KR102203034B1 - 중뇌 유래의 성상교세포와 도파민 신경줄기세포의 공동 이식에 의한 도파민 신경세포의 이식 치료 효과 개선 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포(astrocytes) 및 도파민 신경전구세포(neural progenitor cells)를 포함하는 세포치료제, 중뇌성 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 중뇌성 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 혼합하여 공동 배양하는 단계를 포함하는, 도파민 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 중뇌형 성상교세포 및 도파민 신경전구세포(신경줄기세포)를 공동 배양 또는 공동 이식함으로써 도파민 신경세포의 생존과 분화를 증진시켜 파킨슨병을 포함하는 신경 퇴행성 질환의 치료 효과를 획기적으로 개선시킬 수 있다.

Description

중뇌 유래의 성상교세포와 도파민 신경줄기세포의 공동 이식에 의한 도파민 신경세포의 이식 치료 효과 개선{Improvement of transplantation effect of DA neuron engraftment by Co-transplantation of midbrain astrocytes and VM-NPCs}

본 발명은 중뇌 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 포함하는 세포치료제, 중뇌성 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 공동 배양하여 얻은 세포 또는 배양물, 이들을 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 중뇌 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 공동 배양 또는 공동 이식하여 도파민 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

중뇌의 흑색질(Midbrain substantial nigra)에서 도파민(Dopamine) 신경 세포 손실을 특징으로 하는 파킨슨 병(Parkinson's disease)에서 태아 중뇌 이식의 임상 경험을 감안할 때, 줄기 세포 이식은 난치성 뇌 질환을 치료할 수 있는 잠재적 치료법으로 여겨지고 있다. 신경 전구 세포(Neural progenitor cells)는 뇌 조직에서 추출하거나 배아 줄기 세포 (embryonic stem cells) 또는 유도된 다능성 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells)의 인비트로 분화로 얻을 수 있다. 이렇게 배양된 신경전구세포의 치료 가능성은 인비트로 및 인비보 질병 모델 모두에서 나타났다. 그러나 현재의 이러한 NPC 이식 기술로 얻는 치료 결과는 이식부위의 자가면역작용 및 세포독성 환경으로 인하여 도파민 신경세포의 미분화와 사멸로 인하여 환자 치료에 직접적으로 적용될 수 있는 만족스러운 수준에 이르지 못한다는 것이 공통된 견해이다[비특허문헌 1,2].

또한, 세포 이식 과정에서 발생하는 기계적 손상으로 인한 면역 및 염증 반응으로 인해 이식 후 숙주 뇌가 이식된 세포에 적대적으로 작용하여, 도파민 신경 세포의 적절한 분화, 성숙, 생존 및 기능을 방해하는 것을 무시할 수 없다. 따라서, 생존과 기능이 향상된 실제 중뇌 유형 DA 뉴런을 효율적으로 생성하는 공여자 NPC 배양물에서의 인 비트로 성공은 적대적인 뇌 환경을 교정하지 않고 이식 후 성공적인 치료 결과를 보장하지 못한다.

이러한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 중추신경계 (central nervous system)의 뉴런 보다 수가 많으며, 성숙한 뇌의 신경 세포 생존, 신경 기능 및 뇌 항상성뿐만 아니라 신경 세포 분화 및 발달 동안의 시냅스 성숙을 돕기 위해 생리학적 기능을 발휘하는 성상교세포를 주목하였다.

현재 성상교세포의 신경 영양성(Neurotrophic) 기능을 활용하여 병적인 뇌 환경을 개선하는 아이디어는 중추신경계 (central nervous system) 장애에 대한 치료의 해법으로 제시되고 있다. 그러나 성상교세포의 여러 성질은 다양한 질병에서 손상되며, 성상교세포는 질병이 있는 환경에서 유해하고 적대적인 뇌 환경을 구축하는 세포 유형으로 활성화될 수 있다.

중뇌 유형 도파민 신경세포에 특이적인 전사 인자로 알려진 Nurr1이 성상교세포와 미세아교세포(microglia)에서 발현시킴으로써 Nurr1 발현 아교세포(glia)가 염증 유발 사이토카인의 합성과 방출을 줄임으로써 이웃 도파민 신경세포를 보호한다 [비특허문헌 3]. 또한 우리는 Foxa2가 아교세포에서 Nurr1 매개 염증 역할을 상승시키는 강력한 보조 인자임을 보여 주었다. 또한, 아교세포에서 Nurr1과 Foxa2를 동시에 과발현 시키면 다양한 신경 영양 인자의 합성과 방출이 촉진되어 아교세포에서 Nurr1과 Foxa2의 작용이 중추 신경계 (central nervous system) 질환을 치료하는 강력한 전략이 될 수 있음을 제시한 바 있다[비특허문헌 4].

하지만, 성상교세포와 신경전구세포를 공동 이식에 관한 연구는 전혀 보고된 바 없다.

Goldman, S.A. 2016. Stem and Progenitor Cell-Based Therapy of the Central Nervous System: Hopes, Hype, and Wishful Thinking. Cell Stem Cell 18:174-188. Steinbeck, J.A., and Studer, L. 2015. Moving stem cells to the clinic: potential and limitations for brain repair. Neuron 86:187-206. Saijo, K., Winner, B., Carson, C.T., Collier, J.G., Boyer, L., Rosenfeld, M.G., Gage, F.H., and Glass, C.K. 2009. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell 137:47-59. Oh, S.M., Chang, M.Y., Song, J.J., Rhee, Y.H., Joe, E.H., Lee, H.S., Yi, S.H., and Lee, S.H. 2015. Combined Nurr1 and Foxa2 roles in the therapy of Parkinson's disease. EMBO Mol Med 7:510-525.

이에, 본 발명자들은 신경 퇴행성 질환의 동물 모델을 사용하여 신경전구세포 이식의 치료 결과를 개선하기 위해 세포 유형에서 성상교세포 및/또는 Nurr1 + Foxa2 기능의 신경 영양 작용을 이용하려고 시도하였다. 공동 배양 시스템 및 조건부 배지 처리를 사용한 우리의 인 비트로 분석 결과, 성상교세포, 특히 중뇌 도파민 신경세포가 개발 및 거주하는 중뇌(Ventral midbrain)에서 배양된 성상교세포가 일련의 신경 전구세포 시냅스 성숙, 중뇌 특이적 마커 발현, 시냅스 후 DA 신경세포 기능 및 독성 자극에 대한 저항성과 같은 이식 시 치료 능력과 관련된 행동을 포함한다. 성상교세포에서의 Nurr1+Foxa2 작용은 중뇌 도파민 신경세포를 독소에 대해 주로 염증반응에서 보호하기 위해 성상교세포 기능을 더욱 향상시켰다. 또한, 성상교세포의 작용을 중재할 수 있는 잠재적인 신경 영양성 사이토카인, 세포 외 기질 단백질, 항염증 및 항산화 인자를 확인하였으며, 이러한 결과를 바탕으로 파킨슨병에 대한 신경전구세포 기반 세포 요법에서 성상교세포 동시 이식의 기능적 이점을 입증함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포(astrocytes) 및 도파민 신경전구세포(neural progenitor cells)를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 혼합하여 공동 배양 또는 이식하는 단계를 포함하는, 도파민 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 공동 배양하여 얻은 배양물을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포(astrocytes) 및 도파민 신경전구세포(neural progenitor cells)를 포함하는 세포치료제를 제공한다.

즉, 중뇌 유래의 성상교세포 및 도파민 신경정구세포를 공동 이식하여 도파민 신경세포로 분화시키고 궁극적으로 신경 퇴행성 질환을 치료하고자 한다.

본원 명세서에 기재된 "공동 이식"은 인비보에서 성상교세포(astrocytes) 및 도파민 신경전구세포(neural progenitor cells) 동시에 이식하는 것을 의미하며, 각각의 세포를 별도로 저장 보관하고 사용 직전 혼합하여 치료를 필요로 하는 대상체에 주사 형태로 투여하는 것을 포함한다.

이러한 "공동 이식"의 치료 효과를 인비트로에서 확인하기 위하여, 본 실시예에서는 성상교세포(astrocytes) 및 도파민 신경전구세포(neural progenitor cells)를 공동 배양하여 실험에 사용하였다.

본 명세서에 기재된 "아교세포(glia)"는 뇌에 존재하는 세포 중 가장 많은 부분을 차지하는 세포로서, "성상교세포(astrocyte)" 또는 "미세아교(microglia) 세포"를 포함한다. 상기 성상교세포는 성상세포라고도 하며, 신경세포의 보호 및 영양공급, 염증에 관여하며, 상기 미세아교세포는 뇌에서 염증을 담당하는 세포이다.

상기 성상교세포는 배아 또는 성체 줄기세포로부터 분화시켜 수득할 수도 있고, 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 분리하여 수득할 수도 있다. 본 발명에서는 "성상교세포"로 복측 중뇌(ventral midbrain, VM)형의 사용한 점에 특징이 있다.

"신경전구세포(Neural precursor cells, NPCs)" 또는 "신경줄기세포(Neural stem cells, NSCs)"는 배아/역분화 줄기세포 발생 중이거나 또는 성체에서의 뇌 조직으로부터 분리 및 배양되며, 배양된 NPC는 연구 및 약물 스크리닝을 위한 도파민 신경세포의 대량 형성에 사용될 수 있다.

"신경세포"는 신경계의 세포이고, 용어 "뉴런" 또는 "뉴런 세포"로 서로 바꾸어 사용할 수 있다.

또한, 중뇌형 성상교세포와 신경전구세포는 1 : 1.5 ~ 3의 세포 수 비율로 혼합하여 포함하는 것이 실질적 공동 이식의 양 조절 상 바람직하다.

특히, 본 발명에서는 추가로 Nurr1과 Foxa2의 공여 성상교세포에서의 과별현을 통하여 세포 치료법에서 이식된 성상교세포의 신경 영양성 작용을 더욱 촉진함을 확인하였다. 즉, Nurr1 + Foxa2를 과발현시킨 중뇌성 성상교세포와 도파민 신경줄기세포의 공동 이식을 통한 도파민 신경세포의 생존과 분화를 증진시켜 치료 효과를 획기적으로 개선하였다. 이때, 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 형질도입하여 과발현시킨다.

"형질도입(transduction)" 박테리오파지를 매개로 유전적 형질이 한 세포에서 다른 세포로 옮아가 유전형질이 도입되는 현상으로, 박테리오파지가 어떤 형(型)의 세균에 감염되면 파지 DNA가 숙주 DNA와 결합하고, 용균현상으로 파지가 나올 때 자신의 DNA를 일부 잃는 대신 숙주 DNA의 일부를 갖고 나오는 경우가 있다. 이러한 파지가 다른 세균에 감염되면, 전 숙주의 유전자를 새롭게 도입하는 게 되어 새로운 형질이 나타나게 된다. 생물학적 연구에서 "형질 도입"이라는 용어는 일반적으로 바이러스 벡터를 사용하여 표적 세포에서의 특정 외인성 유전자 과발현하는 것을 의미한다. 즉, 상기 형질도입은 바이러스 벡터를 이용하여 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용한다.

추가로, 본 발명의 실시예에서는 성상교세포에 의한 알파-시뉴클레인 응집체 형성 및 이동을 억제하는 효과를 확인하였다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 인간 배아세포에서 분화시킨 인간 성상교세포에 의한 염증완화 및 개선 효과를 확인하였다.

본 발명은 또한, 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 혼합하여 공동 배양 또는 이식하는 단계를 포함하는, 도파민 신경세포로 분화시키는 방법을 포함한다.

"도파민(DA) 신경세포"는 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase, TH)을 발현하는 신경세포를 말한다. 본 발명에서는 "도파민성 신경세포", "도파민 뉴런", "DA" 등으로 혼용하여 사용한다. 도파민 신경세포은 중간 뇌 흑색질에 특이적으로 위치하고, 생체 내에서 선조체, 변연계 및 신피질을 자극하여 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다.

"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다.

본 발명은 또한, 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 신경 퇴행성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 신경 퇴행성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 “치료”란 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.

본 명세서에 있어서, "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐, 인간 등일 수 있다.

본 발명의 조성물은 신경 퇴행성 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낸다. 상기 신경계 퇴행성 질환은 예를 들어 파킨슨씨 질환, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병을 포함하는 다양한 신경계 질환이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 세포 치료제로써 적용될 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에 있어서, 세포 치료제로써 적용될 수 있는 본 발명의 조성물에 대해 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물인 세포치료제는 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 국소 (협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구 (피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 줄기세포는 적합한 희석제에 약 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입 시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 뇌척수액 등이 있을 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

"세포치료제"는 대상체로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 세포의 1일 투여량은 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹⁰ 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

따라서, 본 발명은 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 포함하는 세포치료제, 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 공동 배양하여 얻은 세포 또는 배양물을 포함하는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 신경 퇴행성 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 공동 배양하여 얻은 배양물을 포함한다.

상기 배양물은 중뇌성 성상교세포의 도파민신경세포에 대한 신경영양인자 및 생존효과 증대를 확인하였으며, Nurr1과 Foxa2에 의한 염증반응감소 효과 및 이에 의한 도파민 신경세포의 생존력 증진을 나타냈다. 따라서, 신경퇴행성 질환의 세포 치료제, 또는 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명에서는 이식 후 적어도 6개월 동안 파킨슨병 동물 모델에서 도파민 신경전구세포와 함께 중뇌에서 유래된 성상교세포의 공동 이식이 파킨슨병 모델의 세포이식 치료 결과를 현저히 향상시켰음을 보여주었다.

특히, Nurr1과 Foxa2의 성상교세포에서의 과별현을 통하여 세포 치료법에서 이식된 성상교세포의 신경 영양성 작용을 더욱 촉진한다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 도파민 신경전구세포와 공동으로 이식된 성상교세포가 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하리라 기대된다.

