CN112368004A - 细胞组合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于移植GABA能神经元的组合物和方法。根据本发明的GABA能神经元和包括其的组合物可以用于基于细胞的疗法中，以恢复或加强受试者的神经系统中的中枢抑制并且治疗与神经功能受损或异常相关的神经学病状、疾病和病症。在优选的实施方案中，移植组合物包含GABA能神经元、GFR‑α激动剂和至少一种细胞凋亡抑制剂，并且所述GABA能神经元是通过分化多潜能干细胞、多能干细胞或祖细胞而产生的。

Description

细胞组合物和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年6月8日提交的澳大利亚临时申请第2018902072号的优先权，所述澳大利亚临时申请的全部内容通过交叉引用并入本文中。
本发明涉及用于移植GABA能神经元的组合物和方法。根据本发明的GABA能神经元和包括其的组合物可以用于基于细胞的疗法中，以恢复或加强受试者的神经系统中的中枢抑制并且治疗与神经功能受损或异常相关的神经学病状、疾病和病症。
背景技术
慢性疼痛已经对全世界数以亿计的患者、家庭和护理者的生活质量产生巨大影响，并且当前的疗法不足以解决大多数患者的疼痛。在全球，估计慢性疼痛每年花费上万亿美元，这类似于癌症、心脏病或糖尿病的花费。重要的是，缺乏针对慢性疼痛的有效治疗已经给社会带来连锁反应，例如阿片类药物的流行，其中自2000年以来，已经有>200,000人死于处方阿片类药物过量。重要的是，慢性疼痛的发生率随年龄而增加，并且与许多年龄相关性疾病(如癌症和糖尿病)相关；因此，在老龄化社会中，慢性疼痛代表明显且尚未得到满足的临床问题。神经性疼痛可以表现为在特性上与电击最类似的灼痛、针刺痛和刺痛。
神经性疼痛(例如，坐骨神经痛、背痛、癌痛、糖尿病性疼痛、意外损伤)通常对可用疗法无效，所述可用疗法的前线抗神经病性仅为约25％的患者提供足够的疼痛缓解。虽然用吗啡进行治疗可以在急性环境中提供疼痛缓解或注意力分散，但是慢性吗啡方案会导致不容忽视的成瘾和耐受性问题。虽然非阿片类药物(如普瑞巴林(pregabalin)和去甲替林(nortriptyline))已经取得了一些成功，但是这些药物的疗效各不相同并且没有充分解决疼痛强度。
尽管对导致神经性疼痛的分子机制和生理机制进行了数十年的研究，但是仍然不清楚应该将何物靶向于治疗负责神经性疼痛的潜在病理。可以逆转或甚至解决慢性疾病的更好的非成瘾性疼痛疗法是需要的。
此外，提供用于恢复或加强受试者的神经系统中的中枢抑制并且用于治疗与抑制性中间神经元活性受损或不足或兴奋性神经元功能增强相关的神经学病状、疾病和病状的基于细胞的疗法表示尚未得到满足的需求。
发明内容
本发明的带编号的声明如下：
1.一种用于施用于哺乳动物的移植物组合物，所述移植物组合物包括GABA能神经元群、GFRα激动剂、细胞凋亡抑制剂和细胞坏死抑制剂，其中所述GABA能神经元是通过在允许多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞获得GABA能神经元表型并产生GABA的条件下体外分化所述细胞而产生的。
2.根据声明1所述的移植物组合物，其中所述GFRα激动剂选自由以下组成的组：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、青蒿素(Artemin，ARTN)和Persephin(PSPN)、脑源性神经营养因子(BDNF)、NGF、GDNF受体内源性激动剂、BT18、BT13、NT-3、NT-4、CNTF、GFRα1激动剂、XIB4035、Trk激活剂、TrkA激动剂、藤黄胺(Gamobogic Amine)、阿米替林(Amitriptyline)、TrkB激动剂、N-乙酰血清素(N-Acetylserotonin)、阿米替林、BNN-20BNN-27、脱氧葛杜宁(Deoxygedunin)、7,8-二羟基黄酮、4'-二甲基氨基-7,8-二羟基黄酮、香叶木素(Diosmetin)、HIOC、LM22A-4、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、去甲汉黄芩素(Norwogonin)、R7(药物)和7,8,3'-三羟基黄酮。
3.根据声明2所述的移植物组合物，其中所述GFRα激动剂是GDNF。
4.根据声明3所述的移植物组合物，其中GDNF以约1pM到100mM的浓度存在。
5.根据声明4所述的移植物组合物，其中GDNF以约10ng/mL的浓度存在。
6.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述细胞凋亡抑制剂选自以下中的一种或多种：选自由Boc-Asp(OMe)氟甲基酮、IDN-8066、7053、7436 1965 6556M867IDN-5370IDN-7866普那卡生(pralnacasan)z-Vad-FMK、YVAD-FMK、c-DEVD-CHO、Ac-YVAD-CHO、Ac-DVAD-FMK、Q-Vd-OPh、CrmA(牛痘病毒蛋白)、p35(杆状病毒蛋白)、Z-ATAD-FMK、INF-4E、Z-DQMD-FMK、Az 10417808、Z-LEED-FMK、ZVDK-FMK、z-IETD-FMK、INf-39、Belnacasan、Ac-DEVD-CHO和恩利卡生(Emricasan)组成的组的胱天蛋白酶抑制剂；或选自由钙蛋白酶抑制剂1、Calpeptin、E64、MDL28170、MG101、乙酰-钙蛋白酶抑制蛋白和PD 150606组成的组的胱天蛋白酶激活剂的抑制剂。
7.根据声明6所述的移植物组合物，其中所述细胞凋亡抑制剂选自胱天蛋白酶抑制剂，所述胱天蛋白酶抑制剂选自由以下组成的组：Boc-Asp(OMe)氟甲基酮、IDN-8066、7053、7436 1965 6556M867 IDN-5370IDN-7866普那卡生z-Vad-FMK、YVAD-FMK、c-DEVD-CHO、Ac-YVAD-CHO、Ac-DVAD-FMK、Q-Vd-OPh、CrmA(牛痘病毒蛋白)、p35(杆状病毒蛋白)、Z-ATAD-FMK、INF-4E、Z-DQMD-FMK、Az 10417808、Z-LEED-FMK、ZVDK-FMK、z-IETD-FMK、INf-39、Belnacasan、Ac-DEVD-CHO和恩利卡生。
8.根据声明6所述的移植物组合物，其中所述细胞凋亡抑制剂是广谱胱天蛋白酶抑制剂。
9.根据声明8所述的移植物组合物，其中所述细胞凋亡抑制剂是Boc-Asp(OMe)氟甲基酮。
10.根据声明9所述的移植物组合物，其中Boc-Asp(OMe)氟甲基酮以约1pM到100mM的浓度存在。
11.根据声明10所述的移植物组合物，其中Boc-Asp(OMe)氟甲基酮以约20μM的浓度存在。
12.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述所述细胞坏死抑制剂选自由以下组成的组：MS-1、IM-54、GSK-872、7-Cl-O-Nec1、坏死抑制蛋白-1(Necrostatin-1)和坏死性磺酰胺(Necrosulfonamide)。
13.根据声明12所述的移植物组合物，其中所述细胞坏死抑制剂选自由以下组成的组：MS-1、IM-54、GSK-872、7-Cl-O-Nec1、坏死抑制蛋白-1和坏死性磺酰胺。
14.根据声明12所述的移植物组合物，其中所述细胞坏死抑制剂是MLKL抑制剂。
15.根据声明14所述的移植物组合物，其中所述细胞坏死抑制剂是坏死性磺酰胺。
16.根据声明15所述的移植物组合物，其中坏死性磺酰胺以约1pM到100mM的浓度存在。
17.根据声明16所述的移植物组合物，其中坏死性磺酰胺以约50nM的浓度存在。
18.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞是从所述哺乳动物获得的。
19.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元是由多潜能干细胞产生的。
20.根据声明19所述的移植物组合物，其中所述多潜能干细胞是iPSC。
21.根据声明20所述的移植物组合物，其中所述iPSC衍生自从活检物获得的细胞，所述活检物是从所述哺乳动物获得的。
22.根据声明21所述的移植物组合物，其中从活检物获得的所述细胞是真皮成纤维细胞。
23.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元是通过存在以下的情况下培养所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞来产生的：
i.从约第0天到约第7天存在至少两种SMAD抑制剂；
ii.从约第0天到约第21天存在音猬因子(sonic hedgehog)通路的激活剂；
iii.从约第0天到约第14天存在wnt抑制剂；
iv.从约第7天到约第14天存在BMP抑制剂；
v.从约第7天到约第21天存在GABA能物种形成因子；以及
vi.从第21天到约第27天存在包括BDNF、GDNF和γ分泌酶抑制剂的神经元成熟生长因子的组合。
24.根据声明23所述的移植物组合物，其中所述至少两种SMAD抑制剂选自由以下组成的组：橙皮素(Hesperetin)、SB431542、SB525334、Galunisertib、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN-193189、LDN-193189HCl、RepSox、A 83-01、DMH1、LDN-212854、ITD 1、LY364947、SD-208、EW-7197、ML347、K02288、A 77-01、SIS3、LDN-214117、R-268712、吡非尼酮(Pirfenidone)、头蛋白(Noggin)、腱蛋白、Gremlin、DAN蛋白和GDF3。
25.根据声明24所述的移植物组合物，其中所述至少两种SMAD抑制剂是LDN193189和SB431542。
26.根据声明25所述的移植物组合物，其中LDN193189以约1pM到100mM的浓度存在，并且SB431542以约1pM到100mM的浓度存在。
27.根据声明26所述的移植物组合物，其中LDN193189以约100nM的浓度存在，并且SB431542以约10μM的浓度存在。
28.根据声明23到27中任一项所述的移植物组合物，其中所述音猬因子信号传导的激活剂选自由以下组成的组：音猬因子、GSA10、嘌吗啡胺(Purmorphamine)、SAG和SAG二盐酸盐。
29.根据声明28所述的移植物组合物，其中所述音猬因子信号传导的激活剂是SAG。
30.根据声明29所述的移植物组合物，其中SAG以约1pM到100mM的浓度存在。
31.根据声明30所述的移植物组合物，其中SAG以约0.1μM的浓度存在。
32.根据声明23到31中任一项所述的移植物组合物，其中所述wnt抑制剂选自由以下组成的组：ICG-001、沙利霉素(Salinomycin)、IWR-1、Wnt-C59、ETC-159、iCRT3、IWP2、IWP-4、恩波酸吡维铵(Pyrvinium Pamoate)、iCRT14、FH535、CCT251545、KYA1797K、汉黄芩素(Wogonin)、NCB-0846、六氯酚(Hexachrorophene)、PNU-74654、Ky0211、雷公藤内酯酮(Triptonide)、IWP12、轴蛋白(Axin)、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115-584、ICG-01、槲皮素(Quercetin)、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB-216763、NSC668036、QS11、G007-LK和G244LM。
33.根据声明32所述的移植物组合物，其中所述wnt抑制剂是IWP2。
34.根据声明33所述的移植物组合物，其中IWP2以约1pM到100mM的浓度存在。
35.根据声明34所述的移植物组合物，其中IWP2以约5μM的浓度存在。
36.根据声明23到35中任一项所述的移植物组合物，其中所述BMP抑制剂选自由以下组成的组：橙皮素、SB431542、SB525334、Galunisertib、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN-193189、LDN-193189HCl、RepSox、A 83-01、DMH1、LDN-212854、ITD 1、LY364947、SD-208、EW-7197、ML347、K02288、A 77-01、SIS3、LDN-214117、R-268712、吡非尼酮、头蛋白、腱蛋白、Gremlin、DAN蛋白和GDF3。
37.根据声明36所述的移植物组合物，其中所述BMP抑制剂是LDN-193189。
38.根据声明37所述的移植物组合物，其中LDN-193189以约1pM到100mM的浓度存在。
39.根据声明38所述的移植物组合物，其中LDN-193189以约100nM的浓度存在。
40.根据声明23到39中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能物种形成因子选自由成纤维细胞生长因子组成的组。
41.根据声明40所述的移植物组合物，其中所述GABA能物种形成因子是FGF8。
42.根据声明41所述的移植物组合物，其中FGF8以约1pM到100mM的浓度存在。
43.根据声明42所述的移植物组合物，其中FGF8以约100ng/mL的浓度存在。
44.根据声明23到43中任一项所述的移植物组合物，其中所述γ分泌酶抑制剂选自由以下组成的组：DAPT、RO4929097、塞美司他(Semagecestat)、阿加司他(Avagacestat)、二苯并氮杂环庚三烯(Dibenzazipine)、Ly411575、IMR-1、L-685、458、FLI-06、Crenigacestat、尼罗司他(Nirogacestat)、MK-0752、贝加司他(Begacestat)、BMS299897、化合物W、DBZ、左旋氟比洛芬(Flurizan)、JLK6、MRK560和PF3084014氢溴酸盐。
45.根据声明44所述的移植物组合物，其中所述γ分泌酶抑制剂是DAPT。
46.根据声明45所述的移植物组合物，其中DAPT以约1pM到100mM的浓度存在。
47.根据声明46所述的移植物组合物，其中DAPT以约2.5μM的浓度存在。
48.根据声明23所述的移植物组合物，其中所述神经元成熟生长因子的组合包括以约1pM到100mM的浓度存在的BDNF、以约1pM到100mM的浓度存在的GDNF以及以约1pM到100mM的浓度存在的DAPT。
49.根据声明48所述的移植物组合物，其中所述神经元成熟生长因子的组合包括以约10ng/mL的浓度存在的BDNF、以约10ng/mL的浓度存在的GDNF以及以约2.5μM的浓度存在的DAPT。
50.根据声明23到49中任一项所述的移植物组合物，其中所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞是从第0天在存在Rock抑制剂的情况下培养的，持续约24小时的时间段。
51.根据声明1到50中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元是有丝分裂期后的。
52.根据声明1到51中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元表达Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67的转录物。
53.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元表达GAD65/67、GlyT2和VGAT。
54.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元群中的至少95％表达GAD65。
55.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元群中的至少95％表达VGAT。
56.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元能够在体内分泌GABA。
57.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元能够在功能上与接受者的神经系统整合。
58.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其进一步包括药学上可接受的载剂。
59.根据声明58所述的移植物组合物，其中所述药学上可接受的载剂选自由盐溶液或水性缓冲液组成的组。
60.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述组合物包括浓度为约1000个到约1千万个细胞/微升的GABA能神经元。
61.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述组合物包括浓度为约100,000个细胞/微升的GABA能神经元。
62.根据前述声明中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元是人细胞。
63.一种恢复或加强哺乳动物的神经系统中的中枢抑制的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
