲル注入液、又は乳酸加リンゲル注入液などの等張性ビヒク
ルを用いる好適な溶液を容易に調製することができる。人工脳脊髄液を用いて、
組成物を調製することもできる。
口的に許容し得る水性溶液の形態であってもよい。当業者であれば、例えば、塩
化ナトリウム、リンゲル注入液、又は乳酸加リンゲル注入液などの等張性ビヒク
ルを用いる好適な溶液を容易に調製することができる。人工脳脊髄液を用いて、
組成物を調製することもできる。
【００５２】 本発明は、医学的治療方法、特に、神経系細胞に対する損傷、神経系細胞の損
失、又は神経系細胞の障害に関連する医学的状態の治療方法における、本発明に
従って作製されたニューロンの使用に拡張される。さらに、本発明は、特定の表
現型のニューロンに対する損傷、又はその損失に関連する状態、疾患又は障害の
治療における、そのような表現型のニューロンの使用を提供する。より具体的に
は、本発明は、ヒトのパーキンソン病の治療におけるドーパミン作動性ニューロ
ンの使用を提供する。本発明は、特に神経変性疾患(例えば、パーキンソン病)の
治療のための材料及び方法に関するが、それに限定されるものではない。例えば
、本発明は、脊髄及び／又は大脳皮質に対する損傷の治療にまで拡張される。
失、又は神経系細胞の障害に関連する医学的状態の治療方法における、本発明に
従って作製されたニューロンの使用に拡張される。さらに、本発明は、特定の表
現型のニューロンに対する損傷、又はその損失に関連する状態、疾患又は障害の
治療における、そのような表現型のニューロンの使用を提供する。より具体的に
は、本発明は、ヒトのパーキンソン病の治療におけるドーパミン作動性ニューロ
ンの使用を提供する。本発明は、特に神経変性疾患(例えば、パーキンソン病)の
治療のための材料及び方法に関するが、それに限定されるものではない。例えば
、本発明は、脊髄及び／又は大脳皮質に対する損傷の治療にまで拡張される。
【００５３】 投与されるニューロンが、２種以上の異なるニューロンの表現型を生じ得る多
分化能細胞である治療方法において、該ニューロン又は組成物を、所望の特定の
ニューロンの運命への該ニューロンの分化を指令するアストロサイトを含む領域
中に導入することができる。例えば、該ニューロン又は組成物を、それがタイプ
１アストロサイトと相互作用する腹側中脳に注入し、ドーパミン作動性の表現型
を獲得するように誘導することができる。あるいは、又はさらに、埋め込まれた
組成物は、多分化能ニューロンと組合せて、上記のような特定のニューロンの運
命に向かうその発生を指令する１種以上の因子、例えば、タイプ１アストロサイ
トを含んでもよい。
分化能細胞である治療方法において、該ニューロン又は組成物を、所望の特定の
ニューロンの運命への該ニューロンの分化を指令するアストロサイトを含む領域
中に導入することができる。例えば、該ニューロン又は組成物を、それがタイプ
１アストロサイトと相互作用する腹側中脳に注入し、ドーパミン作動性の表現型
を獲得するように誘導することができる。あるいは、又はさらに、埋め込まれた
組成物は、多分化能ニューロンと組合せて、上記のような特定のニューロンの運
命に向かうその発生を指令する１種以上の因子、例えば、タイプ１アストロサイ
トを含んでもよい。
【００５４】 ニューロンを、当業界で公知の任意の技術により、患者に埋め込むことができ
る(例えば、Lindvall, O., (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7; Freed, C
.R.ら、(1997) Cell Transplant, 6, 201-202; Kordowerら、(1995) New Englan
d Journal of Medicine, 332, 1118-1124; Freed, C.R., (1992) New England J
ournal of Medicine, 327, 1549-1555を参照されたい)。
る(例えば、Lindvall, O., (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7; Freed, C
.R.ら、(1997) Cell Transplant, 6, 201-202; Kordowerら、(1995) New Englan
d Journal of Medicine, 332, 1118-1124; Freed, C.R., (1992) New England J
ournal of Medicine, 327, 1549-1555を参照されたい)。
【００５５】 本発明に従う組成物の投与は、好ましくは、「予防上有効な量」又は「治療上
有効な量」であり(場合によっては、予防法は治療法とも考えられる)、これは個
体に対する利益を示すのに十分なものである。実際に投与される量、並びに投与
の速度及び間隔は、治療すべき個体の性質及び重篤度に依存するであろう。治療
の処方、例えば、用量などの決定は、通常の開業医及び他の医師の責任の範囲内
にある。
有効な量」であり(場合によっては、予防法は治療法とも考えられる)、これは個
体に対する利益を示すのに十分なものである。実際に投与される量、並びに投与
の速度及び間隔は、治療すべき個体の性質及び重篤度に依存するであろう。治療
の処方、例えば、用量などの決定は、通常の開業医及び他の医師の責任の範囲内
にある。
【００５６】 組成物を、単独で、又は他の治療法と組合せて、治療すべき状態に応じて同時
に、又は連続的に投与することができる。
に、又は連続的に投与することができる。
【００５７】 神経幹細胞又は神経前駆細胞においてニューロンの運命を誘導するための本明
細書に提供される方法を、供給材料としての神経幹細胞系又は神経前駆細胞系を
用いて行うことができる。このように、実質的には、作製することができるニュ
ーロンの数には制限がない。
細書に提供される方法を、供給材料としての神経幹細胞系又は神経前駆細胞系を
用いて行うことができる。このように、実質的には、作製することができるニュ
ーロンの数には制限がない。
【００５８】 移植された細胞の免疫学的な拒絶に関連する不利益となる可能性を改善するた
めに、神経幹細胞又は神経前駆細胞を患者から単離し、所望の表現型に誘導する
ことができる。有利には、単離された神経幹細胞又は神経前駆細胞を用いて、多
数の免疫適合神経系細胞を産生し得る幹細胞系又は前駆細胞系を確立することが
できる。さらなるオプションは、個々の患者のために適当な選択を成し得る広範
囲の免疫適合性を包含する細胞バンクを確立することである。１個体から誘導さ
れる神経幹細胞もしくは神経前駆細胞又はその子孫を、第２の個体に導入する場
合、拒絶を改善するようにそれらを変更することができる。例えば、ドナー細胞
の１種以上のMHC対立遺伝子を、例えば、相同的組換えにより、レシピエントのM
HC対立遺伝子と置換することができる。
めに、神経幹細胞又は神経前駆細胞を患者から単離し、所望の表現型に誘導する
ことができる。有利には、単離された神経幹細胞又は神経前駆細胞を用いて、多
数の免疫適合神経系細胞を産生し得る幹細胞系又は前駆細胞系を確立することが
できる。さらなるオプションは、個々の患者のために適当な選択を成し得る広範
囲の免疫適合性を包含する細胞バンクを確立することである。１個体から誘導さ
れる神経幹細胞もしくは神経前駆細胞又はその子孫を、第２の個体に導入する場
合、拒絶を改善するようにそれらを変更することができる。例えば、ドナー細胞
の１種以上のMHC対立遺伝子を、例えば、相同的組換えにより、レシピエントのM
HC対立遺伝子と置換することができる。
【００５９】 不死化癌遺伝子を担持する細胞系から誘導される神経幹細胞又は神経前駆細胞
を患者への埋め込みに用いる場合、CRE-loxP系を用いてこの癌遺伝子を除去した
後、患者に該細胞を埋め込むことができる(Westerman, K.A.ら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 93, 8971 (1996))。患者の体温では不活性である不死化癌遺伝子
を用いることができる。
を患者への埋め込みに用いる場合、CRE-loxP系を用いてこの癌遺伝子を除去した
後、患者に該細胞を埋め込むことができる(Westerman, K.A.ら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 93, 8971 (1996))。患者の体温では不活性である不死化癌遺伝子
を用いることができる。
【００６０】 さらなる態様において、本発明は、神経変性疾患の治療において使用するため
の薬剤のスクリーニング方法における本発明に従って作製されたニューロンの使
用にまで拡張される。このニューロンは、ドーパミン作動性ニューロンであって
もよい。この神経変性疾患は、パーキンソン病であってもよい。この薬剤は、神
経保護分子及び／又は神経再生分子であってもよい。この方法を、in vitroで行
うことができる。
の薬剤のスクリーニング方法における本発明に従って作製されたニューロンの使
用にまで拡張される。このニューロンは、ドーパミン作動性ニューロンであって
もよい。この神経変性疾患は、パーキンソン病であってもよい。この薬剤は、神
経保護分子及び／又は神経再生分子であってもよい。この方法を、in vitroで行
うことができる。
【００６１】 この方法は、 (i) 本発明のニューロンを、該ニューロンにとっての毒素で処理すること、 (ii) 該ニューロンを該毒素から分離すること、 (iii) 処理されたニューロンと、試験薬剤とを接触させること、 (iv) 該毒素から回復する該ニューロンの能力を判定すること、 (v) 該毒素から回復する該ニューロンの能力と、該試験薬剤との接触の非存在下
で該毒素から回復する同一のニューロンの能力とを比較すること、 を含んでもよい。
で該毒素から回復する同一のニューロンの能力とを比較すること、 を含んでもよい。
【００６２】 この方法は、 (i) 本発明のニューロンを、試験薬剤の存在下で、該ニューロンにとっての毒素
で処理すること、 (ii) 該毒素に耐える該ニューロンの能力を判定すること、 (iii) 該毒素に耐える該ニューロンの能力と、該試験薬剤との接触の非存在下で
該毒素に耐える同一のニューロンの能力とを比較すること、 を含んでもよい。
で処理すること、 (ii) 該毒素に耐える該ニューロンの能力を判定すること、 (iii) 該毒素に耐える該ニューロンの能力と、該試験薬剤との接触の非存在下で
該毒素に耐える同一のニューロンの能力とを比較すること、 を含んでもよい。
【００６３】 この毒素は、6-ヒドロキシドーパミン、5,7-ジヒドロキシトリプトアミン又は
1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)であってもよい。例
えば、細胞の生存能力をモニターし(例えば、細胞計数やTUNEL技術により)、形
態(例えば、発生、軸索の伸長及び／もしくは分枝)をモニターし、および／又は
生化学的性質(例えば、TH活性、神経伝達物質の取込み／放出／含量)をモニター
することにより、当業者には公知の任意の方法により、該毒素から回復するか、
又はそれをに耐えるニューロンの能力を判定することができる。
1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)であってもよい。例
えば、細胞の生存能力をモニターし(例えば、細胞計数やTUNEL技術により)、形
態(例えば、発生、軸索の伸長及び／もしくは分枝)をモニターし、および／又は
生化学的性質(例えば、TH活性、神経伝達物質の取込み／放出／含量)をモニター
することにより、当業者には公知の任意の方法により、該毒素から回復するか、
又はそれをに耐えるニューロンの能力を判定することができる。
【００６４】 本発明に用いることができる神経幹細胞又は神経前駆細胞としては、C17.2 (S
nyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51(1992))及びH6ヒト細胞系(Flaxら、Nature Biot
ech 16(1998))が挙げられる。さらなる例は、Gage, F.H.ら、Ann. Rev. Neurosc
i. 18, 159-192 (1995)に列挙されている。本発明の考察は神経幹細胞又は神経
前駆細胞を参照して為されるが、本明細書に提供される方法は、他の幹細胞／前
駆細胞におけるニューロンの運命の誘導にも適用することができる。そのような
細胞の例としては、神経系に関連しない幹細胞が挙げられる。この方法を、造血
幹細胞及び／又は表皮に由来する増殖性細胞に適用することができる。造血細胞
は、血液又は骨の生検から採集することができる。上皮細胞は、皮膚の生検又は
例えば、口腔粘膜の切屑によって採集することができる。ニューロンの表現型は
、これらの幹細胞／前駆細胞の生理学的なin vivoの運命ではないので、この誘
導方法は、トランス分化、又は脱分化及びニューロンの再分化と呼ばれる場合が
ある。そのような細胞をニューロンの運命に誘導する方法は、非ニューロンの表
現型に関連する遺伝子に対するアンチセンス調節因子、すなわち、非ニューロン
の運命に向かうこれらの細胞の分化を抑制し、及び／又は逆転させる因子の使用
を含んでもよい。
nyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51(1992))及びH6ヒト細胞系(Flaxら、Nature Biot
ech 16(1998))が挙げられる。さらなる例は、Gage, F.H.ら、Ann. Rev. Neurosc
i. 18, 159-192 (1995)に列挙されている。本発明の考察は神経幹細胞又は神経
前駆細胞を参照して為されるが、本明細書に提供される方法は、他の幹細胞／前
駆細胞におけるニューロンの運命の誘導にも適用することができる。そのような
細胞の例としては、神経系に関連しない幹細胞が挙げられる。この方法を、造血
幹細胞及び／又は表皮に由来する増殖性細胞に適用することができる。造血細胞
は、血液又は骨の生検から採集することができる。上皮細胞は、皮膚の生検又は
例えば、口腔粘膜の切屑によって採集することができる。ニューロンの表現型は
、これらの幹細胞／前駆細胞の生理学的なin vivoの運命ではないので、この誘
導方法は、トランス分化、又は脱分化及びニューロンの再分化と呼ばれる場合が
ある。そのような細胞をニューロンの運命に誘導する方法は、非ニューロンの表
現型に関連する遺伝子に対するアンチセンス調節因子、すなわち、非ニューロン
の運命に向かうこれらの細胞の分化を抑制し、及び／又は逆転させる因子の使用
を含んでもよい。
【００６５】 本発明の方法を、発生経路において神経幹細胞の前に位置する幹細胞に適用す
ることができる。これらを、異なる発生系に関連する２種以上の娘幹細胞を生じ
得る幹細胞に適用することができる。娘幹細胞の例としては、造血幹細胞、表皮
由来の増殖性細胞、及び神経幹細胞が挙げられる。
ることができる。これらを、異なる発生系に関連する２種以上の娘幹細胞を生じ
得る幹細胞に適用することができる。娘幹細胞の例としては、造血幹細胞、表皮
由来の増殖性細胞、及び神経幹細胞が挙げられる。
【００６６】 上記のように、本発明の開示は、腹側中脳のタイプ１アストロサイトにより供
給されるか、又はそれから誘導される１種以上の因子と共に、基底レベルを超え
るNurr1の発現を必要とするプロセスによって、多分化能神経幹細胞又は神経前
駆細胞から、ドーパミン作動性ニューロンを生成することができることを証明す
るものである。この１種以上の因子は、微小多孔性インサートを通過する能力に
よって決定されるように、可溶性であり、分泌性である。また、この因子は不安
定であるようでもある。
給されるか、又はそれから誘導される１種以上の因子と共に、基底レベルを超え
るNurr1の発現を必要とするプロセスによって、多分化能神経幹細胞又は神経前
駆細胞から、ドーパミン作動性ニューロンを生成することができることを証明す
るものである。この１種以上の因子は、微小多孔性インサートを通過する能力に
よって決定されるように、可溶性であり、分泌性である。また、この因子は不安
定であるようでもある。
【００６７】 様々なさらなる態様において、本発明は、基底レベルを超えるNurr1を発現す