도 1은 DA 신경세포의 분화 및 성숙이 NPC와 성상교세포의 공동 배양에 의해 촉진됨을 보여준다[A, 공동 배양 실험을 위한 도식. B, Ctx-NPCs (대조군), Ctx-성상교세포 또는 VM-성상교세포의 존재 하에 VM-NPC로부터 분화된 TH + DA 신경세포의 대표 이미지. 삽입(Insets), 박스 영역 확대 이미지. 스케일 바, 100 μm. C, 분화 6일째(D6)에 DA 신경세포 수율. D-H, 신경 돌기 길이(D), 세포 크기(E) 및 Sholl 테스트(F, G)에 의해 평가된 DA 신경세포 성숙의 형태학적 측정. Sholl 분석에서 반경이 15 μm 증가하는 각 원형에서 신경 돌기 교차 수의 총 수가 계산되었다(F). 임계 값 (G)은 최대 개수의 신경 돌기 횡단이 있었던 반경이다. * 각 그룹에서 p <0.05, n = 3-5 웰 (C), 100 (D, E), 25-30 (F, G) TH+ 세포에서 대조군* 및 Ctx-성상교세포와 유의하게 달랐다. ANOVA. H, Neurolucida에 의해 3D로 재구성된 대표적인 TH+ 신경세포 모폴로지, I-L, TH+ 섬유에서의 시냅스 밀도. I, 시냅스+/TH+ 섬유의 대표 공초점 이미지. Scale bar, 25 μm. TH+ 섬유에 대한 시냅스 비히클-특이 마커인 SV2 (J), Synapsin (K) 및 Bassoon (L)에 대해 양성 반응을 나타내었다. 대조군* 및 Ctx-성상교세포#와는 유의 차 각 군마다 p <0.05, n = 20 TH+ 섬유. M, 전-시냅스 DA 방출, n = 3 독립 배양. DA 수준은 24시간 (D13-15) 동안 분화된 배양물에서 켠디션드 배지에서 그리고 30분 동안 KCl-매개 탈분극에 의해 유발된 배양에서 측정되었다. ^{*, #} p <0.05, one-way ANOVA].
도 2는 성상교세포로 분화된 DA 뉴런이 중뇌 특이 인자 발현의 증가와 함께 독성 손상에 더 저항성이 있음을 보여준다. A-C, 분화된 DA 뉴런에서 중뇌 특이 마커의 발현. (C)의 중뇌 특이 마커의 발현 수준은 LAS 이미지 분석 (Leica)을 사용하여 평균 형광 강도 (MFI)를 측정함으로써 개별 TH+ DA 신경세포에서 결정되었다. *, # p <0.01, one-way ANOVA, n = 9 현미경 필드 (B) 및 n = 32-36 TH+ 세포 (C). Scale bar, 50 μm. D-F, 독성 자극에 대한 DA 뉴런의 저항. D12에서 Ctx- 또는 VM-성상교세포 (대조군으로서 Ctx-NPCs)의 존재 하에 분화된 TH+ DA 신경세포를 10시간 동안 H₂O₂ (1000 μM)에 노출시키고 생존 가능한 TH+ 세포 수 (E) 및 섬유 길이 (F)를 다음 날 측정하였다. H₂O₂ 처리 후 대표적인 TH + 세포 이미지가 D에 표시된다. 삽입(Insets), 박스 영역의 확대된 이미지. Scale bar, 100 μm. E의 데이터는 독소 노출 (H₂O₂ = 0 μM)이 없는 환자의 독소 노출 후 생존한 % TH+ 세포를 나타낸다. one-way ANOVA, n = 3 독립 실험 (2-3 배양 웰/실험) (E), n = 80-90 TH+ 세포 (F)].
도 3은 성상교세포에서 근거리분비(파라크린)에 의한 도파민 신경세포의 신경 영양 작용 효과 확인을 확인한 것이다 [A, 컨디션드 배지(CM) 처리 실험의 도식. Ctx- 또는 VM-성상교세포 (또는 대조군으로서 Ctx-NPC)로 컨디션드 배지를 모아 분화 기간 동안 배양된 VM-NPC에 첨가하였다. B, D12에서의 TH+ DA 신경세포에 대한 대표 이미지. 삽입(Insets), 박스 영역 확대 이미지. Scale bar, 100 μm. D6에서 C, TH+ DA 신경세포 수율. * 각 군마다 n = 3 배양 p <0.05로 대조군과 유의미한 차이가 있었다. D, E, 시간 경과 영상 시스템으로 평가된 신경 돌기 성장의 형태학적 측정. D3의 VM-NPC는 CM으로 처리되었다. IncuCyte의 NeuroTrack 소프트웨어를 사용하여 3 개의 독립적인 배양에서 무작위로 선택된 27 개의 현미경 분야의 신경 돌기 길이 (D)와 신경 돌기 (E)의 분기점을 42시간 동안 자동 분석하였다. F-J, 분화된 DA 뉴런에서 성숙한 뉴런 (NeuN) 및 mDA 신경세포 (Foxa2, Nurr1) 마커의 발현. 그래프 I과 J는 각각 TH + DA 신경세포에서 마커와 발현 수준(MFI)을 나타내는 % TH + 세포를 묘사한다. 대조군 * 및 Ctx-성상교세포#와 유의한 차이가 있음. p <0.01, one-way ANOVA, n = 9 현미경 필드 (I) 및 n = 32-36 TH + 세포 (J). K-M, 독성 자극에 대한 DA 뉴런의 내성. D12의 Ctx- 또는 VM-성상교세포-CM (대조군으로서 Ctx-NPC-CM)의 존재 하에 분화된 TH+ DA 신경세포는 8시간 동안 H₂O₂ (1000μM)에 노출되었고, 생존 가능한 TH+ 세포는 다음 날 카운트되었다 (L). K는 H₂O₂ 처리 후 대표적인 TH+ 세포 이미지이다. 삽입(Insets), 박스 영역의 고성능 이미지. Scale bar, 100 μm. 생존한 TH + 세포의 섬유 길이도 또한 추정되었다 (M). ^*,#p<0.01, one-way ANOVA, n = 3 독립 실험 (2-3 웰/실험) (L) 및 n = 80-90TH + 세포 (M). N, 실시간 PCR (qPCR) 분석에 의해 추정된 배양된 Ctx-성상교세포, VM-성상교세포 및 Ctx-NPCs의 신경영양성 유전자의 발현. ^{*, #} p <0.05, one-way ANOVA, n=3].
도 4는 성상교세포의 도파민 영양 기능을 매개하는 잠재적인 분자를 나타낸다 [A-E, mRNA-seq 분석은 VM-성상교세포, Ctx-성상교세포 및 대조군 Ctx-NPC 사이에서 상이하게 발현된 유전자 (DEG)를 분석한다. 분석을 위해 2배 이상으로 조절된 유전자를 선택했다. A, VM -성상교세포 vs. Ctx -NPCs (왼쪽 원) 및 Ctx-성상교세포 vs. Ctx - NPCs (오른쪽 원)로부터 DEG들 사이의 오버랩을 요약한 Venn-다이어그램. Venn-다이어그램에 유전자의 숫자가 표시되어 있다. DEGs와의 오버랩을 계산하기 위해 MASS 패키지의 R 버전 3.3.2를 사용하는 2 x 2 테이블을 기반으로 한 카이 제곱 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. B, GO 및 KEGG는 4445 중복 유전자('공통적인 성상교세포 유전자')를 분석한다. 보라색 막대는 지정된 GO Term/KEGG 경로 하에 유전자의 수를 나타낸다. 노란색 막대는 p 값을 나타내며 p 값의 음수 로그 (아래)는 X 축에 표시된다. C, D, VM -성상교세포와 Ctx -성상교세포 사이 DEG에 대한 Volcano plot (C) 및 GO/KEGG 분석 (D). E, 대조군 Ctx-NPC (Log2 폴드 (VM-성상교세포/Ctx-NPC) 및 (Ctx-성상교세포/Ctx-NPC))와 비교하여 VM- 및 Ctx-성상교세포에서 선택된 유전자의 폴드 변화를 나타내는 히트 맵. (C) 및 GO/KEGG 분석 (D). E, 대조군 Ctx-NPC (Log2 폴드 (VM-성상교세포/Ctx-NPC) 및 (Ctx-성상교세포/Ctx-NPC))와 비교하여 VM- 및 Ctx-성상교세포에서 선택된 유전자의 폴드 변화를 나타내는 히트 맵. F, 중요한 전-염증 및 항-염증 및 분비 항산화 유전자의 발현은 qPCR 분석에 의해 확인되었다. 대조군* 및 Ctx-성상교세포#와 유의한 차이가 있음. p <0.05, n = 3 PCR 반응, ANOVA].
도 5. VM-성상교세포에서 Nurr1 + Foxa2의 과발현은 성상 세포-중재된 도파민 친화성 작용을 강화시킨다[A, 공동 배양 실험의 Schematized 절차. VM-성상교세포에는 Nurr1 + Foxa2 발현 렌티바이러스 (또는 대조군 모의 바이러스)를 형질 도입하여 수확하고 VM-NPC와 혼합하였다. 성상교세포와 혼합된 VM-NPCs에서 분화가 유도된 후 TH + DA 신경세포 수율 (B), 형태학적 (C) 및 시냅스 성숙 (D), 중뇌 특이 마커 (E)의 발현, 시냅스 후 DA 방출 (F) 및 독성 자극 (G, H)에 대한 내성을 차별화된 배양물에서 TH + DA 신경세포에서 평가하였다. I-L, CM 치료 실험. CM은 Nurr1 + Foxa2- 형질도입된 VM-성상교세포 (또는 모의 변형된 VM-성상교세포, 대조군)로부터 준비되었으며, 분화 기간 동안 VM-NPC에 첨가되었다. D12에서 분화된 배양물을 H₂O₂ (1000 μM, 10 시간)에 노출시켰고 살아남은 TH+ 세포의 수 (K)와 신경 돌기 길이 (L)를 도 3의 전설에서 설명한 대로 추정하였다. *, # p <0.05, 양측 스튜던트 t- 테스트, n = 3 배양 웰 (F, H, K) 및 80-90 TH + 세포 (L). Scale bars, 100μm].
도 6은 Nurr1 + Foxa2- 및 대조군 VM-성상교세포 사이의 DEG에 대한 RNA-seq 분석 결과를 나타낸 것이다[A, 대조군 VM-성상교세포 (Cont-Ast) (FPKM> 1)와 비교하여 Nurr1 + Foxa2-VM-성상교세포 (NF-Ast)에서 상향 조절된 (log2> 1) 또는 하향 조절된 (log2 <-1) 유전자들의 GO 및 KEGG 분석. B, NF-Ast vs. 대조군-Ast (log2 <-1, FPKM> 1)에서 하향 조절된 유전자에 대해서만 유전자 온톨로지. C, Nurr1 + Foxa2-VM-성상교세포 vs VM-성상교세포에 풍부한 '면역 반응'및 '염증 반응'유전자 세트에 대한 GSEA. D, 'B'에서 대조군-Ast vs. NF-Ast에서 면역 (121 유전자)/염증 반응 (103 유전자)과 관련된 온톨로지에 주석이 달린 모든 유전자의 발현 수준 (FPKM)의 히트 맵. E, 선택된 면역/염증성, 억제성 ECM 및 항산화 유전자의 발현. F, 중요한 전-/항-염증성 및 신경영양성 요인의 mRNA 수준은 실시간 qPCR 분석에 의해 확인되었다. * p<0.05, 2-tailed Student's t-test, n=3].
도 7은 배양된 성상교세포 이식에 의한 숙주 두뇌 환경의 개선을 나타낸 것이다[랫트에 VM-성상교세포, Ctx-성상교세포 또는 Ctx-NPCs (대조군)를 이식하였다. A, 이식된 그룹 중 신경 영양 또는 적대적인 뇌 환경과 관련된 유전자 발현을 위한 qPCR 데이터. PCR 분석은 이식 후 1개월째 실험방법에 설명된대로 이식편 - 숙주 인터페이스 해부에서 수행되었다. ^{*, #}p <0.05, n = 3. B, 전-염증/세포 독성 (iNOS, CD11b, CD16) 및 항-염증/신경 보호 (아르기닌, CD206) 인자에 대해 면역 반응성인 아교세포에 대한 면역 조직 화학적 분석. 이식-숙주 계면을 따르는 면역 반응성 세포는 이식 후 7-10 일에 3마리의 동물/각 그룹으로부터 6개의 동결 절편에서 계수되었다. 데이터는 DAPI+ 세포, GFAP+ 성상교세포 및 Iba1+ 미세아교세포 집단의 면역 반응성 세포 %로 표시된다. ^{*, #}p <0.05, n = 6, ANOVA. Scale bar, 100μm].
도 8은 이식 후 숙주 두뇌 환경을 개선하기 위해 공여자 VM-성상교세포에서 Nurr1 + Foxa2 프라이밍의 효과를 나타낸 것이다[이식된 뇌에서의 신경 영양성 또는 염증 인자 발현은 도 7에서 설명한대로 qPCR (A) 및 면역 조직 화학 (B) 분석에 의해 결정되었다. ^*,#p<0.05, n=3 PCRs (A) 및 6 slices (B). 2-tailed t-test. Scale bars, 100μm].
도 9은 성상교세포의 공동 이식이 PD 랫트 모델에서 VM-NPC 이식의 치료 효과를 향상시킴을 보여준다[E12에서 랫트 배아 VM에서 유래된 NPCs는 인 비트로에서 증식되고, 수확되며 Ctx-NPCs (대조군), Ctx-성상교세포, VM-성상교세포, 또는 N+F-VM-성상교세포와 혼합하기 전에 세포 주입. 혼합된 세포를 6-OHDA 병소 PD 모델 랫트에 교대로 이식하였다. 행동 후 (A-C) 및 조직학적 (D-L) 분석은 이식 후 또는 이식 후 6개월에 수행되었다. A, 암페타민-유발 회전 점수는 이식 후 6개월 동안 나타낸다. 데이터는 이식 전의 값과 비교하여 각 동물에 대한 회전 점수 변화 백분율로 표시된다. 회전 점수의 평균 + SEM로 묘사된다. 각 그룹에 대해 n = 6. 각각의 이식 후 시점에서 대조군 NPCs*, Ctx-Ast#, VM-Ast†로 공동-이식한 것에서 유의한 감소 p <0.05, ANOVA. 이식된 동물의 행동은 이식 후 6 개월에 단계 조정 (B) 및 실린더 (C) 테스트에 의해 추가적으로 평가되었다. 그룹들 사이의 통계적 유의성 (p <0.01)은 그래프의 도식을 사용하여 표현된다. One-way ANOVA 후 Bonferroni post hoc 분석. D-L, 조직학적 분석은 이식 후 6 개월 수행된다. D, TH+ 세포 이식의 개요. E, 이식 볼륨. F, 총 TH+ 세포 수. G, 이식의 TH+ 세포 밀도. ^{*, #} p <0.05, ANOVA. H-J, TH+ 섬유 길이에 의해 평가된 이식편에서 DA 뉴런의 형태학적 성숙. 제시된 대표적인 TH+ 연결 이미지 (I)의 면역조직 화학 immunohistochemical (H) 및 Neurolucida 재건이다. K-L, synapsin + puncta 밀도에 의해 추정된 TH + DA 뉴런의 시냅스 성숙. *, # p <0.05, ANOVA. 스케일 바, 100 μm (D), 50 μm (H) 25 μm (K)].
도 10은 PD 세포 치료법에서 이식된 성상교세포의 영양 작용에 대한 개요를 나타낸다[VM-NPC와 함께 이식된 성상교세포 (VM, N + F-VM- 성상교세포)는 적대적인 숙주 두뇌 환경을 교정하여 일련의 이식된 NPC 생존, mDA 신경 세포 분화, 연결 성숙 및 시냅스 통합을 촉진한다. 성상교세포 작용은 다양한 신경영양성 ECM 단백질, 항산화제, 신경영양성 사이토카인, 글루타메이트 독성의 GLAST/GLT1 매개 클리어런스 등을 통해 달성된다. 궁극적으로 PD 행동은 중뇌 특이 마커를 발현하는 성숙하고 기능적인 mDA 신경세포의 풍부한 생장과 함께 개선된다].
도 11은 마우스 피질과 VM에서 배양한 성상교세포의 미성숙 및 뇌 영역특이성을 나타낸다[A 및 B, 면역세포화학 (A) 및 실시간 qPCR (B) 분석에 의해 추정 성상교세포 마커의 발현. 마우스 배아 피질 (Ctx-NPC) 유래의 미분화 NPC를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 4회 (A) 및 3회 (B) 실험의 평균 ± SEM이다. Scale bar, 50 um. C, 배양된 성상교세포 내 미성숙 및 성숙한 성상교세포 마커의 유전바 발현 수준을 RNA-seq 데이터에서 FPKM로 평가하였다. FPKM 값은 그래프의 각 막대 위에 표시된다. D-F, DIV 14 및 35에서 피질 및 VM 유래 배양된 성상교세포에 대한 패치-클램프 전기생리학적 분석. (D)는 각 세포에서 기록된 전압 램프-유도 전체-새포 수동 전도 전류에 대한 대표적인 흔적을 보여준다. 평균 컨덕턴스의 요약 막대 그래프. 분석된 세포의 수는 각 막대에 표시된다. P-값은 one-way ANOVA (Kruskal-Wallis test)로 얻었다. * P <0.05. F, 각 그룹에서 낮은 컨덕턴스 (<10nS)를 보이는 세포 수의 백분율. G-H, 성상교세포 성숙과 관련된 배양된 성상교세포의 재생 능력을 스크래치 손상 (G)과 억제성 프로테오 글라이칸 환경(H)에서 평가하였다. 실험방법에서 설명한대로 DIV12-14 및 33-35에서 배양된 Ctx- 및 VM-성상교세포에서 스크래치 손상 (G) 및 아그리칸/라미닌 aggrecan/laminin 구배 스팟(H)을 생성하였다. 스크래치의 두 가장자리 사이의 성상교세포로 채워진 % 면적 (G) 및 스팟 내측으로 자란 세포의 수(H)를 2일 동안 측정하였다. DIV12-14 및 33-35에서의 VM 성상교세포의 대표적인 위상차 현미경 및 GFAP-면역 형광 이미지를 나타냈다. *p<0.01, n=6, Student t-test. Scale bars, 100μm. I 및 J, 배양된 Ctx- 및 VM-성상교세포의 영역 특이적인 유전자 발현을 RNA-seq (I) 및 qPCR (J) 분석에 의해 평가하였다. Ctx-NPC 대조군* 및 Ctx-성상교세포#와 유의한 차이가 있음 p <0.05, n=3 PCR reactions, ANOVA].
도 12는 글루탐산성 자극 및 GABAergic 억제 시냅스 형성을 확인한 것이다[A, 배양된 mDA 신경세포의 TH+ 섬유에서 수상 돌기의 면역세포 화학은 글루탐산성 전시냅스 마커인 vGlut2(vesicular glutamate transporter 2) 및 흥분성 후-시냅스성 마커인 PSD95 (post-synaptic density protein 95) 또는 vGAT (vesicular GABA transporter) 및 억제성 푸-시냅스성 마커인 Gephyrin에 대한 항체로 표지되어 각각 흥분성 또는 억제성 시냅스의 시냅스 전- 및 후-시냅스성 요소를 시각화한다. 화살촉은 vGlut2+/PSD95+ 또는 vGAT+/Gephyrin+ 클러스터를 가리킨다. B, 시냅스성 puncta의 정량. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. ^***p < 0.01 by ANOVA followed by Fisher's LSD post hoc test, 흥분성 시냅스에 대한 n=8-16 및 억제성 시냅스에 대한 n=9-15. Scale bars, 2 μm].
도 13의 A는 도 4B 및 4D에서 상위 순위 GO 및 KEGG 경로에 대한 유전자 세트 농축 분석 (GSEA) 결과이다.
도 14 산화제 및 글루타메이트 매개 독성을 제거하여 배양된 성상교세포의 신경 보호 작용을 보여준다[A. 항산화 용량은 세포 내 글루타티온 수준으로 평가된다. B, 글루타메이트 흡수 활성. 미분화 및 차별화된 Ctx-NPCs (6일간의 차이 후)를 글루타메이트 흡수 검정에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. ^{*, #} p <0.05, n = 4 (A), 3 (B), ANOVA].
도 15는 VM-성상교세포 매개 ROS 소거 및 글루타메이트 제거 활성에서의 Nurr1 + Foxa2 과발현 효과를 나타낸다[A, 대조군 대 NF-성상교세포에서의 세포 내 글루타티온 수준. B, NF-성상교세포 CM 또는 대조군-성상교세포 CM으로 처리한 mDA 신경세포 배양에서의 ROS 수준. mDA 신경세포가 풍부한 배양액은 VM-NPC의 분화에 의해 유도되고 N+F- 또는 mock 대조군으로 형질도입된 VM-성상교세포로부터 제조된 CM으로 처리하였다. 세포를 H₂O₂ (500 uM, 3시간)에 노출시킨 후, DCF 염색에 의해 검출된 ROS 수준을 DCF+ 세포 계수에 의해 정량화하였다. Scale bar, 100 um. C, 글루타메이트 흡수 활성. * p <0.05, n = 3, Student 's t-test (2-tailed)].
도 16의 A-C는 이식 6개월 후 TH+ DA 세포에서 성숙한 신경세포 (HuC/D) 및 중뇌 특이적 mDA 신경세포 (Foxa2 및 Nurr1) 마커의 공동 발현을 나타내며, D-E는 이식편의 대표적인 TH+/GFAP+ 및 TH+/Iba1+ 세포 이미지를 나타낸다[Scale bars, 25 um].
도 17은 DA의 신경 영양성 작용이 소량의 미세아교세포 집단의 부재 또는 존재 하에서 배양된 VM-성상교세포에 의해 유도되었음을 보여준다[순수한 (Iba+ 및 O4+ 세포 없음) 및 소량의 미세아교세포 오염 (Iba+ 세포: <0.5 %)을 갖는 농축된 VM 성상교세포 배양물을 하기 실험방법에 기술된 바와 같이 제조하였다. A, GFAP+/Iba1+/ DAPI+(왼쪽) 및 Iba+/DAPI+(오른쪽) 세포에 대한 대표 이미지. B-D, 분화 동안 E12 VM-NPCs는 성상교세포 배양물로부터 제조된 CM으로 처리하였다. D6 (B)에서의 TH+ mDA 신경세포 수율, D12 (C)에서의 TH+ 신경 돌기 길이, 및 D12 (D)에서 H₂O₂ 처리 (1000 uM, 8시간) 후 생존 가능한 TH+ 세포로 mDA 신경세포 분화, 형태학적 성숙 및 내성 독성을 평가하였다. ^*,#p<0.05, n= 6, Scale bar, 50 μm].
도 18은 성상교세포-매개 신경영양성 작용에 바이러스성 전달 효과를 나타낸다[VM-성상교세포 (비-형질도입), 모의 대조군 및 Nurr1+Foxa2-발현 렌티바이러스로 형질도입된 것들을 qPCR 분석하여 신경 영양성 인자 및 전-염증성 사이토카인 (A)의 발현을 평가하였다. CM은 비-형질도입 및 형질도입된 VM-성상교세포로부터 제조하였다. CM 보충제의 존재 하에, H₂O₂ 독소 (B) 및 전-시냅스 DA 방출 (C)에 대한 세포 생존력을 분화 12일에 VM-NPC로부터 분화된 배양물에서 평가하였다. 비-형질도입* 및 mock 형질도입된# 대조군과 유의한 차이 p <0.05, ANOVA, n = 4. Scale bar, 50 μm].
도 19는 배양된 성상교세포의 Pan-trophic 작용을 보여준다[VM-NPCs는 배양된 Ctx- 또는 VM-성상교세포에서 제조된 CM의 부재 또는 존재 하에서 분화되었다. 총 TuJ1+ 신경세포 및 GFAP+ 성상교세포 (A) 및 글루탐산 작용기 (vGlut2+/TuJ1+) 및 GABAergic (GABA+) 신경세포 아형 (B)의 수율을 평가하였다. * p <0.05, ANOVA, n = 4에서 치료되지 않은 대조군과 유의한 차이. Scale bar, 50 μm].
도 20은 RNA-SEQ에서 phagocytosis 및 Autophagy related gene을 대뇌피질 (cortex)에서 분리한 성상교세포 (대뇌피질형 성상교세포; ctx-astrocyte), 중뇌에서 분리한 성상교세포 (중뇌형 성상교세포; VM-astrocyte), 대조군으로서는 대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포 (ctx-NPC)를 이용하여 mRNA level 비교한 것이다
도 21은 α-synuclein을 과발현(lentivirus)시킨 중뇌 신경줄기세포(VM-NPC)를 분화시켜 α-synuclein을 과발현하는 중뇌 도파민 신경세포를 배양 시 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC)와 각각 공동 배양한 다음, 분화 중 α-synuclein 응집체인 PFF(pre-formed fibrils)를 처리하여 a-synuclein aggregation을 유발하며 20일 분화 후 Thioflavin S과 a-synuclein로 응집체 형성 확인을 a-synucelin/Thioflavin S 면역화학염색법(Immunoncytochemistry) (Thioflavin S: 병적단백응집체 검출 염색)으로 한 것이다.
도 22는 α-synuclein을 과발현(lentivirus)시킨 중뇌 신경줄기세포(VM-NPC)를 분화시켜 α-synuclein을 과발현하는 중뇌 도파민 신경세포 배양 시 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC)와 각각 공동 배양한 다음, 분화 중 α-synuclein 응집체인 PFF(pre-formed fibrils)를 처리하여 a-synuclein aggregation을 유발하며 20일 분화 후 Thioflavin S과 a-synuclein로 응집체 형성 확인을 단백질전기영동법(Western blot)으로 한 것이다.
도 23은 SH-SY5Y 세포에 α-synuclein을 과발현시키고 과발현되지 않은 SH-SY5Y 세포와 공동 배양시킨 후, ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC) 각각으로부터 분리한 컨디션드 배지를 처리하여α-synuclein의 이동(transmission)을 α-syn-GFP의 발현 정도를 측정하여 확인한 것이다.
도 24는 마우스의 선조체(striatum)에 α-synuclein 응집체인 PFF와 Lenti α-syn virus를 이용하여 과발현시킨 PD 모델 개략도이다.
도 25는 α-synuclein 과발현시킨 마우스의 선조체(striatum)에 공동 이식 후 TH/pa-syn(α-syn의 aggregation form)을 관찰한 결과이다[좌: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)와 중뇌성 성상교세포(VM-Ast) 공동 이식, 우: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 단독 이식. 좌우 양측 사진은 각각의 graft를 확대한 사진들이다].
도 26은 α-synuclein 과발현시킨 마우스의 선조체(striatum)에 공동 이식 후 TH/ThS(병적단백응집체 염색)을 관찰한 결과이다[좌: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)와 중뇌성 성상교세포(VM-Ast) 공동 이식, 우: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 단독 이식. 좌우 양측 사진은 각각의 graft를 확대한 사진들이다].
도 27은 α-synuclein 과발현시킨 마우스의 선조체(striatum)에 공동 이식 후 GFAP(성상교세포 염색)/ThS(병적단백응집체 염색)을 관찰한 결과이다[좌: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)와 중뇌성 성상교세포(VM-Ast) 공동 이식, 우: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 단독 이식. 좌우 양측 사진은 각각의 graft를 확대한 사진들이다].
도 28은 α-synuclein 과발현시킨 마우스의 선조체(striatum)에 인간 중뇌 신경전구세포와 성상교세포를 공동 이식 후 human α-synuclein(인간 α-synuclein 염색)/ThS(병적단백응집체 염색)을 관찰한 결과이다[좌: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)와 중뇌성 성상교세포(VM-Ast) 공동 이식, 우: 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 단독 이식. 좌우 양측 사진은 각각의 graft를 확대한 사진들이다].
도 29는 SH-SY5Y 세포에 α-synuclein을 과발현시키고 과발현되지 않은 SH-SY5Y 세포와 공동 배양시킨 후 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC) 각각에 컨디션드 배지를 처리하여α-synuclein의 이동(transmission)을 α-syn의α-syn 발현 정도를 측정하여 확인한 것이다.
도 30은 SH-SY5Y 세포에 α-syn-GFP, α-syn-mCherry를 α-synuclein을 과발현시키고 각각을 공동 배양시킨 후 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC) 각각에 컨디션드 배지를 처리하여α-synuclein의 응집(aggregation)을 α-syn의 발현 정도를 측정하여 확인한 것이다.
도 31은 α-synuclein을 과발현(lentivirus)시킨 중뇌 신경줄기세포(VM-NPC)를 분화시켜 α-synuclein을 과발현하는 중뇌 도파민 신경세포를 배양 시 이때 α-synuclein 과발현 도파민 신경세포를 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC)와 각각에 컨디션드 배지를 처리하여 배양한 다음, 분화 중 α-synuclein 응집체인 PFF(pre-formed fibrils)를 처리하여 a-synuclein aggregation을 유발하며 20일 분화 후 Thioflavin S과 a-synuclein로 응집체 형성 확인을 단백질전기영동법(Western blot)으로 한 것이다.
도 32는 α-synuclein을 과발현(lentivirus)시킨 중뇌 신경줄기세포(VM-NPC)를 분화시켜 α-synuclein을 과발현하는 중뇌 도파민 신경세포를 배양 시 이때 α-synuclein 과발현 도파민 신경세포를 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC)와 각각에 컨디션드 배지를 처리하여 배양한 다음, 분화 중 α-synuclein 응집체인 PFF(pre-formed fibrils)를 처리하여 a-synuclein aggregation을 유발하며 20일 분화 후 a-synucelin 면역화학염색법(Immunoncytochemistry)으로 개수를 정량한 것이다.
도 33은 α-synuclein을 과발현(lentivirus)시킨 중뇌 신경줄기세포(VM-NPC)를 분화시켜 α-synuclein을 과발현하는 중뇌 도파민 신경세포를 배양 시 이때 α-synuclein 과발현 도파민 신경세포를 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC)와 각각에 컨디션드 배지를 처리하여 배양한 다음, 분화 중 α-synuclein 응집체인 PFF(pre-formed fibrils)를 처리하여 a-synuclein aggregation을 유발하며 20일 분화 후 처리하여 a-synuclein aggregation을 유발하며 Thioflavin S과 a-synuclein로 응집체 형성 확인을 a-synucelin/Thioflavin S 면역화학염색법(Immunoncytochemistry) (Thioflavin S: 병적단백응집체 검출 염색)으로 확인한 것이다.
도 34는 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC)와 각각에 α-synuclein 응집체인 PFF(pre-formed fibrils)를 처리하여 24시간 배양한 다음, α-synuclein 및 응집체 형성 확인을 각각 세포와 상층액에서 단백질전기영동법(Western blot)으로 확인한 것이다.
도 35는 랫트의 선조체(striatum)에 이식 후 CD11b(M1 type 염색)/Iba1(microglia 염색)을 관찰한 결과이다[좌: 인간 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)이식, 오른쪽은 인간 중뇌성 성상교세포(VM-Ast) 이식. 좌우 양측 사진은 각각의 graft를 확대한 사진들이다.
도 36은 랫트의 선조체(striatum)에 이식 후 Arg1(M2 type 염색)/Iba1(microglia 염색)을 관찰한 결과이다[왼쪽은 인간 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 이식, 오른쪽은 인간 중뇌성 성상교세포(VM-Ast) 이식. 좌우 양측 사진은 각각의 graft를 확대한 사진들이다.
도 37은 랫트의 선조체(striatum)에 이식 후 TH 도파민성 신경세포 염색을 관찰한 결과이다[왼쪽은 인간 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 이식, 오른쪽은 인간 중뇌성 성상교세포(VM-Ast)와의 공동 이식. 좌우 양측 사진은 각각의 graft를 확대한 사진들이다.