64.一种治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
65.根据声明64所述的方法，其中所述神经学病状、疾病或病症的特征在于抑制性中间神经元活性不足。
66.根据声明64所述的方法，其中所述神经学病状、疾病或病症选自神经退行性疾病、神经学损伤或神经性疼痛。
67.根据声明64所述的方法，其中所述神经学病状、疾病或病症选自由以下组成的组：慢性神经性疼痛、慢性炎性疼痛、慢性功能障碍性疼痛、癫痫、运动神经元病(ALS、SMA)、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、中风、多发性硬化症、τ蛋白病(进行性核上性麻痹、皮克氏病(Pick's disease)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆症、伴有ALS的FTLD)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、酒精戒断和酒精中毒、糖尿病诱导的脑损伤、颅脑损伤、偏头痛、头痛、丛集性头痛、脊髓损伤、缺血性损伤、化学疗法诱导的疼痛和化学疗法诱导的神经病、精神分裂症、慢性抑郁症、迟发性运动障碍、双相情感障碍和神经病。
68.一种治疗哺乳动物的神经性疼痛的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
69.根据声明68所述的方法，其中所述神经性疼痛与坐骨神经痛、背痛、癌痛、糖尿病性疼痛、意外损伤、脊髓损伤、周围神经损伤相关。
70.一种治疗哺乳动物的异常性疼痛的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
71.根据声明63到70中任一项所述的方法，其中所述移植物组合物被施用于所述哺乳动物的中枢神经系统。
72.根据声明63到71中任一项所述的方法，其中所述施用包括将所述移植物组合物注射到所述哺乳动物的脊髓中。
73.根据声明72所述的方法，其中所述注射是立体定向注射。
74.根据权利要求63到73中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
75.一种将GABA能神经元递送到有需要的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从所述受试者获得活检物并从所述活检物中分离出细胞；
b)由在步骤a)中分离出的细胞产生iPSC；
c)在将所述iPSC分化成GABA能神经元的条件下培养在步骤b)中产生的所述iPSC，其中所述GABA能神经元表达GABA能神经元表型并产生GABA；
d)制备适合于注射到所述受试者的移植物组合物，所述移植物组合物包括在步骤c)中产生的所述GABA能神经元、GFRα激动剂、细胞凋亡抑制剂、细胞坏死抑制剂和药学上可接受的载剂；
e)向所述受试者施用在步骤d)中制备的所述移植物组合物。
76.根据声明75所述的方法，其中所述受试者的抑制性中间神经元活性不足或兴奋性神经元功能增强。
77.根据声明75所述的方法，其中所述受试者患有神经学病状、疾病或病症。
78.根据声明77所述的方法，其中所述神经学病状、疾病或病症的特征在于抑制性中间神经元活性不足。
79.根据声明77所述的方法，其中所述神经学病状、疾病或病症选自神经退行性疾病、神经学损伤或神经性疼痛。
80.根据声明77所述的方法，其中所述神经学病状、疾病或病症选自由以下组成的组：慢性神经性疼痛、慢性炎性疼痛、慢性功能障碍性疼痛、癫痫、运动神经元病(ALS、SMA)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、多发性硬化症、τ蛋白病(进行性核上性麻痹、皮克氏病、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆症、伴有ALS的FTLD)、亨廷顿氏病、酒精戒断和酒精中毒、糖尿病诱导的脑损伤、颅脑损伤、偏头痛、头痛、丛集性头痛、脊髓损伤、缺血性损伤、化学疗法诱导的疼痛和化学疗法诱导的神经病、精神分裂症、慢性抑郁症、迟发性运动障碍、双相情感障碍和神经病。
81.根据声明75所述的方法，其中所述受试者患有神经性疼痛。
82.根据声明81所述的方法，其中所述神经性疼痛与炎症、坐骨神经痛、背痛、癌痛、糖尿病性神经病、意外损伤、脊髓损伤、周围神经损伤相关。
83.根据声明75所述的方法，其中所述受试者患有异常性疼痛。
84.根据声明75到83中任一项所述的方法，其中所述移植物组合物被施用于所述受试者的中枢神经系统。
85.根据声明75到84中任一项所述的方法，其中所述施用包括将所述移植物组合物注射到所述受试者的脊髓中。
86.根据声明85所述的方法，其中所述注射是通过立体定向注射进行的。
87.根据权利要求75到86中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
88.根据声明75到87所述的方法，其中所述GFRα激动剂选自由以下组成的组：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、青蒿素(ARTN)和Persephin(PSPN)、脑源性神经营养因子(BDNF)、NGF、GDNF受体内源性激动剂、BT18、BT13、NT-3、NT-4、CNTF、GFRα1激动剂、XIB4035、Trk激活剂、TrkA激动剂、藤黄胺、阿米替林、TrkB激动剂、N-乙酰血清素、阿米替林、BNN-20BNN-27、脱氧葛杜宁、7,8-二羟基黄酮、4'-二甲基氨基-7,8-二羟基黄酮、香叶木素、HIOC、LM22A-4、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、去甲汉黄芩素、R7(药物)和7,8,3'-三羟基黄酮。
89.根据声明88所述的方法，其中所述GFRα激动剂是GDNF。
90.根据声明89所述的方法，其中GDNF以约1pM到100mM的浓度存在。
91.根据声明90所述的方法，其中GDNF以约10ng/mL的浓度存在。
92.根据声明75到91中任一项所述的方法，其中所述细胞凋亡抑制剂选自以下中的一种或多种：选自由Boc-Asp(OMe)氟甲基酮、IDN-8066、7053、7436 1965 6556、M867IDN-5370IDN-7866普那卡生z-Vad-FMK、YVAD-FMK、c-DEVD-CHO、Ac-YVAD-CHO、Ac-DVAD-FMK、Q-Vd-OPh、CrmA(牛痘病毒蛋白)、p35(杆状病毒蛋白)、Z-ATAD-FMK、INF-4E、Z-DQMD-FMK、Az10417808、Z-LEED-FMK、ZVDK-FMK、z-IETD-FMK、INf-39、Belnacasan、Ac-DEVD-CHO和恩利卡生组成的组的胱天蛋白酶抑制剂；或选自由钙蛋白酶抑制剂1、Calpeptin、E64、MDL28170、MG101、乙酰-钙蛋白酶抑制蛋白和PD150606组成的组的胱天蛋白酶激活剂的抑制剂。
93.根据声明92所述的方法，其中所述细胞凋亡抑制剂选自胱天蛋白酶抑制剂，所述胱天蛋白酶抑制剂选自由以下组成的组：Boc-Asp(OMe)氟甲基酮、IDN-8066、7053、74361965 6556M867 IDN-5370IDN-7866普那卡生、z-Vad-FMK、YVAD-FMK、c-DEVD-CHO、Ac-YVAD-CHO、Ac-DVAD-FMK、Q-Vd-OPh、CrmA(牛痘病毒蛋白)、p35(杆状病毒蛋白)、Z-ATAD-FMK、INF-4E、Z-DQMD-FMK、Az 10417808、Z-LEED-FMK、ZVDK-FMK、z-IETD-FMK、INf-39、Belnacasan、Ac-DEVD-CHO和恩利卡生。
94.根据声明93所述的方法，其中所述细胞凋亡抑制剂是广谱胱天蛋白酶抑制剂。
95.根据声明94所述的方法，其中所述细胞凋亡抑制剂是Boc-Asp(OMe)氟甲基酮。
96.根据声明95所述的方法，其中Boc-Asp(OMe)氟甲基酮以约1pM到100mM的浓度存在。
97.根据声明96所述的方法，其中Boc-Asp(OMe)氟甲基酮以约20μM的浓度存在。
98.根据声明75到97中任一项所述的方法，其中所述所述细胞坏死抑制剂选自由以下组成的组：MS-1、IM-54、GSK-872、7-Cl-O-Nec1、坏死抑制蛋白-1和坏死性磺酰胺。
99.根据声明98所述的方法，其中所述细胞坏死抑制剂选自由以下组成的组：MS-1、IM-54、GSK-872、7-Cl-O-Nec1、坏死抑制蛋白-1和坏死性磺酰胺。
100.根据声明99所述的方法，其中所述细胞坏死抑制剂是MLKL抑制剂。
101.根据声明100所述的方法，其中所述细胞坏死抑制剂是坏死性磺酰胺。
102.根据声明101所述的方法，其中坏死性磺酰胺以约1pM到100mM的浓度存在。
103.根据声明102所述的方法，其中坏死性磺酰胺以约50nM的浓度存在。
104.根据声明21所述的方法，其中从所述活检物获得的所述细胞是真皮成纤维细胞。
105.根据前述声明中任一项所述的方法，其中在步骤c)中产生的所述GABA能神经元是通过在存在以下的情况下培养所述iPSC来产生的：
i.从约第0天到约第7天存在至少两种SMAD抑制剂；
ii.从约第0天到约第21天存在音猬因子(sonic hedgehog)通路的激活剂；
iii.从约第0天到约第14天存在wnt抑制剂；
iv.从约第7天到约第14天存在BMP抑制剂；
v.从约第7天到约第21天存在GABA能物种形成因子；以及
vi.从第21天到约第27天存在包括BDNF、GDNF和γ分泌酶抑制剂的神经元成熟生长因子的组合。
106.根据声明105所述的方法，其中所述至少两种SMAD抑制剂选自由以下组成的组：橙皮素、SB431542、SB525334、Galunisertib、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN-193189、LDN-193189HCl、RepSox、A 83-01、DMH1、LDN-212854、ITD 1、LY364947、SD-208、EW-7197、ML347、K02288、A 77-01、SIS3、LDN-214117、R-268712、吡非尼酮、头蛋白、腱蛋白、Gremlin、DAN蛋白和GDF3。
107.根据声明106所述的方法，其中所述至少两种SMAD抑制剂是LDN193189和SB431542。
108.根据声明107所述的方法，其中LDN193189以约1pM到100mM的浓度存在，并且SB431542以约1pM到100mM的浓度存在。
109.根据声明108所述的方法，其中LDN193189以约100nM的浓度存在，并且SB431542以约10μM的浓度存在。
110.根据声明105到109中任一项所述的方法，其中所述音猬因子信号传导的激活剂选自由以下组成的组：音猬因子、GSA10、嘌吗啡胺、SAG和SAG二盐酸盐。
111.根据声明110所述的方法，其中所述音猬因子信号传导的激活剂是SAG。
112.根据声明111所述的方法，其中SAG以约1pM到100mM的浓度存在。
113.根据声明112所述的方法，其中SAG以约0.1μM的浓度存在。
114.根据声明105到113中任一项所述的方法，其中所述wnt抑制剂选自由以下组成的组：ICG-001、沙利霉素、IWR-1、Wnt-C59、ETC-159、iCRT3、IWP2、IWP-4、恩波酸吡维铵、iCRT14、FH535、CCT251545、KYA1797K、汉黄芩素、NCB-0846、六氯酚、PNU-74654、Ky0211、雷公藤内酯酮、IWP12、轴蛋白、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115-584、ICG-01、槲皮素、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB-216763、NSC668036、QS11、G007-LK和G244LM。
115.根据声明114所述的方法，其中所述wnt抑制剂是IWP2。
116.根据声明115所述的方法，其中IWP2以约1pM到100mM的浓度存在。
117.根据声明116所述的方法，其中IWP2以约5μM的浓度存在。
118.根据声明105到117中任一项所述的方法，其中所述BMP抑制剂选自由以下组成的组：橙皮素、SB431542、SB525334、Galunisertib、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN-193189、LDN-193189HCl、RepSox、A 83-01、DMH1、LDN-212854、ITD 1、LY364947、SD-208、EW-7197、ML347、K02288、A 77-01、SIS3、LDN-214117、R-268712、吡非尼酮、头蛋白、腱蛋白、Gremlin、DAN蛋白和GDF3。
119.根据声明118所述的方法，其中所述BMP抑制剂是LDN-193189。
120.根据声明119所述的方法，其中LDN-193189以约1pM到100mM的浓度存在。
121.根据声明120所述的方法，其中LDN-193189以约100nM的浓度存在。
122.根据声明105到121中任一项所述的方法，其中所述GABA能物种形成因子选自由成纤维细胞生长因子组成的组。
123.根据声明122所述的方法，其中所述GABA能物种形成因子是FGF8。
124.根据声明124所述的方法，其中FGF8以约1pM到100mM的浓度存在。
125.根据声明124所述的方法，其中FGF8以约100ng/mL的浓度存在。
126.根据声明105到125中任一项所述的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂选自由以下组成的组：DAPT、RO4929097、塞美司他、阿加司他、二苯并氮杂环庚三烯、Ly411575、IMR-1、L-685、458、FLI-06、Crenigacestat、尼罗司他、MK-0752、贝加司他、BMS299897、化合物W、DBZ、左旋氟比洛芬、JLK6、MRK560和PF3084014氢溴酸盐。
127.根据声明126所述的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂是DAPT。
128.根据声明127所述的方法，其中DAPT以约1pM到100mM的浓度存在。
129.根据声明128所述的方法，其中DAPT以约2.5μM的浓度存在。
130.根据声明105所述的方法，其中所述神经元成熟生长因子的组合包括以约1pM到100mM的浓度存在的BDNF、以约1pM到100mM的浓度存在的GDNF以及以约1pM到100mM的浓度存在的DAPT。
131.根据声明105到130中任一项所述的方法，其中所述神经元成熟生长因子的组合包括以约10ng/mL的浓度存在的BDNF、以约10ng/mL的浓度存在的GDNF以及以约2.5μM的浓度存在的DAPT。
132.根据声明105到131中任一项所述的方法，其中所述iPSC是从第0天在存在Rock抑制剂的情况下培养的，持续约24小时的时间段。
133.根据声明75到132中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元是有丝分裂期后的。
134.根据声明75到133中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元表达Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67的转录物。
135.根据声明75到134中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元表达GAD65/67、GlyT2和VGAT。
136.根据声明75到135中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元群中的至少95％表达GAD65。
137.根据声明75到136中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元群中的至少95％表达VGAT。
138.根据声明75到137中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元能够在体内分泌GABA。
139.根据声明75到138中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元能够在功能上与接受者的神经系统整合。
140.根据声明75到139中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的载剂选自由盐溶液或水性缓冲液组成的组。
141.根据声明75到141中任一项所述的方法，其中所述移植物组合物包括浓度为约1000个到约1千万个细胞/微升的GABA能神经元。
142.根据声明141所述的方法，其中所述组合物包括浓度为约100,000个细胞/微升的GABA能神经元。
143.一种用于治疗受试者的抑制性中间神经元活性不足或兴奋性神经元功能增强的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
144.一种用于治疗受试者的神经学病状、疾病或病症的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
145.用于根据声明144所述的用途的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物，其中所述神经学病状、疾病或病症的特征在于抑制性中间神经元活性不足。