る神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるドーパミン作動性の運命を誘導する因子
のアッセイの提供及びスクリーニング方法、並びにそれによって同定される因子
に関する。
る神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるドーパミン作動性の運命を誘導する因子
のアッセイの提供及びスクリーニング方法、並びにそれによって同定される因子
に関する。
【００６８】 本発明は、単独又は組合せで、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細
胞又は神経前駆細胞におけるドーパミン作動性の運命を誘導し得る因子のスクリ
ーニング方法を提供する。本発明のさらなる態様は、神経幹細胞又は神経前駆細
胞におけるドーパミン作動性の運命を誘導する因子のスクリーニング又は探索及
び／もしくは取得／同定における、基底レベルを超えるNurr1を発現する該神経
幹細胞又は前駆細胞の使用を提供する。
胞又は神経前駆細胞におけるドーパミン作動性の運命を誘導し得る因子のスクリ
ーニング方法を提供する。本発明のさらなる態様は、神経幹細胞又は神経前駆細
胞におけるドーパミン作動性の運命を誘導する因子のスクリーニング又は探索及
び／もしくは取得／同定における、基底レベルを超えるNurr1を発現する該神経
幹細胞又は前駆細胞の使用を提供する。
【００６９】 スクリーニング方法は、 (a) 試験物質と、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆
細胞とを接触させること(この接触は試験物質と神経幹細胞又は神経前駆細胞と
の間の相互作用をもたらす）、及び (b) 試験物質と神経幹細胞又は神経前駆細胞との間の相互作用を測定すること、
を含んでもよい。
細胞とを接触させること(この接触は試験物質と神経幹細胞又は神経前駆細胞と
の間の相互作用をもたらす）、及び (b) 試験物質と神経幹細胞又は神経前駆細胞との間の相互作用を測定すること、
を含んでもよい。
【００７０】 スクリーニング方法は、試験物質を、基底レベルを超えるNurr1を発現する神
経幹細胞又は神経前駆細胞から誘導される膜画分とを接触させ、該試験物質と、
該膜画分との間の相互作用を測定することを含んでもよい。膜画分の調製は、当
業者の能力の範囲内にある。
経幹細胞又は神経前駆細胞から誘導される膜画分とを接触させ、該試験物質と、
該膜画分との間の相互作用を測定することを含んでもよい。膜画分の調製は、当
業者の能力の範囲内にある。
【００７１】 結合又は相互作用を、当業界で公知の任意の技術によって、定性的又は定量的
に測定することができる。一方を検出可能な標識を用いて標識し、例えば、固相
支持体に結合した抗体、又はそれ自体公知の他の技術を用いて、固相支持体上に
固定されていてもよい他方にそれを接触させることにより、試験物質と、幹細胞
又は前駆細胞との間の相互作用を研究することができる。
に測定することができる。一方を検出可能な標識を用いて標識し、例えば、固相
支持体に結合した抗体、又はそれ自体公知の他の技術を用いて、固相支持体上に
固定されていてもよい他方にそれを接触させることにより、試験物質と、幹細胞
又は前駆細胞との間の相互作用を研究することができる。
【００７２】 スクリーニング方法は、試験物質の存在下で、神経幹細胞又は神経前駆細胞を
培養し、例えば、本明細書で考察するドーパミン作動性の表現型のマーカーを検
出することにより、ドーパミン作動性の表現型への分化について該細胞を分析す
ることを含む。チロシンヒドロキシラーゼ(TH)は、ドーパミン作動性の表現型の
マーカーの一つである。
培養し、例えば、本明細書で考察するドーパミン作動性の表現型のマーカーを検
出することにより、ドーパミン作動性の表現型への分化について該細胞を分析す
ることを含む。チロシンヒドロキシラーゼ(TH)は、ドーパミン作動性の表現型の
マーカーの一つである。
【００７３】 本発明に従ってスクリーニングされる物質は全て、天然又は合成の化合物であ
ってよい。
ってよい。
【００７４】 スクリーニング方法は、腹側中脳のタイプ１アストロサイトと、基底レベルを
超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞においてドーパミン作動性
の運命を誘導することができない神経系細胞(例えば、アストロサイト)とを比較
することを含む。この比較は、例えば、腹側中脳のタイプ１アストロサイトと、
他の神経的位置に由来するタイプ１アストロサイトとの間のものであってもよい
。
超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞においてドーパミン作動性
の運命を誘導することができない神経系細胞(例えば、アストロサイト)とを比較
することを含む。この比較は、例えば、腹側中脳のタイプ１アストロサイトと、
他の神経的位置に由来するタイプ１アストロサイトとの間のものであってもよい
。
【００７５】 アストロサイトに関するスクリーニング方法には、不死化されたアストロサイ
トを用いてもよい。これは、アストロサイト細胞系、例えば、アストロサイト中
脳細胞系を含んでもよい。そのような細胞系は、均一な細胞集団を提供する。
トを用いてもよい。これは、アストロサイト細胞系、例えば、アストロサイト中
脳細胞系を含んでもよい。そのような細胞系は、均一な細胞集団を提供する。
【００７６】 スクリーニング方法には、DNA、mRNA、cDNA又はポリペプチドレベルであって
もよい細胞間の表現型の差異を分析するための任意の公知の方法を用いることが
できる。差示的スクリーニング及び遺伝子スクリーニングは、そのような技術の
うちの２つである。本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかによって同
定される物質を、本明細書に記載の他のスクリーニング方法のいずれかにおける
試験物質として用いることができる。
もよい細胞間の表現型の差異を分析するための任意の公知の方法を用いることが
できる。差示的スクリーニング及び遺伝子スクリーニングは、そのような技術の
うちの２つである。本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかによって同
定される物質を、本明細書に記載の他のスクリーニング方法のいずれかにおける
試験物質として用いることができる。
【００７７】 スクリーニング方法には、核酸発現アレイ、例えば、マウスcDNA発現アレイを
用いてもよい。この手法においては、異なる核酸分子のアレイを、例えば、該核
酸をフィルターに架橋させることにより、フィルター上に配列させる。試験溶液
又は抽出物を取得し、その中の核酸を、例えば、蛍光により標識する。次いで、
この溶液又は抽出物を、該フィルター上に適用する。フィルター上の核酸への試
験核酸のハイブリダイゼーションを測定し、対照溶液を用いて行ったハイブリダ
イゼーションと比較する。試験サンプル及び対照サンプルを用いて得られたハイ
ブリダイゼーション間の差異は、異なる核酸内容物の存在を示唆するものである
。核酸アレイに関するさらなる情報については、www.clontech.comを参照された
い。
用いてもよい。この手法においては、異なる核酸分子のアレイを、例えば、該核
酸をフィルターに架橋させることにより、フィルター上に配列させる。試験溶液
又は抽出物を取得し、その中の核酸を、例えば、蛍光により標識する。次いで、
この溶液又は抽出物を、該フィルター上に適用する。フィルター上の核酸への試
験核酸のハイブリダイゼーションを測定し、対照溶液を用いて行ったハイブリダ
イゼーションと比較する。試験サンプル及び対照サンプルを用いて得られたハイ
ブリダイゼーション間の差異は、異なる核酸内容物の存在を示唆するものである
。核酸アレイに関するさらなる情報については、www.clontech.comを参照された
い。
【００７８】 スクリーニング方法は、例えば、Nurr1の標的遺伝子及び／又は腹側中脳のタ
イプ１アストロサイトによって供給されるか、もしくはそれから誘導され、基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるドーパミ
ン作動性の運命を誘導する因子の受容体を同定するために、C17.2親細胞と、基
底レベルを超えるNurr1を発現するC17.2細胞とを比較することを含んでもよい。
一度標的遺伝子及び／又は受容体を同定すれば、それらを単離及び／又は精製及
び／又はクローニングし、例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより、
該因子自体のためのスクリーニング方法に用いることができる。
イプ１アストロサイトによって供給されるか、もしくはそれから誘導され、基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるドーパミ
ン作動性の運命を誘導する因子の受容体を同定するために、C17.2親細胞と、基
底レベルを超えるNurr1を発現するC17.2細胞とを比較することを含んでもよい。
一度標的遺伝子及び／又は受容体を同定すれば、それらを単離及び／又は精製及
び／又はクローニングし、例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより、
該因子自体のためのスクリーニング方法に用いることができる。
【００７９】 スクリーニング方法は、混合物から物質を精製及び／又は単離することを含ん
でもよい。この方法は、該混合物の１つ以上の画分が、基底レベルを超えるNurr
1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞と相互作用する能力、例えば、そのよ
うな神経幹細胞もしくは神経前駆細胞に結合し、及び／又は該細胞におけるドー
パミン作動性の運命を誘導する能力を判定することを含んでもよい。精製及び／
又は単離には、当業者には公知の任意の方法を用いることができる。
でもよい。この方法は、該混合物の１つ以上の画分が、基底レベルを超えるNurr
1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞と相互作用する能力、例えば、そのよ
うな神経幹細胞もしくは神経前駆細胞に結合し、及び／又は該細胞におけるドー
パミン作動性の運命を誘導する能力を判定することを含んでもよい。精製及び／
又は単離には、当業者には公知の任意の方法を用いることができる。
【００８０】 スクリーニング方法には、試験物質をコードする核酸に機能し得る形で連結さ
れた誘導性プロモーターを用いることができる。そのような構築物を宿主細胞中
に組み込み、該プロモーターを許容する条件下及び許容しない条件下で、該細胞
の１種以上の特性を決定し、比較する。決定される特性は、宿主細胞が、基底レ
ベルを超えるNurr1を発現する共培養した神経幹細胞又は神経前駆細胞における
ドーパミン作動性の表現型を誘導する能力であってもよい。許容条件と非許容条
件との間の宿主細胞のその能力における差異は、該試験物質が、単独又は組合せ
で、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞における
ドーパミン作動性の運命を誘導し得ることを示唆する。
れた誘導性プロモーターを用いることができる。そのような構築物を宿主細胞中
に組み込み、該プロモーターを許容する条件下及び許容しない条件下で、該細胞
の１種以上の特性を決定し、比較する。決定される特性は、宿主細胞が、基底レ
ベルを超えるNurr1を発現する共培養した神経幹細胞又は神経前駆細胞における
ドーパミン作動性の表現型を誘導する能力であってもよい。許容条件と非許容条
件との間の宿主細胞のその能力における差異は、該試験物質が、単独又は組合せ
で、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞における
ドーパミン作動性の運命を誘導し得ることを示唆する。
【００８１】 当業者であれば、通常の技術及び知識を用いて、本発明のスクリーニング方法
のいずれかの正確な形式を変更することができる。
のいずれかの正確な形式を変更することができる。
【００８２】 本発明により提供される方法のいずれか１つによって同定される因子を、単離
及び／又は精製及び／又はさらに調査することができる。該因子を製造すること
もできる。
及び／又は精製及び／又はさらに調査することができる。該因子を製造すること
もできる。
【００８３】 種々のさらなる態様において、本発明はさらに、本明細書に開示される方法の
いずれか１つによって同定される因子、そのような因子を含む医薬組成物、医薬
、薬物又はその他の組成物(この組成物は基底レベルを超えるNurr1を発現する神
経幹細胞又は神経前駆細胞を含んでもよい)、基底レベルを超えるNurr1を発現す
る神経幹細胞又は神経前駆細胞を、ドーパミン作動性の表現型を獲得するように
誘導するそのような因子の使用、例えば、ドーパミン作動性ニューロンに対する
損傷、その損失、又はそれにおける障害に関連する医学的状態（例えば、パーキ
ンソン病又は別の神経変性疾患）の治療(予防的治療を含んでもよい)のために、
そのような因子又は組成物を患者に投与することを含む医学的治療方法における
そのような因子又は組成物の使用、例えば、パーキンソン病又は他の疾患(例え
ば、神経変性疾患)の治療のための投与のための組成物、医薬又は薬物の製造に
おけるそのような因子の使用、並びにそのような因子と、製薬上許容し得る賦形
剤、ビヒクル又は担体、及び場合によっては他の成分とを混合することを含む医
薬組成物の製造方法を提供する。
いずれか１つによって同定される因子、そのような因子を含む医薬組成物、医薬
、薬物又はその他の組成物(この組成物は基底レベルを超えるNurr1を発現する神
経幹細胞又は神経前駆細胞を含んでもよい)、基底レベルを超えるNurr1を発現す
る神経幹細胞又は神経前駆細胞を、ドーパミン作動性の表現型を獲得するように
誘導するそのような因子の使用、例えば、ドーパミン作動性ニューロンに対する
損傷、その損失、又はそれにおける障害に関連する医学的状態（例えば、パーキ
ンソン病又は別の神経変性疾患）の治療(予防的治療を含んでもよい)のために、
そのような因子又は組成物を患者に投与することを含む医学的治療方法における
そのような因子又は組成物の使用、例えば、パーキンソン病又は他の疾患(例え
ば、神経変性疾患)の治療のための投与のための組成物、医薬又は薬物の製造に
おけるそのような因子の使用、並びにそのような因子と、製薬上許容し得る賦形
剤、ビヒクル又は担体、及び場合によっては他の成分とを混合することを含む医
薬組成物の製造方法を提供する。
【００８４】 関連する態様において、本発明は、腹側中脳のタイプ１アストロサイト(又は
本発明により提供されるスクリーニング方法によって同定される因子)が、基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるドーパミ
ン作動性の運命を誘導する能力をモジュレートする物質のスクリーニング方法を
提供する。
本発明により提供されるスクリーニング方法によって同定される因子)が、基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞におけるドーパミ
ン作動性の運命を誘導する能力をモジュレートする物質のスクリーニング方法を
提供する。
【００８５】 そのような方法は、 (i) １種以上の試験物質の存在下で、タイプ１アストロサイトと、基底レベルを
超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞とを共培養すること、 (ii) 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞と、その
ような細胞においてドーパミン作動性の表現型を誘導し得るような、本発明によ
り提供されるスクリーニング方法によって同定された１種以上の因子とを接触さ
せること(この接触は１種以上の試験物質の存在下で起こる)、 (iii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合を分析する
こと、 (iv) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合と、比較可