이하, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실험방법

세포 배양

신경전구세포 (또는 신경줄기세포 , NPC) 배양

DA 신경성 잠재력을 갖는 NPC는 E(배아일, embryonic day)10.5의 마우스 배아 (imprinting control region, ICR) 또는 E12에의 Sprague-Dawley 랫트 배아의 VM으로부터 직접 분리 배양하였다. VM-NPCs는 미토겐(mitogens) 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF; 20 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)와 상피 성장 인자 (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems, only for mouse cultures)가 보충된 무혈청 N2 배지에서 증식시켜 (일반적으로 3-4 일간) 70% 이상의 농도로 도달시키고 계대 배양하였다. 추가적인 NPC 증식 후, 세포를 공동 배양 및 다른 실험을 위해 수확하거나 또는 (CM 처리 실험에서) 미토겐을 회수하여 직접 분화하도록 유도하였다. NPC는 또한 비-도파민성 뇌 영역 (E12에서 마우스 또는 E14에서 랫트)인 피질에서 배양하고 다음 실험에서 대조군 세포로 사용되었다.

성상교세포 배양

성상교세포는 출생 후 5~7일에 마우스 또는 랫트의 VM 또는 피질(cortices)로부터 분리되어 astro-medium에서 배양되었다 [Heinrich, C., Gascon, S., Masserdotti, G., Lepier, A., Sanchez, R., Simon-Ebert, T., Schroeder, T., Gotz, M., and Berninger, B. 2011. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc 6:214-228.]. 요컨대, VM을 제거하고, 10% 태아 소 혈청 (FBS, HyClone, Logan, UT)을 함유한 Dulbecco 's modified Eagle 's 배지 (DMEM, Life Technologies, Camarillo, CA, USA)에서 분쇄하고 75-cm2 T-flasks에 플레이트하였다. 세포 합류가 80-90%에 도달했을 때, 세포를 0.1% 트립신으로 수확하고 폴리-D-라이신(PDL; Sigma, ST, Louis, MO)으로 코팅된 배양 표면 상에서 계대 배양(sub-culture)하였다. 4~6일 후, 오비탈 진탕기에서 180 rpm으로 흔들어 미세아교세포(miceoglia)를 제거하였다. 7일 동안 배양한 후, 성상교세포를 공동 배양 실험을 위해 수확하거나, 추가로 N2에서 8일 동안 배양하여 컨디션드 배지(CM)를 제조하였다.