146.用于根据声明144所述的用途的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物，其中所述神经学病状、疾病或病症选自神经退行性疾病、神经学损伤或神经性疼痛。
147.用于根据声明144所述的用途的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物，其中所述神经学病状、疾病或病症选自由以下组成的组：慢性神经性疼痛、慢性炎性疼痛、慢性功能障碍性疼痛、癫痫、运动神经元病(ALS、SMA)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、多发性硬化症、τ蛋白病(进行性核上性麻痹、皮克氏病、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆症、伴有ALS的FTLD)、亨廷顿氏病、酒精戒断和酒精中毒、糖尿病诱导的脑损伤、颅脑损伤、偏头痛、头痛、丛集性头痛、脊髓损伤、缺血性损伤、化学疗法诱导的疼痛和化学疗法诱导的神经病、精神分裂症、慢性抑郁症、迟发性运动障碍、双相情感障碍和神经病。
148.一种用于治疗受试者的神经性疼痛的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
149.用于根据声明148所述的用途的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物，其中所述神经性疼痛与炎症、坐骨神经痛、背痛、癌痛、糖尿病性神经病、意外损伤、脊髓损伤、周围神经损伤相关。
150.一种用于治疗受试者的异常性疼痛的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物。
151.一种用于根据声明143到150中任一项所述的用途的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物，其中所述施用包括将所述移植物组合物注射到所述受试者的脊髓中。
152.一种用于根据声明151所述的用途的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物，其中所述注射是通过立体定向注射进行的。
153.一种用于根据声明143到152中任一项所述的用途的根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物，其中所述受试者是人。
154.一种根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物的用途，其用于制造用于治疗受试者的神经学病状、疾病或病症的药物。
155.根据声明154所述的用途，其中所述神经学病状、疾病或病症的特征在于抑制性中间神经元活性不足。
156.根据声明154或155所述的用途，其中所述神经学病状、疾病或病症选自神经退行性疾病、神经学损伤或神经性疼痛。
157.根据声明156所述用途，其中所述神经学病状、疾病或病症选自由以下组成的组：慢性神经性疼痛、慢性炎性疼痛、慢性功能障碍性疼痛、癫痫、运动神经元病(ALS、SMA)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、多发性硬化症、τ蛋白病(进行性核上性麻痹、皮克氏病、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆症、伴有ALS的FTLD)、亨廷顿氏病、酒精戒断和酒精中毒、糖尿病诱导的脑损伤、颅脑损伤、偏头痛、头痛、丛集性头痛、脊髓损伤、缺血性损伤、化学疗法诱导的疼痛和化学疗法诱导的神经病、精神分裂症、慢性抑郁症、迟发性运动障碍、双相情感障碍和神经病。
158.一种根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物的用途，其用于制造用于治疗受试者的神经性疼痛的药物。
159.根据声明158所述的用途，其中所述神经性疼痛与炎症、坐骨神经痛、背痛、癌痛、糖尿病性神经病、意外损伤、脊髓损伤、周围神经损伤相关。
160.一种根据声明1到62中任一项所述的移植物组合物的用途，其用于制造用于治疗受试者的异常性疼痛的药物。
161.根据声明154到161中任一项所述的用途，其中所述药物被调配用于施用于所述受试者的中枢神经系统。
162.根据声明154到161中任一项所述的用途，其中所述药物被调配用于注射到所述受试者的脊髓中。
163.根据声明162所述的用途，其中所述注射是立体定向注射。
164.根据声明154到163中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。
附图说明
图1.果蝇在损伤后表现出热异常性疼痛。(A)未受损伤的野生型动物响应于≥42℃的温度而表现出逃避行为；这种响应取决于无痛性和TrpA1(每个重复n＝12、10只动物)。(B)这个研究中使用的截肢损伤。(C)损伤后的异常性疼痛响应(38℃)的时间进程。(D)损伤后14天对温度的剂量响应(每个重复n＝9、10只动物)。(E)Canton S数据中的未受损伤的完整对照或损伤后7天的动物的平均移动速度。数据表示为平均值±SEM。***p<0.001；ns为不显著，对A、C-D进行双向ANOVA，然后进行Tukey事后测试，并对E进行斯图登氏t测试。
图2.TrpA1是ppk+感觉神经元损伤后的异常性疼痛所需要的。(A)蝇腿中的ppk+感觉神经元投射。(B)在腿中用Lamin-GFP标记的ppk+细胞体。(C)从解剖的腿到VNC和脑的ppk+感觉神经元投射。(D)活性破伤风毒素(TNT)而不是失活破伤风毒素(iTNT)在ppk+感觉神经元中的表达阻断所有成体热疼痛反应行为(每个重复n＝9、10只动物)。(E)TrpA1和无痛性突变体对热异常性疼痛(38℃)具有抗性。(F)TrpA1是ppk+感觉神经元损伤后的异常性疼痛特别需要的(每个重复n＝9、10只动物)。(G)特异性地将TrpA1再引入ppk+感觉神经元中挽救异常性疼痛响应(每个重复n＝9、10只动物)。数据表示为平均值±SEM。***p<0.001；ns为不显著，进行ANOVA，然后进行Tukey事后测试。
图3.周围损伤导致感觉神经病、中枢敏化和伤害性感受逃避回路增大。(A-B)来自DLM的电生理学记录，其是巨纤维系统在(A)来自完整中腿的刺激(n≥7)、(B)在截肢后7天对受损伤的腿的刺激(n≥7)之后的输出。(C)腿截肢后观察到ppk+感觉神经病。(D)随时间推移在截肢的腿中对感觉神经病(ppk1+投射长度)进行定量(n≥7)。(E)损伤后的成体伤害感受电生理学准备。(F-H)腿截肢导致逃避响应回路的对侧敏化，其中(F、G)逃避回路速度增加(速度差异以品红色突出显示)，(F、H)逃避响应的持续时间增加(受损伤的持续时间以绿色突出显示)(n≥9)。数据表示为平均值±SEM。**p<0.01；***p<0.001，对D进行双向ANOVA，然后进行Tukey事后，并且对G和H进行Mann-Whitney-Wilcoxon测试。
图4.GABA门控周围活性；周围神经损伤降低GABA能功能。(A)ppk+感觉神经元投射到腹神经索(VNC)。ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP呈黄色，抗GABA呈绿色，nc82对比染色呈品红色，其示出了抗GABA和ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP共定位的腹俯视图特写以及抗GABA和ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP共定位的切向侧视图特写。(B)GABA免疫反应性在针对来自完整的未受损伤的动物和受损伤的动物(腿截肢后7天)的GABA和nc82染色的VNC损伤之后降低，其示出了腹俯视图特写。(C)针对表达ppk-Gal4>TNT的蝇的GABA和nc82染色的VNC中的GABA能神经元的成像。(D)用经过核标记的Lamin-GFP(Gad1-Gal4>UAS-Lamin-GFP)和活性胱天蛋白酶抗体对VNC进行的成像。(E)胱天蛋白酶抑制剂p35的异位表达阻断腿损伤后的GABA能细胞死亡。(F-G)p35的GABA能特异性表达(Gad1-Gal4>UAS-p35)挽救通过(F)逃避回路速度、(G)逃避响应持续时间测量的逃避响应回路的对侧敏化(n≥9)。(H)通过UAS-p35的Gad1-Gal4驱动的表达阻断GABA能细胞死亡预防神经性异常性疼痛行为(每个重复n＝9、10只动物)。(I)GABA受体D-GABA-B-R2的伤害性感受感觉神经元特异性(ppk-Gal4)敲低，其示出了所述敲低足以引起未受损伤的蝇的热异常性疼痛(38℃)(每个重复n≥9、10只动物)。数据表示为平均值±SEM。**p<0.01；ns为不显著，进行双向ANOVA，然后进行Tukey事后测试。
图5：纯GABA能神经元可以有效地源自hiPSC。(A)周围神经损伤诱导对小鼠的疼痛门控的抑制的示意图。用于恢复正常疼痛的潜在临床策略是呈紫色的iPSC源性GABA神经元的注射。(B)用于产生内侧神经节隆起型GABA能神经元的分化方案。(C)分化期间的GABA神经元的明场图像。表达典型标志物(核DAPI、TUBB3、GAD65/67)的成熟GABA能神经元的DIV28图像和示出纯度的合并通道。(D)在分化的DIV25处对hiPSC源性GABA神经元进行的FACS分析。左：直方图示出了呈紫色的TUBB3+细胞(灰色为同种型对照抗体)。中间：呈紫色的GAD65表达性细胞(灰色为同种型对照抗体)。右：hiPSC源性GABA神经元TUBB3对GAD65的点状图。(E)GABA能神经元对hiPSC的RNASeq归一化FKPM，n＝3个hiPSC和n＝4个GABA能神经元(来自独立分化)。(F)对DIV25神经元对hiPSC(每组n＝3)进行的蛋白质组学，归一化iBAQ强度的热图。(J)Ki67染色证实一些增殖性细胞保持在DIV25处。(H-I)DIV25神经元的成像。(H)神经元表达VGAT并且(I)具有GABA免疫反应性。
图6：人iPSC源性GABA能神经元在体外具有功能性。(A)DIV25 GABA能神经元的培养基中的GABA浓度。(B)离子型谷氨酸受体亚基表达的归一化FPKM。(C)添加谷氨酸盐和KCl后的钙瞬变的代表性图像，(D)对由细胞(n＝50)表现出的钙瞬变进行的定量。
图7：人iPSC源性GABA能神经元的脊柱移植减轻触觉异常性疼痛。(A)在保留性神经损伤(周围神经性疼痛模型)和体内实验的时间线之后进行的基于椎板切除术的GABA能神经元到L1中的脊柱插入的策略示意图。(B)神经损伤和GABA能神经元的脊柱移植后的受损伤的小鼠的归一化von Frey阈值。(n＝21种媒剂，29个GABA能神经元)，(C)2个月时相对于神经受损伤的小鼠的刺激响应曲线(n＝12种媒剂和n＝16个GABA能神经元)，(D-E)在使用旷场范例进行的实验后对小鼠进行的旷场运动分析以及(F)同侧的经过修饰的Basso小鼠步态分析量表得分。对于这些实验，n＝9种媒剂，对于GABA能神经元移植物，n＝13。(G)丙酮冷异常性疼痛响应。(H)在原初小鼠中进行实验后的归一化von Frey阈值。(n＝11)(I)神经损伤和i感觉神经元注射后的归一化von Frey阈值。n＝7。使用重复测量ANOVA与邦费罗尼校正(bonferroni correction)对D、E、F、G、H、I进行多次比较。使用邦费罗尼校正，对B进行双向ANOVA。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8：人iPSC源性GABA能移植物存活并与内源性回路系统整合。(A)保留性神经损伤(周围神经性疼痛模型)后的hiPSC源性GABA能神经元的脊柱注射的示意图和时间线。(B-C)在用针对人核(红色)、抗IB4(蓝色)和CGRP(绿色)的抗体(B-B”)或用针对人核(红色)和突触蛋白(绿色)的抗体(C-C”)染色的经过注射的同侧背角中鉴定出经过移植的人GABA能神经元。(D-D”)经过移植的人核(红色)与GABA合成标志物GAD65/67(绿色)共定位。(E-E”)如通过TUBB3和人NCAM共定位所评估的，GABA能神经元在移植后维持神经元表型。(F-F”')人细胞质(绿色)与标记小鼠突触前活性区并示出推测的小鼠到人移植物突触的小鼠特异性Bassoon(红色)并置。
图8：人iPSC源性GABA能移植物存活并且可以在10周后与内源性回路系统整合。(A)细胞广泛地迁移。(B)细胞定位于背角内。(C)人核与NeuN共定位。(D)人神经元粘附分子与MAP2共定位。(E)人细胞质与TUBB3共定位。(F)在人细胞质阳性细胞中发现GABA。(G)在推定的人突触处发现GAD65/67。(H)定位于人细胞的突触泡囊对VGAT呈阳性。(I)人细胞与小鼠Bassoon RIM2并置。(J)在人细胞中发现电压门控钙通道(VGCC)。(K)在推定的人突触处发现Liprin。(L-N)定位于人细胞质的突触蛋白被定位成与表明突触后发育的桥尾蛋白并置。(O)在人细胞中发现SST。(P)在人细胞中发现小白蛋白。(Q-R)在阳性对照小鼠皮肤中而不在脊髓中的人核中进行Ki67染色。
图10：损伤引起持续性异常性疼痛以及到腹神经索(VNC)和脑的ppk+感觉神经元投射。(A-B)异常性疼痛在损伤后(A)1天、(B)7天对温度的剂量响应(每个重复n＝9、10只动物)。(C)由ppk-Gal4(ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP)(黄色)驱动并针对nc82共染色(品红色)的表达CD8-GFP的蝇的脑和附接的VNC，其中(C)为腹俯视图并且(D)为VNC的第2叶的腹俯视图和切向侧视图(下图)；n＝6。(E)ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP的蝇(GFP是绿色的)的连接的脑、附接的VNC和股节段的部分，n＝5。
图11：周围损伤引起伤害性感受逃避回路的电生理学特性的变化。(A-B)巨纤维响应需要更高阶的脑功能。(A)来自头部被去除的蝇中的巨纤维神经元的直接刺激(n≥7)。(B)来自头部被去除的蝇中的完整中腿的刺激(n≥7)。(C)来自受损伤的蝇的头部的下降刺激仍然示出减小的响应潜伏期(n≥9)。(D)对周围损伤后的中枢GABA能中间神经元损失进行的成像；针对来自完整的未受损伤的动物和受损伤的动物(腿截肢后7天)的GABA(绿色)和nc82(品红色)染色的VNC的切向视图。(E-F)对来自(E)Canton S以及表达ppk-Gal4>TNT的蝇的同侧和对侧的完整的VNC和受损伤的VNC中的抗GABA团簇进行的定量。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，对C进行Mann-Whitney-Wilcoxon测试，并对E和F进行斯图登氏t测试。
图12：VNC而非脑中的周围损伤的GABA免疫反应性降低(A-C)对来自VNC和脑的GABA团簇进行的成像和定量，在对照完整蝇和受损伤的蝇中，用抗GABA(绿色)对VNC和脑进行染色并用抗nc82(呈品红色)对其进行共染色。(A)未受损伤的动物和受损伤的动物的第1个VNC叶的腹俯视图。(B)来自未受损伤的动物和受损伤的动物的第3个VNC叶。(C)来自未受损伤的动物和受损伤的动物的脑，每组n≥7只动物。(D)对表达经过核标记的Lamin-GFP(Gad1-Gal4>UAS-Lamin-GFP)的蝇的第2个VNC叶中的GABA能中间神经元进行的定量。(E)对来自表达经过核标记的Lamin-GFP的蝇的对照完整VNC和受损伤的VNC的GABA/活性胱天蛋白酶双阳性细胞进行的定量。(F)对表达阻断腿损伤后的GABA能细胞死亡的胱天蛋白酶抑制剂p35的蝇的第2个VNC叶中的GABA团簇进行的定量。(G)Rdl而并非Grd、GABA-B-R1或GABA-B-R3的敲低引起未受损伤的蝇的异常性疼痛(每个重复n≥9、10只蝇)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01；ns为不显著，对A-C、D-F进行斯图登氏t测试；对G进行ANOVA，然后进行Tukey事后。
图13：GABA能神经元相较于hiPSC以及hiPSC源性感觉神经元的RNASeq。(A)RNAseq样品的分层聚类产生预期的簇。(B)RNAseq示出GABA能神经元表达GABA的合成和释放所需的所有组分。(C)GABA神经元表达多种离子移变型谷氨酸受体，包含AMPA型和NMDA型。(D)GABA能神经元的多潜能性标志物以及细胞周期和增殖细胞标志物被耗尽。(E)GABA能神经元富含少突胶质细胞的转录标志物，但不表达少突胶质细胞的其它标志物或星形胶质细胞或小神经胶质细胞的标志物。(F)通过qPCR验证所选GABA合成基因。
图14：分化特征标签和亚型分类。(A)示出了GABA能规格的异质性的GABA能分化的示意图。(B)通过RNASeq(归一化)对分类标志物进行的测量，其中表达半定量地表达。(C)在这个发育阶段处，神经元主要属于PVALB-ve/SST+ve表型。它们被亚分类成多种表型。示出了一些明确获得的CGE标志物和CGE的亚型分类。
图15：GABA能神经元相对于hiPSC的蛋白质组学分析。(A)主组分分析产生预期的样品聚类。(B)蛋白质组学数据的火山图。(C)对GABA能神经元中的经过差异表达的基因进行的Reactome通路分析。(D)GABA合成通路使iBAQ值归一化。(E)验证GABA能标志物GAD65和甘氨酸能标志物GlyT2的蛋白质印迹(Western blot)。每组N＝3。