能な反応培地及び条件において、試験物質の非存在下で、ドーパミン作動性の運
命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の数とを比較すること(処理した共培養物と未
処理の共培養物との間のドーパミン作動性ニューロンの割合における差異は、相
当する試験物質のモジュレート作用の存在を示唆する)、 のうちの１つ以上を含んでもよい。
超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞とを共培養すること、 (ii) 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞と、その
ような細胞においてドーパミン作動性の表現型を誘導し得るような、本発明によ
り提供されるスクリーニング方法によって同定された１種以上の因子とを接触さ
せること(この接触は１種以上の試験物質の存在下で起こる)、 (iii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合を分析する
こと、 (iv) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合と、比較可
能な反応培地及び条件において、試験物質の非存在下で、ドーパミン作動性の運
命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の数とを比較すること(処理した共培養物と未
処理の共培養物との間のドーパミン作動性ニューロンの割合における差異は、相
当する試験物質のモジュレート作用の存在を示唆する)、 のうちの１つ以上を含んでもよい。
【００８６】 そのようなスクリーニング方法は、 (i) １種以上の試験物質の存在下で、タイプ１アストロサイトと、基底レベルを
超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞とを共培養すること、 (ii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合を分析する
こと、 (iii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合と、比較可
能な反応培地及び条件において、試験物質の非存在下で、ドーパミン作動性の運
命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の数とを比較すること、 を含んでもよい。
超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞とを共培養すること、 (ii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合を分析する
こと、 (iii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合と、比較可
能な反応培地及び条件において、試験物質の非存在下で、ドーパミン作動性の運
命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の数とを比較すること、 を含んでもよい。
【００８７】 そのようなスクリーニング方法は、 (i) 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞と、その
ような細胞においてドーパミン作動性の表現型を誘導し得るような、本発明によ
り提供されるスクリーニング方法によって同定された１種以上の因子とを接触さ
せること(この接触は１種以上の試験物質の存在下で起こる)、 (ii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合を分析する
こと、 (iii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合と、比較可
能な反応培地及び条件において、試験物質の非存在下で、ドーパミン作動性の運
命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の数とを比較すること、 を含んでもよい。
ような細胞においてドーパミン作動性の表現型を誘導し得るような、本発明によ
り提供されるスクリーニング方法によって同定された１種以上の因子とを接触さ
せること(この接触は１種以上の試験物質の存在下で起こる)、 (ii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合を分析する
こと、 (iii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合と、比較可
能な反応培地及び条件において、試験物質の非存在下で、ドーパミン作動性の運
命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の数とを比較すること、 を含んでもよい。
【００８８】 誘導活性をモジュレートする物質を同定した後、この物質をさらに調べること
ができる。これを、医薬、医薬組成物もしくは薬物などの組成物の調製物、すな
わち製造物もしくは製剤中に製造し、及び／又は使用することができる。モジュ
レート活性について試験される物質は、天然の化合物であっても、化学合成化合
物であってもよい。
ができる。これを、医薬、医薬組成物もしくは薬物などの組成物の調製物、すな
わち製造物もしくは製剤中に製造し、及び／又は使用することができる。モジュ
レート活性について試験される物質は、天然の化合物であっても、化学合成化合
物であってもよい。
【００８９】 本発明の態様及び実施形態を、実施例により、添付の図面を参照して説明する
。さらなる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書に記載さ
れる参考文献は全て、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
。さらなる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書に記載さ
れる参考文献は全て、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００９０】詳細な説明 方法 Nurr1過剰発現細胞系 CMX-Nurr1発現ベクター(Perlmann, T.ら、Genes Dev. 9, 769-782 (1995))及
びPGK-ピューロマイシン耐性プラスミド(Nurr1クローン)又はPGK-ピューロマイ
シンのみ(モッククローン)を用いて、C17.2細胞を同時トランスフェクトした。
リポーターアッセイについては、2:1:2の比のNurr1発現ベクター、リポータープ
ラスミド(ホタルルシフェラーゼに融合したTK最少プロモーターのトリプレット
上流のNGFIB結合応答エレメント(NBRE))及びpRSV-アルカリ性ホスファターゼプ
ラスミドを用いて、C17.2親細胞をトランスフェクトした。
びPGK-ピューロマイシン耐性プラスミド(Nurr1クローン)又はPGK-ピューロマイ
シンのみ(モッククローン)を用いて、C17.2細胞を同時トランスフェクトした。
リポーターアッセイについては、2:1:2の比のNurr1発現ベクター、リポータープ
ラスミド(ホタルルシフェラーゼに融合したTK最少プロモーターのトリプレット
上流のNGFIB結合応答エレメント(NBRE))及びpRSV-アルカリ性ホスファターゼプ
ラスミドを用いて、C17.2親細胞をトランスフェクトした。
【００９１】 50個のNurr1でトランスフェクトされたクローンをピューロマイシン耐性につ
いて選択し、単離し、増幅し、Nurr1 mRNA発現をRNase保護アッセイ(RPA)により
分析した。RPAIIリボヌクレアーゼ保護アッセイキット(Ambion)を用いて、製造
業者の推奨に従ってアッセイを行った。マウスNurr1 cDNA配列(Law, S.W.ら、Mo
l. Endocrinol. 6, 2129-2135 (1992))のヌクレオチド1798-2086にわたる288 bp
のアンチセンスNurr1 cDNAプローブを、T7を用いて(EcoRIで直鎖化したPBS-KS+
ベクターのEcoRI/XhoI部位中にクローニングされたNurr1 cDNAから)転写し、(α
-32P)CTP (Amersham)で標識した。保護されたcRNA断片を、変性条件下で4％ PAG
E上で分離した。phosphoimager MD storm 840を用いて、シグナルの強度を分析
し、サンプル毎にGAPDHの含量に対してNurr1シグナルを標準化した。
いて選択し、単離し、増幅し、Nurr1 mRNA発現をRNase保護アッセイ(RPA)により
分析した。RPAIIリボヌクレアーゼ保護アッセイキット(Ambion)を用いて、製造
業者の推奨に従ってアッセイを行った。マウスNurr1 cDNA配列(Law, S.W.ら、Mo
l. Endocrinol. 6, 2129-2135 (1992))のヌクレオチド1798-2086にわたる288 bp
のアンチセンスNurr1 cDNAプローブを、T7を用いて(EcoRIで直鎖化したPBS-KS+
ベクターのEcoRI/XhoI部位中にクローニングされたNurr1 cDNAから)転写し、(α
-32P)CTP (Amersham)で標識した。保護されたcRNA断片を、変性条件下で4％ PAG
E上で分離した。phosphoimager MD storm 840を用いて、シグナルの強度を分析
し、サンプル毎にGAPDHの含量に対してNurr1シグナルを標準化した。
【００９２】細胞培養及び処理 C17.2神経幹細胞(Snyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51 (1992))を、以前に記載(S
nyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51 (1992))のように、維持し、継代した。E16ラッ
ト胚から得た腹側中脳を切開し、機械的に分離し、最終密度1 x 105細胞／cm2で
、規定の無血清培地(インスリン(10 ng/ml)、トランスフェリン(100μg/ml)、プ
トレシン(100μM)、プロゲステロン(20 nM)、セレン(30 nM)、グルコース(6 mg/
ml)、及びウシ血清アルブミン(1 mg/ml)を含有するF12およびDMEMの1：1の混合
物から成るN2)中のポリ-D-リジンで被覆した培養ウェル上にプレーティングした
。in vitroで24時間培養した後、初代培養物中に2.5〜5 x 104個のC17.2由来細
胞を直接プレーティングすることにより、共培養を開始した。培養物の齢数は全
て、この時点を0 DIVとして用いた。この一連のプレーティング及び初代／C17.2
細胞の比により、最も健康な培養物が得られたが、10倍の範囲を超えるC17.2細
胞数の変化は、観察されるTH+細胞の割合に有意な影響を及ぼさなかった。標準
的なプロトコール(McCarthy, K.D.ら、J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980))に従
って、P1ラットの様々な領域から誘導された混合グリア培養物から、精製された
タイプ１アストロサイトを取得した。6又は12ウェルのプレートに再びプレーテ
ィングした後、血清含有培地中で集密になるまでアストロサイトを増殖させ、N2
培地に変更した。3〜5 DIVの後、上記のように新鮮なN2中で共培養を開始した。
共培養の開始の時点で、全ての因子を同時に添加した(濃度は結果及び考察に記
載されている)が、5-ブロモデオキシウリジン(BrdU)だけは固定前4〜6時間に添
加した。加湿した5％ CO2、95％空気のインキュベーター中、37℃にて培養物を
維持し、所与の時間経過の後、4％パラホルムアルデヒドで45分間固定し、免疫
細胞化学的分析を行った。
nyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51 (1992))のように、維持し、継代した。E16ラッ
ト胚から得た腹側中脳を切開し、機械的に分離し、最終密度1 x 105細胞／cm2で
、規定の無血清培地(インスリン(10 ng/ml)、トランスフェリン(100μg/ml)、プ
トレシン(100μM)、プロゲステロン(20 nM)、セレン(30 nM)、グルコース(6 mg/
ml)、及びウシ血清アルブミン(1 mg/ml)を含有するF12およびDMEMの1：1の混合
物から成るN2)中のポリ-D-リジンで被覆した培養ウェル上にプレーティングした
。in vitroで24時間培養した後、初代培養物中に2.5〜5 x 104個のC17.2由来細
胞を直接プレーティングすることにより、共培養を開始した。培養物の齢数は全
て、この時点を0 DIVとして用いた。この一連のプレーティング及び初代／C17.2
細胞の比により、最も健康な培養物が得られたが、10倍の範囲を超えるC17.2細
胞数の変化は、観察されるTH+細胞の割合に有意な影響を及ぼさなかった。標準
的なプロトコール(McCarthy, K.D.ら、J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980))に従
って、P1ラットの様々な領域から誘導された混合グリア培養物から、精製された
タイプ１アストロサイトを取得した。6又は12ウェルのプレートに再びプレーテ
ィングした後、血清含有培地中で集密になるまでアストロサイトを増殖させ、N2
培地に変更した。3〜5 DIVの後、上記のように新鮮なN2中で共培養を開始した。
共培養の開始の時点で、全ての因子を同時に添加した(濃度は結果及び考察に記
載されている)が、5-ブロモデオキシウリジン(BrdU)だけは固定前4〜6時間に添
加した。加湿した5％ CO2、95％空気のインキュベーター中、37℃にて培養物を
維持し、所与の時間経過の後、4％パラホルムアルデヒドで45分間固定し、免疫
細胞化学的分析を行った。
【００９３】免疫細胞化学的分析及びHPLC 1％ウシ血清アルブミン及び0.3％Triton-X100を含むリン酸緩衝生理食塩水(PB
S)で適当に希釈された以下の抗体：マウス抗BrdU、1:50 (DAKO, Denmark)、マウ
ス抗β-チューブリン、タイプIII (TuJ1)、1:250 (Sigma)、マウス抗TH、1:1000
(Incstar, USA)、ウサギ抗β-ガラクトシダーゼ、1:250 (Cappel, USA)、ウサ
ギ抗GFAP、1:500 (DAKO, Denmark)、ウサギ抗AHD-2、1:4000のうちの一つと共に
、固定した培養物をインキュベートした。インキュベーションは、4℃にて一晩
か、又は室温にて1時間行った。両方のプロセスにより、同様の結果が得られた
。洗浄した後、同じ希釈バッファーで1:100に希釈された適当な二次抗体(ビオチ
ン化ウマ抗マウスIgG又はヤギ抗ウサギIgG、Vector、USA)と共に、培養物を1〜3
時間インキュベートした。AEC(赤)又はSG(グレー)基質を用いて、Vector Labora
tory ABCイムノペルオキシダーゼキットにより、免疫染色を可視化した。ビオチ
ン化二次抗体の代わりにFITC結合抗体(Vector, USA)（1:100）を用いることによ
り、β-ガラクトシダーゼ(β-gal)の蛍光二重標識を行った。定量的免疫細胞化
学データは、2〜4回の実験から得られた3〜6個の別々のウェルの各々で計数され
た100〜500個の細胞から得られた平均及び標準誤差を示す。初代細胞及びC17.2
由来細胞の共培養物におけるTH発現の定量のために、明視野AEC基質を用いてTH
を可視化する一方、FITCを用いてβ-galを評価した。従って、「%TH+」と表され
る全てのデータは、全β-gal陽性細胞数で割られたTH+/β-gal+の数を示す。
S)で適当に希釈された以下の抗体：マウス抗BrdU、1:50 (DAKO, Denmark)、マウ
ス抗β-チューブリン、タイプIII (TuJ1)、1:250 (Sigma)、マウス抗TH、1:1000
(Incstar, USA)、ウサギ抗β-ガラクトシダーゼ、1:250 (Cappel, USA)、ウサ