상기한 바와 같이, 미세아교세포 제거 절차 후에도 소량의(minor) 미세아교세포가 존재 하였다. 본 실험에서는 소량의 미세아교세포 집단을 포함한 성상교세포 배양물을 사용하였다. 소량의 미세아교세포 오염의 결과를 평가하기 위해, 진탕 절차 후 20-30분간 DMEM/F12 내 0.06% 트립신으로 배양하고 부유 세포를 버림으로써 미세아교세포가 없는 성상교세포 배양을 확립하였다.

공동-배양

DA 신경성 잠재력을 갖는 VM-NPC를 수확하고 VM-NPC vs. 성상교세포(Ctx-성상교세포 또는 VM-성상교세포)의 세포수 2 : 1 비율로 혼합하였다. (24well 플레이트 기준 3X10⁴ vs 2X10⁴) 혼합된 세포를 플레이트하고 VM-NPC의 분화를 무혈청 N2 배지에서 직접 유도하였다. 대조군 배양에서, VM-NPC는 비-도파민성 Ctx-NPC와 혼합되었다.

인간 중뇌 신경전구세포 (또는 인간중뇌 신경줄기세포 , Human VM NPC)

인간 중뇌 신경전구세포로 직접 분화시키기 위해서 hESCs(human Embryonic Stem cells, 예로 WA-09,H9 (WiCell 구입 사용))에 다음 물질들 LDN193189 (100 nM, Stemgent), SB431542 (10μM, Tocris), SHH (100ng/ml, R&D), Purmorphamine (2μM, Stemgent), FGF8 (100 ng/ml, R&D), CHIR99021 (CHIR; 3μM, Stemgent)을 ventral mid-brain 패턴화 순서대로 17일 동안 처리하였다. 세포들은 적정 개수(2×10⁶ cells per 6cm dish)로 플레이팅한 후 20일 동안 matrigel (BD) 코팅된 디쉬에서 배양한 후 poly-L-ornithine(PLO)/Fibronectin(FN)/Laminin 코팅된 dish에 적정 개수로 (3×10⁶ per 6cm dish) 깔아 배양하였다.

인간 중뇌 성상교세포 배양

상기 인간 중뇌 신경전구세포로 직접 분화시킨 후 인간 중뇌 성상세포로의 배양을 위해, 세포들은 적정 개수(3×10⁶ cells per 6cm dish) 로 플레이팅한 후 20일 동안 matrigel (BD) 코팅된 디쉬에서 배양한 후 poly-L-ornithine(PLO)/Fibronectin(FN)/Laminin 코팅된 dish에 적정 개수로 (3×10⁶ per 6cm dish) 깔아 계대를 진행하며 약 120일 배양하였다. 배양의 확인을 위해 사용 전에 소량을 24well 플레이트에 배양하여 GFAP 면역염색으로 분화를 확인하였다.

컨디션드 배지( Conditioned medium , CM ) 제조

상기한 바와 같이, 새로운 N2 배지 (또는 HBSS, Hank's balanced salt solution)를 성상교세포 배양물에 첨가하고, 성상교세포의 컨디션드 배지(CM)을 8일 동안 격일로 모았다. 대조군 CM은 6일간의 분화 동안 Ctx-NPC 배양물에서 유사하게 제조되었다. CM의 부피는 0.1-0.15 mg 단백질/ml로 조정하고, 0.45 μm에서 여과하고, 사용하기 전까지 -80 ℃에서 유지하였다. 배양물 세포 내 첨가하기 전에 CM을 N2 배지 (1 : 1, v : v)로 희석시켰다.

Nurr1 + Foxa2 형질 도입

CMV 프로모터의 조절하에 Nurr1 또는 Foxa2를 발현하는 렌티바이러스 벡터는 각각의 cDNA를 pCDH (System Biosciences, Mountain View, CA)의 다중 클로닝 사이트에 삽입함으로써 생성되었다. 빈(empty) 백본 벡터 (pCDH)를 음성 대조군으로 사용하였다. 렌티바이러스를 제조하고 인 비트로 배양물을 형질도입하는데 사용하였다 [Yi, S.H., He, X.B., Rhee, Y.H., Park, C.H., Takizawa, T., Nakashima, K., and Lee, S.H. 2014. Foxa2 acts as a co-activator potentiating expression of the Nurr1-induced DA phenotype via epigenetic regulation. Development 141:761-772.]. 렌티바이러스의 역가(titer)는 QuickTiterTM HIV Lentivirus Quantitation Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 사용하여 결정하였고, 10⁶의 TU(transducing units)/mL를 가진 Nurr1과 Foxa2 바이러스 각각 20ul를 2mL의 배지와 혼합하고 형질도입 반응을 위해 1~1.5x10⁶ cells/6cm-dish에 첨가하였다.

면역 염색

배양된 세포를 인산 완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 첨가된 0.3 % Triton X-100에서 40분간 차단한 후 4 ℃에서 밤새 1차 항체로 인큐베이션하였다. 1차 항체 정보는 하기 표 1에 나타낸다. 시각화에 사용되는 보조 항체는 Cy3 (1 : 200, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) 또는 Alexa Fluor 488 (1 : 200, Life Technologies)이다.

[표 1]

염색된 세포를 DAPI 마운팅 용액(Vector Laboratories, CA, USA)이 포함된 VECTASHIELD로 준비하고, 형광(epifluorescence) 현미경 (Leica, Heidelberg, Germany) 및 공초점 현미경 (Leica PCS SP5)으로 사진을 얻었다.

이식 및 조직학적 절차

실험은 NIH (National Institutes of Health) 지침에 따라 수행되었다. Hemi-parkinsonian을 흑색질의 우측(AP-4.8 mm, ML-1.8 mm, V-8.2 mm) 및 MFB(median forebrain bundle)(AP -4.4 mm, ML -1.2 mm, V -7.8 mm)에 6-OHDA (6-hydroxydopamine, 8 μg/μl; 시그마) 3 μl의 단독 정위 주사로 성숙한 암컷 Sprague-Dawley 랫트 (220-250g)에 유도하였다. 절치 막대(incisor bar)는 -3.5 mm로 설정되었고, AP와 ML 좌표는 브레그마에 상대적으로 주어진다. 암페타민-유도 회전 검사에서 상기 장애에 대해 같은 쪽 300회/시간을 가지는 랫트를 선택하였다. 이식을 위해, 랫트 E12 VM-NPC를 증식시키고, 2 : 1 비율로 Ctx-, VM-성상교세포, N + F-VM-성상교세포 또는 E14 Ctx-NPCs (대조군)과 혼합시켰다. 혼합된 세포 (1.5 x 10⁵ 세포/ul) 3 ㎕를 Rompun 100 ul/100 g (23.32 mg/ml)과 혼합된 100 ul/100 g (50 mg/ml)의 Zoletil에 의해 유도된 마취 하에서 선조체 (bregma 및 dura에 상대적인 AP, ML 및 V의 좌표: [1] 0.07, -0.30, -0.55; [2] -0.10, -0.40, -0.50; 제로 아래 3.5mm로 설정한 절치 막대)의 2개의 부위 각각에 10분에 걸쳐 주사하였다. 각 주사 완료 후 5분 동안 바늘 (22 게이지)을 제 위치에 두었다. 랫트는 이식 1일 전부터 시작하여 1개월 동안 계속 시클로스포린 A (10 mg/kg, i.p.)를 매일 투여받았고 나머지 이식 후 기간 동안 면역 억제제 없이 유지되었다. 이식 6개월 후, 동물을 마취시키고 4% 파라포름알데히드로 경피 관류시켰다. 뇌를 제거하고 PBS 내 30% 수크로오스에 밤새 담그고 Tissue-Tek® (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)에서 냉동시킨 다음 냉동 마이크로톰 (Leica)에서 슬라이스하였다. 자유 부동성 뇌 Free-floating brain부분 (30 μm 두께)은 위에서 설명한대로 면역 조직 화학을 시행하고 공초점 현미경 (Leica)으로 이미지를 얻었다. 이식된 뇌의 숙주 환경을 시험하기 위한 실험에서, 이식 후 1달째에 동물을 희생시키고 랫트 뇌 슬라이스 매트릭스 (ZIVIC Instruments, Pittsburgh, PA) 상에서 1 mm 두께로 슬라이스하였고, 이식 후의 변화를 관찰하기 위해 이식부위의 조직을 적출하였다. 이식-숙주 계면 (ca 2x2 mm) /이식의 8-12 군데의 영역을 해부하고 qPCR 분석을 수행하였다. 또한, 신경영양 및 전-염증성 아교세포 마커에 대해 면역 반응성인 세포는 이식 후 7-10 일에 동결 절단된 뇌 슬라이스의 이식-숙주 계면을 따라 계수되었다.

행동 테스트

동물 행동은 이전에 기술된 것처럼 암페타민-유도 회전, 단계 조정 및 실린더 테스트를 사용하여 평가되었다 [Oh, S.M., Chang, M.Y., Song, J.J., Rhee, Y.H., Joe, E.H., Lee, H.S., Yi, S.H., and Lee, S.H. 2015. Combined Nurr1 and Foxa2 roles in the therapy of Parkinson's disease. EMBO Mol Med 7:510-525].

세포 계수 및 통계 분석

면역 염색 및 DAPI-염색된 세포는 200배 또는 400배 배율로 아이피스 그리드(eyepiece grid)를 사용하여 각 배양 커버슬립 내의 9-20 군데의 무작위 영역에서 계산되었다. 모든 수치에 대해 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며 통계 테스트는 적절하게 입증된다. 통계학적 비교는 Student 's t-test (unpaired), 2-tailed 또는 one-way ANOVA, SPSS (Statistics 21; IBM Inc. Bentonville, AR, USA)를 이용한 Bonferroni post hoc 분석을 사용하여 이루어졌다. n, p- 값 및 통계 분석 방법은 도면 범례에 표시되어 있다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다.

연구 승인

동물 실험을 위한 모든 절차는 한양 의과 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC) (승인 번호 2016-0113A)의 승인을 받았다.

성상교세포 기능 분석

배양된 성상교세포에서의 전기 생리학적 기록

배양된 성상교세포를 커버슬립 상에 플레이팅하고 전기 생리학 실험 전 적어도 24시간 동안 10% 소 태아 혈청 및 10% 말 혈청이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. 전기 생리학적 기록을 위해 패치 피펫은 150 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM EGTA 및 10 mM HEPES(pH 7.2는 KOH로 조정)를 함유한 피펫 용액으로 채울 때 4-7MΩ의 개방 팁 저항을 가졌다. 표준 배쓰 용액은 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5.5 mM D-포도당 및 20 mM 수크로오스 (pH 7.4는 NaOH로 조정)를 함유하였다. 배양 중의 해마 성상교세포의 평균 막 저항은 7.45 ± 0.76 mega ohms (평균 ± s.e.m)이었고, 직렬 저항은 30 mΩ 미만이었고 모든 실험을 모니터링하였다. P-97 Flaming/Brown 마이크로 피펫 풀러 (Sutter Instruments)를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세관(World Precision Instruments)으로 기록 피펫을 만들었다. 전체-세포 막 전류는 Axopatch 200A에 의해 증폭되었다. 전류는 -150mV에서 +50mV까지 1-s ramps 상승 (-70mV의 유지 잠재력에서)으로 나타났다. 데이터 수집은 증폭기와 컴퓨터 사이의 신호에 의해 제어되었다. 데이터를 5 kHz에서 샘플링하고 2 kHz에서 필터링하였다. 세포막 커패시턴스는 pClamp10.0에 내장된 멤브레인 테스트 프로토콜을 사용하여 측정되었다. 계산 및 측정된 접합 전위는 각각 -2.6mV 및 -2.5mV였다.

스크래치 손상 분석

멸균 피펫 팁을 사용하여, 성상교세포의 monoconfluent 세포 층에 긁힌 자국이 만들어졌다. 플레이트를 멸균 PBS로 헹구어 세포 파편을 제거하고 새로운 세포 배양 배지로 대체하였다. 스크래치 0, 1 및 2일 후, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 성상교세포에 의해 점유된 영역을 스크래치의 두 에지 사이에서 측정하였다.

억제성 프로테오글리칸 환경에서 성장 능력

구배 스팟 유리 커버슬립 (12 ㎜)을 문헌[Tom, V.J., Steinmetz, M.P., Miller, J.H., Doller, C.M., and Silver, J. 2004. Studies on the development and 22 behavior of the dystrophic growth cone, the hallmark of regeneration failure, in an in vitro model of the glial 23 scar and after spinal cord injury. J Neurosci 24:6531-6539.]과 같이 제조하였다.

간단히 말하면, 폴리-L-라이신 (PLL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 니트로 셀룰로오스로 코팅된 커버슬립을 Ca++, Mg++-프리 행크스 발랜스드 염 용액(CMF; Invitrogen, Gaithersburg, MD) 내 아그리칸(aggrecan) (0.7 mg/mL; Sigma-Aldrich) 및 라미닌(5ug/mL, Biomedical Technologies, Stoughton, MA)의 용액 2 ul로 스팟하였다. 상기 스팟을 건조시킨 다음 CMF에서 라미닌 (5ug/mL)으로 덮고 세포 플레이팅 직전까지 3시간 동안 37 ℃로 보관하였다. 성상교세포 (24-웰 플레이트에서 2 Х 10⁴ 세포/웰)를 플레이팅하기 전에 라미닌 용액을 제거하였다. 그라데이션 아그리칸/라미닌 스팟 내측의 성상교세포의 이동가능성은 2일 동안 그 스팟에서 성상교세포가 덮은 영역에 의해 결정되었다.

형태 측정 평가

형태학적 성숙을 평가하기 위해 무작위로 선택된 TH + DA 신경세포의 총 섬유 길이와 소마 크기 (둘레)를 이미지 분석 시스템 (Leica LAS)을 사용하여 측정하였다.

TH+ DA 신경 영상은 또한 Neurolucida 360 (MicroBrightfield, Inc.)을 사용하여 재구성되었다. TH+ 세포에서 섬유의 복잡성은 Sholl 시험을 사용하여 추가로 평가되었다. 소마의 중심으로부터 증가하는 경계와의 교합 수의 교차 수는 200 ㎛의 거리까지 15 ㎛마다 매겨졌다. 최대 돌기 수의 반경의 임계 값도 Sholl 시험에서 결정되었다. TH+ DA 신경세포의 신경 돌기 길이 및 분지화는 하기 기술된 바와 같이 시간-경과 영상을 이용하여 더 평가되었다.

신경 축삭 신도의 시간-경과 영상

E10.5에서의 마우스 배아로부터의 VM-NPC를 24-웰 플레이트의 각 웰에 4.0 x 10⁴ 세포에 접종하고 배양하였다. CM을 분화 3 일 후에 처리하고 N2 배지 (1 : 1, v : v)로 희석하여 신경 돌기 신장을 유도하였다. 위상차 현미경 이미지는 42시간 동안 2시간마다 IncuCyte ZOOM 라이브 셀 이미징 시스템 (Essen Bioscience, 미국 미시건, Ann Arbor)을 사용하여 자동으로 촬영되었다. 신경 돌기의 길이와 지점은 IncuCyte의 NeuroTrack 소프트웨어로 자동 분석되었다.

메신저 RNA 발현 분석

RNA 분리 프로토콜을 통해 Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 준비하였다. Superscript 키트 (Invitrogen)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. Real-time PCR은 iQTM SYBR green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 CFX96TM 실시간 시스템에서 수행되었으며 유전자 발현 수준은 GAPDH 수준에 따라 결정되었다. RT2 Profiler PCR ArrayR (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 산화 스트레스와 관련된 84개의 유전자 발현을 프로파일링 하기 위해 마우스 산화 스트레스 RT² Profiler ™ PCR Array (카탈로그 330231 PAMM-065ZA)를 사용했습니다. 프라이머 정보는 표 2에 나와있다.