图16：移植物的行为表征。(a)第3周和第4周的刺激响应曲线示出了显著的镇痛。(b)GABA能移植物(左)、原初移植物(中间)和感觉移植物(右)的数据分布，(c)感觉神经元移植物的3周后的刺激响应曲线。感觉神经元移植物而非培养基引起痛觉过敏。(d)将GABA能神经元注射到原初小鼠中没有效果。
图17：SST对PAVB(富集的)hiPSC-GABA神经元缓解神经性小鼠疼痛的功效。(A-B)对在第3周时用BMP4处理或没有用BMP4处理的DIV25hiPSC-GABA神经元中的(A)PAVB表达和(B)SST表达进行的qPCR分析。(C)如通过von Frey阈值所评估的，用BMP4处理的hiPSC-GABA能神经元在移植到神经受损伤的小鼠中时表现出更大的镇痛效果；(D)移植后5周，经过移植的富PAVB的iGABA能神经元与其相应的基线对照相比没有示出显著差异(即，SNI动物的疼痛已经完全回到正常)。Von Frey阈值是50％缩爪阈值。(除非另有说明，否则相比于经过处理的培养基，进行双向ANOVA，进行Sidak的多重比较测试，P<0.05，*，P<0.0001，****)
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“细胞”是指单个细胞以及细胞群(即，多于一个细胞)。群可以是包括一种细胞类型的纯群，如神经元细胞群或未分化干细胞群。可替代地，群可以包括多于一种细胞类型，例如混合细胞群。其并不意指限制群中的细胞数量，例如混合细胞群可以包括至少一个分化细胞。在一个实施例中，混合群可以包括至少一个分化的。在本发明中，对细胞群可以包括的细胞类型的数量没有限制。
如本文所用，关于分化细胞系统中的细胞所用的术语“分化”是指细胞通过其从一种细胞类型(例如，多能、全能或多潜能可分化细胞)分化成另一种细胞类型(如靶分化细胞)的过程。因此，本文所用的术语“细胞分化”是指较不特化的细胞(例如，干细胞)通过其发育或成熟以具有更独特的形式和功能(即，更特化)的特化过程或通路。
如本文所用，关于细胞所用的术语“去分化”或“去分化的”是指其中具有更独特的形式和功能和/或有限的自我更新和/或增殖能力的更特化的细胞变得较不特化并获得更大的自我更新和/或增殖能力或分化能力(例如，多能、多潜能等)的过程。诱导性多潜能干细胞(iPSC)是去分化细胞的实例。因此，去分化可以指代细胞重新编程的过程。
如本文所用，关于细胞的术语“诱导神经元分化”是指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变成非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“在细胞中诱导神经元分化”或“使细胞分化”以允许细胞获得神经元表型包含诱导细胞具有神经元特征或诱导细胞分裂成与所述细胞的原始身份不同的具有神经元特征的后代细胞，如基因型(即，如通过遗传分析如PCR或微阵列测定的基因表达的变化)和/或表型(即，蛋白质(如β-III微管蛋白)或多种蛋白质(包含β-III微管蛋白、微管相关蛋白2(MAP2)、突触蛋白、神经丝L、巢蛋白和N-Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2和VGAT中的两种或多种蛋白质的组合)的形态、功能和/或表达的变化)。
如本文所用，术语“神经元”是指表现出成熟的有丝分裂期后神经元的功能和/或表型特征的神经谱系的分化的谱系定向细胞或需要在体内或体外进一步成熟以表现出成熟的有丝分裂期后神经元的另外的功能和/或表型特征的神经谱系的分化的谱系定向细胞。神经元可以表达以下标志物中的一种或多种标志物：β-III微管蛋白、微管相关蛋白2(MAP2)、突触蛋白、神经丝L、巢蛋白和N-Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2和VGAT。“GABA能神经元表型”或“GABA能神经元”是指表现出成熟的有丝分裂期后神经元的功能和/或表型特征并且表达β-III微管蛋白、微管相关蛋白2(MAP2)、突触蛋白、神经丝L、巢蛋白和N-Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2和VGAT中的一种或多种标志物并产生GABA的神经谱系的分化的谱系定向细胞。
如本文所用，术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”和“抑制(inhibition)”是指活性或量的减少、降低、失活、下调、消除或抑制(suppression)。因此，如本文所用，术语“抑制剂”是指干扰(即，减少、降低、失活、下调、消除或抑制)分子的基因或蛋白质表达和/或分子的活性和/或功能。例如，关于信号传导分子或信号传导分子的通路，如SMAD信号传导的抑制剂，抑制剂是指干扰SMAD信号传导通路中涉及的实体的基因或蛋白质表达/或信号传导分子的活性和/或功能或所述分子或通路的信号传导功能的药剂。类似地，关于BMP、wnt、γ分泌酶等的抑制剂，抑制剂是指干扰BMP、wnt、γ分泌酶等的表达或活性或功能的药剂。
如本文所用，术语“使细胞与如本发明所定义的化合物接触”是指将化合物放置于允许其触碰细胞以产生“经接触的”细胞的位置。可以使用任何适合的方法来完成接触。例如，在一个实施例中，接触是通过将化合物添加到细胞的容器(例如，管、小瓶或培养瓶或培养皿等)。也可以通过将化合物添加到细胞的培养物来完成接触。
如本文所用，术语“干细胞”是指全能或多潜能或多能的并且能够分化成一种或多种不同细胞类型的细胞，如胚胎干细胞、从器官分离的干细胞。如本文所用，术语“成体干细胞”是指衍生自出生后的生物体的干细胞。
如本文所用，术语“神经干细胞”或“NSC”或“神经前体细胞”或“神经祖细胞”是指能够在体内变成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经胶质细胞以及在培养物中变成神经元细胞后代和神经胶质后代的细胞。
如本文所用，术语“多潜能的”是指能够分化成任何(或多种)分化细胞类型的细胞系。
如本文所用，术语“多能的”是指能够分化成至少两种分化细胞类型的细胞系。
如本文所用，术语“原代细胞”是在不存在培养物的情况下直接从动物的组织(例如，血液)或器官获得的细胞。通常，尽管不是必要的，但是原代细胞能够在衰老和/或停止增殖之前在体外经历十次或更少的传代。
“诱导性多潜能干细胞(iPSC)或(iPS细胞)”是涉及已经例如通过引入将低分化表型赋予体细胞的外源性基因被重新编程或“去分化”的体细胞的名称。然后，可以诱导这些细胞分化成低分化后代。已经使用对最初在2006年(Yamanaka,S.等人,《细胞干细胞(CellStem Cell)》,1:39-49(2007))发现的方法进行的修改衍生出IPS细胞。例如，在一个实例中，为了产生iPS细胞，科学家们开始使用皮肤细胞，然后通过标准实验室技术使用逆转录病毒对所述皮肤细胞进行修饰以将基因插入细胞DNA中。在一个实例中，插入的基因是已知一起充当天然调节剂以使细胞保持处于胚胎干细胞样状态的Oct4、Sox2、Lif4和c-myc。已经在文献中描述了这些细胞。参见例如，Wernig等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,105:5856-5861(2008)；Jaenisch等人,《细胞(Cell)》,132:567-582(2008)；Hanna等人,《细胞》,133:250-264(2008)；和Brambrink等人,《细胞干细胞》,2:151-159(2008)。也可能可以通过特定的培养条件(暴露于特定试剂)产生此类细胞，也可以从多种不同的起始细胞类型产生此类细胞。这些参考文献均通过引用并入本文以教导IPSC和用于产生其的方法。
iPS细胞具有胚胎干细胞的许多特征特性。例如，所述iPS细胞具有产生具有种系传递和四倍体互补的嵌合体的能力，并且它们还可以从三个胚胎种系层形成含有各种细胞类型的畸胎瘤。另一方面，它们可能与某些报告所证实的不相同。参见例如，Chin等人,《细胞干细胞》5:111-123(2009)，其示出诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞可以通过基因表达特征标签来区分。
如本文所用，术语“细胞系”是指在体外培养的细胞，包含原代细胞系、有限细胞系、连续细胞系和经过转化细胞系，但不要求所述细胞能够培养物中进行无限次数的传代。细胞系可以自发地或通过转化产生。
如本文所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。术语“培养”是指生长和/或维持和/或操纵细胞的过程。包含在这个术语内的是连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化细胞)以及体外维持的任何其它细胞群，包含卵母细胞和胚胎。如本文所用，术语“原代细胞培养物”和“原代培养物”是指已经直接在体内从细胞(如从来自动物或人的组织样本或活检物)获得的细胞培养物。这些培养物可以源自于成人以及胎儿组织。
如本文所用，术语“培养基”和“细胞培养基”是指适合于支持细胞在体外生长的培养基(即，细胞培养物、细胞系等)。其并非旨在所述术语限于任何特定的培养基。例如，其旨在定义涵盖维持培养基以及用于分化或特化细胞的其它培养基。实际上，其旨在所述术语涵盖适合于所关注的细胞培养物和细胞的生长的任何培养基。
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。在细胞分化的背景下，试剂盒可以指代用于接触干细胞的材料的组合，此类递送系统包含允许将反应试剂(例如，适当的容器(如管等)中的化合物、蛋白质、检测剂(如探针或抗体)等)和/或支撑材料(例如，缓冲液、用于进行细胞分化的书面说明等)从一个位置储存、运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包含含有相关反应试剂(如抑制剂(例如，SB431542和LDN193189wnt抑制剂、bmp抑制剂、细胞凋亡抑制剂、细胞坏死抑制剂)和生长因子和细胞因子(例如，GDNF、BDNF))和/或支撑材料的一个或多个外壳(例如，盒子或袋子等)。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成但不限于此。术语“体内”是指自然环境(例如，动物或细胞)以及在自然环境内发生的过程或反应。
如本文所用，术语“标志物”或“细胞标志物”是指鉴定特定细胞或细胞类型的基因或蛋白质。细胞的标志物可能不限于一种标志物；标志物可以指代标志物的“模式”，使得指定的一组标志物可以从另一种细胞或细胞类型鉴定出细胞或细胞类型。例如，本发明的神经元表达区分神经元的一种或多种标志物，例如β-III微管蛋白、巢蛋白、N-Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2和VGAT。
当关于本文所公开的任何细胞时，术语“衍生自”或“从……建立”或“从……分化”是指使用任何操纵从细胞系、组织或流体中的亲本细胞获得(例如，分离、纯化等)的细胞，包含对培养的亲本细胞中含有的任何细胞进行单细胞分离、体内培养、使用例如蛋白质、化学物质、放射、感染病毒、用DNA序列(如用形态发生)转染等进行处理和/或诱变、选择(如通过连续培养)。借助于对生长因子、细胞因子、细胞因子治疗的所选择进展、粘附性、缺乏粘附性、分选程序等的响应，可以从混合群中选择衍生细胞。
如本文所用，术语“神经退行性病症”和“神经退行性疾病”在本文档中可互换使用并且意指特征在于异常细胞死亡的神经系统(例如，中枢神经系统或周围神经系统)的疾病。神经退行性病状的实例包含阿尔茨海默氏病、唐氏综合征(Down's syndrome)、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、皮克氏病、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、帕金森氏病、亨廷顿氏病、齿状核红核苍白球丘脑底核萎缩症(dentatorubropallidoluysianatrophy)、肯尼迪病(Kennedy's disease，其也被称为脊延髓肌萎缩症)和脊髓小脑共济失调(例如，1型、2型、3型(也被称为马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)、6型、7型和17型))、脆性X(雷特氏(Rett's))综合征、脆性XE智力迟钝、弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、肌强直性营养不良、8型脊髓小脑共济失调和12型脊髓小脑共济失调、亚历山大病(Alexander disease)、阿尔珀氏病(Alper's disease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(或运动神经元病)、遗传性痉挛性截瘫、线粒体疾病、共济失调性毛细血管扩张、巴滕病(Batten disease，其也被称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、卡纳万病(Canavan disease)、科克因综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底变性、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、缺血性中风、克拉伯病(Krabbe disease)、路易体痴呆(Lewy body dementia)、多发性硬化症、多系统萎缩症、佩梅氏病(Pelizaeus-Merzbacherdisease)、皮克氏病、原发性侧索硬化症、雷弗素姆氏病(Refsum's disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、谢耳德氏病(Schilder's disease)、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩症、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基病(Steele-Richardson-Olszewski disease)和脊髓痨。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等在本文中用于通常指代获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人的疾病的任何治疗，并且包含：(a)防止疾病或病状在可能倾向于患有疾病或症状但尚未被诊断为患有所述疾病或症状的受试者身上发生；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，即使疾病或症状消退。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指期望进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者(具体地，人)。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面说明方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含所引用的数字并且是指可以被随后分解为上文所讨论的子范围的范围。
在术语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”、“comprised(comprised)”或“包括(comprising)”用于本说明书中的情况下，应将它们解释为指定存在所陈述特性、整数、步骤或组件，但是不排除存在一个或多个其它特性、整数、步骤或组件或其组。
本文中对作为现有技术给出的专利文件或其它事项的引用不应视为承认所述文件或事项是已知的或其所含有的信息是自权利要求项中的任一项的优先权日起的公知常识的一部分。
GABA能神经元移植物组合物
伤害感受是允许动物检测到并逃避潜在破坏性刺激的感觉。在哺乳动物中，伤害性感受感觉信息在然后会经历“疼痛”的中枢神经系统中被整合和处理。这个系统最初在5亿年前进化并且伤害感受的基因架构似乎处于强大的选择压力下。蝇幼虫的疼痛反应行为范例已经成为定义急性伤害感受的核心保守基因架构的强大工具。虽然已经进行了大量工作来表征蝇幼虫的急性或瞬态伤害性感受敏化，但是尚无法研究慢性伤害性感受状态。
神经性损伤导致慢性伤害性感受敏化，其中无害刺激会触发疼痛(被称为“异常性疼痛”)。为了鉴定可以靶向治疗疼痛疾病的核心潜在机制，发明人研究了果蝇的神经性“疼痛”响应。令人惊讶地，发明人发现完整的动物对高于42℃的温度展现出强烈的逃避响应，然而在损伤之后，动物开始表现出对低毒温度的疼痛反应响应(即，热异常性疼痛)。通过对这种响应进行的系统基因剖析，发明人已经发现热异常性疼痛依赖于保守的TRP通道TrpA1，并且中枢GABA能抑制的损失对于异常性疼痛是必要的和充分的。通过研究在神经性疼痛的背景下恢复脊柱抑制的治疗潜力，发明人令人惊讶地发现由人诱导性多潜能干细胞(hiPSC)产生的抑制性GABA能神经元移植物在被移植到神经病受试者中时不仅会存活并整合在接受者的内神经系统(例如，中枢神经系统)内，而且重要的是会提供对神经性疼痛的长久性缓解而无副作用。
本发明提供了一种药物组合物，其包括根据本发明的GABA能神经元群。在另一方面，本发明提供了用于产生GABA能神经元的方法。在优选实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包括根据本文所描述的方法产生的GABA能神经元群。