ギ抗GFAP、1:500 (DAKO, Denmark)、ウサギ抗AHD-2、1:4000のうちの一つと共に
、固定した培養物をインキュベートした。インキュベーションは、4℃にて一晩
か、又は室温にて1時間行った。両方のプロセスにより、同様の結果が得られた
。洗浄した後、同じ希釈バッファーで1:100に希釈された適当な二次抗体(ビオチ
ン化ウマ抗マウスIgG又はヤギ抗ウサギIgG、Vector、USA)と共に、培養物を1〜3
時間インキュベートした。AEC(赤)又はSG(グレー)基質を用いて、Vector Labora
tory ABCイムノペルオキシダーゼキットにより、免疫染色を可視化した。ビオチ
ン化二次抗体の代わりにFITC結合抗体(Vector, USA)（1:100）を用いることによ
り、β-ガラクトシダーゼ(β-gal)の蛍光二重標識を行った。定量的免疫細胞化
学データは、2〜4回の実験から得られた3〜6個の別々のウェルの各々で計数され
た100〜500個の細胞から得られた平均及び標準誤差を示す。初代細胞及びC17.2
由来細胞の共培養物におけるTH発現の定量のために、明視野AEC基質を用いてTH
を可視化する一方、FITCを用いてβ-galを評価した。従って、「%TH+」と表され
る全てのデータは、全β-gal陽性細胞数で割られたTH+/β-gal+の数を示す。
【００９４】 ドーパミンの放出の分析については、約100万個のNurr1-C17.2-c42又はC17.2
親細胞と、P1 VM T1Aとを含有する大量(10 cm)共培養物を、PBS中の50 mM KCl 2
00μl／0.1 Mクエン酸ナトリウムで5分間攪拌しながら処理した。高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)を用いて、ドーパミン含量について上清を直接アッセイし
た。逆相C-18カラムを用いてサンプルを分離し、アセトニトリルで溶出し、電気
化学的に検出した。ドーパミン、DOPAC、5-HT、及び5-HIAAを含有する標準を用
いて、結果を検証した。
親細胞と、P1 VM T1Aとを含有する大量(10 cm)共培養物を、PBS中の50 mM KCl 2
00μl／0.1 Mクエン酸ナトリウムで5分間攪拌しながら処理した。高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)を用いて、ドーパミン含量について上清を直接アッセイし
た。逆相C-18カラムを用いてサンプルを分離し、アセトニトリルで溶出し、電気
化学的に検出した。ドーパミン、DOPAC、5-HT、及び5-HIAAを含有する標準を用
いて、結果を検証した。
【００９５】長期培養及び移植 親C17.2細胞又はC17.2-Nurr1-c42細胞を、bFGF (10 ng/ml)及びSR11237 (1μM
)の存在下で、8日間、VMタイプ１アストロサイトとの大量(10 cm)インサート共
培養物中で増殖させた。次いで、インサートから細胞をトリプシン処理し、ペレ
ットにし、100,000細胞／μlの濃度で、それらの固有のならし培地中に再懸濁し
た。その後、この混合物のアリコートを、N2培地を含むポリ-D-リジン処理され
た6ウェルの組織培養プレートにプレーティングする一方、残りを移植に用いた
。欧州共同体のガイドライン(86/609/EEC)に従って飼育し、処理された成体(25
〜30 g)のCD1マウスを、ペントバルビタール(60 mg/kg i.p.)で麻酔した。2つの
以下の座標(mm単位)：AP(ブレグマ)＝0.56, L＝1.9, DV(硬膜)＝-2.55及び-2.75
の各々で、切歯バーを-3で用いて、25,000個の細胞を線条中に定位的に注入した
。移植後12日目に、マウスを、4％パラホルムアルデヒドを用いて心臓を介する
ように(transcardially)灌流した。脳を2時間、後固定し、1日以上の間、10％ス
クロース中に入れ、ドライアイスで冷却したイソペンタン中で凍結した。マウス
抗TH抗体 (Incstar, Minnesota, USA) 1:1000、及びロバ抗マウスローダミン抗
体 (Jackson, Pennsylvania, USA) 1:100を用いて、TH免疫組織化学のために、1
4ミクロンのクリオスタット切片を処理した。Zeiss Axioplan 2顕微鏡に取り付
けたHamamatsu cameraを用いて、TH陽性細胞を撮影した。
)の存在下で、8日間、VMタイプ１アストロサイトとの大量(10 cm)インサート共
培養物中で増殖させた。次いで、インサートから細胞をトリプシン処理し、ペレ
ットにし、100,000細胞／μlの濃度で、それらの固有のならし培地中に再懸濁し
た。その後、この混合物のアリコートを、N2培地を含むポリ-D-リジン処理され
た6ウェルの組織培養プレートにプレーティングする一方、残りを移植に用いた
。欧州共同体のガイドライン(86/609/EEC)に従って飼育し、処理された成体(25
〜30 g)のCD1マウスを、ペントバルビタール(60 mg/kg i.p.)で麻酔した。2つの
以下の座標(mm単位)：AP(ブレグマ)＝0.56, L＝1.9, DV(硬膜)＝-2.55及び-2.75
の各々で、切歯バーを-3で用いて、25,000個の細胞を線条中に定位的に注入した
。移植後12日目に、マウスを、4％パラホルムアルデヒドを用いて心臓を介する
ように(transcardially)灌流した。脳を2時間、後固定し、1日以上の間、10％ス
クロース中に入れ、ドライアイスで冷却したイソペンタン中で凍結した。マウス
抗TH抗体 (Incstar, Minnesota, USA) 1:1000、及びロバ抗マウスローダミン抗
体 (Jackson, Pennsylvania, USA) 1:100を用いて、TH免疫組織化学のために、1
4ミクロンのクリオスタット切片を処理した。Zeiss Axioplan 2顕微鏡に取り付
けたHamamatsu cameraを用いて、TH陽性細胞を撮影した。
【００９６】結果及び考察 多分化能神経幹細胞における基底レベルを超えるNurr1の発現 本発明者らは、C17.2 (Snyder, E.Y.ら、Cell 68, 33-51 (1992))と呼ばれる
、よく知られた特徴を有する多分化能神経幹細胞のクローンを用いた。発生中の
マウス小脳から最初に誘導され、さらにv-mycを用いて不死化されたC17.2細胞は
、lacZリポーターを含有し、in vitro及びin vivoでニューロン、アストロサイ
ト、及びオリゴデンドロサイトに分化する能力を有し、さらには発生中の脳への
移植の際、領域的に適合したニューロンの表現型を獲得する(Snyder, E.Y.ら、C
ell 68, 33-51 (1992); Snyder, E.Y.ら、Nature 374, 367-370 (1995))。さら
に、胎児及び成体の中枢神経系に由来する初代幹細胞の分化を指令することが知
られる同じ単一の因子(Johe, K.K.ら、Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996))は、i
n vitroでC17.2細胞の分化を指令する。
、よく知られた特徴を有する多分化能神経幹細胞のクローンを用いた。発生中の
マウス小脳から最初に誘導され、さらにv-mycを用いて不死化されたC17.2細胞は
、lacZリポーターを含有し、in vitro及びin vivoでニューロン、アストロサイ
ト、及びオリゴデンドロサイトに分化する能力を有し、さらには発生中の脳への
移植の際、領域的に適合したニューロンの表現型を獲得する(Snyder, E.Y.ら、C
ell 68, 33-51 (1992); Snyder, E.Y.ら、Nature 374, 367-370 (1995))。さら
に、胎児及び成体の中枢神経系に由来する初代幹細胞の分化を指令することが知
られる同じ単一の因子(Johe, K.K.ら、Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996))は、i
n vitroでC17.2細胞の分化を指令する。
【００９７】 下記のように、C17.2細胞を安定にトランスフェクトし、RNase保護アッセイ(R
PA)により、トランスジーンの発現について、50個のNurr1クローンを分析した。
いくつかのNurr1クローンがトランスジーンを過剰発現したので、そのうちの5個
の最も高く発現したクローンを分析のために選択した。これらの5個の選択した
クローンは、親C17.2細胞、又は腹側中脳、小脳もしくは皮質の細胞よりも高い
レベルのNurr1を発現した。8個の無作為に選択したモック対照クローンも選択し
た。全てのNurr1クローンは、血清含有培地中では親クローン及びモッククロー
ンと同様に振る舞い、増殖速度や形態に明らかな差異は認められなかった。
PA)により、トランスジーンの発現について、50個のNurr1クローンを分析した。
いくつかのNurr1クローンがトランスジーンを過剰発現したので、そのうちの5個
の最も高く発現したクローンを分析のために選択した。これらの5個の選択した
クローンは、親C17.2細胞、又は腹側中脳、小脳もしくは皮質の細胞よりも高い
レベルのNurr1を発現した。8個の無作為に選択したモック対照クローンも選択し
た。全てのNurr1クローンは、血清含有培地中では親クローン及びモッククロー
ンと同様に振る舞い、増殖速度や形態に明らかな差異は認められなかった。
【００９８】Nurr1過剰発現クローンの分化能力 Nurr1過剰発現クローンの分化能力及び表現型の運命を定義するために、本発
明者らは、無血清の規定培地(分化を可能にする条件)中に低密度で継代した後の
該クローンの振る舞いを試験した。この条件下で、親細胞系は分化しはじめ、in
vitroで4〜5日(DIV)後には、80〜85％の集団が有糸分裂後のものであるが(すな
わち、パルス延長後にBrdU陰性である)、有糸分裂後の細胞の約20〜30％がニュ
ーロンの運命を獲得し、これはβ-チューブリンIII(TuJ1)の発現により判断され
る。
明者らは、無血清の規定培地(分化を可能にする条件)中に低密度で継代した後の
該クローンの振る舞いを試験した。この条件下で、親細胞系は分化しはじめ、in
vitroで4〜5日(DIV)後には、80〜85％の集団が有糸分裂後のものであるが(すな
わち、パルス延長後にBrdU陰性である)、有糸分裂後の細胞の約20〜30％がニュ
ーロンの運命を獲得し、これはβ-チューブリンIII(TuJ1)の発現により判断され
る。
【００９９】 無血清培地中で6時間のパルス後の10μMのBrdUの取込みにより測定された通り
、分化能力に対するNurr1の効果は変化した。Nurr1クローン内で分化が増加する
傾向があったが、このプロセスに対するトランスジーンの明らかな効果は認めら
れなかった(図1A)。しかし、有糸分裂後の細胞の運命に対するNurr1の効果は明
らかであり、強力であった(図1B)。β-チューブリンIII(TuJ1)の発現により判断
されるように、Nurr1トランスジーンの発現は、5個全てのクローンにわたって平
均68％の有糸分裂後の細胞にまで、無血清培地におけるニューロンの運命を有意
に増加させた(Nurr1トランスジーン対モックの全体的な効果、2-way ANOVAによ
る*P < 0.0001)。5個のNurr1クローンのうちの4個において、大多数の有糸分裂
後の細胞(60％を超える)がニューロンの運命を獲得したが、これはモッククロー
ンにおいては全く認められない現象であった。
、分化能力に対するNurr1の効果は変化した。Nurr1クローン内で分化が増加する
傾向があったが、このプロセスに対するトランスジーンの明らかな効果は認めら
れなかった(図1A)。しかし、有糸分裂後の細胞の運命に対するNurr1の効果は明
らかであり、強力であった(図1B)。β-チューブリンIII(TuJ1)の発現により判断
されるように、Nurr1トランスジーンの発現は、5個全てのクローンにわたって平
均68％の有糸分裂後の細胞にまで、無血清培地におけるニューロンの運命を有意
に増加させた(Nurr1トランスジーン対モックの全体的な効果、2-way ANOVAによ
る*P < 0.0001)。5個のNurr1クローンのうちの4個において、大多数の有糸分裂
後の細胞(60％を超える)がニューロンの運命を獲得したが、これはモッククロー
ンにおいては全く認められない現象であった。
【０１００】 Nurr1は、C17.2細胞をニューロンの系列に限定させるようであるが、有意なチ
ロシンヒドロキシラーゼ(TH、ドーパミン作動性ニューロンのマーカー)の免疫反
応性はこれらの条件下でNurr1クローンのいずれにおいても検出されなかったよ
うに、これらのニューロンの神経化学的運命はドーパミン作動性ではなかった。
ロシンヒドロキシラーゼ(TH、ドーパミン作動性ニューロンのマーカー)の免疫反
応性はこれらの条件下でNurr1クローンのいずれにおいても検出されなかったよ
うに、これらのニューロンの神経化学的運命はドーパミン作動性ではなかった。
【０１０１】ドーパミン作動性の運命へのNurr1過剰発現クローンの誘導 本発明者らは、種々の栄養因子、分裂促進剤、サイトカイン、並びに内因性ド
ーパミン作動性ニューロンの増殖(塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖
因子(EGF)、インスリン様増殖因子、ウシ胎児血清)、分化(レチノイン酸、ドー
パミン、フォルスコリン、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog))及び生存(
グリア細胞系由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン-3、
毛様体神経栄養因子)において重要であることが知られている他の薬剤を用いて
、Nurr1クローンを処理した。これらの因子はいずれも、単独でも、組合せても
、該クローンにおけるTH発現を誘導しなかった。
ーパミン作動性ニューロンの増殖(塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖
因子(EGF)、インスリン様増殖因子、ウシ胎児血清)、分化(レチノイン酸、ドー
パミン、フォルスコリン、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog))及び生存(
グリア細胞系由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン-3、
毛様体神経栄養因子)において重要であることが知られている他の薬剤を用いて
、Nurr1クローンを処理した。これらの因子はいずれも、単独でも、組合せても
、該クローンにおけるTH発現を誘導しなかった。
【０１０２】 Nurr1クローンを、in vitroにおいて、E16ラット腹側中脳(黒質の内因性ドー
パミン作動性ニューロンを生成した齢数及び領域)に由来する初代培養物と共培
養した(Altman, J.ら、Neurogenesis and Neuronal Migration, in The Rat Ner
vous System,第2版, (Paxinos, G. Academic Press, San Diego編) p.1054 (199
5))。これらの条件下で、2つのNurr1系(最も高い増殖能力を有するクローンであ
る、クローン4及び42)に由来する細胞の有意な割合により、測定可能な量のTH免
疫反応性が示された(図1C-*P < 0.0001、2-way ANOVAによる、トランスジーン対
クローンの相互作用)。C17.2親細胞又はモック対照系のいずれにおいても、TH染
色はほとんど認められないか、又は全く認められなかった。共培養物の位相差顕
微鏡観察により、Nurr1クローン由来TH+細胞の大きな増殖塊が認められた。
パミン作動性ニューロンを生成した齢数及び領域)に由来する初代培養物と共培
養した(Altman, J.ら、Neurogenesis and Neuronal Migration, in The Rat Ner
vous System,第2版, (Paxinos, G. Academic Press, San Diego編) p.1054 (199