[표 2]

RNA - seq 분석

RNA 서열 분석은 Macrogen (Seoul, Korea)에서 수행되었다. FastQC를 사용하여 품질 점수 20 이하의 판독을 트리밍하고 Bowtie를 사용하여 불일치 비율을 확인한 후 모든 RNA-seq 데이터를 STAR [Dobin, A., Davis, C.A., Schlesinger, F., Drenkow, J., Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and Gingeras, T.R. 2013. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29:15-21.]를 사용하여 마우스 기준 게놈 (GRCm38/mm10)에 매핑하였다. 마우스 게놈에서 NCBI RefSeq annotations Release 105: February 2015에 근거하여 모든 46,432개의 주석이 달린 유전자, 107,631개의 전사물 및 76,131개의 단백질 코딩 (mRNA) 기록의 발현 수준을 측정하기 위해 Htseq를 사용하여 유전자의 엑손에 매핑된 판독 수를 계산하였다 FPKM (Million fragments Mapping) 당 엑손의 킬로그로 염기 당 단편 수를 계산하여 계산한다. Quantile 표준화는 그룹 간의 표현의 기술적인 글로벌 바이어스를 줄이기 위해 수행되었다[Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M., and Speed, T.P. 2003. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19:185-193.]. 모든 데이터는 GEO 데이터베이스에 기탁되었다 (GEO: GSE106216).

세포 내 ROS 및 글루타티온 수준의 측정

세포 내 ROS 수준의 측정을 위해 세포를 10 μM의 5-(및-6)-chloromethyl-2 ', 7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate[CM-H2DCF-DA (본 명세서에서는 DCF 라 칭함) (Invitrogen)]와 함께 10분 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 D-PBS (mM: 2.68 KCl, 1.47 KH₂PO₄, 136.89 NaCl, 8.1 Na₂HPO₄)로 세척하고 Olympus 현미경 (IX71, Hicksville, NY, USA)을 사용하여 형광 및 위상차 영상을 촬영하였다. 세포 내 글루타티온 수준의 결정은 CelltoinTM (서울, 한국)에 의해 요청되고 수행되었다.

DA 방출 분석

DA 신경세포의 시냅스 전 활동은 분화된 VM-NPC 배양물에서 방출된 DA 신경전달물질의 수준을 측정함으로써 결정되었다. 24시간 배양된 배지(분화 12-13 일)를 수집하여 ELISA 키트 (BA E-5300, LDN)를 사용하여 DA 수준을 측정하였다. 또한, 멤브레인 탈 극성에 의해 유발된 DA 방출은 56 mM KCl의 존재 또는 부재 하에 30분 동안 새로운 N2 배지에서 배양 (배양 12일째) 배양함으로써 평가하였다. 유발된 DA 방출은 KCl 있는 DA 수준에서 KCl 없는 DA 방출을 뺀 값으로 계산되었다.

글루타메이트 흡수

세포를 Tissue Buffer (5 mM Tris, 320 mM sucrose, pH 7.4)에서 2회 세척하고 Na+ 함유 Krebs 완충액 (120 mM NaCl, 25 mM NaHCO₃, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM) 중 10 μM 글루타메이트에 노출시켰다. mM KH₂PO₄, 1mM MgSO₄, 10% glucose) 또는 Na +가없는 Krebs (120 mM choline-Cl과 25 mM Tris-HCl)를 37 ℃에서 10분간 처리하였다. 세포를 얼음에 놓고 Wash Buffer (5 mM Tris/160 mM NaCl, pH 7.4)로 2 회 세척하여 흡수를 중단시켰다. 세포를 수집하고 100 ㎕의 분석 완충액에서 균질화시키고, 세포 균질액 중의 글루타메이트의 양을 글루타메이트 분석 키트 (Abcam, Cambridge, MA, USA, ab83389)를 사용하여 측정하였다. Na+ 의존성 흡수는 Na+가 존재할 때 총 카운트로부터 Na+가 없는 카운트를 뺀 값으로 측정되었다.

α- synuclein 과발현된 도파민 신경세포에 성상교세포를 공동 배양 후 α-synuclein 응집체 형성 확인

세포 배양으로 α-synuclein을 과발현(lentivirus)시킨 중뇌 신경줄기세포(VM-NPC)를 분화시켜 α-synuclein을 과발현하는 중뇌 도파민 신경세포를 배양하였다. 이때 α-synuclein과발현 도파민 신경세포를 (1) 대뇌피질(cortex)에서 분리한 성상교세포 (대뇌피질형 성상교세포; ctx-astrocyte, (2) 중뇌에서 분리한 성상교세포 (중뇌형 성상교세포; VM-astrocyte)와 공동 배양하며, 대조군으로서는 대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포 (ctx-NPC)와 공동 배양하였다. 그리고 분화 중 α-synuclein응집체인 pre-formed fibrils (PFF)를 처리하여 a-synuclein aggregation을 유발하며 20일 분화 후에 a-synucelin aggregation정도를 Thioflavin S(단백응집을 측정하는 염색법; sigma Aldrich 사)과 a-synuclein 항체를 이용한 면역염색 (Immunoncytochemistry) 및 단백질전기영동법(Western blot)으로 존재 확인 및 그 응집을 단백질 크기 변화로 관찰하였다.

성상교세포에서 분비된 factor에 의한 세포간 α- synuclein 응집체 이동 확인

신경모세포종(neuroblastoma)에서 유래된SH-SY5Y (아주대 박상면교수님) 세포에 α-synuclein을 과발현시키고 과발현되지 않은SH-SY5Y 세포와 공동 배양시킨 후 (1) 대뇌피질 (cortex)에서 분리한 성상교세포 (대뇌피질형 성상교세포; ctx-astrocyte, (2) 중뇌에서 분리한 성상교세포 (중뇌형 성상교세포; VM-astrocyte), 대조군으로서는 대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포 (ctx-NPC)의 컨디션드 배지를 처리하여 αsynuclein의 이동(transmission)을 항체를 이용한 α-syn-GFP의 밝기를 통한 면역염색 (Immunoncytochemistry)으로 확인하였다.

성상교세포에서 분비된 factor에 의한 세포간 α- synuclein 응집 효과 확인

SH-SY5Y 세포에 α-syn-GFP, α-syn-mCherry를 α-synuclein을 과발현시키고 각각을 공동 배양시킨 후 ctx-astrocyte, VM-astrocyte 및 대조군(대뇌피질에서 분리한 신경줄기세포, ctx-NPC) 각각에 컨디션드 배지를 처리하여α-synuclein의 응집(aggregation)을 GFP와 mCherry의 발현 정도를 측정하여 확인한 것이다.

인간 중뇌 성상교세포에 의한 환경개선효과 분석

인간 중뇌 신경전구세포와 인간 중뇌 성상교세포를 배양하여, 각기 세포를 좌우반구에 각각 주입함으로서 인간 성상교세포에 의한 환경개선효과를 M2 marker의 면역염색법으로 관찰 분석한다. 각기의 세포를 앞서 설명된 '이식 및 조직학적 절차'에 따라 따로 (1.5 x 10⁵ 세포/ ul) 3 ㎕씩을 Rompun 100 ul/100 g (23.32 mg/ml)과 혼합된 100 ul/100 g (50 mg/ml)의 Zoletil에 의해 유도된 마취 하에서 선조체 (bregma 및 dura에 상대적인 AP, ML 및 V의 좌표: [1] 0.07, -0.30, -0.55; [2] -0.10, -0.40, -0.50; 제로 아래 3.5mm로 설정한 절치 막대)의 2개의 부위 각각에 10분에 걸쳐 주사하였다. 이하 앞서 설명된 '이식 및 조직학적 절차'에 따라 면역염색법으로 분석하였다.

실험 결과

마우스의 피질과 VM에서 배양한 성상교세포의 미성숙 및 뇌 부위-특이성

본 발명의 목적은 성상교세포의 신경 영양성 작용을 이용하여 NPC 이식 효능을 향상시키는 것이다. 뇌 영역에 의존하는 성상교세포의 다양성과 잠재적인 영역별 역할에 기초하여, 본 발명자들은 고전적인 비도파민성 뇌 영역 피질(Ctx) 및 도파민성 중뇌(VM)를 포함하는 2개의 뇌 영역으로부터 성상교세포를 배양하였다.

성상교세포 표지 인자의 높은 mRNA 발현과 함께 (도 11B), 성상교세포의 유해한 재활성화와 관련된 가용성 단백질인 S100β(20% 및 32%)를 제외하고는, 면역세포화학 분석은 DIV(days in vitro) 14에 Ctx- 및 VM-성상아교세포 배양에서 주요 세포 집단이 GFAP (85% 및 82%), CD44 (79% 및 76%), GLT-1% 및 71%), GLAST 단백질 (71% 및 77%)에 대해 포지티브함을 나타낸다(도 11A). 이 배양물에서 Iba1+ 미세아교세포와 O4+ 희소돌기아교세포, 각각인 세포가 약간 있거나(Ctx-Ast에서 0.24 ± 0.35 %, VM-Ast에서 0.43 ± 0.39 %) 없었다. 대조적으로, 대조군으로 사용된 배아 피질(Ctx-NPCs) 유래 NPC 배양물에서 성상아교세포 마커에 대해 양성인 세포가 없거나 약간 있었다 (도 11A).

미성숙한 성상교세포 표지자인 GLAST와 Sox2에 대해 면역 반응이 많은 풍부한 세포들과 함께, RNA 서열 분석 (RNA-seq) 데이터에서 미성숙한 성상교세포 유전자 (Sox2, Nestin, GLAST, 및 Vimentin)의 발현 수준이 높았으며(fragments per kilobase of exons per million reads (FPKM): 94-4180, 도 11C), 이 연구에서 배양된 성상교세포는 미성숙한 특성을 나타냈다. 이전 연구에서 배양된 성상교세포는 인 비보 성상교세포에 비해 전기 생리학적으로 미성숙한 것으로 보고되었다 [Kressin, K., Kuprijanova, E., Jabs, R., Seifert, G., and Steinhauser, C. 1995. Developmental regulation of Na+ and K+ conductances in glial cells of mouse hippocampal brain slices. Glia 15:173-187. Hwang, E.M., Kim, E., Yarishkin, O., Woo, D.H., Han, K.S., Park, N., Bae, Y., Woo, J., Kim, D., Park, M., et al. 2014. A disulphide-linked heterodimer of TWIK-1 and TREK-1 mediates passive conductance in astrocytes. Nat Commun 5:3227]. 일관되게, 패치-클램프 분석에서, 본 발명 DIV14에 피질에서 배양한 성상교세 포는 전류 (2577 ± 401.1pA, n = 16)와 전도도 (23.08 ± 3.306 nS, n = 16)를 보였으며, 이는 인 비보 피질 조각에서 검출된 것 보다 유의하게 낮았다 (40 nS).

흥미롭게도, DIV14에 VM에서 배양한 성상교세포의 전류 및 전도도 값은 DIV14에 배양된 Ctx-성상교세포에 비해 더 낮았으며, 배양 기간이 길어질수록 (DIV35에) VM-성상교세포의 증가율이 더 높았다(도 11D 및 E). 각 그룹의 성상교세포에는 전도도가 10nS 미만인 개체군이 있었다. 저전도성 세포의 백분율은 DIV14(young)의 VM-성상교세포 배양에서 가장 높았고 DIV35(old)의 VM에서 성숙하는 동안 감소하였으며 백분율은 Ctx DIV14(young) 및 Ctx DIV35(old)에 유사하였다 (도 11F).

주목할 것은, 이식된 미성숙(성숙하지 않은) 성상교세포가 손상된 CNS에서 신경 영양 지원을 발휘한다는 것이다. 스크래치 손상 모델에서 DIV33-35 (도 11G)의 성상교세포 보다 우수한 상처 치유력 외에도, DIV12-14의 성상교세포는 인 비보 glial scar에서 관찰된 강하게 억제된 CSPG 농도 변화를 재현하는 인 비트로 모델에서 높은 수준의 CSPGs(chondroitin sulfate proteoglycans)에 더 큰 능력을 나타내었다 (도 11H). 이러한 결과는 종합적으로 본 실험에서 배양된 성상교세포, 특히 DIV12-14의 배양된 성상교세포가 미숙하고 재생 능력을 발휘할 수 있음을 나타냈다.

이 발견에 근거하여 달리 언급하지 않는 한, DIV7-14의 성상교세포 배양물을 사용하여 다음 실험을 수행하였다.

위치 특이성은 신경 세포 아형의 다양성을 결정하는 기본 조직 원리로서 성상교세포의 다양화와 관련이 있다. 일관되게, Ctx-성상교세포는 피질 부위 특이적 유전자 (Emx2, Lhx2, FoxG1 및 Pax6)의 발현 수준이 높았으며, 반면 중뇌 특이 마커 Foxa1/2, Lmx1a /b, 및 En1 /2) 의 발현은 VM- 성상교세포 배양에서 풍부해졌다 (도 11I, J). Foxa2의 내인성 발현은 VM 유래 성상교세포에서만 독점적으로 강화되었지만, 본 실험에서 관심있는 또 다른 주요 유전자인 Nurr1과 그것의 하향 타겟(downstream target) 유전자인 Pitx3의 발현은 Ctx와 VM에서 유래된 성상교세포 배양액 간에 구별할 수 없었다 (도 11I, J).

이 결과는 중뇌뿐만 아니라 대뇌 피질 층 VI 및 해마에서도 Nurr1 발현의 검출과 일치한다. 이러한 연구 결과는 본 실험에서 사용된 성상교세포 배양의 미성숙한 성상교세포와 뇌 영역 특이성을 총체적으로 증명한다.

VM 성상교세포는 NPC를 mDA 뉴런으로 분화시키는데, 이는 신경 연결 성숙도, 중뇌 특이 마커의 발현 및 독성 자극에 대한 내성을 갖는다 .

PD에서 NPC 이식에 의한 치료 효능을 얻기 위해, 이식된 NPC는 mDA 신경 세포로의 분화, 시냅스 형성에 의한 신경 성숙 및 이식된 뇌의 적대적인 환경에서 이식된 mDA 신경세포의 생존을 거쳐야 한다.

본 발명자들은 먼저 인 비트로에서 Ctx- 또는 VM-성상교세포의 부재 또는 존재에서 이 일련의 세포 이벤트를 평가하였다.

이를 위해 설치류 배아 VM에서 분리된 NPC(E10.5에서 마우스 또는 E12에서 랫트)를 인 비트로에서 4일 동안 증식되었고 2 : 1 VM-NPC vs. 성상교세포의 세포 수 비로 Ctx-성상교세포 또는 VM-성상교세포와 혼합되었다. 혼합된 세포를 플레이트하고 VM-NPC의 분화를 무혈청 N2 배지에서 직접 유도하였다 (도 1A에서 개략적으로 도시됨).

세포 분화가 세포 밀도에 영향을 받기 때문에, 대조군 배양물에서 VM-NPC는 비-도파민성 Ctx-NPC와 혼합되었고, 시험군들 간의 세포 밀도 (confluence)는 분석 동안 크게 다르지 않음을 결정하였다.

DA 신경세포 분화가 DA 생합성에서 중요한 효소인 티로신 히드록실라제(TH)에 양성인 세포의 수에 의해 분화 6일에 평가되었을 때, TH+ 세포의 수는 성상교세포와 혼합된 배양물에서 Ctx-NPC와 혼합된 대조군 배양물과 비교하여 유의하게 더 컸다 (도 1B, C). Ctx-성상교세포와의 공동 배양과 비교하여 VM-성상교세포와의 공동 배양으로 촉진된 TH + 세포 수율에는 유의한 차이가 없었다 (도 1C). 성상교세포에서 분화된 TH + DA 뉴런은 TH + 세포의 신경 돌기 길이 (도 1D) 및 세포 크기 (도 1E)에 의해 정량된 대조군 배양 (도 1b, 삽입) 보다 더 성숙한 신경 형태를 나타냈다. Sholl test를 사용하여 신경 돌기 성장의 복잡성을 토대로 TH+ DA 신경세포의 형태학적 성숙도를 평가하였다 (도 1F, G). Ctx- vs. VM-성상교세포에 의해 촉진된 TH+ 세포 수율의 차이가 없는 것과는 대조적으로, VM-성상교세포와 함께 배양된 TH+ DA 신경세포는 Ctx-성상교세포와 함께 배양된 것 보다 유의하게 더 큰 신경 돌기 성장을 보였다 (도 1B, D, F-H).