所述药物组合物通常可以包含一种或多种药学上可接受和/或批准的载剂、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。适合的载剂通常是大型代谢缓慢分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质团聚体等。这种药物组合物可以含有适合于体内施用的另外的添加剂(如甘露醇、右旋糖酐、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其它添加剂(如抗氧化剂或惰性气体)、稳定剂或重组蛋白(例如，人血清白蛋白)。
如本文所用，在适当情况下，术语“药学上可接受的”是指在施用于哺乳动物尤其是人时不会产生不利的、过敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载剂或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或调配物助剂。
在一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括用于治疗受试者的疼痛的根据本发明的GABA能神经元群。在优选实施例中，所述疼痛是神经性疼痛。本发明还涉及一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包括根据本发明的GABA能神经元群的药物组合物的步骤。在优选实施例中，所述疼痛是神经性疼痛。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗神经退行性疾病或对中枢或周围神经系统的损伤的如本文所描述的本发明的GABA能神经元群。本发明还涉及一种用于治疗神经退行性疾病或对中枢或周围神经系统的损伤的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如上文所描述的神经元群的步骤。
在本发明的上下文中，如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指旨在进行以下的方法：延迟或预防病理学发作；逆转、减轻、抑制、减慢或停止病理学的症状的进展、加剧或恶化；引起病理学的症状的改善；和/或治愈病理学。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以实现预期目的的根据本文所描述的方法制备的移植物组合物或多个GABA能神经元(或其群或其药物组合物)的任何量。有效剂量和施用方案可以基于受试者的病理学的性质通过良好的医学实践容易地确定并且将取决于多种因素，包含但不限于病理学的症状的程度和所关注组织或器官的损伤或退化的程度以及受试者的特征(例如，年龄、体重、性别、总体健康状况等)。
在一个实施例中，本发明涉及一种移植物组合物，其包括GABA能神经元群、GFRα激动剂和至少一种细胞死亡抑制剂，其中所述GABA能神经元是通过在允许多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞获得GABA能神经元表型并产生GABA的条件下体外分化所述细胞而产生的。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于移植物组合物，其包括GABA能神经元群、GFRα激动剂、细胞凋亡抑制剂和细胞坏死抑制剂，其中所述GABA能神经元是通过在允许多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞获得GABA能神经元表型并产生GABA的条件下体外分化所述细胞而产生的。
对于疗法，可以通过任何适当的途径施用根据本文所描述和示例的方法产生的iPSC源性GABA能神经元和根据本发明的药物组合物。本领域技术人员可以以已知的方式优化施用的剂量和次数。
例如，剂量可以从约100个细胞；500个细胞；1,000个细胞；2,500个细胞；5,000个细胞；10,000个细胞；20,000个细胞；50,000个细胞；100,000个细胞；500,000个细胞；1,000,000个细胞；5,000,000个细胞到10,000,000个细胞或更多个(或其之间的任何整数值)细胞不等；施用频率为例如每天一次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次、每年一次、每年两次、每两个、三个、四个或五个月一次，这取决于例如体重、施用途径、疾病的严重程度等。在一个实施例中，优选剂量是100,000个细胞/微升。在另一个实施例中，本发明的组合物包括250万个细胞。
可以将本文所描述的细胞悬浮于生理上相容的载剂中以进行移植。如本文所用，术语“生理上相容的载剂”是指与调配物的其它成分相容并且对其接受者无害的载剂。本领域技术人员熟悉生理上相容的载剂。适合的载剂的实例包含细胞培养基(例如，伊格尔氏基本必需培养基(Eagle's minimal essential medium))、磷酸盐缓冲盐水、汉克平衡盐溶液+/-葡萄糖(Hank's balanced salt solution+/-glucose，HBSS)以及多种电解质溶液，如Plasma-LyteTM A(巴克斯特公司(Baxter))。
在一个实施例中，所述移植物组合物中的所述GFRα激动剂选自由以下组成的组中的任何一个或多个：GDNF、脑源性神经营养因子(BDNF)、NGF、神经秩蛋白、青蒿素、Persephin、GDNF受体内源性激动剂、BT18、BT13、NT-3、NT-4、CNTF、GFRα1激动剂、XIB4035、Trk激活剂、TrkA激动剂、藤黄胺、阿米替林、TrkB激动剂、N-乙酰血清素、阿米替林、BNN-20BNN-27、脱氧葛杜宁、7,8-二羟基黄酮、4'-二甲基氨基-7,8-二羟基黄酮、香叶木素、HIOC、LM22A-4、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、去甲汉黄芩素、R7(药物)和7,8,3'-三羟基黄酮。在一个实施例中，所述GFRα激动剂选自由胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、青蒿素(ARTN)和Persephin(PSPN)组成的组。在优选实施例中，所述GFRα激动剂是GDNF。
在一个实施例中，所述移植物组合物中的所述细胞凋亡抑制剂选自以下中的一种或多种：选自由Boc-Asp(OMe)氟甲基酮、IDN-8066、7053、7436 19656556M867 IDN-5370IDN-7866普那卡生z-Vad-FMK、YVAD-FMK、c-DEVD-CHO、Ac-YVAD-CHO、Ac-DVAD-FMK、Q-Vd-OPh、CrmA(牛痘病毒蛋白)、p35(杆状病毒蛋白)、Z-ATAD-FMK、INF-4E、Z-DQMD-FMK、Az10417808、Z-LEED-FMK、ZVDK-FMK、z-IETD-FMK、INf-39、Belnacasan、Ac-DEVD-CHO和恩利卡生组成的组的胱天蛋白酶抑制剂；或选自由钙蛋白酶抑制剂1、Calpeptin、E64、MDL28170、MG101、乙酰-钙蛋白酶抑制蛋白、PD150606组成的组的胱天蛋白酶激活剂的抑制剂。在优选实施例中，所述细胞凋亡抑制剂是Boc-Asp(OMe)氟甲基酮。
在另一个实施例中，胱天蛋白酶基因和通路的直接抑制可以通过如通过TALENS、CRISPR-Cas9或RNAi对根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元或所述GABA能神经元衍生自其的细胞进行基因工程以促进细胞存活来实现。
在一个实施例中，所述移植物组合物中的所述细胞坏死抑制剂选自MS-1、IM-54、GSK-872、7-Cl-O-Nec1、坏死抑制蛋白-1、坏死性磺酰胺中的一个或多个。在优选实施例中，所述细胞坏死抑制剂是坏死性磺酰胺。
在另一个实施例中，细胞坏死基因和通路和通路的直接抑制可以通过如通过TALENS、CRISPR-Cas9或RNAi对根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元或所述GABA能神经元衍生自其的细胞进行基因工程以促进细胞存活来实现。
在另一个实施例中，本发明的所述移植物组合物包括以下抑制剂或可以与以下抑制剂一起施用：选自由以下组成的组的一种或多种细胞毒性诱导性细胞凋亡或细胞坏死抑制剂：金刚烷胺(Amantadine)、美金刚(Memantine)、盐酸氯胺酮(Ketaminehydrochloride)、哌替啶(pethidine)、曲马多(tramadol)、美沙酮(methadone)、dectropoxyphene、一氧化二氮、右美沙芬(dextromethorphan)、AP5、AP7、CPPene、赛福太(Selfotel)、乙醇、米诺环素(Minocycline)、阿托莫西汀(Atomoxetine)、AZD6765、胍丁胺(Agmatine)、三氯甲烷(Chlorophorm)、Dextrallorphan、右啡烷(Dextrorphan)、Diphenidine、地佐环平(Dizocilpine)、乙环利定(Eticyclidine)、GAcyclidine、克他命(其它形式)、镁、Methoxetimine、Nitormemantine、PD-137899、苯环己哌啶(Phencyclidine)、咯环利定(Rolicyclidine)、替诺环定(Tenocyclidine)、替莱他明(Tiletamine)、奈拉美仙(Neramexane)、Elipradol、乙苯噁啶(Etoxadrol)、右奥沙屈(Doxoxadrol)、WMS-2539、NEFA、德芦西明(delucemine)、8A-PDHQ、阿替加奈(Aptiganel)、HU-211、石杉碱A、伊博格碱(Ibogaine)、瑞马西胺(remacemide)、Rhynchophylline、加巴喷丁(GABApentin)、Rapastinel、NRX-1074、7-氯尿嘧啶酸、4-氯尿嘧啶、5,7-二氯尿苷酸、犬尿喹啉酸、TK-40、1-氨基环丙烷二羧酸、L-苯基丙氨酸和氙；选自以下的一种或多种兴奋性抑制剂：布比卡因(Bupivacaine)、利多卡因(Lidocaine)、可卡因(Cocaine)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、三聚乙醛(Paraldehyde)、司替戊醇(Stiripentol)、苯巴比妥(Phenobarbitol)、普里米酮(Primidone)、甲基苯巴比妥纳(Methylphenobarbitol)、戊巴比妥(pentobarbital)、苯二氮卓类(Benzodiazepines)(氯巴占(Clobazam)、氯硝西泮(Clonazepam)、Clrazrazepate、安定(Diazepam)、咪达唑仑(Midazolam)、氯羟去甲安定(Lorazepam)、硝基安定(Nitrazepam)、羟基安定(Temidapram)、硝甲西泮(Nimetazepam))、溴化钾(Potassium Bromide)、非尔氨酯(Felbamate)、酰胺(Carboxamides)(卡巴咪嗪(Carbamazepine))、奥卡西平(Oxcarbazepine)、Esclicarbazepine Acetate、丙戊酸类(Valproate)(丙戊酸(Valporic Acid)、丙戊酸钠(Sodium Valporate)、双丙戊酸钠(Divaproex sodium))、氨己烯酸(Vigabatrin)、普罗加比(Progabide)、噻加宾(Tiagabine)、托吡酯(Topiramate)、普瑞巴林(Pregabalin)、乙妥英(Ethotoin)、苯妥英(Phenytoin)、美芬妥英(Mephenytoin)、磷苯妥英(Fosphenytoin)、甲乙双酮(Paramethadone)、三甲双酮(Trimethadione)、乙噁二酮(Ethadione)、贝克拉胺(Becalamide)、普里米酮(Primidone)、布瓦西坦(Brivaracetam)、乙拉西坦(Etiracetam)、左乙拉西坦(Levetircetem)、Slectracetem、乙琥胺(Ethosuximide)、苯琥胺(Phensuximide)、甲琥胺(Mesuximide)、乙酰唑胺(Acetazolamide)、舒噻胺(Sultiame)、醋甲唑胺(Methazolamide)、唑尼沙胺(Zonisamide)、苯丁酰脲(Pheneturide)、苯乙酰脲(Phenacemide)、丙戊酰胺(Valpromide)、戊诺酰胺(Valnoctamide)、吡仑帕奈(Perampanel)、司替戊醇(Stiripentol)、吡哆醇(Pyroxidine)、异氟烷(Isoflurane)、Levoflurane、CNV1014802、Funapide、丙胺卡因(Prilocaine)、Iontocaine、左布比卡因(Levobupivacaine)、布坦卡因(Butanilicaine)、卡替卡因(Carticaine)、地布卡因(Dibucaine)、依替卡因(Etidocaine)、卡波卡因(Mepivacaine)、丙胺卡因(Prilocaine)、三甲卡因(Trimecaine)、阿米洛卡因(Amylocaine)、甲基环卡因(Cyclomethylcaine)、α优卡因(alpha-Eucaine)、β优卡因(Beta-Eucaine)、海克卡因(Hexylcaine)、异布卡因(Isobucaine)、哌罗卡因(Piperocaine)、俄妥卡因(Orhtocaine)、苯坐卡因(Benzocaine)、氨苯丁酯(Butamibe)、氯普鲁卡因(Chloroprocaine)、鲁卡因(Lucaine)、二甲卡因(Dimethocaine)、美普卡因(Meprylcaine)、鲁卡因、硝卡因(Nitrocaine)、俄妥卡因(Orthocaine)、丙氧普鲁卡因(Propoxycaine)、奴佛卡因(Novocaine)、丙美卡因(Proxymetacaine)、利索卡因(Risocaine)、丁卡因(Tetracaine)、Raxatrigine、三环抗忧郁药(Tricyclic antidepressants)(阿米替林、去甲替林)、DSP-2230、美西汀(Mexilitine)、氟吡汀(Flupirtine)、齐考诺肽(ziconotide)；或抑制周围活性的任何药物，包含阿片(Opium)和阿片类药物(Opioids)、非甾体类抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatories)、醋氨酚(Paracetamol)、乙酰丙酮(Acetenalidide)、辣椒素(Capsaicin)、薄荷醇(Menthol)、大麻(Cannabis)和大麻类(Cannibinoids)。
本领域技术人员可以容易地确定需要提供的上文提到的激动剂和抑制剂中的每种激动剂和抑制剂的量。例如，可以通过常规测定来确定胱天蛋白酶或胱天蛋白酶信号传导的抑制水平和/或细胞凋亡或细胞坏死的程度。考虑到神经元细胞活力和功能，可以容易地确定用于移植物组合物和方法(包含但不限于细胞培养基和试剂盒)中的GFRα激动剂、细胞凋亡抑制剂和细胞坏死抑制剂的浓度，所述神经元细胞活力和功能两者均可以使用本领域技术人员已知的测定以及本文所描述的测定容易地评估并因此对其进行调整。
在本发明的实施例中，上文提到的抑制剂和激动剂可以以范围为皮摩尔浓度到微摩尔浓度的浓度存在。
在另一个实施例中，本发明的所述移植物组合物的所述GABA能神经元表达以下中的一种或多种：β-III微管蛋白、微管相关蛋白2(MAP2)、突触蛋白、神经丝L、巢蛋白和N-Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2和VGAT。在优选实施例中，所述GABA能神经元表达VGAT。在另一个实施例中，所述GABA能神经元表达Glyt2以及GAD65和GAD67。在另一个实施例中，所述GABA能神经元表达VGAT、Glyt2以及GAD65和GAD67。
在另一个实施例中，所述GABA能神经元在体内产生GABA。在另一个实施例中，所述GABA能神经元以本文所阐述的实例中所描述的浓度分泌GABA。
在另一方面，本发明提供了本发明的所述移植物组合物的剂型。在一些实施例中，这些剂型包括立即施用组合物。如本文所用，术语“立即施用”是指药物溶液是无菌的并且适合于直接静脉内输注或注射，并且在将药物溶液肠胃外施用于患者之前不需要稀释或重构的中间步骤。药物水溶液可以从剂型的容器直接肠胃外施用。术语“立即施用”与“立即输注”或“立即注射”同义。
制备GABA能神经元的方法
本发明还涉及用于产生GABA能神经元的方法，并且以下方面和实施例可以单独或以任何适合的组合结合使用。
由于衍生自干细胞的分化细胞在无数治疗应用中具有潜力，因此指导或促进培养物中的干细胞向特定体细胞命运的分化备受关注。人干细胞为细胞替代疗法和用于细胞筛选疗法提供了很大的前景。体细胞重新编程成诱导性多潜能干细胞(iPSC)的最新进展已经为生成用于再生医学和疾病建模的患者特异性细胞打开了门。
现在已经令人惊讶地发现，使正在经历向GABA能神经元表型的分化或成熟的细胞与激活BMP信号传导的药剂接触会促进祖细胞向GABA能神经元表型的分化，其中此类细胞的生长抑素表达降低并且小白蛋白表达增加。换句话说，诱导BMP信号传导的这些因子诱导或指导干细胞或祖细胞向具有更有利的抑制性表型的GABA能神经元的分化。因此，已经设想使用在培养系统中增强BMP信号传导的因子来指导干细胞或祖细胞向抑制性GABA能神经元表型的分化。