5))。これらの条件下で、2つのNurr1系(最も高い増殖能力を有するクローンであ
る、クローン4及び42)に由来する細胞の有意な割合により、測定可能な量のTH免
疫反応性が示された(図1C-*P < 0.0001、2-way ANOVAによる、トランスジーン対
クローンの相互作用)。C17.2親細胞又はモック対照系のいずれにおいても、TH染
色はほとんど認められないか、又は全く認められなかった。共培養物の位相差顕
微鏡観察により、Nurr1クローン由来TH+細胞の大きな増殖塊が認められた。
【０１０３】 全体として、これらの観察は、初代培養物に由来する1種以上の局所因子はNur
r1と直接的又は間接的に相互作用して、THを発現するニューロンを誘導すること
を示唆していた。TH発現は、Nurr1クローンの画分内の少数の亜集団に限定され
ていた。
r1と直接的又は間接的に相互作用して、THを発現するニューロンを誘導すること
を示唆していた。TH発現は、Nurr1クローンの画分内の少数の亜集団に限定され
ていた。
【０１０４】SR11237、bFGF、及びEGFを用いた共培養物の処理 最も高くTHを発現するNurr1クローン(クローン42)と初代VM細胞との共培養物
の、前記因子の組合せによる処理は、3つの重要な例外：合成レチノイド類似体S
R11237、bFGF、及びEGFを除き、一様にTH発現の上昇には影響しなかった(図2A)
。
の、前記因子の組合せによる処理は、3つの重要な例外：合成レチノイド類似体S
R11237、bFGF、及びEGFを除き、一様にTH発現の上昇には影響しなかった(図2A)
。
【０１０５】 共培養物中の親C17.2細胞へのSR11237(1μMまで)及びbFGF(10 ng/ml)の添加は
、THの発現を誘導しなかったが、これらの分子の各々は、無血清培地中の共培養
物に添加した場合、Nurr1-C17.2クローン42集団の40〜60％において、TH発現を
誘導した。bFGFの効果はEGFにより置換することが可能であった。さらに、SR112
37及びbFGF又はEGFの効果は、飽和用量(最大で90％のLacZ+がTH+であった)で付
加され、これらの因子が異なる機構を介して機能することを示唆している。
、THの発現を誘導しなかったが、これらの分子の各々は、無血清培地中の共培養
物に添加した場合、Nurr1-C17.2クローン42集団の40〜60％において、TH発現を
誘導した。bFGFの効果はEGFにより置換することが可能であった。さらに、SR112
37及びbFGF又はEGFの効果は、飽和用量(最大で90％のLacZ+がTH+であった)で付
加され、これらの因子が異なる機構を介して機能することを示唆している。
【０１０６】 SR11237は、RXRレチノイド受容体(Lehmann, J.M.ら、Science 258, 1944-1946
(1992))を特異的に刺激する。該受容体は、Nurr1とヘテロ二量体化して、転写
開始複合体を形成することが示されている(Perlmann, T.ら、Genes Dev. 9, 769
-782 (1995))。この観察結果と、オールトランス型レチノイン酸は効果を有さな
いという観察結果とから、Nurr1、RXR受容体及び初代VM細胞の間の機能的相互作
用が関与し得ることが示唆される。
(1992))を特異的に刺激する。該受容体は、Nurr1とヘテロ二量体化して、転写
開始複合体を形成することが示されている(Perlmann, T.ら、Genes Dev. 9, 769
-782 (1995))。この観察結果と、オールトランス型レチノイン酸は効果を有さな
いという観察結果とから、Nurr1、RXR受容体及び初代VM細胞の間の機能的相互作
用が関与し得ることが示唆される。
【０１０７】 レチノイド及びFGFは、正常なドーパミン作動性ニューロンの発生に何らかの
役割を果たすことが以前に示されている(Ye, W.ら、Cell 93, 755-766 (1998);
Eichele, G. Trends Genet 13, 343-345 (1997); Krezel, W. Science 279, 864
-867 (1998))。しかし、これらの因子は上記したようにTH発現細胞の集団を増加
させるが、Nurr1-C17.2-c42 (c42)に対するこれらの因子の効果は調節的である
ことを本発明者らは示した。ブロッキング抗体又は特異的RARもしくはRXRアンタ
ゴニストの拮抗作用は、共培養物におけるc42の基底TH発現(すなわち、約10％、
図1C)を阻害しなかった。ブロッキング抗体を用いるソニックヘッジホッグの拮
抗作用も、基底TH発現の阻害に効果を示さなかった。従って、c42におけるドー
パミン作動性の表現型の誘導のための唯一の絶対的条件は、初代腹側中脳細胞か
ら誘導されるシグナルへの曝露であるようである。
役割を果たすことが以前に示されている(Ye, W.ら、Cell 93, 755-766 (1998);
Eichele, G. Trends Genet 13, 343-345 (1997); Krezel, W. Science 279, 864
-867 (1998))。しかし、これらの因子は上記したようにTH発現細胞の集団を増加
させるが、Nurr1-C17.2-c42 (c42)に対するこれらの因子の効果は調節的である
ことを本発明者らは示した。ブロッキング抗体又は特異的RARもしくはRXRアンタ
ゴニストの拮抗作用は、共培養物におけるc42の基底TH発現(すなわち、約10％、
図1C)を阻害しなかった。ブロッキング抗体を用いるソニックヘッジホッグの拮
抗作用も、基底TH発現の阻害に効果を示さなかった。従って、c42におけるドー
パミン作動性の表現型の誘導のための唯一の絶対的条件は、初代腹側中脳細胞か
ら誘導されるシグナルへの曝露であるようである。
【０１０８】bFGF及びEGFを用いたクローンの予備処理 bFGF及びEGFは双方とも、C17.2細胞に対する直接的な分裂促進剤であるが(Kit
chens, D.L.ら、J. Neurobiol 25 (7), 797-807 (1994))、無血清培地(SFM)中で
のどちらかの因子による延長された処理の後は、予期せぬことに、ほとんどのク
ローン系の基底増殖レベルは、SFMのみにおける継代の後にも上昇したままであ
ることが見出された。さらに、無血清培地中で最も多い量の残存増殖率を有する
Nurr1クローン(クローン4及び42)が、共培養物において有意なTH発現を示すこと
は驚くべきことであった。
chens, D.L.ら、J. Neurobiol 25 (7), 797-807 (1994))、無血清培地(SFM)中で
のどちらかの因子による延長された処理の後は、予期せぬことに、ほとんどのク
ローン系の基底増殖レベルは、SFMのみにおける継代の後にも上昇したままであ
ることが見出された。さらに、無血清培地中で最も多い量の残存増殖率を有する
Nurr1クローン(クローン4及び42)が、共培養物において有意なTH発現を示すこと
は驚くべきことであった。
【０１０９】 本発明者らは、他のNurr1クローンの増殖の増加は、THを発現するニューロン
の数を増加させると考えた。Nurr1クローンを、5 DIVの間bFGFで予備処理した後
、分離させ、初代腹側中脳培養物中に再塗布した。妹培養物を、予備処理後の増
殖及び9 DIVの間の共培養後のTH発現の双方についてアッセイした。この方法は
、Nurr1クローンに対するbFGFの作用の選択的な検討を可能にし、初代細胞に対
するbFGFの分裂促進作用並びに初代ドーパミン作動性ニューロンに対するその間
接的な栄養作用を排除した。
の数を増加させると考えた。Nurr1クローンを、5 DIVの間bFGFで予備処理した後
、分離させ、初代腹側中脳培養物中に再塗布した。妹培養物を、予備処理後の増
殖及び9 DIVの間の共培養後のTH発現の双方についてアッセイした。この方法は
、Nurr1クローンに対するbFGFの作用の選択的な検討を可能にし、初代細胞に対
するbFGFの分裂促進作用並びに初代ドーパミン作動性ニューロンに対するその間
接的な栄養作用を排除した。
【０１１０】 bFGFで予備処理したNurr1クローンのBrdU標識は、血清含有培地から直接分離
した細胞と比較して、共培養物における細胞の継代後24時間で増加した(X軸に対
する個々のクローンの右方向へのシフト、図2B)。この増殖の増加に付随して、T
H陽性細胞の割合の比例的増加が全てのNurr1クローンにおいて観察され(Y軸に対
するクローンの上向きのシフト、図2B)、TH+は45％に達した(クローン42)。実際
、回帰分析により、共培養の開始時点でのNurr1過剰発現クローンの増殖能力と
、9 DIV後の個々のクローン内、並びにそのクローン間の分化後にTHを発現する
性質との間には、有意な直線関係(回帰によるr2=0.890)が示される。
した細胞と比較して、共培養物における細胞の継代後24時間で増加した(X軸に対
する個々のクローンの右方向へのシフト、図2B)。この増殖の増加に付随して、T
H陽性細胞の割合の比例的増加が全てのNurr1クローンにおいて観察され(Y軸に対
するクローンの上向きのシフト、図2B)、TH+は45％に達した(クローン42)。実際
、回帰分析により、共培養の開始時点でのNurr1過剰発現クローンの増殖能力と
、9 DIV後の個々のクローン内、並びにそのクローン間の分化後にTHを発現する
性質との間には、有意な直線関係(回帰によるr2=0.890)が示される。
【０１１１】 従って、上記の結果は、Nurr1過剰発現クローンは、好ましくは、初代VM細胞
に接触させたとき、又は初代VM細胞によって供給されるか、もしくはそれから誘
導される1種以上の因子に接触させたとき、有糸分裂すべきであること、すなわ
ち、Nurr1クローンにおけるドーパミン作動性の運命への分化に対する重要な影
響は、それらの増殖能力であることを示唆している。
に接触させたとき、又は初代VM細胞によって供給されるか、もしくはそれから誘
導される1種以上の因子に接触させたとき、有糸分裂すべきであること、すなわ
ち、Nurr1クローンにおけるドーパミン作動性の運命への分化に対する重要な影
響は、それらの増殖能力であることを示唆している。
【０１１２】 これは、大部分のTH発現c42細胞が共培養物中に出現し始める時点(6 DIV)で、
それらの細胞のほとんど全てが依然として有糸分裂する(6 DIVでの激しいパルス
印加後にBrdU陽性である)という観察結果によってさらに支持される。しかし、9
DIVで共培養物の同様に処理した後は、大部分のTH+細胞がBrdU陰性であり、こ
のことは、測定可能なTH発現誘導後の細胞周期からの脱離を示唆している。
それらの細胞のほとんど全てが依然として有糸分裂する(6 DIVでの激しいパルス
印加後にBrdU陽性である)という観察結果によってさらに支持される。しかし、9
DIVで共培養物の同様に処理した後は、大部分のTH+細胞がBrdU陰性であり、こ
のことは、測定可能なTH発現誘導後の細胞周期からの脱離を示唆している。
【０１１３】 大脳皮質(McConnell, S.K.ら、Science 254, 282-285 (1991))及び脊髄(Erics
on, J.ら、Cell 87, 661-673 (1996))の発生中の表現型の運命の獲得を試験する
以前の研究により、空間的に制限された局所因子に対する未分化神経芽細胞の曝
露は、これらの集団内に特定の表現型を誘導するが、この誘導は、神経芽細胞の
S期終末まで連続的に曝露することを条件とすることが示された。同様の機構が
、本発明の観察の基礎をなしているかもしれない。
on, J.ら、Cell 87, 661-673 (1996))の発生中の表現型の運命の獲得を試験する
以前の研究により、空間的に制限された局所因子に対する未分化神経芽細胞の曝
露は、これらの集団内に特定の表現型を誘導するが、この誘導は、神経芽細胞の
S期終末まで連続的に曝露することを条件とすることが示された。同様の機構が
、本発明の観察の基礎をなしているかもしれない。
【０１１４】初代腹側中脳細胞から得られる誘導シグナルの分析 典型的には、初代腹側中脳培養物は、ドーパミン作動性ニューロン及びその他
のニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、並びにミクログリア、
内皮細胞、及び線維芽細胞などの多彩な非神経要素の混合物を含む。TH促進活性
の起源を同定するために、本発明者らは、接着に基づく初代細胞の粗い分離を行
った：急速に接着する集団は、グリア及び非神経要素に富んでいたが、非接着集
団は、主にニューロン、オリゴデンドロサイト前駆体、及び少量のアストロサイ
トからなっていた。
のニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、並びにミクログリア、
内皮細胞、及び線維芽細胞などの多彩な非神経要素の混合物を含む。TH促進活性
の起源を同定するために、本発明者らは、接着に基づく初代細胞の粗い分離を行
った：急速に接着する集団は、グリア及び非神経要素に富んでいたが、非接着集
団は、主にニューロン、オリゴデンドロサイト前駆体、及び少量のアストロサイ
トからなっていた。
【０１１５】 これらの画分とc42との共培養により、TH誘導活性の大部分はE16腹側中脳細胞
の急速に接着する集団に含まれることが示された(図3)。次いで、本発明者らは
、E16腹側中脳由来のタイプ１アストロサイトの精製培養物を調製し、T1AがTH誘
導活性の起源であることを証明した：任意の添加因子の非存在下では、Nurr1-c4
2系から誘導されるドーパミン作動性細胞の数は劇的に増加した。さらに、この
活性は、発生初期に限定されておらず、新生ラットのVMから単離されたアストロ
サイトは等価数のTH陽性c42細胞を誘導した(約70％)(図3)。
の急速に接着する集団に含まれることが示された(図3)。次いで、本発明者らは
、E16腹側中脳由来のタイプ１アストロサイトの精製培養物を調製し、T1AがTH誘
導活性の起源であることを証明した：任意の添加因子の非存在下では、Nurr1-c4
2系から誘導されるドーパミン作動性細胞の数は劇的に増加した。さらに、この
活性は、発生初期に限定されておらず、新生ラットのVMから単離されたアストロ
サイトは等価数のTH陽性c42細胞を誘導した(約70％)(図3)。
【０１１６】 Nurr1-C17.2-c42細胞を、タイプ1アストロサイトならし培地又は膜断片で、そ
れぞれ処理した。しかし、これらの処理のいずれも、TH発現細胞数の有意な増加
を誘導しなかった。このことは、この誘導活性が極めて不安定であることを示し
ている。本発明者らは、アストロサイトとNurr1-C17.2-c42細胞とを共培養した
が、微小多孔性インサート(0.4μmの多孔性膜)を介してこの2つの集団を空間的
に分離した(約1 mm)。このインサートは、巨大分子を自由に通過させたが、2つ
の集団の間の接触を防止した。この環境下では、Nurr1-C17.2-c42細胞において
、直接共培養と等しいレベルで、TH発現が誘導された(図3)。これらの結果は、
腹側中脳のタイプ１アストロサイトが、Nurr1過剰発現系と相互作用してTH発現
を誘導する極めて不安定な拡散性因子を分泌するという示唆を与える。
れぞれ処理した。しかし、これらの処理のいずれも、TH発現細胞数の有意な増加
を誘導しなかった。このことは、この誘導活性が極めて不安定であることを示し
ている。本発明者らは、アストロサイトとNurr1-C17.2-c42細胞とを共培養した
が、微小多孔性インサート(0.4μmの多孔性膜)を介してこの2つの集団を空間的
に分離した(約1 mm)。このインサートは、巨大分子を自由に通過させたが、2つ
の集団の間の接触を防止した。この環境下では、Nurr1-C17.2-c42細胞において
、直接共培養と等しいレベルで、TH発現が誘導された(図3)。これらの結果は、
腹側中脳のタイプ１アストロサイトが、Nurr1過剰発現系と相互作用してTH発現
を誘導する極めて不安定な拡散性因子を分泌するという示唆を与える。
【０１１７】他の脳領域に由来するT1Aの誘導活性 次いで、本発明者らは、この誘導活性が腹側中脳に由来するタイプ１アストロ
サイトに限定されているか否かを試験した。発生中のNurr1発現細胞の集団を含
むいくつかの脳領域からT1Aを単離した(Zetterstrom, R.H.ら、Mol. Brain Res.