공초점 현미경에 의해 캡쳐된 이미지에서, 성선 자극 호르몬에 특이적인 마커인 SV2, synapsin 및 Bassoon은 성상교세포로 분화된 TH+ DA 신경세포의 신경원에 더 많이 국한되어 있었고 점액 밀도는 VM-성상교세포와 함께 배양된 군에서 가장 많았다 (도 1I -L). 형성된 시냅스의 유형은 신경전달물질 특이적인 시냅스 전후 마커를 사용하여 더 분석되었다. Nigral mDA 신경세포는 생리학적으로 글루탐산성 자극(glutamatergic excitatory)과 GABA 효소 억제성 시냅스 입력(GABAergic inhibitory synaptic inputs)을 뇌의 여러 부위에서 받는다. 흥분성 PSD95 (postsynaptic density protein 95) 클러스터 TH+ DA의 신경세포의 돌기 샤프트에서 발견되었고 그들 중 다수는 TH+ DA 신경세에 무극 글루탐산성 골간(aspiny glutamatergic shaft) 시냅스의 존재를 나타내는 vGlut2(vesicular glutamate transporter 2) puncta와 병치되었다 (도 12A).

본 발명자들은 vGlut2+/PSD95+ 클러스터가 성상교세포와 공동 배양한 TH+ DA 신경세포에서 대조군 배양물에서보다 더 많이 검출되었음을 발견하였다 (도 12A, B).

Ctx-성상교세포로 배양된 것 보다 VM-성상교세포로 공동-배양된 TH+ 세포 상에서 상당히 많은 vGlut2+/PSD95+ 클러스터와 함께, 척추-유사 구조물 상의 글루타메이트성 시냅스는 VM-성상교세포에서만 발견되어 VM-성상교세포와의 보다 성숙한 신경 형태를 나타내었다. 또한 GABA 억제성 (vGAT+/Gephyrin+) 시냅스 점(puncta)은 성상교세포로 배양된 TH+ DA 신경세포의 섬유에 더 많이 국한되었다 (도 12A,B).

본 발명자들은 특히, KCl 유도된 탈분극에 의해 유발된 DA 방출이 성상교세포로 분화된 배양에서 유의하게 촉진되었음을 관찰하였다; 성상교세포에 의해 추진된 사전 시냅스 DA 방출은 Ctx-성상교세포를 가진 배양물에서 보다 VM-성상교세포를 가진 배양물에서 더 컸다 (도 1M). 중뇌 유형 DA (mDA) 신경세포는 Nurr1, Foxa2, Lmx1a/b, Pitx3 및 En1/2와 같은 몇몇 중뇌 특이적 유전자의 발현에 기초하여 특정된다. 이러한 중뇌 마커는 DA 표현형 유지, 생존 및 기능에서 중요한 역할을 하므로, 그들의 발현은 치료 목적을 위한 mDA 신경세포의 제조에 중요하다.

그러나 우리와 다른 연구자들은 mDA 뉴런에서 중뇌 특이 마커의 발현이 인 비트로 및 인 비보 환경에 크게 영향을 받음을 보여 주었으며, 따라서 인비트로 분화 후 및 인 비보 이식 후에 오랫동안 통로 중에 쉽게 손실되었다.

실제로, Foxa2, Nurr1 및 Lmx1a의 발현은 각각 분화 12일째에 TH+ 세포의 64, 44 및 46%에서만 검출되었다 (도 2A, B). 중뇌 마커 (도 2B)를 발현하는 TH+ DA 신경세포의 비율과 개별 TH+ 세포에서의 발현 수준(TH+ 세포의 핵에서 평균 형광 강도 [MFI]로 추정됨 (도 2C))은 성상교세포와 혼합된 배양에서 유의하게 더 컸다. VM-성상교세포와의 공동 배양은 중뇌 특이 마커를 공동 발현하는 거의 모든 TH+ 세포에서 가장 큰 효과를 나타내었으며, 중뇌 도파민 영양 작용에서 Ct-성상교세포 보다 VM-성상교세포의 기능적 우수성을 더 뒷받침했다. 분화된 배양물이 ROS 생산 제제 H₂O₂ (1000μM, 10 시간)에 노출되었을 때, 독소 처리되지 않은 TH+ DA 신경세포의 15%만이 Ctx-NPC와 혼합된 대조군 배양물에서 생존하였다 (도 2D, E). 예상대로, 현저히 낮은 비율의 DA 신경세포는 성상교세포의 존재 하에서 독성 자극 후에 사멸하였다.

또한, 성상교세포와 혼합된 배양물에서 TH+ 세포는 독소 처리에서 생존하고 광범위한 신경 돌기 성장으로 건강한 신경 형태를 보였으나, 반면에 대조군 배양물에서 살아남은 TH+ 세포의 대부분은 블런트되거나 단편화된 신경 돌기 (도 2D, 삽입), 신경성 노화와 퇴행성 표현형을 가졌다. 이 발견은 살아남은 TH+ 세포에서 섬유 길이의 정량화에 의해 뒷받침되었다 (도 2F). 또한, VM-성상교세포는 Ctx-성상교세포 보다 mDA 신경세포에 대해 훨씬 더 큰 보호 효과를 나타냈다 (도 2D-F).

종합적으로, 이러한 발견은 배양된 성상교세포가 형태학적으로, 시냅스적으로, 기능적으로 성숙하고 독성이 강한 모발에 저항성이 있는 실제 중뇌 유형 DA 신경세포 에 대해 VM-NPC 분화를 촉진함을 시사한다. 또한, 우리의 데이터는 mDA 신경세포 분화 및 생존에 대한 영양 작용 측면에서 VM-성상교세포가 Ctx-성상교세포 보다 우월하다는 것을 보여준다.

관찰된 성상교세포 활동의 근거리 분비( paracrine ) 방식

관찰된 성상교세포 작용은 성상교세포 및/또는 세포-세포 접촉 신호로부터 방출된 인자에 의해 매개될 수 있다. 파라크린 효과의 가능성을 시험하기 위해, 배지를 성상교세포 배양액 (또는 대조군으로서 분화된 Ctx-NPC 배양물)에 2일 동안 컨디션드 배지(CM)를 미분화된 VM-NPC 배양물에 첨가하였다 (도 3A). 성상교세포-CM은 분화 후 6일에 TH+ 세포 수율에 의해 추정된 대조군-CM과 비교하여 DA 신경세포로 VM-NPC 분화를 보다 효과적으로 촉진시켰다 (도 3B, C). 또한, CM 처리 42시간 동안 섬유의 성장(도 3D)과 분지(도 3E)는 대조군-CM에 비해 성상교세포-CM으로 처리된 분화된 배양에서 증가하였으며, VM-성상교세포-CM 처리에 의해 가장 증가하였다. 형태학 성숙 효과와 함께 성상교세포-CM 효과의 유사한 패턴이 TH+ DA 신경세포에서 성숙한 신경세포 마커인 NeuN의 발현에 나타났다 (도 3F, I, J). 중뇌 특이-인자인 Nurr1과 Foxa2의 발현(도 3G, H, I, J) 및 H₂O₂ 독소 처리에 의한 TH+ 세포 생존(도 3K-M)은 대조군-CM 또는 Ctx-성상교세포-CM으로 처리한 배양물에 비해 VM-성상교세포-CM 처리에서 크게 개선되었다. 이러한 발견은 종합적으로 도 1과 2에서 관찰된 성상교세포 기능이 성상교세포에서 분비된 파라크린 인자에 의해 적어도 부분적으로 매개된다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 다음으로 성상교세포-매개 신경 영양성 작용에 관여하는 파라크린 인자를 확인하려고 노력했다. 성상아교세포(astroglial cell)의 신경 영양성 인자 분비(neurotrophic factor secretion)와 일치하여 배양된 성상교세포는 다양한 신경 영양성 인자에 대한 mRNA 발현을 증가시켰다 (도 3N).

주목할 것은, GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor), SHH (sonic hedgehog), FGF8 (fibroblast growth factor 8)의 발현은 Ct-성상교세포나 대조군 Ctx-NPC에 비해 VM-성상교세포에서 크게 증가하였다. GDNF는 mDA 신경세포에 특이적인 생리적 신경 영양성 역할을 가지고 있으며, SHH는 Foxa2와의 자동 조절 루프를 확립함으로써 mDA 신경세포 발달 및 생존에서 가장 중요한 요소 중 하나이다. FGF8과 SHH의 협력 작용은 mDA 신경세포 발달에 중요하며, 따라서 이 사이토카인 조합은 줄기 세포로부터의 인 비트로 mDA 신경세포 패터닝에 일반적으로 사용된다. 또한, mDA 신경 발생에서 재생에 이르는 Wnt/β-catenin 신호 전달 및 VM-성상교세포에서 Wnt1 및 Wnt5a 단백질의 분비에 대한 중요한 역할이 보고되었다.

일관되게, 배양된 VM-성상교세포는 Wnt/Wnt 사이토카인 (Wnt1, 4, 5a)뿐만 아니라 Frzzled-LRP Wnt 수용체 복합체의 제거를 방지함으로써 Wnt/β-카테닌 신호 전달을 활성화시키는 R-스핀딘(R-spondin) 계열의 분비 단백질인 스폰딘-2 (SP0-2)도 풍부하게 발현하였다 (도 3N).

또한 배양된 성상교세포는 THBS-1 (thrombospondin-1), GPC (Glypicans) 4 및 6, 시냅스 형성을 촉진하는 분비성 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 발현을 증가시켰다; THBS-1 mRNA 수준은 Ctx-성상교세포에서 보다 VM-성상교세포 배양에서 더 높았으며, 이는 VM-성상교세포의 존재 하에서 DA 신경세포의 시냅스 성숙에 원인이 있음을 시사한다 [도 1I-L 및 도 12].

분화된 NPC, Ctx -성상교세포 및 VM -성상교세포 사이에서 차별적으로 발현된 유전자

관찰된 성상교세포 기능에 대한 더 많은 분자 통찰력을 얻기 위해, 본 발명자들은 공동 배양 및 CM 실험에 사용된 분화된 Ctx-NPCs (대조군), Ctx-성상교세포 및 VM-성상교세포의 RNA-시퀀싱 (RNA-seq) 분석을 수행하였다.

분화된 Ctx-NPCs (FPKM>1, log2>1)와 비교하여 Ctx-성상교세포에서 차등적으로 발현되는 유전자 (DEGs)는 분화된 Ctx-NPCs와 비교하여 VM-성상교세포의 DEG와 유의적으로 겹쳤다('N-1', Chi　square = 9059.4, df = 1, P < 2.2e-16, 도 4A). 유전자 세트 분석에서, 중첩된 유전자(이하 '공통적인 성상교세포 유전자')는 '세포 접착/세포 외 기질 (ECM)' '면역/염증 반응'과 '신경 세포 분화'와 관련된 유전자 존재론이 중첩된 유전자 온톨로지에서 풍부해졌다 (도 4B). 놀랍게도 Ctx-성상교세포와 VM-성상교세포 사이의 DEG에 대한 최상위 유전자 온톨로지도 유사한 유전자 범주에 속하였다 (도 4C, D).

배양된 성상교세포 (vs 대조군 NPCs)와 VM-성상교세포 (vs Ctx-성상교세포)에서 풍부한 유전자 세트는 유전자 세트 농축 분석(gene set enrichment analysis, GSEA)에서 추가로 확인되었다 (도 13A). 구체적으로, q-PCR (도 3N)에 의해 결정된 신경 영양성 인자에 대한 차등 발현 패턴이 RNA-seq 분석에서 유사하게 복제되었으며(도 4E), RNA-seq 분석의 충실도를 나타내었으며, 이들 신경 영양성 인자가 성상교세포의 관찰된 영양 효과에 대한 원인임을 추가로 확인하였다

최상위의 온톨로지에 주석 처리된 세포 접착/ECM은 손상된 조직의 줄기 세포 행동 및 재생 과정에서 세포-대-세포 및 세포-대-ECM 접촉의 중요성 때문에 주요 관심사이다. (Ctx-성상교세포 및/또는 대조군 NPC와 비교하여) VM-성상교세포에서 증가된 수준의 발현을 나타내는 세포 부착/ECM 분자에 대한 열-지도가 도 4E 및 도 13B에 도시되어 있다. 이들 유전자 중에서, 성상교세포(VM-성상교세포)에서 fibronectin 1과 Collagen IV의 상향 조절된 발현은 DA 신경세포의 성공적인 생착이 PD의 동물 모델에서 인테그린과 피브로넥틴 사이의 상호작용을 통한 세포 대 ECM 접착을 필요로 한다.

또한, VM-성상교세포의 또 다른 상향 조절된 유전자인 tenascin은 뇌 손상 및 이식 후 이식된 DA 신경세포의 부착과 생존을 증가시킨다.

CSPGs(Chondroitin sulfate proteoglycans)는 축삭 재생과 신경 발생을 억제하는 것으로 알려져 있다. 특히, Neurocan (CSPG3)과 Brevican (CSPG7)의 발현은 Ctx -성상교세포와 대조군 NPC 배양물과 비교하여 VM-성상교세포 배양물에서 크게 하향 조절되었다 (도 4E). 게다가, 배양된 Ctx- 및 VM-성상교세포는 일반적으로 신경 돌기 성장을 억제하는 미엘린-염기성 단백질 (myelin-basic protein (MBP)) 및 미엘린-관련 단백질(myelin-associated protein (MAG)), 신경 염증을 일으키는 펩타이드인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (myelin oligodendrocyte glycoprotein) (MOG35-55)의 발현을 현저하게 감소시켰다.

성상교세포에서 대조군 NPC와 비교하여 면역 염증 반응의 카테고리에서 DEG가 풍부해진 것은 성상교세포가 일반적으로 세포형 중재 뇌 염증으로 여겨지는 것을 고려하면 놀랄 일이 아니다.

성상교세포 배양에서 전-염증성 사이토카인 mRNA의 발현이 증가하였고, 흥미롭게도 VM-성상교세포에서 Ctx-성상교세포 보다 높았다 (도 4E 및 도 13A).

전-염증성 사이토카인은 세포 방어 메커니즘을 유발할 수 있으며, 종종 증가된 연결 분화 및 생존과 관련이 있다. 이러한 긍정적인 측면에도 불구하고, 공통적인 생각은 전-염증성 사이토카인이 세포 독성 염증성 환경을 확립한다는 것이다. 전-염증성 유전자 발현 증가와 함께 항-염증성 및 신경 영양성 아교세포(glial) 마커의 유전자 발현도 성상교세포 배양에서 증가하였다 (도 4E).

예를 들어, VM-성상교세포 배양에서 가장 많이 발현된 유전자는 IL-10 계열의 항 염증성 사이토킨인 IL-19이다. 다른 항-염증성 마커 arginase 1 (Arg1, NO 생합성을 억제하는 효소) 및 IL-1 수용체 길항제(IL1RN)의 mRNA 발현 수준은 배양된 VM-성상교세포에서 Ctx-성상교세포 및 대조군 NPC 배양물 보다 훨씬 높았다: VM-astrocytes, Ctx-astrocytes 및 대조군 NPC 각각에 대하여, ARG1의 FPKM은 49.9, 5.5 및 0.03이었으며, IL1RN의 FPKM은 14.0, 1.4 및 0.04였다 (도 4E). 낮은 FPKM 값 (<1)으로 인해 유전자 농축 분석에서 제외되었지만, 항염증성 사이토카인 IL-10 및 IL-27의 발현은 가장 높았으며 VM-성상교세포 배양에서만 검출되었다. I형 인터페론 (IFN) α 및 β는 mDA 신경 세포 변성에 대해 항-염증성 및 신경 보호 활성을 나타낸다. I형 IFN의 항-염증 작용은 성상교세포에서 아릴 탄화수소 수용체 (AHR)를 통해 매개되는 것으로 최근 보고된 바 있다.