因此，根据本发明的另一方面，提供了一种用于产生小白蛋白表达增加的GABA能神经元的方法，所述方法包括在足以诱导细胞群中的BMP信号传导的时间和条件下培养经历神经元分化的所述细胞群，持续足以诱导细胞群中的BMP信号传导的时间，与在BMP信号传导未被诱导的条件下培养的细胞相比，所述BMP信号传导足以将所述细胞群分化成具有GABA能神经元表型并且小白蛋白表达升高的细胞。
虽然诱导细胞内的BMP信号传导的多种药剂是已知的，但是根据优选实施例，分化细胞群是通过使所述细胞群与诱导BMP信号传导的一种或多种药剂接触在足以诱导所述细胞群中的BMP信号传导的条件下培养的，持续足以诱导所述细胞群中的BMP信号传导的时间，所述BMP信号传导足以将所述细胞群分化成具有GABA能神经元表型并且小白蛋白表达升高的细胞。优选地，所述一种或多种药剂选自针对BMP I型和/或II型受体的典型配体，并通过与任一个或两个受体结合来激活BMP信号传导。在另一个实施例中，所述一种或多种药剂与BMP I型受体(BMPR-I)和BMP I型受体(BMPR-II)结合，和/或激活SMAD1/5/8信号传导通路。
在一个实施例中，诱导BMP信号传导的所述一种或多种药剂包括BMP4。在优选实施例中，诱导BMP信号传导的所述药剂是BMP4。在另一个实施例中，诱导BMP信号传导的所述一种或多种药剂选自由以下组成的组：选自由以下组成的组的ventromorphins：SJ000291942、SJ000063181和SJ000370178，异甘草素(isoliquiritigenin，SJ000286237)、BMP敏化剂(PD407824)、BMP2、BMP5、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9、BMP10、BMP15、BMP共激活剂FK506(他克莫司(Tacrolimus))和CK2.3(CK2抑制剂)、工程化BMP、内源性BMP拮抗剂头蛋白和腱蛋白的抑制剂(包含中和抗体，如抗头蛋白、抗腱蛋白抗体)、盐酸法舒地尔(FasudilHydrochloride)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(Simvastatin，其可以增强BMP表达)、己酮可可碱(pentoxifyline)、西地那非(sildenafil)、咯利普兰(rolipram，其可以通过磷酸二酯酶抑制增强BMP的作用)。
在另一个实施例中，激活诱导BMP信号传导和/或SMAD1/5/8信号传导的所述一种或多种药剂抑制SMURF1(SMURF1的内源性抑制剂)。
技术人员可以根据本文所描述的方法确定可以用于实现诱导视网膜祖细胞群中的BMP信号传导的一种或多种药剂的浓度，所述BMP信号传导足以将所述细胞群分化成经历神经元分化的细胞。在一个实施例中，细胞群是在包括以约1pM到约100μM的浓度存在的诱导BMP信号传导的一种或多种药剂的细胞培养基中培养的。在另一个实施例中，诱导BMP信号传导的所述一种或多种药剂以约5ng/mL到约50ng/mL的浓度存在。更优选地，诱导BMP信号传导的所述一种或多种药剂以约10ng/mL的浓度存在。在优选实施例中，BMP4以10ng/mL的量存在。
如下文更详细地解释的，在从iPSC群制备GABA能神经元的过程中，发明人令人惊奇地发现，在培养的约第14天到约第21天的时段期间用激活BMP信号传导的药剂使经历向GABA能神经元表型的神经元分化或成熟的细胞暴露证明，与在从约第14天到约第28天或从约第21天到约第28天期间未经处理或经过处理的细胞相比，小白蛋白表达增加6倍并且生长抑素降低50％。
进一步令人惊奇地发现，当正在经历向GABA能神经元表型的分化或成熟的细胞在培养的从约第14天到约第21天的时段期间与激活BMP信号传导的一种或多种药剂接触时，此类细胞在被治疗上采用以治疗疼痛时展现出更有效的长期镇痛响应。
因此，在另一个实施例中，正在经历向GABA能神经元表型的分化或成熟的细胞在培养的从约第14天到约第21天的时段期间与激活BMP信号传导的一种或多种药剂接触。在另一个实施例中，正在经历向GABA能神经元表型的分化或成熟的细胞与激活BMP信号传导的一种或多种药剂接触，持续培养的从约第14天到约第21天的时段的持续时间。在优选实施例中，所述一种或多种药剂包括BMP。在另一个实施例中，正在经历向GABA能神经元表型的分化或成熟的细胞从培养的约第14天到约第21天与BMP4接触。
在一个实施例中，根据以下程序制备本发明的GABA能神经元：
将hiPSC用TripLE(英杰公司(Invitrogen))解离，并悬浮于超低附着结合板中生长2周，以允许形成胚状体(EB)。对于神经诱导，用SMAD抑制剂LDN193189(100nM，第0天到第14天)和SB431542(10μM，第0天到第10天)对细胞进行处理。为了进行MGE(内侧神经节隆起)诱导，用Wnt抑制剂IWP2(5μM，第0天到第7天)、SHH激活剂SAG(平滑激动剂-0.1μM，第0天到第21天)和生长因子FGF8(100ng/mL，第8天到第21天)对细胞进行处理。在分化的第一天添加Rock抑制剂。悬浮2周后，将EB转移到聚鸟氨酸(PLO)和纤连蛋白(FN)涂覆的表面。在第21天，将EB解离，并将细胞重铺在含有10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF和2.5μMγ分泌酶抑制剂DAPT的分化培养基上的PLO/FN涂覆的板上以进行进一步的分化和成熟。
根据前述程序，可以诱导hiPSC在超低附着24孔板(每个孔＝1.9cm2)中分化。最佳细胞密度为每孔约600,000个细胞。将胚状体以d14(3.8cm2)铺于纤连蛋白涂覆的12孔板中。每个孔的最佳EB数量约为10个。然后，将细胞解离并以d21(12孔板)重铺。最佳细胞密度为每孔约30,000个细胞。本领域技术人员将容易地意识到，可以将细胞或EB的最佳密度应用于不同形式和大小的培养容器(例如，组织培养瓶、陪替氏培养皿(petri dish)等)。
可以使用本文所描述和例示的方法来评估对GABA的产生进行的确认，包含分析与GABA有关的转录物和将GABA分泌到细胞培养基中。
治疗的方法
本发明的另一方面涉及用于治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症的本发明的移植物组合物，其包括如本文所描述的GABA能神经元群。本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所描述的移植物组合物施用于有需要的受试者的步骤。本发明还涉及一种如本文所描述的移植物组合物或根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元群的用途，其用于制造用于治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症的药物。
在本发明的上下文中，如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指旨在进行以下的方法：延迟或预防病理学发作；逆转、减轻、抑制、减慢或停止病理学的症状的进展、加剧或恶化；引起病理学的症状的改善；和/或治愈病理学。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以实现预期目的的根据本发明的移植物组合物的任何量。有效剂量和施用方案可以基于受试者的病理学的性质通过良好的医学实践容易地确定并且将取决于多种因素，包含但不限于病理学的症状的程度和所关注组织或器官的损伤或退化的程度以及受试者的特征(例如，年龄、体重、性别、总体健康状况等)。
对于疗法，可以通过任何适当的途径施用根据本发明的移植物组合物。本领域技术人员可以以已知的方式优化施用的剂量和次数。
在一个实施例中，本发明提供了一种治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症的方法。在另一个实施例中，神经学疾病、病症或病状与需要恢复或加强抑制的兴奋性毒性相关。在一个实施例中，神经学病状、疾病或病症选自由以下组成的组：神经性疼痛(包含慢性神经性疼痛)、慢性炎性疼痛、慢性功能障碍性疼痛、癫痫、运动神经元病(ALS、SMA)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、多发性硬化症、τ蛋白病(进行性核上性麻痹、皮克氏病、CBD、FTLD、伴有ALS的FTLD)、亨廷顿氏病、酒精戒断和酒精中毒、糖尿病诱导的脑损伤、颅脑损伤、偏头痛、头痛、丛集性头痛、脊髓损伤、缺血性损伤、化学疗法诱导的疼痛和化学疗法诱导的神经病、精神分裂症、慢性抑郁症、迟发性运动障碍、双相情感障碍和神经病。
在一个实施例中，如本文所描述的GABA能神经元或如本文所描述的移植物组合物或GABA能神经元群施用于受试者的中枢神经系统。在一个实施例中，所述移植物组合物或GABA能神经元群施用于受试者的脊髓。在另一个实施例中，所述移植物组合物或GABA能神经元群施用于受试者的脑。在另一个实施例中，所述移植物组合物或GABA能神经元群施用于受试者的背根神经节。
其中本发明涉及用于治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症的包括如本文所描述的GABA能神经元群的本发明的移植物组合物或如本文所描述的GABA能神经元群，或所述移植物组合物或GABA能神经元群用于制造用于治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症的药物的用途，所述组合物或药物可以被调配用于施用于受试者的中枢神经系统。在一个实施例中，所述移植物组合物或药物被调配用于施用于受试者的脊髓。在另一个实施例中，所述移植物组合物或药物被调配用于施用于受试者的脑。在另一个实施例中，所述移植物组合物或药物被调配用于施用于受试者的背根神经节。
在一个实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的疼痛的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元群或如本文所描述的移植物组合物施用于所述受试者。在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗受试者的疼痛的根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元群或如本文所描述的移植物组合物。在一个实施例中，本发明提供了一种根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元群或如本文所描述的移植物组合物的用途，其用于制造用于治疗受试者的疼痛的药物。在一优选实施例中，所述疼痛是神经性疼痛。
在一个实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的与神经元兴奋性相关的疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元群或如本文所描述的移植物组合物施用于所述受试者。在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的与神经元兴奋性相关的疾病或病症的根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元群或如本文所描述的移植物组合物。在一个实施例中，本发明提供了一种根据本文所描述的方法制备的GABA能神经元群或如本文所描述的移植物组合物的用途，其用于制造用于治疗有需要的受试者的与神经元兴奋性相关的疾病或病症的药物。
试剂盒
本发明提供了一种用于制备本文所描述的移植物组合物的试剂盒。在一个实施例中，所述试剂盒提供了至少一种GFRα激动剂和至少一种细胞死亡抑制剂以及GABA能神经元群。在一个实施例中，所述试剂盒提供了至少一种GFRα激动剂、至少一种细胞凋亡抑制剂和至少一种细胞坏死抑制剂以及GABA能神经元群。
在另一个实施例中，所述试剂盒包括代替所述GABA能神经元群的多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞以及如本文所描述的用于分化细胞以获得GABA能神经元表型并产生GABA的细胞培养试剂。在另一个实施例中，所述试剂盒进一步包括激活BMP信号传导的一种或多种药剂。在一个实施例中，诱导BMP信号传导的所述一种或多种药剂包括BMP4。在优选实施例中，诱导BMP信号传导的所述药剂是BMP4。在另一个实施例中，诱导BMP信号传导的所述一种或多种药剂选自由以下组成的组：选自由以下组成的组的ventromorphins：SJ000291942、SJ000063181和SJ000370178，异甘草素(isoliquiritigenin，SJ000286237)、BMP敏化剂(PD407824)、BMP2、BMP5、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9、BMP10、BMP15、BMP共激活剂FK506(他克莫司(Tacrolimus))和CK2.3(CK2抑制剂)、工程化BMP、内源性BMP拮抗剂头蛋白和腱蛋白的抑制剂(包含中和抗体，如抗头蛋白、抗腱蛋白抗体)、盐酸法舒地尔(FasudilHydrochloride)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(Simvastatin，其可以增强BMP表达)、己酮可可碱(pentoxifyline)、西地那非(sildenafil)、咯利普兰(rolipram，其可以通过磷酸二酯酶抑制增强BMP的作用)。
在另一个实施例中，激活诱导BMP信号传导和/或SMAD1/5/8信号传导的所述一种或多种药剂抑制SMURF1(SMURF1的内源性抑制剂)。
在另一个实施例中，所述试剂盒进一步包括根据本文所描述的方法从多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞分化GABA能神经元的说明以及用于制备包括此类GABA能神经元的移植物组合物的说明。
除抑制剂和激动剂之外，本发明的所述试剂盒可以进一步包括以下中的一种或多种：培养基、至少一种细胞培养基补充剂、用于抑制或增加一种或多种基因产物的表达的药剂以及用于检测神经元分化的标志物的表达的至少一种药剂。
在优选实施例中，所述试剂盒中的所述GFRα激动剂选自由以下组成的组中的任何一个：GDNF、脑源性神经营养因子(BDNF)、NGF、神经秩蛋白、青蒿素、Persephin、GDNF受体内源性激动剂、BT18、BT13、NT-3、NT-4、CNTF、GFRα1激动剂、XIB4035、Trk激活剂、TrkA激动剂、藤黄胺、阿米替林、TrkB激动剂、N-乙酰血清素、阿米替林、BNN-20BNN-27、脱氧葛杜宁、7,8-二羟基黄酮、4'-二甲基氨基-7,8-二羟基黄酮、香叶木素、HIOC、LM22A-4、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、去甲汉黄芩素、R7(药物)和7,8,3'-三羟基黄酮。在一个实施例中，所述GFRα激动剂选自由胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、青蒿素(ARTN)和Persephin(PSPN)组成的组。在优选实施例中，所述GFRα激动剂是GDNF。
在一个实施例中，所述移植物组合物中的所述细胞凋亡抑制剂选自以下中的一种或多种：选自由Boc-Asp(OMe)氟甲基酮、IDN-8066、7053、7436 19656556M867 IDN-5370IDN-7866普那卡生z-Vad-FMK、YVAD-FMK、c-DEVD-CHO、Ac-YVAD-CHO、Ac-DVAD-FMK、Q-Vd-OPh、CrmA(牛痘病毒蛋白)、p35(杆状病毒蛋白)、Z-ATAD-FMK、INF-4E、Z-DQMD-FMK、Az10417808、Z-LEED-FMK、ZVDK-FMK、z-IETD-FMK、INf-39、Belnacasan、Ac-DEVD-CHO和恩利卡生组成的组的胱天蛋白酶抑制剂；或选自由钙蛋白酶抑制剂1、Calpeptin、E64、MDL28170、MG101、乙酰-钙蛋白酶抑制蛋白、PD150606组成的组的胱天蛋白酶激活剂的抑制剂。在优选实施例中，所述细胞凋亡抑制剂是Boc-Asp(OMe)氟甲基酮。
在另一个实施例中，胱天蛋白酶基因和通路的直接抑制可以通过如通过TALENS、CRISPR-Cas9或RNAi对所述GABA能神经元进行基因工程以促进细胞存活来实现。
在一个实施例中，所述试剂盒中的所述细胞坏死抑制剂选自MS-1、IM-54、GSK-872、7-Cl-O-Nec1、坏死抑制蛋白-1、坏死性磺酰胺中的一个或多个。在优选实施例中，所述细胞坏死抑制剂是坏死性磺酰胺。
在另一个实施例中，细胞坏死基因和通路和通路的直接抑制可以通过如通过TALENS、CRISPR-Cas9或RNAi对所述GABA能神经元进行基因工程以促进细胞存活来实现。