41, 111-120 (1996))。c42においては、大脳皮質、海馬、又は脊髄などの他の
脳領域に由来するT1Aと共培養した場合、親C17.2細胞と比較して、TH免疫反応細
胞数の増加は観察されなかった(図3)。このことは、推定されるTH誘導因子は、
腹側中脳のタイプ１アストロサイトによって特異的かつ選択的に産生されること
を示唆している。
サイトに限定されているか否かを試験した。発生中のNurr1発現細胞の集団を含
むいくつかの脳領域からT1Aを単離した(Zetterstrom, R.H.ら、Mol. Brain Res.
41, 111-120 (1996))。c42においては、大脳皮質、海馬、又は脊髄などの他の
脳領域に由来するT1Aと共培養した場合、親C17.2細胞と比較して、TH免疫反応細
胞数の増加は観察されなかった(図3)。このことは、推定されるTH誘導因子は、
腹側中脳のタイプ１アストロサイトによって特異的かつ選択的に産生されること
を示唆している。
【０１１８】 しかし、c42細胞は、これらの領域に由来するアストロサイトによっては影響
されなかった。この系の細胞は、各領域に独特な異なるニューロン様の形態に発
生した。しかし、同じ条件下で、C17.2親細胞系は、多角形、双極性、及び三極
性の形態の均一な混合物を示す傾向があった。全体として、これらのデータは、
異なる脳領域に由来するアストロサイトは、Nurr1発現細胞と相互作用して、特
定の、そしておそらく領域的に適当なニューロンの表現型をもたらす独特な因子
、または独特な組合せの因子を分泌することを示唆している。これは、共培養物
中に産生されるニューロンの表現型を同定することにより確認される。NPY、P物
質、Ach、及びIslet 1などの特異的なニューロンのマーカーを用いる。基底レベ
ルを超えるNurr1を発現するC17.2細胞を、初期胚の段階で大脳−脳室内に移植し
て、それらの組込みを可能にすることにより、さらなる支持が得られる。これら
の細胞を起源とするニューロンの表現型を、lacZ発現及び特異的なニューロンの
マーカーに対する免疫組織化学により判定する。
されなかった。この系の細胞は、各領域に独特な異なるニューロン様の形態に発
生した。しかし、同じ条件下で、C17.2親細胞系は、多角形、双極性、及び三極
性の形態の均一な混合物を示す傾向があった。全体として、これらのデータは、
異なる脳領域に由来するアストロサイトは、Nurr1発現細胞と相互作用して、特
定の、そしておそらく領域的に適当なニューロンの表現型をもたらす独特な因子
、または独特な組合せの因子を分泌することを示唆している。これは、共培養物
中に産生されるニューロンの表現型を同定することにより確認される。NPY、P物
質、Ach、及びIslet 1などの特異的なニューロンのマーカーを用いる。基底レベ
ルを超えるNurr1を発現するC17.2細胞を、初期胚の段階で大脳−脳室内に移植し
て、それらの組込みを可能にすることにより、さらなる支持が得られる。これら
の細胞を起源とするニューロンの表現型を、lacZ発現及び特異的なニューロンの
マーカーに対する免疫組織化学により判定する。
【０１１９】ドーパミン作動性の誘導の機構 本発明者らは、トランスフェクション直後のC17.2細胞におけるNurr1活性と、
確立されたC17.2-Nurr1クローンにおけるNurr1活性とを比較した。本発明者らは
、有意なNurr1トランス活性化活性が、C17.2細胞へのNurr1発現ベクターとNurr1
応答性NBRE-ルシフェラーゼリポーターとの同時トランスフェクション後36時間
で検出されることを見出した。安定に増殖するC17.2-Nurr1クローン(血清中で増
殖させたもの)中への該リポーターのトランスフェクション後には、基底Nurr1ト
ランス活性化活性の有意な上昇は認められず(図5)、また、無血清培地中で継代
した後に得られた分化したクローン中へのトランスフェクション後にも認められ
なかった。
確立されたC17.2-Nurr1クローンにおけるNurr1活性とを比較した。本発明者らは
、有意なNurr1トランス活性化活性が、C17.2細胞へのNurr1発現ベクターとNurr1
応答性NBRE-ルシフェラーゼリポーターとの同時トランスフェクション後36時間
で検出されることを見出した。安定に増殖するC17.2-Nurr1クローン(血清中で増
殖させたもの)中への該リポーターのトランスフェクション後には、基底Nurr1ト
ランス活性化活性の有意な上昇は認められず(図5)、また、無血清培地中で継代
した後に得られた分化したクローン中へのトランスフェクション後にも認められ
なかった。
【０１２０】 これらのデータは、Nurr1が、安定なC17.2-Nurr1クローンの神経分化において
は活性を有さないことを示唆しており、また、初期の一過性の高レベルのNurr1
活性が、Nurr1クローンに、ドーパミン作動性になる長期にわたる反応能(compet
ence)を付与することを示唆している。
は活性を有さないことを示唆しており、また、初期の一過性の高レベルのNurr1
活性が、Nurr1クローンに、ドーパミン作動性になる長期にわたる反応能(compet
ence)を付与することを示唆している。
【０１２１】Nurr1クローンにおける遺伝子発現の変化 本発明者らは、Nurr1クローンにおける遺伝子発現の変化について試験した。
モッククローン及びNurr1クローンにおけるGFRα1及びGFRα2のmRNAレベルを、R
Nase保護アッセイを用いて試験した(GDNFファミリー受容体α1；GDNFとはグリア
細胞系由来神経栄養因子を指す)。試験したC17.2クローン及び全てのモッククロ
ーンは、高レベルのGFRα1 mRNA及び極めて低レベルの関連受容体GFRα2を発現
した。対照的に、全てのNurr1クローンは、逆のプロフィールを示した(すなわち
、極めて低いGFRα1及び極めて高いGFRα2 mRNAレベル)。このことは、C17.2細
胞においては、Nurr1はTH+表現型を直接的には誘導せず、むしろ関連タンパク質
の安定なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションをもたらすことに
よって間接的に働くことを示唆している。このように、Nurr1は、多分化能細胞
に、腹側中脳のアストロサイトから誘導される因子を含む特定の因子に応答する
反応能を付与し得る。
モッククローン及びNurr1クローンにおけるGFRα1及びGFRα2のmRNAレベルを、R
Nase保護アッセイを用いて試験した(GDNFファミリー受容体α1；GDNFとはグリア
細胞系由来神経栄養因子を指す)。試験したC17.2クローン及び全てのモッククロ
ーンは、高レベルのGFRα1 mRNA及び極めて低レベルの関連受容体GFRα2を発現
した。対照的に、全てのNurr1クローンは、逆のプロフィールを示した(すなわち
、極めて低いGFRα1及び極めて高いGFRα2 mRNAレベル)。このことは、C17.2細
胞においては、Nurr1はTH+表現型を直接的には誘導せず、むしろ関連タンパク質
の安定なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションをもたらすことに
よって間接的に働くことを示唆している。このように、Nurr1は、多分化能細胞
に、腹側中脳のアストロサイトから誘導される因子を含む特定の因子に応答する
反応能を付与し得る。
【０１２２】 遺伝子発現のパターンに対するNurr1活性の影響を、中脳のニューロン及び腹
側の表現型の特殊化にとって重要な遺伝子(例えば、Shh、Patch、Smo、Gli遺伝
子、Hes、FGF8、Ptx3、Pax遺伝子、Engrailed 1及び2)並びに神経発生及び分化
にとって重要な遺伝子(例えば、Noggin、Chordin、Follistatin、Mash1、Math1
、NeuroD、Neurogenin1-3、Notch1-3、Delta、Serrate及びMyt1)の発現を分析す
ることにより、さらに調べた。
側の表現型の特殊化にとって重要な遺伝子(例えば、Shh、Patch、Smo、Gli遺伝
子、Hes、FGF8、Ptx3、Pax遺伝子、Engrailed 1及び2)並びに神経発生及び分化
にとって重要な遺伝子(例えば、Noggin、Chordin、Follistatin、Mash1、Math1
、NeuroD、Neurogenin1-3、Notch1-3、Delta、Serrate及びMyt1)の発現を分析す
ることにより、さらに調べた。
【０１２３】ドーパミン作動性の表現型 TH発現の上昇は、Nurr1-C17.2-c42系内の正規のドーパミン作動性の表現型の
獲得を示した。慣例によると、膜の脱分極に応答してドーパミンを放出する能力
は、神経化学的表現型をドーパミン作動性であると指定する際の重要な規準であ
る。親系又はc42系と、VMアストロサイトとの共培養物を、50 mM KClで短時間処
理し、HPLCを用いて、モノアミン含量について上清をアッセイした。有意なドー
パミンとその代謝物であるDOPACの放出が、c42を含む共培養物において検出され
た。またこの際、ドーパミン作動性の分化を増強する因子（例えば、SR11237及
びbFGF）で処理した共培養物において放出の上昇が検出され、これにより、ドー
パミンの放出とTH発現細胞数とが相関付けられた(図4)。親系においては、ドー
パミン放出は観察されなかった。従って、THを発現するNurr1-C17.2-c42細胞は
、真にドーパミン作動性であると考えられる。
獲得を示した。慣例によると、膜の脱分極に応答してドーパミンを放出する能力
は、神経化学的表現型をドーパミン作動性であると指定する際の重要な規準であ
る。親系又はc42系と、VMアストロサイトとの共培養物を、50 mM KClで短時間処
理し、HPLCを用いて、モノアミン含量について上清をアッセイした。有意なドー
パミンとその代謝物であるDOPACの放出が、c42を含む共培養物において検出され
た。またこの際、ドーパミン作動性の分化を増強する因子（例えば、SR11237及
びbFGF）で処理した共培養物において放出の上昇が検出され、これにより、ドー
パミンの放出とTH発現細胞数とが相関付けられた(図4)。親系においては、ドー
パミン放出は観察されなかった。従って、THを発現するNurr1-C17.2-c42細胞は
、真にドーパミン作動性であると考えられる。
【０１２４】 THを発現するNurr1-C17.2-c42細胞系は、腹側中脳のドーパミン作動性型のも
のであった。共培養物中のNurr1-C17.2-c42細胞は、腹側中脳内のドーパミン作
動性前駆細胞の発生中に選択的に発現される酵素(McCaffery, P.ら、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 91, 7772-7776 (1994))であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ−
2 (AHD-2;図4)に対する免疫反応性を獲得した。また、これらの細胞は、ドーパ
ミン作動性ニューロン中に存在するGDNFに対するシグナリング受容体(Trupp, M.