주목할 것은, qPCR 분석에서 I형 IFN 발현의 증가와 함께 (도 4F), VM-성상교세포 배양에서 AHR 발현 수준은 또한 크게 조절되지 않았다 (FPKM: 51.34 [VM-성상교세포], 6.21 [Ctx-성상교세포] 및 3.21 [NPC]) (도 4E), 이러한 항-염증성 사이토카인/수용체의 발현이 VM-성상교세포와 함께 배양된 배양물에서 염증 세포 독성 효과를 완화시킴으로써 세포 생존을 개선시키는데 기여한다는 것을 나타낸다.

전-염증성 및 항-염증성 유전자의 발현 수준의 증가는 qPCR 분석에 의해 추가로 확인되었다 (도 4F).

여러 항산화 유전자의 발현은 대조군 NPC와 비교하여 상기 배양된 성상교세포에서 상향 조절되었다 (도 4E). 그러나, 세포 내 글루타티온 수준으로 추정되는 ROS 소거 활성은 대조군 배양물 보다 상기 배양된 성상교세포에서 상대적으로 낮았다 (도 14A).

성상교세포의 또 다른 신경 보호 메커니즘은 글루타메이트 유도 독성의 clearance 를 통해 일어난다. 배양된 성상교세포에서 글루타메이트 트랜스포터 GLAST 및 GLT-1이 풍부하게 발현됨에 따라 (도 11B, C), 글루타메이트 흡수 활성이 상기 배양된 성상교세포에서 대조군 NPCs 보다 더 컸다 (도 14B). 특히, 배양된 VM-성상교세포에서 Ctx-성상교세포와 비교하여 글루타메이트 섭취가 훨씬 더 많음에 따라, 글루타메이트 제거 활성이 증가하면 성상교세포, 특히 VM-성상교세포가 관여하는 신경 보호 작용에 기여한다는 것을 알 수 있다.

Nurr1 + Foxa2 과발현은 VM -성상교세포의 신경 보호 작용을 더욱 강화시킨다.

본 발명자들은 VM-성상교세포에서 Nurr1+Foxa2 과발현이 성상교세포-매개 도파민 친화성 작용을 추가로 촉진하는지를 조사하였다.

VM 성상교세포는 Nurr1+Foxa2 발현 렌티바이러스 또는 모의 바이러스 (대조군)로 형질도입시켰다. 수확된 VM-NPC를 형질도입된 성상교세포와 함께 배양하고, 이식 시 치료 용량과 관련된 NPC 행동을 평가하였다 (도 5A). DA 신경세포 수율(도 5B), 형태학적(TH+ fiber lengths; 도 5C) 및 시냅스 성숙 (SV2+ puncta density; 도 5D), 및 Nurr1+Foxa2-형질도입된 VM-성상교세포 존재 하(N+F-astrocytes)에 VM-NPC로부터 분화된 DA 신경세포에서 중뇌 특이 마커의 발현(도 5E)은 대조군-성상교세포와 함께 배양된 배양물과 구별할 수 없었다.

그러나, DA 신경전달물질 방출에 의해 추정된 바와 같이, 시냅스 전 DA 연결 기능은 대조군-성상교세포로 분화된 배양물에서 보다 Nurr1+Foxa2-성상교세포의 존재 하에서 분화된 배양물에서 유의하게 더 컸다 (도 5F).

또한, Nurr1+Foxa2-성상교세포의 존재 하에서 분화된 TH+ DA 신경세포는 대조군-성상교세포와 공동 배양 차별화된 TH+ DA 신경세포 보다 H₂O₂ 처리에 의해 유도된 독성 손상에 대해 더 내성이 있었다 (도 5G, H). 대조군-CM으로 처리한 배양물과 비교하여 Nurr1+Foxa2-성상교세포에서 컨디션드 배지 (N+F-CM)로 처리한 배양물에서 더 많은 수의 TH+ DA 신경세포와 더 건강한 연결 형태가 관찰되었으며 (도 5I-L), 이는 Nurr1+Foxa2 신경 보호 작용이 파라크린(paracrine) 방식으로 중재되었음을 시사한다.

대조군-성상교세포와 비교하여 N+F-성상교세포의 RNA-seq 분석에서 DEG가 강화한 상위 10개 온톨로지에는 '면역/염증', '상처 치유 반응' 및 '세포 부착'을 포함하였다 (도 6A).

게다가, 우리는 N+F 성상교세포 vs. 대조군-성상교세포 (log2<-1)에서 발현이 감소된 유전자를 가진 유전자 세트 분석을 수행했을 때 상위 5개 온톨로지 중 4개가 '면역/염증'과 관련이 있었으며(도 6B, D), 이는 큐레이트된 유전자 세트 '면역 반응' 및 '염증 반응'을 갖는 GSEA에 의해 추가로 확인되었다(도 6C)

VM 성상교세포에서 Nurr1 + Foxa2 발현이 주로 면역/염증 매개 신경 독성을 감소시킴으로써 외인성 신경 보호 역할을 수행할 수 있음을 나타낸다.

특히, 전-염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α 및 iNOS) 및 미엘린-관련 단백질 (MBP, MAG 및 MOG)의 감소된 mRNA 수준이 RNA-seq 데이터에서 나타났으며 (도 6E), 이들을 qPCR 분석에 의해 추가로 확인하였다 (도 6F). 또한, Nurr1+Foxa2-성상교세포에서 분비 신경영양성 (SHH, BDNF, GDNF, NT-3) 및 항염증성 (IFN-α, IFN-β)의 발현이 증가하였다 (도 6F). 이들이 또한 N+F-CM 매개 신경 보호 작용에 기여했음을 시사한다.

RNA-seq 데이터에 대한 추가 연구로 N+F-성상교세포에서 유전자 발현이 상향 조절된 여러 개의 항산화 효소가 확인되었다 (도 6E). 일관되게, 현저하게 더 큰 세포 내 글루타티온 수준이 대조군 VM-성상교세포 배양액과 비교하여 N+F-VM-성상교세포에서 나타났다 (도 15A).

상향 조절된 분비 ROS 소거 인자 SOD3 및 GPX3 (도 6E)과 일치하여, mDA 뉴런 풍부 배양물 (VM-NPC로부터 분화된)의 ROS 수준은 N+F-CM 처리에 의해 극적으로 감소되었다 (도 15B).

이러한 결과는 종합적으로 Nurr1+Foxa2에 의한 VM-성상교세포에서의 향상된 ROS 소거능이 N+F-성상교세포-매개 신경 보호 작용에 기여한다는 것을 나타냈다. 그러나 글루타메이트 흡수 활성은 대조군과 N+F-VM-성상교세포 사이에서 구별할 수 없었다 (도 15C).

성상교세포의 공동 이식은 신경 영양성 숙주 두뇌 환경을 확립함으로써 VM-NPC 이식의 세포 치료 효과를 강화시켰다.

인 비트로 데이터가 분명히 배양된 성상교세포의 신경영양 작용을 서포트했지만, 유사한 성상교세포-매개 효과가 인 비보 숙주 뇌에서 이식한 후에 발생한다면, 이식된 세포는 필연적으로 적대적인 염증성/면역 원성 환경에 노출되고 세포사멸 과정에서 파괴된 혈액 뇌 장벽(BBB)을 통해 들어갈 수 있는 외음부, 신경세포 및 말초 혈액 세포와 같은 내인성 세포와 상호 작용한다. 특히, 아교세포가 지연 부상 단계 동안 유해한 표현형으로 재활성화될 수 있으며 이식 후 이식된 성상아교세포(astroglia)가 해로운 표현형으로 전환될 수 있다는 우려가 제기되었다. 따라서, 배양된 성상교세포의 이식이 신경 영양성 환경을 만들 수 있는지를 결정하기 위해 이식 실험의 첫 라운드를 수행하였다.

인 비트로 데이타와 유사하게, 신경 이식 인자 (GDNF, NT3, SHH, Wnt1, 3, 5), 영양 ECM 단백질 (COL6A2, FN1, THBS-1) 및 항산화 단백질 (GPX3 및 SOD3)의 발현은 이식 후 1개월째 대조군 Ctx-NPC (또는 Ctx-성상교세포)로 이식된 선조체와 비교하여 VM-성상교세포로 이식된 선조체에서 상향 조절되었다 (도 7A). 또한, 항-염증성 표현형 마커 (IFN-β, CCL17, IL-1R2, IL-1RN, Ym1 및 IL10)의 발현은 VM-성상교세포가 이식된 뇌에서 더 컸다.

주목할 만하게, 인 비트로 발견과 달리, 전-염증성 표현형 유전자의 발현은 증가하지 않았고, 일부 유전자 (iNOS, IL-1β, CXCL11)는 대조군 NPC로 이식된 뇌에 비해 VM-성상교세포로 이식된 뇌에서 하향 조절되었다 (도 7A), 이는 인 비트로에서 전-염증성 유전자의 높은 발현의 순수 VM-성상교세포 특성이 내인성 세포와의 상호 작용으로 인해 이식된 생체 내 뇌 환경에서 변형되었음을 시사한다.

내인성 미세아교세포/성상교세포가 이식된 VM-성상교세포와의 상호작용으로 인해 항염증제/신경 영양성 표현형으로 활성화될 수도 있다. 우리는 면역 조직 화학적 분석에 의한 성상교세포 이식 효과를 확인하였다 (도 7B). 염증/세포 독성 인자(iNOS, CD11b, CD16)를 나타내는 세포의 감소와 함께, 항염증성/신경 영양성 아교세포(Arg1, CD206)에 특이적인 마커에 대한 면역 반응성 세포(astrocytes, microglia)는 배양된 성상교세포로 이식된 뇌의 이식-숙주 계면에서 Ctx-NPC로 이식된 세포와 비교하여 유의하게 더 컸다. 대조군 VM-성상교세포로 이식된 뇌와 비교하여 N + F-형질도입된 VM-성상교세포로 이식된 뇌에서 신경 영양성, 항산화 및 ECM 유전자의 상향 조절된 발현 양상이 관찰되었다 (도 8A).

N + F-VM-성상교세포 이식에 의한 표현형 전환은 대조군 VM-성상교세포로 이식된 뇌와 비교하여 N + F-VM-성상교세포로 이식된 뇌에서 전-염증성/세포 독성 표현형 마커의 발현이 감소하고 항염증성/신경 영양성 표현형 마커의 발현이 증가하는 면역조직화학 분석에서 더 명확히 되었다 (도 8B).

이러한 결과는 배양된 VM-성상교세포의 이식이 신경 영양성 뇌 환경을 형성할 수 있고, 공여 성상교세포의 Nurr1 + Foxa2 발현이 성상교세포 이식 효과를 강화시킨다는 것을 보여준다.

우리는 궁극적으로 공동-이식 성상교세포가 PD에서 세포 치료 결과를 향상시킬 수 있는지 평가하였다. 배양된 VM- 또는 Ctx-성상교세포 (또는 대조군으로서 Ctx-NPCs)와 혼합된 VM-NPC를 hemi-parkinsonian 랫트 모델 내로 병리학적으로 이식하고 PD 관련 행동을 이식 후 6개월 동안 평가하였다.

암페타민-유도 회전 시험은 VM-NPCs + Ctx-NPC (대조군)으로 공동-이식된 PD 마우스의 이식 전 값에 비해 회전 점수의 사소한 감소만을 나타내었지만 성상교세포와의 공동-이식으로 더 큰 행동 회복을 달성하였다 (도 9A).

특히, VM-NPCs와 함께 N + F-VM-성상교세포의 공동 이식은 회전 점수에서 거의 완전한 회복을 가져왔다 (이식 후 3개월에서 회전 점수가 95% 이상 감소, n = 6).

우리는 또한 이식 후 6개월에 비약리학적 검사를 사용하여 PD 행동을 평가하였다. 단계 조정(도 9B) 및 실린더 테스트 (도 9C)에서 유사한 동물 그룹 패턴이 관찰되었다.

인 비트로 공동-배양 및 CM 실험뿐만 아니라 행동 분석의 데이터와 일치하여, 이식 후 6개월 동안 수행된 조직학적 분석은 대조군 NPC 보다 성상교세포로 이식된 랫트에서 훨씬 더 큰 TH+ 세포 이식물의 형성을 나타내었다 (도 9D, E). DA 신경세포 생착에 대한 모든 지수(도 9E-G)는 VM-성상교세포와 함께 이식된 동물에서 Ctx-성상교세포에 비해 현저히 더 컸으나, VM-성상교세포 vs. N + F-VM-성상교세포로 공동- 이식된 동물군 간에는 지표에서 유의한 차이가 발견되지 않았다. 성상교세포로 공동-이식된 선조체의 TH+ 세포는 TH+ 섬유 길이(도 9J)와 시냅스+ puncta 밀도(도 9K,L)의 추정에 의해 확인된 대조군 이식편 보다 건강하고 성숙한 신경 성숙을 나타냈다 (도 9H, I). 대조군- VM-성상교세포를 이식한 군과 비교하여 N + F-VM-성상교세포-이식 군에서 TH+ 섬유 길이의 약간의 증가만이 검출되었다 (도 9J).

놀랍게도, 이식 후 공여 세포에서 쉽게 발현되지 않는 중뇌 특이 마커 Nurr1 및 Foxa2는 성상교세포 공동-이식에 의해, 특히 이식 후 6개월에도 N + F-VM-성상교세포와 공동-이식함으로써 생성된 이식편에서 TH+ DA 신경세포에서, 충실하게 국한되었다(도 16A-C). 이식편에서 TH+ DA 신경 세포는 GFAP+ 성상교세포 (아마도 이식되고 내인성 모두) (도 16D)와 Iba+미세아교 (내인성) (도 16E)에 둘러싸여 있었다.

Iba+미세아교는 resting 또는 신경 보호 형태학으로 분화되어 이식된 DA 신경세포가 이웃하고 커버되므로 보호되었음을 나타낸다. 이러한 결과는 VM-NPC와 성상교세포, 특히 N + F-VM-성상교세포의 공동 이식이 숙주 뇌 환경을 개선하기 위해 성상교세포 활동을 통한 성숙한 본격적인 mDA 신경세포의 장기적인 이식을 가능하게 함을 나타냈다 (도식화된 요약은 도 10에 도시됨).

세포 이식 후 파킨슨 환자 host brain으로부터 α- synucleinopathy가 이식된 세포에 전달됨이 파킨슨병 세포이식 치료의 큰 문제로 대두되었다 .

α-synuclein은 정상적으로 신경세포에서 발현되어 신경신호전달 등 정상적인 역할을 담당하는 단백이나 a-synuclein의 양의 증가 및 병적 환경 하에서 비정상적인 병적 응집체(aggregate, Lewy body라 함)가 형성되면 파킨슨병과 같은 신경 퇴행성 질환을 유발하는 요인이 된다. 그러므로 a-synclein aggregate에 의한 a-synucleinopathy를 제거하는 것이 파킨슨병 예방 및 치료의 해결책이다.

그런데 a-synclein 응집은 프리온(prion)과 같은 특성이 있어 한 세포에서 다른 세포로 이동하는 특성이 있으며 파킨슨병 환자가 사망한 후 환자의 brain을 살펴보면 α-synuclein이 host에서graft로 이동하여 침투하는 현상이 관찰되었다.

본 발명자들은 성상교세포 중 특히 중뇌형 성상교세포(VM-AST)에서 α-synuclein aggregation 의 억제 및 제거에 관련된 유전자(INF-알파, INF-베타)의 발현이 증가됨을 RNA-SEQ 분석에서 발견하였다[도 4F].

또한 대식작용(Phagocytosis) 및 자가소화작용(Autophagy)에 관련된 유전자들이 중뇌형 성상교세포에서 높게 발현되고 있음을 알아내었다 (도 20).