在另一个实施例中，本发明的所述试剂盒包括以下抑制剂：选自由以下组成的组的一种或多种细胞毒性诱导性细胞凋亡或细胞坏死抑制剂：金刚烷胺、美金刚、盐酸氯胺酮、哌替啶、曲马多、美沙酮、dectropoxyphene、一氧化二氮、右美沙芬、AP5、AP7、CPPene、赛福太、乙醇、米诺环素、阿托莫西汀、AZD6765、胍丁胺、三氯甲烷、Dextrallorphan、右啡烷、Diphenidine、地佐环平、乙环利定、GAcyclidine、克他命(其它形式)、镁、Methoxetimine、Nitormemantine、PD-137899、苯环己哌啶、咯环利定、替诺环定、替莱他明、奈拉美仙、Elipradol、乙苯噁啶、右奥沙屈、WMS-2539、NEFA、德芦西明、8A-PDHQ、阿替加奈、HU-211、石杉碱A、伊博格碱、瑞马西胺、Rhynchophylline、加巴喷丁、Rapastinel、NRX-1074、7-氯尿嘧啶酸、4-氯尿嘧啶、5,7-二氯尿苷酸、犬尿喹啉酸、TK-40、1-氨基环丙烷二羧酸、L-苯基丙氨酸和氙；选自以下的一种或多种兴奋性抑制剂：布比卡因、利多卡因、可卡因、拉莫三嗪、三聚乙醛、司替戊)、苯巴比妥、普里米酮、甲基苯巴比妥纳、戊巴比妥、苯二氮卓类(氯巴占、氯硝西泮、Clrazrazepate、安定、咪达唑仑、氯羟去甲安定、硝基安定、羟基安定、硝甲西泮)、溴化钾、非尔氨酯、酰胺(卡巴咪嗪)、奥卡西平、Esclicarbazepine Acetate、丙戊酸类(丙戊酸、丙戊酸钠、双丙戊酸钠)、氨己烯酸、普罗加比、噻加宾、托吡酯、普瑞巴林、乙妥英、苯妥英、美芬妥英、磷苯妥英、甲乙双酮、三甲双酮、乙噁二酮、贝克拉胺、普里米酮、布瓦西坦、乙拉西坦、左乙拉西坦、Slectracetem、乙琥胺、苯琥胺、甲琥胺、乙酰唑胺、舒噻胺、醋甲唑胺、唑尼沙胺、苯丁酰脲、苯乙酰脲、丙戊酰胺、戊诺酰胺、吡仑帕奈、司替戊醇、吡哆醇、异氟烷、Levoflurane、CNV1014802、Funapide、丙胺卡因、Iontocaine、左布比卡因、布坦卡因、卡替卡因、地布卡因、依替卡因、卡波卡因、丙胺卡因、三甲卡因、阿米洛卡因、甲基环卡因、α优卡因、β优卡因、海克卡因、异布卡因、哌罗卡因、俄妥卡因、苯坐卡因、氨苯丁酯、氯普鲁卡因、鲁卡因、二甲卡因、美普卡因、鲁卡因、硝卡因、俄妥卡因、丙氧普鲁卡因、奴佛卡因、丙美卡因、利索卡因、丁卡因、Raxatrigine、三环抗忧郁药(阿米替林、去甲替林、DSP-2230、美西汀、氟吡汀、齐考诺肽)；或抑制周围活性的任何药物，包含阿片和阿片类药物、非甾体类抗炎药、醋氨酚、乙酰丙酮、辣椒素、薄荷醇、大麻和大麻类。
在其它实施例中，当根据如本文所描述的治疗方法使用时，本发明提供了一种试剂盒。
通过以下非限制性实例说明了本发明的这些方面和其它方面。应当理解，在一些方面，实例中所描述的一个或多个实施例通常可以与上文所描述的一个或多个实施例组合地适用。
实例
实验模型和受试者细节
动物
小鼠是从ARC(动物资源中心，ARC)获得的年龄为10周并对设施和设备习惯了2周的雄性NOD.PRKDSCID.ARC。所有动物实验均对治疗不知情，并且对实验组的分配由对行为数据和健康状况不知情的实验者伪随机进行。将小鼠饲养在12小时光暗循环下，并在所有阶段随意为其提供标准饮食和水。将所有小鼠维持在无特定病原体的设施中，并将无菌技术用于所有处理和实验。所有行为均由单个男性研究人员执行。所有实验均由悉尼大学动物伦理委员会(University of Sydney Animal Ethics Committee)根据动物伦理协议938批准。已经通过ARRIVE指南并根据澳大利亚国家卫生与医学研究委员会(AustralianNational Health and Medical Research Council)指南来指导实验设计和记录。
果蝇资源
将果蝇在25℃下饲养在标准玉米粉、酵母和蔗糖琼脂培养基上处于12小时:12小时的光:暗循环下。从BDSC文库获得Canton S(BDSC 64349)、无痛性(EP(2)2451)(BDSC27895)、ppk-Gal4(BDSC 32078)、UAS-CD8-GFP(BDSC 5130)、UAS-Dcr2、UAS-破伤风毒素(活性BDSC 28838和失活BDSC 28839)、UAS-p35(BDSC 5072)和UAS-Lamin-GFP(BDSC 7376)蝇。从VDRC RNAi文库获得w1118(VDRC 60000)、UAS-TrpA1-RNAi(VDRC 37249)、UAS-RDL-RNAi(VDRC 41101)、UAS-GRD-RNAi(VDRC 5329)、UAS-D-GABA-B-R1-RNAi(VDRC 101440)、UAS-D-GABA-B-R2-RNAi(VDRC 110268和VDRC 1785)、UAS-D-GABA-B-R3-RNAi(VDRC 50176)、UAS-LCCH3-RNAi(VDRC 37408)蝇。
人多潜能干细胞系
在这项研究中使用了ATCC-BXS0116 hiPSC系(ATCC、ACS1030)。
实验方法
成体热伤害感受测定系统
成体热伤害感受测定系统由以下组成：透明的聚苯乙烯测试室(高度0.3cm、直径5.5cm的透明塑料盖)、可变加热元件(型号AHP-1200DCP，部件号9-34KB-1-0A1，美国伊利诺伊州美国热电制冷(TECA)公司(ThermoElectric Cooling America(TECA)Corp.))、影片记录设置和行为分析软件。用单个摄像机(佳能(Canon)EOS 700D，18-55mm镜头)从顶部记录影片；影片含有十只蝇的行为痕迹。
蝇损伤模型
使用vannas剪刀将右中腿在股节段处截肢。蝇在腿被截肢时的年龄为7天，并在1天、7天或14天后对其进行了测试。将每组10只苍蝇在被置于行为室之前在冰上进行轻度麻醉。将表面最初设置在25℃。使蝇适应测试室，并且然后记录基线25℃响应。将表面温度保持在25℃持续2分钟，然后上升到30℃持续2分钟，然后类似地上升到35℃持续2分钟，上升到38℃持续2分钟，并且最终上升到42℃持续1分钟。将设置为29fps图像/秒并且定位在设备上方的视频记录摄像机用于记录对蝇的观察。使用记录的视频手动地对跳跃行为进行评分，以免对治疗产生影响。使用跟踪单独的蝇的Ctrax软件和包对移动速度进行测量。对于每个实验，对3批10只蝇进行测试，然后用三个独立组(n＝9)来重复结果。使用t测试进行单次比较并且使用ANOVA、然后使用事后Tukey测试进行多次比较来进行统计分析。
电生理学记录
使用冰麻醉蝇，然后将其锚定到蜡支持物，保持腹侧向下。将由钨制成的两个刺激电极连接到刺激器(恒定电压隔离刺激器，型号DS2A-Mk.II，Digitimer公司)置于两只眼睛中以激活巨纤维系统(GFS)。类似地，将两个钨刺激电极也置于右腿(同侧)或左腿(对侧)的Femis段的中间以激活通过腿的伤害性感受GFS逃避。对于通过眼睛的GFS，蝇被给予20个单刺激，最大刺激强度小于15V。对于腿刺激伤害性感受逃避，最大刺激强度小于60V。对于所有实验，刺激持续时间始终保持在10微秒。将钨接地电极置于蝇腹部中。将在5M氢氧化钠中锐化的钨记录电极(具有台式电源，PSU 130-LASCAR)置于蝇的左后侧处于背纵肌纤维(DLM)处以记录突触后电位(PSP)。将每组至少9只蝇的PSP用型号1800(A-M系统)的微电极AC放大器记录，在0.5kHz下进行过滤，并在1kHz下进行数字化。使用AxoGraph软件(加利福尼亚州伯克利的AxoGraph科技公司(AxoGraph Scientific,))对PSP进行分析。为了确定通过刺激腿所测量到的响应是否是由中枢神经系统介导的，使用类似的录音设置，并将蝇的头部去除。将Mann-Whitney秩和测试用于确定响应潜伏期和持续时间的差异。
免疫组织化学研究和成像
如所描述的，对蝇脑和VNC进行免疫荧光。以1:500的稀释度使用抗GABA(A2052，西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich))，以1:75的稀释度使用nc82抗体(发育研究杂交瘤库(Developmental Studies Hybridoma Bank))，并以1:500的稀释度切割胱天蛋白酶-3抗体(Asp175，细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))。以1/500的稀释度使用次级抗体(来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)的Alexa 488、Alexa 555和Alexa 647)。使用具有40X NA 1.30油物镜的徕卡(Leica)DMI 6000SP8共聚焦显微镜以0.6μm的间隔获取共聚焦切片。通过进行ImageJ中的图像堆叠的最大投射来制作俯视图图片(NIH；http:// rsbweb.nih.gov/ij/)；并使用ImageJ和徕卡应用套件X(Leica Application Suite X)、LASX软件制作切向侧视图图像。使用ImageJ中的3D对象计数器功能对GABA团簇进行定量。在同一共聚焦显微镜下，以2.34μm的间隔以16X/0.5IMM物镜进行腿成像，并以0.6μm的间隔以40X油物镜获取跗节段成像。通过使用ImageJ测量保留在腿中的树突长度来评估腿中的ppk+神经元的神经病。
HiPSC培养和分化成GABA中间神经元或感觉神经元
将HiPSC维持在mTESR1培养基(干细胞技术公司(Stem Cell technologies))中的基质胶涂覆的表面上。
使用由Kim TG等人,《干细胞(Stem Cells)》,2014描述的协议的改编版本将HiPSC在GABA中间神经元中分化。简而言之，将hiPSC用TripLE(英杰公司)解离，并悬浮于超低附着结合板中生长2周，以允许形成胚状体(EB)。对于神经诱导，用SMAD抑制剂LDN193189(100nM，第0天到第14天)和SB431542(10μM，第0天到第10天)对细胞进行处理。为了进行MGE(内侧神经节隆起)诱导，用Wnt抑制剂IWP2(5μM，第0天到第7天)、SHH激活剂SAG(平滑激动剂-0.1μM，第0天到第21天)和生长因子FGF8(100ng/mL，第8天到第21天)对细胞进行处理。仅在分化的第一天添加Rock抑制剂。悬浮2周后，将EB转移到聚鸟氨酸(PLO)和纤连蛋白(FN)涂覆的表面。在第21天，将EB解离，并将细胞重铺在含有10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF和2.5μMγ分泌酶抑制剂DAPT的分化培养基上的PLO/FN涂覆的板上以进行进一步的分化和成熟。
将HiPSC按照Young GT等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》,2014中描述的协议在感觉神经元中分化，不同之处在于丝裂霉素C被省略。
针对移植的细胞制备
将HiPSC源性GABA中间神经元在分化的25天解离，并重新悬浮于由具有10ng/mLGDNF、20μM Boc-Asp(OMe)氟甲基酮(广谱胱天蛋白酶抑制剂-细胞凋亡抑制剂)和50nM坏死性磺酰胺(MLKL抑制剂-细胞坏死抑制剂)的汉克平衡盐溶液(HBSS)制成的注射培养基中，最终浓度为每微升100,000个细胞。
旷场
使小鼠习惯于在其居住笼中到具有两个向上照明源的平均受光的暗室。通过移动电话光度计(摩托罗拉公司(Motorola))测量盒子的每个角落中的光。在每个测试场合记录小鼠行为持续五分钟。然后通过Topscan行为分析软件对行为进行分析。
SNI修饰的Basso小鼠量表
将Basso的修饰形式用于评估移植后的步态。简而言之，针对以下对小鼠进行评分：脚踝移动(总分3，从不＝0，有时＝1，经常＝2，始终＝3)、足底踏步(总分3，从不＝0，有时＝1，经常＝2，始终＝3)、协调(总分3，从不＝0，有时＝1，经常＝2，始终＝3)和爪旋转(平行＝2，旋转＝1，未行走＝0)。根据视频对小鼠进行双边评分。
Von Frey
使小鼠在单独的3天习惯。为了对疼痛进行基线评估，然后在不同的3天对小鼠进行测试。将基线阈值定义为测试的最后两天的阈值的平均值。将Von Frey长丝应用于脚垫的腓肠部分，并在每个刺激阈值(0.04到2.0g)下应用10次。记录对每个长丝的响应，直到达到100％响应为止。在50％的测试中，将阈值报告为引起响应的最低长丝。在保留性神经损伤后6天对小鼠进行评估，并且然后每周评估一次。
丙酮
使用来自1ml胰岛素注射器的约30ul的喷射，将一滴丙酮应用于小鼠后爪。对舔和咬所花费的时间进行持续一分钟的记录。
保留性神经损伤
将小鼠用3％的异氟烷以0.8L/分钟的氧气麻醉以进行诱导，然后用2％的异氟烷进行维持。通过脚趾反射和眼睑反射的不存在来确认麻醉深度。为眼睛提供润滑，以防止对角膜的损伤。将皮肤用手术刀切开，并将肌肉钝性解剖以分离出左坐骨神经。将神经的胫节和腓总部分用Ethilon 4-0尼龙缝合材料(约翰逊和约翰逊国际公司(Johnson andJohnson International))连接，并将神经的一部分去除，注意不要触碰腓肠神经。然后，将切口用伤口夹(Reflex，Fine科技工具公司(FineScience Tools))闭合。通过皮下注射每天向NOD SCID小鼠提供含2.5mg/kg恩诺沙星(enrofloxacin，拜耳公司拜有利(Baytril,Bayer))的0.9mg生理盐水(辉瑞公司(Pfizer))，持续7天。在4-5天后对运动行为进行评估，并在6天时对疼痛行为进行评估。
体内椎板切除术和脊髓细胞注射
通过腹膜内注射用氯胺酮(克他命(Ketamil))/甲苯噻嗪混合物(100mg/8mg/kg)麻醉小鼠。通过脚趾夹紧和不存在眼睑反射来对麻醉深度进行定期监测。还对呼吸速率、体温和粘膜再灌注进行监测。用37℃加热板维持体温，并且在手术期间中提供0.8到1L/分钟的氧气以分别防止体温过低和缺氧。沿背部形成切口，并通过使用眼科Vannas弹簧剪刀(世界精密仪器公司(World Precision instruments))进行仔细椎弓根解剖将L1去除。使用脊柱后中央动脉作为标志，与损伤同侧地使用立体定位设备(Kopf)和带有定制设计的针的Hamilton注射器(29号，其针样式为4且角度为30°，长度为1.5英寸)进行针对腰椎背角的2μl注射。简而言之，将针推进，直到初始地刺穿硬脑膜，然后使用数字立体定位监测装置将针头下降。将2μl的溶液缓慢注射并留在适当位置持续5分钟以防止流出。使用Vicryl 5-0反向切割缝线(约翰逊和约翰逊国际公司)缝合浅筋膜，并将切口用2-3个伤口夹闭合。注射8mg/kg布比卡因(辉瑞公司)并将其在伤口边缘周围经皮下/经皮冲洗，并且每天提供恩诺沙星，持续10天。手术后6天对疼痛行为进行首次评估。在实验的持续时间内每天监测小鼠。手术后立即向小鼠提供40℃的温生理盐水(辉瑞公司)。手术后每2小时监测一次小鼠，并向其提供温暖直到完全恢复为止。
灌注
在神经损伤后四周将经过深度麻醉的小鼠取出。打开胸腔并使心脏暴露，并将有翼导管(Griener Bio-one)插入左心室中。使用注射器驱动器向小鼠灌注25ml的0.1M磷酸盐缓冲液(PB，pH 7.4，西格玛公司(Sigma))，然后灌注含25ml的4％(w/v)多聚甲醛(PFA，西格玛公司)的0.1M PB。将脊柱组织从根部和尾部去除至少2mm到注射部位。将组织固定在PFA中持续2-4小时，并且然后在30％(w/v)蔗糖中冷冻保护过夜。对所得组织进行切割以符合冷冻模具，并将其快速冷冻嵌入在O.C.T(VWR)中。在低温恒温器(赛默飞世尔公司)上以16-20μm对脊髓进行切片。
抗体染色
在室温下将细胞用10％福尔马林(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，HT5011)固定15分钟，并使用所列抗体和稀释度针对特定神经元标志物对其进行染色。使用适当的Alexa Fluor次级抗体(赛默飞世尔科技生命科学公司(Thermo Fisher ScientificLife Sciences)；1:500)，并用Hoechst 33342(1:5,000；赛默飞世尔科技生命科学公司目录号H3570)使核可视化。
为了进行脊髓染色，使冷冻切片平衡到室温持续20分钟。然后，将切片在PBS中冲洗三次，持续五分钟。将载玻片在室温下在封闭溶液(PBS、牛血清白蛋白(2％)和0.3％Triton X100)中封闭1小时。添加初级抗体，将其在封闭溶液中稀释，并在4℃下在加湿室内温育过夜。以所列稀释度添加适当的次级抗体。最后，将载玻片在PBS中洗涤3次，每次持续15分钟，并将载玻片用Vectashield防褪色封固溶液盖上盖玻片。
RNA萃取
通过使用Favorgen血液/培养细胞总RNA试剂盒(Favorgen生物技术公司(Favorgen Biotech Corp.))，从hiPSC和GABA能神经元培养物中收集总RNA。使用柱上DNase I消化套件(西格玛公司)在溶液中用DNase对RNA进行处理，并用40U RibosafeRNase抑制剂(Bioline)对每个样品进行维持。通过吸光度光谱法(Nanodrop，赛默飞世尔科技生命科学公司)、安捷伦生物分析仪(Agilent Bio-analyser)和琼脂糖凝胶电泳对RNA的质量和数量进行评估。
qPCR
定量后，使用针对qRT-PCR的Superscript III First-Strand SynthesisSuperMix(赛默飞世尔科技生命科学公司)对1μg的RNA进行反转录。使用SYBR SelectMaster Mix，将总共2μl的cDNA用于qPCR。在LightCycler 480仪器II(罗氏生命科学公司(Roche Life Science))上运行实时PCR。所有基因的循环程序如下：
-1.95℃10'，初始变性步骤
-2.95℃30”
-3.58℃30”
-4.72℃30”，转到2持续35个循环
-5.熔融曲线分析。
引物序列如下：
GAD1 FWD：CACAAGGCGACTCTTCTCTTC
GAD1 RVR：GCGGACCCCAATACCACTAAC
GAD2 FWD：TTTTGGTCTTTCGGGTCGGAA
GAD2 RVR：TTCTCGGCGTCTCCGTAGAG
VGAT FWD：ACGTCCGTGTCCAACAAGTC
VGAT RVR：AAAGTCGAGGTCGTCGCAAT
SST FWD ACCCAACCAGACGGAGAATGA