ら、Nature 381, 785-789 (1996); Jing, S.Q.ら、Cell 85, 1113-1124 (1996))
であるc-ret mRNAをも発現した(Trupp, M.ら、Nature 381, 785-789 (1996))。
さらに、TH陽性c42細胞は、in vitroでドーパミン作動性前駆細胞(Studer, L.ら
、Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998))及び初代腹側中脳のドーパミン作動性
ニューロン(Hyman, C.ら、J. Neurosci. 14, 335-347 (1994); Lin, L.H.ら、Sc
ience 260, 1130-1173 (1993))に対する公知の神経栄養作用を有する因子に対し
て同様の応答を示した(図4)。先ず、共培養物をSR11237及びbFGFで処理してドー
パミン作動性の表現型を誘導し、その後、培地を、様々な増殖因子を含むか又は
含まないN2に交換した。9 DIVで、bFGF及びニューロトロフィン−3(NT-3 30 ng/
ml)は、N2対照条件と比較して、培養物中のTH+細胞数を劇的に増加させた；脳由
来神経栄養因子(BDNF, 30 ng/ml)、毛様体神経栄養因子(CNTF, 10 ng/ml)及びグ
リア細胞系由来神経栄養因子(GDNF, 10 ng/ml)は、Nurr1-c42由来ドーパミン作
動性ニューロンに対する神経栄養発生(neuritogenesis)及び／又は過栄養を誘導
した。従って、THを発現するc42細胞の挙動は、黒質の内因性ニューロンの挙動
と一致しているので、これらの細胞は腹側中脳様ドーパミン作動性ニューロンで
ある。
のであった。共培養物中のNurr1-C17.2-c42細胞は、腹側中脳内のドーパミン作
動性前駆細胞の発生中に選択的に発現される酵素(McCaffery, P.ら、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 91, 7772-7776 (1994))であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ−
2 (AHD-2;図4)に対する免疫反応性を獲得した。また、これらの細胞は、ドーパ
ミン作動性ニューロン中に存在するGDNFに対するシグナリング受容体(Trupp, M.
ら、Nature 381, 785-789 (1996); Jing, S.Q.ら、Cell 85, 1113-1124 (1996))
であるc-ret mRNAをも発現した(Trupp, M.ら、Nature 381, 785-789 (1996))。
さらに、TH陽性c42細胞は、in vitroでドーパミン作動性前駆細胞(Studer, L.ら
、Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998))及び初代腹側中脳のドーパミン作動性
ニューロン(Hyman, C.ら、J. Neurosci. 14, 335-347 (1994); Lin, L.H.ら、Sc
ience 260, 1130-1173 (1993))に対する公知の神経栄養作用を有する因子に対し
て同様の応答を示した(図4)。先ず、共培養物をSR11237及びbFGFで処理してドー
パミン作動性の表現型を誘導し、その後、培地を、様々な増殖因子を含むか又は
含まないN2に交換した。9 DIVで、bFGF及びニューロトロフィン−3(NT-3 30 ng/
ml)は、N2対照条件と比較して、培養物中のTH+細胞数を劇的に増加させた；脳由
来神経栄養因子(BDNF, 30 ng/ml)、毛様体神経栄養因子(CNTF, 10 ng/ml)及びグ
リア細胞系由来神経栄養因子(GDNF, 10 ng/ml)は、Nurr1-c42由来ドーパミン作
動性ニューロンに対する神経栄養発生(neuritogenesis)及び／又は過栄養を誘導
した。従って、THを発現するc42細胞の挙動は、黒質の内因性ニューロンの挙動
と一致しているので、これらの細胞は腹側中脳様ドーパミン作動性ニューロンで
ある。
【０１２５】誘導されたドーパミン作動性ニューロンの安定性 本発明者らは、in vitro及びin vivoにおける、特に、アストロサイト由来誘
導因子除去後の誘導されたドーパミン作動性の表現型の長期安定性を評価した。
c42細胞を、VMのタイプ1アストロサイトを有するインサート中で8日間共培養し
、インサートから取り出し、さらに14日間、追加の因子を含まない規定のN2培地
中に再びまいて培養した。共培養物から取り出して2週間後、いくらかの細胞磨
耗が観察されたものの、有意な数の細胞が、長い複雑なプロセス、過栄養細胞体
及び高いレベルのTH免疫反応性などの高度に成熟したドーパミン作動性の表現型
を示した。
導因子除去後の誘導されたドーパミン作動性の表現型の長期安定性を評価した。
c42細胞を、VMのタイプ1アストロサイトを有するインサート中で8日間共培養し
、インサートから取り出し、さらに14日間、追加の因子を含まない規定のN2培地
中に再びまいて培養した。共培養物から取り出して2週間後、いくらかの細胞磨
耗が観察されたものの、有意な数の細胞が、長い複雑なプロセス、過栄養細胞体
及び高いレベルのTH免疫反応性などの高度に成熟したドーパミン作動性の表現型
を示した。
【０１２６】 また、同様の共培養物から得たc42細胞を、成体マウスの線条体中に外科的に
注入し、追加栄養因子又は支持細胞(すなわち、アストロサイト、オリゴデンド
ロサイト、又は他のニューロン)の非存在下で12日間成熟させた。細胞はこの条
件下で失われたが、少数だが有意な数のc42由来ドーパミン作動性細胞が、高レ
ベルの分化及び宿主組織中への明らかな組込みを示した。c17.2親細胞系から誘
導されたTH+細胞は、長期のin vitro実験においても、in vivo実験においても見
出されなかった。従って、一部のc42細胞は、タイプ1由来因子から取り出した後
もTH発現を維持し、又は増加さえさせたという観察は、ドーパミン作動性の誘導
後、それらの表現型が安定であることを示している。ごく限られた数の生存TH+
細胞しか検出できないため、外因的に適用された栄養因子又は支持細胞が、長期
間の生存にとって必要である。
注入し、追加栄養因子又は支持細胞(すなわち、アストロサイト、オリゴデンド
ロサイト、又は他のニューロン)の非存在下で12日間成熟させた。細胞はこの条
件下で失われたが、少数だが有意な数のc42由来ドーパミン作動性細胞が、高レ
ベルの分化及び宿主組織中への明らかな組込みを示した。c17.2親細胞系から誘
導されたTH+細胞は、長期のin vitro実験においても、in vivo実験においても見
出されなかった。従って、一部のc42細胞は、タイプ1由来因子から取り出した後
もTH発現を維持し、又は増加さえさせたという観察は、ドーパミン作動性の誘導
後、それらの表現型が安定であることを示している。ごく限られた数の生存TH+
細胞しか検出できないため、外因的に適用された栄養因子又は支持細胞が、長期
間の生存にとって必要である。
【０１２７】神経変性疾患の治療 神経変性疾患を治療するc17.2由来ニューロンの能力は、パーキンソン病のin
vivoモデルを用いて確認することができる。偽神経伝達物質である6−ヒドロキ
シドーパミン(6-OHDA)又はMPTPは、ニューロンによって特異的に取り込まれ、酸
化ストレス並びにドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性ニューロンの損
失をもたらす。
vivoモデルを用いて確認することができる。偽神経伝達物質である6−ヒドロキ
シドーパミン(6-OHDA)又はMPTPは、ニューロンによって特異的に取り込まれ、酸
化ストレス並びにドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性ニューロンの損
失をもたらす。
【０１２８】 in vitroでドーパミン作動性ニューロンに分化したNurr1-c17.2細胞を、6-OHD
Aで処理したマウスの黒質又は線条中に外科的に埋め込む。組み込み、完全に分
化するこれらの細胞の能力を、ドーパミン輸送因子及びドーパミン受容体につい
て、β-gal染色、TH免疫組織化学及びin situハイブリダイゼーションにより形
態学的に評価する。
Aで処理したマウスの黒質又は線条中に外科的に埋め込む。組み込み、完全に分
化するこれらの細胞の能力を、ドーパミン輸送因子及びドーパミン受容体につい
て、β-gal染色、TH免疫組織化学及びin situハイブリダイゼーションにより形
態学的に評価する。
【０１２９】 in vivoでドーパミン作動性の表現型に自発的に分化する未分化Nurr1-c17.2細
胞の能力を、そのような細胞の6-OHDAで処理した動物への線条体内又は黒質内の
移植により評価する。ドーパミン作動性の表現型を、上記のように検出する。
胞の能力を、そのような細胞の6-OHDAで処理した動物への線条体内又は黒質内の
移植により評価する。ドーパミン作動性の表現型を、上記のように検出する。
【０１３０】 片側だけの6-OHDA処理により誘導された運動の非対称性を救助する、線条体又
は黒質中に移植されたNurr1-c17.2細胞の能力を、アポモルフィン及びアンフェ
タミン試験における旋回行動の評価により確認する(Schwarting, R.K.ら、(1996
) Progress in Neurobiology, 50(2-3), 275-331)。
は黒質中に移植されたNurr1-c17.2細胞の能力を、アポモルフィン及びアンフェ
タミン試験における旋回行動の評価により確認する(Schwarting, R.K.ら、(1996
) Progress in Neurobiology, 50(2-3), 275-331)。
【０１３１】まとめ 結論として、本明細書に提示された結果は、神経幹細胞又は神経前駆細胞にお
ける基底レベルを超えるNurr1の発現がニューロンの運命を誘導することを証明
するものである。さらに、腹側中脳のタイプ1アストロサイトは、他の脳領域に
由来するものではなく、元々は非ドーパミン作動性の脳領域から得られかつ基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞を誘導する1種以上
の可溶性因子を放出して、腹側中脳のドーパミン作動性ニューロンに発生する。
従って、神経幹細胞又は神経前駆細胞における基底レベルを超えるNurr1の発現
及び該細胞と、腹側中脳のタイプ1アストロサイトによって供給されるか又はそ
れから誘導される1種以上の因子との接触を含むプロセスを介して、該細胞から
ドーパミン作動性ニューロンを作製することができる。さらに、この結果は、初
代アストロサイトが複数の脳構造における領域的に適当なニューロンの表現型の
誘導に必要とされるシグナルの供給源であることを示唆している。
ける基底レベルを超えるNurr1の発現がニューロンの運命を誘導することを証明
するものである。さらに、腹側中脳のタイプ1アストロサイトは、他の脳領域に
由来するものではなく、元々は非ドーパミン作動性の脳領域から得られかつ基底
レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞を誘導する1種以上
の可溶性因子を放出して、腹側中脳のドーパミン作動性ニューロンに発生する。
従って、神経幹細胞又は神経前駆細胞における基底レベルを超えるNurr1の発現
及び該細胞と、腹側中脳のタイプ1アストロサイトによって供給されるか又はそ
れから誘導される1種以上の因子との接触を含むプロセスを介して、該細胞から
ドーパミン作動性ニューロンを作製することができる。さらに、この結果は、初
代アストロサイトが複数の脳構造における領域的に適当なニューロンの表現型の
誘導に必要とされるシグナルの供給源であることを示唆している。
【０１３２】 本明細書に記載される方法は、神経幹細胞又は神経前駆細胞の多能性、Nurr1
などのセレクター遺伝子、及び初代アストロサイトを利用するものであり、神経
変性疾患の治療における神経移植のための供給材料としての所望の神経化学的表
現型を有するニューロンの作製を提供する。中脳のドーパミン作動性ニューロン
の誘導を、パーキンソン病を治療するための細胞置換戦略において用いることが
できる。
などのセレクター遺伝子、及び初代アストロサイトを利用するものであり、神経
変性疾患の治療における神経移植のための供給材料としての所望の神経化学的表
現型を有するニューロンの作製を提供する。中脳のドーパミン作動性ニューロン
の誘導を、パーキンソン病を治療するための細胞置換戦略において用いることが
できる。
【図１】 図1は、Nurr1-C17.2クローンの特性評価を示す。 図1Aは、親-、Nurr1-、及びモック-C17.2対照クローンの残存増殖率を示す。%
BrdU+は、無血清培地における6時間のパルス後にBrdUを取り込んだ細胞の割合を
示す。 図1Bは、無血清培地においてNurr1の発現がニューロンの運命を有意に増加さ
せることを示す。%TuJ1+/%BrdU-は、β-チューブリンIIIを発現したが、BrdUを
取り込まなかった細胞の割合を示す。 図1Cは、該クローンのうちの2つと、E16腹側中脳の細胞との共培養は、ドーパ
ミン作動性の運命を有意に増加させることを示す。%TH+は、チロシンヒドロキシ
ラーゼ陽性C17.2細胞の割合を示す。
BrdU+は、無血清培地における6時間のパルス後にBrdUを取り込んだ細胞の割合を
示す。 図1Bは、無血清培地においてNurr1の発現がニューロンの運命を有意に増加さ
せることを示す。%TuJ1+/%BrdU-は、β-チューブリンIIIを発現したが、BrdUを
取り込まなかった細胞の割合を示す。 図1Cは、該クローンのうちの2つと、E16腹側中脳の細胞との共培養は、ドーパ
ミン作動性の運命を有意に増加させることを示す。%TH+は、チロシンヒドロキシ
ラーゼ陽性C17.2細胞の割合を示す。
【図２】 図2は、腹側中脳共培養物におけるNurr1を過剰発現する神経幹細胞系又は神経
前駆細胞系からのドーパミン作動性ニューロンの誘導における、レチノイド、bF
GF、及び増殖の役割を示す。 図2Aは、ドーパミン作動性の誘導に対するSR11237、bFGF、及びEGFの効果を示
す。%TH+は、チロシンヒドロキシラーゼを発現する共培養物におけるC17.2細胞
の割合を示す。(C): E16 VM細胞と、親C17.2細胞又はNurr1-C17.2-クローン42細
胞との共培養物、(SR): SR11237を加えた共培養物、(F): bFGFを加えた共培養物
、(αF): bFGFに対するブロッキング抗体を加えた共培養物、(E): EGFを加えた
共培養物。 図2Bは、増殖とドーパミン作動性の誘導との間の関連を示す。%TH+は、チロシ
ンヒドロキシラーゼを発現する9 DIVの共培養後のC17.2細胞の割合を示す。%Brd
U+は、BrdUを取り込んだこれらの細胞の割合を示す。
前駆細胞系からのドーパミン作動性ニューロンの誘導における、レチノイド、bF
GF、及び増殖の役割を示す。 図2Aは、ドーパミン作動性の誘導に対するSR11237、bFGF、及びEGFの効果を示
す。%TH+は、チロシンヒドロキシラーゼを発現する共培養物におけるC17.2細胞
の割合を示す。(C): E16 VM細胞と、親C17.2細胞又はNurr1-C17.2-クローン42細
胞との共培養物、(SR): SR11237を加えた共培養物、(F): bFGFを加えた共培養物
、(αF): bFGFに対するブロッキング抗体を加えた共培養物、(E): EGFを加えた
共培養物。 図2Bは、増殖とドーパミン作動性の誘導との間の関連を示す。%TH+は、チロシ
ンヒドロキシラーゼを発現する9 DIVの共培養後のC17.2細胞の割合を示す。%Brd
U+は、BrdUを取り込んだこれらの細胞の割合を示す。
【図３】 図3は、VMタイプ１アストロサイトがNurr1を過剰発現する神経幹細胞系(Nurr1
-C17.2-クローン42)においてドーパミン作動性の表現型を誘導することを示す。
%TH+は、チロシンヒドロキシラーゼを発現するクローン42細胞の割合を示す。(E
16 VM): クローン42とE16腹側中脳細胞との共培養物、(Tot): 全初代細胞との共
培養物、(Ad+): 接着細胞画分との共培養物、(Ad-): 非接着細胞画分との共培養
物、(T1A): タイプ１アストロサイトとの共培養物、(P1 T1A): 腹側中脳に由来
する生後1日のタイプ１アストロサイトとの共培養物、(インサート): インサー
トは共培養物においてP1 T1A細胞からクローン42細胞を分離する、(CTX): 皮質
との共培養物、(HC): 海馬との共培養物、(SC): 脊髄との共培養物。
-C17.2-クローン42)においてドーパミン作動性の表現型を誘導することを示す。
%TH+は、チロシンヒドロキシラーゼを発現するクローン42細胞の割合を示す。(E
16 VM): クローン42とE16腹側中脳細胞との共培養物、(Tot): 全初代細胞との共
培養物、(Ad+): 接着細胞画分との共培養物、(Ad-): 非接着細胞画分との共培養
物、(T1A): タイプ１アストロサイトとの共培養物、(P1 T1A): 腹側中脳に由来
する生後1日のタイプ１アストロサイトとの共培養物、(インサート): インサー
トは共培養物においてP1 T1A細胞からクローン42細胞を分離する、(CTX): 皮質
との共培養物、(HC): 海馬との共培養物、(SC): 脊髄との共培養物。
【図４】 図4は、腹側中脳のタイプ１アストロサイト(T1A)と、KCl脱分極Nurr1-C17.2-