염증반응은 병적 단백 응집을 촉진하며, 항염증물질, 항산화 및 신경영양성 (Neurotrophic) 물질들은 병적단백응집체 형성을 억제하는 것으로 알려졌는데, 본 발명자들은 중뇌형 성상교세포가 이식된 graft 주변에서 신경영양성 (Neurotrophic), 항산화(Anti-oxidant) 및 항염증반응 (Anti-inflammation)이 매우 증가되어 있는 것을 밝혀내었다 (도 7A).

이런 연구결과를 토대로 중뇌 신경줄기세포와 성상교세포를 a-synucleiopathy를 동반한 파킨슨병 모델 마우스에 공동 이식하였을 때 α-synuclein 응집 형성 억제, 제거(clearance) 및 세포간 이동 억제되어 이식된 세포에 a-synucleinopathy 출현이 방지되는지 알아보고자 하였다.

1) α- synuclein과발현된 도파민 신경세포에 성상교세포를 공동 배양함으로써 α- synuclein 응집체 형성 감소 효과 확인

대조군에 비해 성상교세포와, 특히 중뇌형 성상교세포와 공동 배양 시 α-synuclein 응집체 형성이 감소됨을 a-synucelin/Thioflavin S면역화학염색법 (Immunoncytochemistry) (Thioflavin S: 병적단백 응집체 검출 염색) 및 단백질전기영동법(Western blot)으로 확인할 수 있었다(도 21~22).

2) 성상교세포에서 분비된 factor에 의한 세포간 α- synuclein aggregate 이동 및 응집 억제 효과

성상교세포의 조건화 배지(Conditioned medium), 특히 중뇌형 성상교세포가 대조군 및 대뇌피질 성상교세포에 비해 신경세포로의 α-synuclein 이동(transmission)을 더욱 억제하는 사실을 확인할 수 있었고(도 23), SH-SY5Y 세포에 α-syn-GFP, α-syn-mCherry를 α-synuclein을 과발현시키고 각각을 공동 배양시킨 후에도 GFP와 mCherry의 발현 정도를 측정하였을 때 응집(aggregation)도 억제되는 것을 관찰하였다(도 29-33). 이를 통해 성상교세포뿐만 아니라 성상교세포가 방출하는 인자들도 α-synuclein의 이동 및 이동된 세포에서의 제거에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.

3) 성상교세포에서 분비된 factor에 의한 α- synuclein aggregate 분해 효과

중뇌성상교세포에서 PFF를 처리 후 남아있는 PFF를 관찰하였을 때에 α-synuclein aggregate이 분해되는 것을 확인하였으며(도 34), 성상교세포에서 분비된 특정 물질에 의해 α-synuclein aggregation의 분해되는 것을 확인하였다.

4) α- synucleinopathy유발 파킨슨병 모델 마우스에서 중뇌형 성상교세포 공동 이식(co- grafting )에 의한 이식된 세포 ( graft )에 α- synuclein 응집체 출현 억제 효과

이에 대한 결과로 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)와 중뇌성 성상교세포(VM-Ast)를 공동 이식한 graft는 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 단독 이식한 대조군에 비해 도파민 신경세포가 더욱 많고 큰 graft의 형성을 관찰하였고 p-αsyn(α-syn의 aggregation form)이 graft 내로 침투하지 못하고 주변에도 관찰되지 않은 반면 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 단독 이식한 대조군에서는 관찰되었음을 확인하였다 (도 25).

또한 protein aggregation form을 관찰할 수 있는 Thioflavin S 역시 p-αsyn과 마찬가지로 성상교세포군의 graft내로 침투하지 못하고 주변에 존재함을 관찰하였고 대조군은 graft에 침투되어 도파민 신경세포가 사멸한 것을 관찰하였다 (도 26).

이러한 효과가 성상교세포가 의한 것임을 관찰하기 위하여 성상교세포 마커인 GFAP와 Thioflavin S 를 staining하여 관찰하였고 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)와 중뇌성 성상교세포(VM-Ast)에서 형성된 graft내에서 많은 성상교세포가 존재하며 이러한 성상교세포 내에는 Thioflavin S 관찰되지 않는 반면 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)를 단독 이식한 대조군에서는 GFAP를 거의 관찰할 수 없었고 Thioflavin S가 graft 내의 많은 세포에서 발현되고 있음을 확인하였다 (도 27).

5) Inflammation유발 파킨슨병 모델 렛트에서 인간 중뇌형 성상교세포 이식(grafting)에 의한 염증 억제 효과

성상교세포의 항염증 효과 가능성 확인을 위해, 성상교세포의 이식(grafting)후에 이식된 세포 (graft)염증 억제 결과를 랫트의 선조체(striatum) 왼쪽은 인간 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 이식, 오른쪽은 인간 중뇌성 성상교세포(VM-Ast) 이식으로 관찰하였다. 인간 중뇌성 성상교세포(VM-Ast)에서 인간중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)에 비해 염증 면역 반응 [CD11b(M1 type 염색)/Iba1(microglia 염색)]이 감소함을 확인하였으며(도 35) 항염증 면역 반응 [Arg1(M2 type 염색)/Iba1(microglia 염색)]의 증가함을 확인하였다 (도 36).

6) α- synucleinopathy 유발 파킨슨병 모델 마우스에서 중뇌형 성상교세포 공동 이식(co- grafting )에 의한 안정적인 도파민 신경세포의 생존 및 유지 효과 확인

이에 대한 결과로 인간 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC)와 중뇌성 성상교세포(VM-Ast)를 공동 이식한 graft는 중뇌 신경 전구세포(VM-NPC) 단독 이식한 대조군에 비해 도파민 신경세포가 더욱 많고, 잘 유지되며 큰 graft의 형성을 관찰하였다 (도 37).

토의

이식 후 숙주 뇌가 이식된 세포에 적대적인 것으로 알려져 있으며, 이 유해한 뇌 환경은 불량한 세포 이식 치료 결과에 대한 책임이 있다. 그럼에도 불구하고, 세포 치료 효과를 향상시키기 위해 숙주 뇌를 표적으로 하는 것은 몇몇 연구에서만 다루어졌다.

또한, 이들 연구 중 어느 것도 염증 세포 독성 숙주 뇌 환경을 근본적으로 교정하는 접근법을 사용하지 않았다. 성상교세포의 생리학적 신경영양 기능에 기초하여, 이 세포 유형의 이용은 병리학적 뇌 환경을 변형시키는 잠재적인 전략이다.

그러나, 주로 병든 뇌 세포의 유해한/신경 독성 표현형으로 이러한 세포 유형의 잠재적 재활성화 때문에 신경계 질환에 대한 성상교세포-기반 요법의 개발에 대한 연구는 거의 없다.

그러나 누적된 연구는 배양된 성상교세포는 일반적으로 도 11D-H에서 입증된 미성숙 특성을 나타내며 이식된 미성숙한 성상교세포는 CNS 손상 후에 유해한 재활성화를 겪지 않고 손상된 CNS에서 신경 돌기의 성장을 돕고 아교 흉터 형성을 감소시키는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 바탕으로 우리는 PD에 대한 세포 이식의 치료 효능을 향상시키기 위해 성상교세포와의 공동-이식을 시도하였다.

도 11A에 나타내었듯이, 성상교세포 배양은 종종 미세아교세포에 의해 점점 더 오염(contamination)된다. 미세아교세포는 성상교세포의 전-염증/세포 독성 재활성화를 유도한다. 또한, 성상교세포의 신경 영양성 기능에도 소량의 미세아교세포 (<1 %)가 필요하다고 보고된 바 있다.

미세아교세포 오염이 성상교세포의 신경 영양 기능에 영향을 미치는지 확인하고자, 우리는 배양 프로토콜을 수정하여 미세아교가 없는 성상교세포 배양 생성하였다 (마일드한 트립신 처리 단계의 1 라운드 포함, 실험방법 참조).

순수 성상교세포 배양에서 유래된 CM에 의해 촉진되는 mDA 신경세포 분화, 형태적 성숙 및 독소 내성은 마이너 미세아교세포 집단을 포함하는 성상교세포 배양물로부터 CM에 의해 촉진된 것과 유사하거나 약간 낮았다 (도 17) 배양의 성상교세포는 미세아교세포의 부재 하에 관찰된 영양 작용을 발휘할 수 있으며, 소량의 미세아교세포 오염(본 실험에서, <0.5 %)은 또한 성상교세포의 순수한 신경 영양성 작용에 영향을 미치지 않는다.

더 나아가서, 미세아교세포 오염의 더 높은 수준은 유해하거나 유익한 것으로 확인되어야 한다. 신경세포와 마찬가지로, 성상교세포는 또한 영역성을 갖고 영역 특유의 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서, VM 신경원성 적소로부터 배양된 성상교세포는 도파민 영양이 예상된다. VM 유래 성상교세포가 GDNF, FGF2 및 Wnt의 분비를 통해 DA 신경세포 분화 및 생존을 촉진한다.

본 실험에서, 본 발명자들은 피질의 비-도파민성 영역에서 배양된 성상교세포와 비교하여, 배양된 VM-성상교세포의 도파민 친화도 기능을 시험하기 위해 이식 후 체외 및 체외에서 추가로 체계적이고 비교 분석을 수행하였고, VM-Nurr1 + Foxa2를 가진 성상교세포는 아교세포의 신경 영양 기능을 강화시켰다.

VM-성상교세포에 의해 확립된 niche에서, 이식된 NPC가 형태학적으로, 시냅스적으로, 그리고 기능적으로 성숙한 mDA 신경 세포로 효율적으로 분화되고, 이식 후 장기간 생존한 분화된 mDA 신경 세포는 중뇌 특이 마커의 발현을 유지한다.

Nurr1과 Foxa2와 같은 중뇌 특이 인자의 발현은 mDA 신경세포의 생존, 기능 및 표현형 유지에 이러한 유전자의 발현이 필요하기 때문에 성공적인 mDA 신경세포 생식의 중요한 지표이다.

중뇌 인자의 발현이 스트레스성 조건에서 쉽게 상실된다는 것을 고려하면, 성상교세포의 존재에서 중뇌 마커의 지속적인 발현은 적대적인 염증성 숙주 뇌의 환경을 신경 영양성 환경으로 변화시키는 관찰된 성상교세포 작용에 의해 달성될 것으로 보인다.

성상교세포가 매개하는 도파민 영양성 틈새의 기초가 되는 메커니즘에는 보고된 신경 영양 인자의 분비뿐만 아니라 Ctx-성상교세포 보다 배양된 VM-성상교세포에서 훨씬 더 많은 발현 수준을 갖는 SHH 및 FGF8과 같은 다른 사이토카인을 포함한다. SHH 및 FGF8의 발현은 VM-성상교세포의 양성 조절 루프에서 배양된 VM-성상교세포에서 높은 수준으로 유지되는 중뇌 특이 전사 인자 Foxa2 및 Lmx1a에 의해 각각 조절될 가능성이 있다.

또한, VM-성상교세포는 시냅스유전성 ECM 인 트롬보스폰딘과 글리피칸을 포함한 다양한 세포-세포 접촉과 ECM 분자의 합성 증가와 피질 유래 성상교세포 보다 우수한 글루타메이트 제거 활성을 나타내었다. VM-성상교세포에서 중뇌 특이 인자인 Nurr1 + Foxa2의 기술은 염증을 감소시키고 ROS 소거 활성을 증가시킴으로써 주로 신경 보호 작용을 향상시켰다. 관찰된 Nurr1 + Foxa2 기능을 기반으로, 성상교세포에서의 이러한 인자 발현을 프라이밍 (priming)하는 것은 공동-이식 전에 강력하게 제안된다. 그러나, 이 연구에서 사용된 렌티바이러스 형질감염을 포함한 exogene 발현을 위한 현재 이용 가능한 방법은 세포에 대해 점점 더 독성을 나타내므로 순진한 세포 기능을 감소시킬 수 있다.

사실, 나란히 비교 분석한 결과, 바이러스성 형질감염된 성상교세포의 신경 영양 인자 발현 감소와 함께, DA 방출 및 H2O2 독소에 대한 DA 뉴런의 내성은 모의 형질도입된 VM-성상교세포에서 제조된 CM으로 처리한 mDA 신경 세포 배양에서 비-형질도입된 VM-성상교세포로부터의 CM으로 처리된 것 보다 현저히 낮음을 보여주었다(도 18).

Nurr1 + Foxa2 과발현 효과는 드라마틱하고 성상교세포 기능의 바이러스 형질 도입에 의한 감소를 충분히 극복했으며 모든 검정에서 비-형질도입된 대조군 보다 유의하게 큰 신경 영양성 작용을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, Nurr1 + Foxa2 매개성 영양 작용을 최대화하기 위해서는 최소한의 부작용으로 외인성 발현 시스템을 개발해야 한다.

이 연구에서 성상교세포 동시 이식의 효과는 극적으로 나타났으며, PD 마우스에 이식한 후 적어도 6개월 동안 거의 완전한 행동 복원과 광범위한 DA 신경세포 생체 이식이 이루어졌다.

이식 후 6개월째에 VM-성상교세포와 N + F-VM-성상교세포가 이식된 PD 마우스에서 동물 당 3,762 개 및 3,916 개의 TH + DA 신경세포가 검출되었는데 (공여 세포를 변형시키지 않고), 이는 특히 장기간의 공여자 세포 생존 및 치료 효능을 위해. 숙주 뇌 변형 전략의 필요성을 강력히 시사한다.

결론적으로, 우리는 PD에 대한 세포 치료 접근법의 미래 옵션으로 성상교세포 공동 이식을 제안한다.

또한, 성상교세포 이식만으로 뇌 환경을 개선함으로써 치료 효능을 발휘할 수 있으며, SN의 남아있는 내인성 Mda 신경세포가 축색 돌기를 확장시켜 DA를 선조체로 방출하고 선조체 GABA성 신경계가 구제된다. 성상교세포는 배양된 성상교세포로부터 방출된 인자에 의해 글루탐산 및 GABA 신경계의 신경세포 수율을 포함하는 총 신경세포 수율이 촉진되는 팬-신경세포 영양 처리를 발휘한다 (도 19).

따라서, 성상교세포 이식 전략은 다른 중추 신경계 질환을 치료하는데 활용될 수 있다.

또한, 중뇌 성상교세포와 도파민 신경전구세포의 공동 이식은 in vitro와 in vivo 실험을 통하여 α-synuclein이 중뇌형 성상교세포에 의해 이동(transmission)과 응집(aggregation) 및 제거(clearance)의 감소에 영향을 미치는 것을 확인하였다.

즉, α-synucleinopathy에서 중뇌형 도파민 신경전구세포와 성상교세포의 공동 이식을 통하여 α-synuclein의 응집 및 제거, 그리고 이식된 도파민 신경세포로의 이동을 막음으로써 도파민 신경세포의 생존 및 유지를 도움으로 파킨슨병의 세포이식 치료에 중요한 해결책을 제시할 수 있을 것이다.

Claims (12)

1. 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포(astrocytes) 및 도파민 신경전구세포(neural progenitor cells)를 포함하는, 공동 이식을 위한 파킨슨병 치료용 세포치료제.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 성상교세포는 Nurr1(Nuclear receptor related 1)과 Foxa2(forkhead box protein A2)이 과발현된 것인, 공동 이식을 위한 파킨슨병 치료용 세포치료제.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 성상교세포와 신경전구세포는 1 : 1.5 ~ 3의 세포 수 비율로 혼합하는, 공동 이식을 위한 파킨슨병 치료용 세포치료제.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   알파-시뉴클레인 응집체 형성 및 이동을 억제하는, 공동 이식을 위한 파킨슨병 치료용 세포치료제.
   
5. 삭제
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8. 중뇌(ventral midbrain) 유래의 성상교세포 및 도파민 신경전구세포를 포함하는, 공동 이식을 위한 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 성상교세포는 Nurr1(Nuclear receptor related 1)과 Foxa2(forkhead box protein A2)이 과발현된 것인, 공동 이식을 위한 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 성상교세포와 신경전구세포는 1 : 1.5 ~ 3의 세포 수 비율로 혼합하는, 공동 이식을 위한 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
11. 삭제
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