クローン42(c42)細胞又はKCl脱分極親C17.2(C17-2)細胞との共培養物から回収さ
れた上清のHPLC分析を示す。(+SR+bFGF): bFGF及びSR11237を加えた共培養物。
クローン42(c42)細胞又はKCl脱分極親C17.2(C17-2)細胞との共培養物から回収さ
れた上清のHPLC分析を示す。(+SR+bFGF): bFGF及びSR11237を加えた共培養物。
【図５】 図5は、Nurr1の初期活性がC17.2細胞における遺伝子発現の長期的な変化をも
たらすことを示す。相対発光ユニット(RLU)は、Nurr1により活性化されたNBRE-
ルシフェラーゼリポーターからのルシフェラーゼの発現を示す。
たらすことを示す。相対発光ユニット(RLU)は、Nurr1により活性化されたNBRE-
ルシフェラーゼリポーターからのルシフェラーゼの発現を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年６月１５日（２００１．６．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パールマン，トーマス スウェーデン国 エス−171 77 ストッ クホルム ピィー．オー．ボックス 240， カロリンスカ インスティテュート，スト ックホルム ブランチ，ザ ルドウィグ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ (72)発明者 スニダー，エヴァン，ワイ． アメリカ合衆国 02115 マサチューセッ ツ州 ボストン，ロングウッド アヴェニ ュー 320，チルドレン’ズ ホスピタル， ニューロサイエンス，ハーヴァード メデ ィカル スクール アンド デヴィジョン オブ，デパートメンツ オブ ニューロ ロジー アンド ペディエイトリクス (72)発明者 ワグナー，ヨセフ スウエーデン国 エス−171 77 ストッ クホルム カロリンスカ インスティテュ ート，デパートメント オブ メディカル バイオケミストリー アンド バイオフ ィシクス，ラボラトリー オブ モレキュ ラー ニューロバイオロジー (72)発明者 アケルド，ペーター スウェーデン国 エス−171 77 ストッ クホルム カロリンスカ インスティテュ ート，デパートメント オブ メディカル バイオケミストリー アンド バイオフ ィシクス，ラボラトリー オブ モレキュ ラー ニューロバイオロジー Ｆターム(参考） 2G045 BB20 CB01 4B063 QA01 QQ01 QQ08 QQ20 QR48 QR77 QS36 QX01 QX02 4B065 AA93X BA24 BD39 BD50 CA44 4C084 AA17 MA67 NA14 ZA152 ZA162 4C087 AA01 AA02 BB33 BB45 CA04 MA67 NA14 ZA15 ZA16
Claims (59)
- 【請求項１】 神経幹細胞又は神経前駆細胞においてニューロンの運命を誘
導する方法であって、該細胞内で基底レベルを超えるNurr1を発現させることを
含む前記方法。 - 【請求項２】 前記細胞とFGF8とを接触させることを含む、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 Nurr1を用いて神経幹細胞又は神経前駆細胞を形質転換する
ことを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記細胞と、タイプ1アストロサイトによって供給されるか
、又はそれから誘導される1種以上の因子とを接触させることをさらに含む、請
求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 神経幹細胞又は神経前駆細胞をタイプ1アストロサイトと共
培養することを含む、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 タイプ1アストロサイトが不死化されたものであるか、又は
アストロサイト細胞系のものである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 タイプ1アストロサイトが腹側中脳のものである、請求項５
又は６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記細胞においてドーパミン作動性の運命を誘導する、請求
項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記細胞が、前記1種以上の因子に接触するときに有糸分裂
する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖
因子(EGF)、レチノイドX受容体(RXR)の活性化因子、及び9−シスレチノールから
なる群より選択される１種以上の薬剤にさらに接触させる、請求項４〜９のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記細胞を、FGFファミリーの増殖因子のメンバーにさら
に接触させる、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記細胞を、bFGF又はEGF、及びSR11237に接触させる、請
求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 神経幹細胞又は神経前駆細胞を、bFGF及び／又はEGFで予
備処理した後、該細胞と、タイプ１アストロサイトによって供給されるか、又は
それから誘導される１種以上の因子とを接触させる、請求項４〜１０のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記方法によって作製されたニューロンを、１種以上の追
加成分を含む組成物中に製剤化することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記組成物が製薬上許容し得る賦形剤を含む、請求項１４
に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記組成物を個体に投与することをさらに含む、請求項１
５に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記個体の脳に前記ニューロンを埋め込む、請求項１６に
記載の方法。 - 【請求項１８】 前記個体がパーキンソン病を有する、請求項１７に記載の
方法。 - 【請求項１９】 個体の治療のための医薬の製造において、前記方法に従っ
て作製されたニューロンを使用することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記医薬が、前記個体の脳に埋め込むためのものである、
請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記個体がパーキンソン病を有する、請求項２０に記載の
方法。 - 【請求項２２】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法に従って作製
されたニューロン。 - 【請求項２３】 請求項２２に記載のニューロンを含む組成物。
- 【請求項２４】 １種以上の追加成分を含む、請求項２３に記載の組成物。
- 【請求項２５】 神経変性疾患の治療に使用するための薬剤のスクリーニン
グ方法における請求項２２に記載のニューロンの使用。 - 【請求項２６】 以下の工程： (i) ニューロンを、該ニューロンにとっての毒素で処理すること、 (ii) 該毒素から該ニューロンを分離すること、 (iii) 処理されたニューロンと、１種以上の試験薬剤とを接触させること、 (iv) 該毒素から回復する該ニューロンの能力を判定すること、 (v) 該毒素から回復する該ニューロンの能力と、該試験薬剤との接触の非存在下
で該毒素から回復するニューロンの能力とを比較すること、 をさらに含む、請求項２５に記載の使用、又は請求項１〜１３のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項２７】 以下の工程： (i) １種以上の試験薬剤の存在下で、ニューロンにとっての毒素で該ニューロン
を処理すること、 (ii) 該毒素に耐える該ニューロンの能力を判定すること、 (iii) 該毒素に耐える該ニューロンの能力と、該試験薬剤との接触の非存在下で
該毒素に耐えるニューロンの能力とを比較すること、 をさらに含む、請求項２５に記載の使用、又は請求項１〜１３のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項２８】 前記毒素から回復するか、又はそれに耐えるニューロンの
能力を改善する薬剤を、１種以上の追加成分を含む組成物中に製剤化することを
さらに含む、請求項２６又は２７に記載の使用、又は方法。 - 【請求項２９】 前記組成物が製薬上許容し得る賦形剤を含む、請求項２８
に記載の使用、又は方法。 - 【請求項３０】 前記組成物を個体に投与することをさらに含む、請求項２
９に記載の使用、又は方法。 - 【請求項３１】 前記個体がパーキンソン病を有する、請求項３０に記載の
使用、又は方法。 - 【請求項３２】 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経
前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を、単独又は組合せで、誘導する因子
のスクリーニング方法であって、 (a) 試験物質と、基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆
細胞とを接触させること、ただし、該接触は試験物質と神経幹細胞又は神経前駆
細胞との間の相互作用をもたらすこと、 (b) 試験物質と神経幹細胞又は神経前駆細胞との間の相互作用を測定すること、
を含む前記方法。 - 【請求項３３】 前記細胞とタイプ１アストロサイトの分子とを接触させる
ことを含む、請求項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 腹側中脳のタイプ１アストロサイトの分子と、基底レベル
を超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞においてドーパミン作動
性の運命を誘導することができない神経系細胞の分子とを比較することを含む、
請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経
前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を、単独又は組合せで、誘導する因子
をスクリーニングする方法であって、１種以上の試験物質の存在下で、基底レベ
ルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞を培養し、ドーパミン
作動性の表現型への分化について該細胞を分析することを含む前記方法。 - 【請求項３６】 前記細胞を、タイプ１アストロサイトと共に培養すること
を含む、請求項３４に記載の方法。 - 【請求項３７】 腹側中脳のタイプ１アストロサイトと、基底レベルを超え
るNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞においてドーパミン作動性の運
命を誘導することができない神経系細胞とを比較することを含む、請求項３６に
記載の方法。 - 【請求項３８】 差示的発現スクリーニングを含む、請求項３７に記載の方
法。 - 【請求項３９】 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経
前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を誘導することができる因子を、単離
された、及び／又は精製された形態で提供する、請求項３２〜３８のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項４０】 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経
前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を誘導することができる因子を、１種
以上の追加成分を含む組成物中に製剤化する、請求項３２〜３９のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項４１】 前記組成物が基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹
細胞又は神経前駆細胞を含む、請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 前記組成物が製薬上許容し得る賦形剤を含む、請求項４０
又は４１に記載の方法。 - 【請求項４３】 前記組成物を個体に投与することをさらに含む、請求項４
２に記載の方法。 - 【請求項４４】 前記組成物を、前記個体の脳に埋め込む、請求項４３に記
載の方法。 - 【請求項４５】 前記個体がパーキンソン病を有する、請求項４４に記載の
方法。 - 【請求項４６】 個体の治療のための医薬の製造において、基底レベルを超
えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞においてドーパミン作動性の
運命を誘導することができる因子を使用することをさらに含む、請求項３２〜３
９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４７】 前記医薬が基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細
胞又は神経前駆細胞を含む、請求項４６に記載の方法。 - 【請求項４８】 前記医薬が個体の脳に埋め込むためのものである、請求項
４６又は４７に記載の方法。 - 【請求項４９】 前記個体がパーキンソン病を有する、請求項４８に記載の
方法。 - 【請求項５０】 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経
前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を誘導する、腹側中脳のタイプ１アス
トロサイトの能力をモジュレートする物質、又はそのようなアストロサイトの１
種以上の分子をスクリーニングする方法であって、 (i)１種以上の試験物質の存在下で、タイプ１アストロサイトと、基底レベルを
超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞とを共培養すること、又は
(ii) 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞と、その
ような細胞においてドーパミン作動性の表現型を誘導することができるタイプ１
アストロサイトの１種以上の分子とを接触させること、及び (iii) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合を分析する
こと、 (iv) ドーパミン作動性の運命を獲得する幹細胞又は前駆細胞の割合と、試験物
質の非存在下に、匹敵する反応培地及び条件下でドーパミン作動性の運命を獲得
する幹細胞及び前駆細胞の数とを比較すること、 を含む前記方法。 - 【請求項５１】 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経
前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を誘導する、腹側中脳のタイプ１アス
トロサイトの能力をモジュレートする物質、又はそのようなアストロサイトの１
種以上の分子を、単離された、及び／又は精製された形態で提供する、請求項５
０に記載の方法。 - 【請求項５２】 基底レベルを超えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経
前駆細胞においてドーパミン作動性の運命を誘導する、腹側中脳のタイプ１アス
トロサイトの能力をモジュレートする物質、又はそのようなアストロサイトの分
子を、１種以上の追加成分を含む組成物中に製剤化する、請求項５０又は５１に
記載の方法。 - 【請求項５３】 前記組成物が製薬上許容し得る賦形剤を含む、請求項５２
に記載の方法。 - 【請求項５４】 前記組成物を個体に投与することをさらに含む、請求項５
３に記載の方法。 - 【請求項５５】 前記組成物を前記個体の脳に埋め込む、請求項５４に記載
の方法。 - 【請求項５６】 前記個体がパーキンソン病を有する、請求項５５に記載の
方法。 - 【請求項５７】 個体の治療のための医薬の製造において、基底レベルを超
えるNurr1を発現する神経幹細胞又は神経前駆細胞においてドーパミン作動性の
運命を誘導する、腹側中脳のタイプ１アストロサイトの能力をモジュレートする
物質、又はそのようなアストロサイトの分子を使用することをさらに含む、請求
項５０又は５１に記載の方法。 - 【請求項５８】 前記医薬が前記個体の脳に埋め込むためのものである、請
求項５７に記載の方法。 - 【請求項５９】 前記個体がパーキンソン病を有する、請求項５８に記載の
方法。
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