SST RVR GCCGGGTTTGAGTTAGCAGA
SOX 6FWD：GGATGCAATGACCCAGGATTT
SOX6 RVR：GGATGCAATGACCCAGGATTT
Catrenin FWD：ACTTTGACGCAGACGGAAATG
Caltrenin RVR：GAAGTTCTCTTCGGTTGGCAG
钙结合蛋白FWD：GGCTCCATTTCGACGCTGA
钙结合蛋白RVR：GCCCATACTGATCCACAAAAGTT
TUBB3 FWD：GGCCAAGGGTCACTACACG
TUBB3 RVR：GCAGTCGCAGTTTTCACACTC
LHX6 FWD：GGGCGCGTCATAAAAAGCAC
LHX6 RVR：TGAACGGGGTGTAGTGGATGT
OLIG2 FWD：CCAGAGCCCGATGACCTTTTT
OLIG2 RVR：CACTGCCTCCTAGCTTGTCC
NKX2.1 FWD：AGCACACGACTCCGTTCTC
NKX2.1 RVR：GCCCACTTTCTTGTAGCTTTCC
PAX6 FWD：TGGGCAGGTATTACGAGACTG
PAX6 RVR：ACTCCCGCTTATACTGGGCTA
RNA测序
Novogene根据其标准内部方法进行RNA测序。使用用于Illumina的NEBNext UltraRNA文库制备试剂盒进行文库制备。使用HiSeq PE簇试剂盒cBot-HS(illumina)对带有索引编码样品进行聚类，并在illumine hiseq平台上对所得文库进行测序，并生成125/150BP配对末端读段。
RNA测序分析
通过去除含有衔接子、聚-N和低质量读段的读段获得纯净读段。对纯净数据进行所有下游数据分析。使用Bowtie v2.2.3产生参考基因组的索引，并使用TopHat v2.0.12将配对末端纯净读段与参考基因组比对。使用HTSeq v0.6.1对映射到每个基因的读段数量进行计数，并且然后基于基因长度和映射到基因的读段计数对FPKM进行计算。将原始读段计数以R输入到DESeq2包中，并对差异表达进行评估。对于可视化热图，将FPKM归一化到最大值FPKM。通过Benjamani Hochberg对所得p值进行调整，并将经过调整的p值小于0.05的基因评估为经过差异表达的。
流式细胞术分析
将细胞用TryPLE(英杰公司)解离，固定在10％福尔马林(西格玛-奥德里奇公司，HT5011)中持续20分钟，并且用封闭缓冲液(具有3％BSA和0.3％Triton X100的PBS)温育。将经过封闭的细胞用初级抗体(缀合的抗-β3微管蛋白抗体-Alexa Fluor 488(艾博抗(Abcam))或抗GAD65抗体(艾博抗))在封闭缓冲液中温育30分钟。将细胞用PBS洗涤3次，并用Alexa Fluor 594缀合的次级抗体(艾博抗)温育另外30分钟。用PBS洗涤后，将细胞重浮于具有3％BSA的PBS中并对其进行分析。在相同条件下使用针对GAD-65的小鼠IgG同种型对照抗体。未经标记的对照也用作对照。使用FACSAria(BD生物科学公司)收集10,000个事件的获取。使用Flowjo软件分析原始数据。
ELISA
在25DIV下，将GABA能神经元留在培养基中，持续三天。对培养基进行抽吸，并使用大鼠γ-氨基丁酸ELISA(MyBioSource)对其进行测试。使用GraphPad Prism使用4点逻辑回归根据制造商的说明转换吸光度值。
GABA对诱导性多潜能干细胞蛋白质组学
通过本文所描述的方法衍生GABA神经元。在25DIV下，通过在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中进行温和洗涤3次，将所述GABA神经元裂解。将变性裂解缓冲液(4％SDS、20mM磷酸钠6.0、100mM NaCl、完全蛋白酶抑制剂(不含EDTA，罗氏公司)、10mM NaF、10mM焦磷酸钠、2mM原钒酸钠、60mM B-甘油磷酸酯)添加到孔并且然后使用细胞刮刀对其进行刮擦，将样品在65℃下加热10分钟。然后，在Q.Sonica 800上对样品进行超声处理(30秒超声开/关循环，总超声10分钟，在18℃下振幅80％)。
蛋白质消化、肽清理和定量——通过添加三羧乙基膦(TCEP)将蛋白质(100ug)减少到最终浓度10mM。将蛋白质样品以1000rpm在ThermoMixer-C(Eppendorf)中加热到65℃，持续10分钟。一旦冷却到室温，就将N-乙基马来酰亚胺(NEM)以20mM的最终浓度添加到级分，并使其在室温下温育30分钟。使用先前描述的SP3方法(使用顺磁珠技术的超灵敏蛋白质组分析)对级分进行缓冲液交换和胰蛋白酶消化。Hughes CS、Foehr S、Garfield DA、Furlong EE、Steinmetz LM、Krijgsveld《分子系统生物学(J.Mol Syst Biol.)》2014年10月30日；10:757.doi:10.15252/msb.20145625)。
LC-MS/MS和质谱分析
使用赛默飞世尔科技公司的EasyLC 1000UHPLC，将4％(vol/vol)甲酸中的肽(注射量3μL，大约1000ng肽)直接注射到带有集成发射器的具有1.9μm颗粒的50cm×75μm反相C18色谱柱上(Maisch GmbH博士)。以300nL/分钟-1的流速在90分钟内在5％乙腈到30％乙腈的梯度内对肽进行分离。通过电喷射离子化在+2.3kV上使肽离子化。在Q-Exactive质谱仪(赛默飞世尔科技)上使用HCD碎裂进行串联质谱法分析。数据依赖性获取方法使用在梯度期间的任一点处的前20个最丰富离子上的所获取的MS/MS质谱图。所有原始MS数据都已经存储到ProteomeXchange联盟(http://proteomecentral.proteomex change.org)，这是通过PRIDE合作伙伴存储库用数据集标识符PXD00XXXX、用户名：reviewerXXXX@ebi.ac.uk、密码：XXXXX进行的。使用MaxQuant对由质谱仪产生的原始数据进行分析。使用基于靶-诱饵的策略将肽和蛋白质水平鉴定设置成错误发现率为1％。提供给搜索引擎的用于肽鉴定的数据库是于2017年9月30日下载的Human Swissprot数据库。将前体离子的质量容差设置成4.5ppm并将MS/MS质量容差设置成20ppm。将酶设置成胰蛋白酶(切割C末端到R/K)，其具有多达2个漏切。将N/Q的脱酰胺化、M的氧化、N端pyro-E/Q、蛋白质N端乙酰化设置为可变修饰。搜索C上的N-乙基马来酰亚胺作为固定修饰。来自MaxQuant的输出也已经通过上文所给出的相同标识符上传到ProteomeXchange联盟。
蛋白质测定
根据制造商的说明(赛默飞世尔科技公司)使用二喹啉甲酸蛋白质测定对样品蛋白质浓度进行测定。
蛋白质印迹
将10μg所萃取的人干细胞蛋白质和梯(参见BluePlus 2预染的，赛默飞世尔目录号LC5925)在8-12％(w/v)SDS-聚丙烯酰胺凝胶(S5)上进行电泳(1小时，150V)。然后将分离出的蛋白质在35V下湿转移到硝酸纤维素膜(Li-Cor)持续1.5小时，并且然后将其在含5％(w/v)干脱脂奶粉的PBS中封闭，并在4℃下在溶解于5％BSA、0.1％PBS吐温-20(Tween-20)和0.02％叠氮化钠封闭缓冲液(表XXX)中的初级抗体中温育过夜。洗涤后，将硝酸纤维素膜用适当的荧光团缀合的次级抗体温育(参见表)。使用
Figure BDA0002822466030000611
红外成像系统(Li-Cor生物科学公司(Li-Cor Biosciences))使印迹可视化。对于考马斯染色(Coomassie stains)(考马斯Insta蓝，西格玛-奥德里奇公司，目录号ISB1L)，将10μg的蛋白质与纤连蛋白和基质胶对照一起在150V下进行电泳1小时，并在室温下在考马斯染色中温育过夜。在脱色2小时后，使用
Figure BDA0002822466030000612
红外成像系统对凝胶进行成像。
数据分析
通过斯图登氏t测试对蛋白质组学数据进行分析，并用Benjamani Hochberg程序针对错误发现对其进行调整。
实例1.神经性“疼痛”是对损伤的保守响应。
为了研究基因易处理的无脊椎动物的慢性“疼痛”，发明人在成体果蝇中建立了神经损伤模型。在蝇中，≥42℃的表面温度在几分钟内触发强烈的伤害性感受避免响应或死亡。利用这种行为，发明人开发了蝇热板逃避范例以研究伤害性感受阈值。当表面被设置为25-38℃时，野生型(Canton S)果蝇示出最小逃避响应(图1A，未示出)。然而，当动物暴露于有毒热时(42℃)，未受损伤的蝇示出强烈的伤害性感受逃避响应，其中动物表现出约3次逃避响应/蝇/分钟(图1A)。由于果蝇TrpA家族成员TrpA1(Neely等人,2011；Zhong等人,2012)和无痛性(Neely等人,2010；Tracey等人,2003)是幼体和成体蝇的急性热伤害感受所需要的，因此发明人测试了这些受体是否也参与这个响应。实际上，TrpA1和无痛性两者均是有毒(42℃)温度下的急性逃避行为所需要的(图1A)。
接下来，发明人使蝇受损伤，并询问损伤是否改变热逃避响应曲线。发明人对野生型动物的右中腿进行截肢(图1B)，允许动物恢复，然后对不同温度下的逃避响应进行评价。完整的动物在暴露于38℃表面时展现出最小逃避尝试，截肢后，蝇显著示出更多的逃避行为(图1C)。这个响应在损伤后立即不存在，损伤后约7天首次变得明显，并持续14天(图1C，图1A和1B)。损伤没有改变有毒温度(42℃)下的逃避响应，所述逃避响应被认为是痛觉过敏响应，但限于与热异常性疼痛一致的低毒敏化(38℃)；其中“疼痛”行为响应是通过无害刺激引发的(图1D，图1A和1B)。对整体速度进行的分析示出，肢体截肢后移动没有明显变化，这指示观察到的表型不是由于活性的普遍差异所致(图1E)。这些数据在一起示出，果蝇响应于严重损伤而表现出异常性疼痛。
实例2.异常性疼痛由TrpA1在ppk+感觉神经元中介导
在幼体中，ppk+感觉神经元使动物的身体成图块状并转导急性有毒热响应(Zhong等人,2010)。在成体蝇中，发明人观察到ppk+神经元在腿中组织成可能的感觉结构(图2A)，其中ppk+细胞体沿腿定位(图2B)并且ppk+神经元外围地并向腹神经索(VNC)和大脑发送投射(图2C，图8C-8E)。重要的是，当发明人用UAS-破伤风毒素阻断ppk+神经元的突触输出时，动物在损伤后不再表现出异常性疼痛(图2D)，而以其它方式示出相当的移动性(未示出)。此外，虽然对照动物在损伤后对38℃表现敏感的逃避响应，但是无痛性突变动物和TrpA1突变动物两者均完全对这种效应具有抗性(图2E)并且甚至在42℃下未示出敏化。最后，在ppk+感觉神经元中驱动TrpA1 RNAi足以阻断异常性疼痛(图2F)，并且通过在TrpA1突变体背景下将TrpA1特异性地重新引入ppk+感觉神经元中完全挽救敏化(图2G)。因此，在蝇中，神经性异常性疼痛需要在ppk+伤害性感受感觉神经元中特异性表达的保守的伤害性感受TRP通道TrpA1。
实例3.周围神经性损伤通过中枢机制引起异常性疼痛
因为蝇在被置于热表面上时会表现出“跳跃”逃避响应，并且这种响应在损伤后示出敏化，所以发明人接下来研究激活腿中的感觉神经元是否可以直接触发逃避响应回路。发明人刺激完整蝇的中腿上的伤害性感受器，并通过来自背纵肌(DLM)的细胞内记录(果蝇逃避响应回路的最终步骤)对逃避响应进行了评价(图3A)。对完整腿进行的刺激触发强烈的逃避响应(图3A)。巨纤维响应可以在没有脑参与的情况下发生(图9A)。然而，发明人发现导致逃避响应的腿刺激不是局部反射而是需要更高阶的脑功能(图9B)。有趣的是，虽然对中腿进行的截肢引起了对无害热的行为敏化，但是当发明人直接刺激受损伤的腿时，发明人没有观察到响应(图3B)。因此，发明人在7天内在受损伤的腿中看见近端ppk+感觉神经元的逐渐的神经病(图3C，以D定量)，并且在哺乳动物中的周围神经横切后观察到经轴索显微外科术的神经元的类似的变性损失(Tandrup等人,2000)。
由于受损伤的腿的其余区段示出严重的感觉神经病并且对刺激无响应，因此发明人改为刺激经过截肢的蝇的对侧未受损伤的腿并对逃避响应的激活进行了评估(图3E)。令人惊讶的是，损伤后7天，发明人在刺激对侧腿时观察到明显变化，其中整体逃避响应速度加快0.2毫秒发生(图3F，以G定量)并且响应持续时间持续延长0.2毫秒(图3F，以H定量)。伤害性感受逃避回路的上升组件和下降组件均在损伤后发生变化，因为当发明人绕过传入的感觉输入并直接刺激下降的逃避回路时，发明人仍然观察到总增强响应速度的50％(加快0.1毫秒；图9C)。这些数据在一起示出，周围损伤会导致感觉神经病、对侧敏化和伤害性感受逃避回路的经验驱动可塑性。
实例4.GABA能抑制的中枢损失引起神经性异常性疼痛
ppk+感觉神经元从腿投射到果蝇CNS的腹“角”(图2A-2C，图8C-8E)。通过共同标记伤害性感受(ppk+)神经元和GABA能神经元，发明人观察到VNC中这两个群之间的紧密相互作用。重要的是，损伤后7天，发明人观察到第2个VNC叶的同侧区段和对侧区段两者中的GABA免疫反应性显著降低40％(图4A-4B；俯视图，图9D；横向平面，以9E定量)，其中这种损失主要沿VNC中线发生。GABA团簇在VNC的第一叶和第三叶中也发生显著但较不严重的降低(图10A-10B)，然而，在受损伤的动物的脑中没有观察到GABA团簇数量的差异(图10C)，即，GABA免疫反应性的损失定位于VNC。GABA能神经元的损失不是由于这些细胞的直接损伤所致，因为在蝇腿中没有观察到GABA能核或投射(未显示)。TrpA1不是GABA能团簇的损失所需要的(未显示)，然而，阻断来自ppk+感觉神经元的突触输出(ppk-Gal4驱动UAS-破伤风毒素)完全阻止了VNC GABA团簇的损失(图4C，以9F定量)，这证实了这种损伤的神经病性质。
由于胱天蛋白酶的药理学抑制可以防止GABA损失并抑制啮齿类动物的神经性疼痛的产生(Scholz等人,2005)，发明人对胱天蛋白酶调节蝇的中枢GABA的作用进行了评估。完整动物示出其VNC中几乎没有GABA/活性胱天蛋白酶共同标记(由Gad1-Gal4>UAS-Lamin-GFP标记的GABA能神经元；图4D，以10E定量)。损伤后，VNC中的GABA能核的总数急剧减少(以10D定量)，而Gad1/活性胱天蛋白酶双阳性细胞的数量显著增加(图4D；以10E定量)。为了直接测试GABA能细胞损失是否是胱天蛋白酶依赖性事件，发明人驱动胱天蛋白酶抑制剂p35在GABA能神经元中的特异性表达(Gad1-Gal4>UAS-p35)。虽然阻断胱天蛋白酶不会改变蝇VNC中的GABA团簇的基线数量，但是Gad1+GABA能神经元中的p35的异位表达完全阻断神经损伤后的GABA团簇的损失(图4E，以10F定量)。接下来，发明人测试了阻断GABA能(+)细胞损失是否对受损伤的动物的整体伤害性感受回路造成功能性后果。伤害性感受逃避回路在亲本对照系(UAS-p35/+)中显示出增加的响应潜伏期和持续时间，而抑制GABA能细胞死亡(Gad1-Gal4>UAS-p35)完全阻断损伤后的伤害性感受逃避回路的所有变化(图4F-4G)。重要的是，腿截肢后，亲本对照系表现出神经性异常性疼痛，而阻断胱天蛋白酶介导的GABA能细胞死亡完全抑制这种响应(图4H)。相反，对狄氏剂(Rdl)具有抗性的代谢型GABA-B-R2或离子型GABA/甘氨酸受体亚基的伤害感受器特异性(ppk-Gal4)RNAi敲低可以促进异常性疼痛并响应于低毒温度(38℃)在未受损伤的动物中增强逃避行为(图4I，图10G)。这些数据在一起示出，在蝇中，中枢GABA的损失对于热异常性疼痛而言是必要和充分的。
实例5.iPSC源性GABA能移植物可以在治疗上治疗神经性疼痛
发明人的蝇神经病研究强调了中枢抑制的损失是驱动神经性疼痛的核心潜在病理。类似地，在哺乳动物的疼痛感知中，产生GABA的抑制性中间神经元在脊髓的疼痛中枢门控中起着重要作用。为此，发明人开发了临床前GABA能移植方案，以评估这个方法的治疗可行性。细胞替代疗法将需要移植自体材料，因此发明人研究了人诱导性多潜能干细胞(hiPSC)的潜在用途。
通过如上文所描述的方案在体外从hiPSC分化出GABA能神经元(如图5B中所示出的)。将hiPSC用TripLE(英杰公司)解离，并悬浮于超低附着结合板中生长2周，以允许形成胚状体(EB)。对于神经诱导，用SMAD抑制剂LDN193189(100nM，第0天到第14天)和SB431542(10μM，第0天到第10天)对细胞进行处理。为了进行MGE(内侧神经节隆起)诱导，用Wnt抑制剂IWP2(5μM，第0天到第7天)、SHH激活剂SAG(平滑激动剂-0.1μM，第0天到第21天)和生长因子FGF8(100ng/mL，第8天到第21天)对细胞进行处理。在分化的第一天添加Rock抑制剂。悬浮2周后，将EB转移到聚鸟氨酸(PLO)和纤连蛋白(FN)涂覆的表面。在第21天，将EB解离，并将细胞重铺在含有10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF和2.5μMγ分泌酶抑制剂DAPT的分化培养基上的PLO/FN涂覆的板上以进行进一步的分化和成熟。分化方案有效地驱动了hiPSC在28天内分化成GABA能(GAD65/67+)神经元(TUBB3+)(图5C)。
通过FACS，分化条件促进TUBB3表达谱的整体偏移和纯的GAD65+细胞群(约95％纯度，图5D)。为了进一步表征移植材料的分子谱，在DIV25 hiPSC源性GABA能神经元以及亲本hiPSC中进行了RNA测序。为了确认GABA能特异性，还对hiPSC源性感觉神经元的转录组进行了分析。分化的GABA能神经元表达GABA特异性转录物和生长抑素亚型标志物(图5E，图13B)。HiPSC源性GABA能神经元还下调增殖或多潜能性标志物(图5E，图13D)，上调谷氨酸受体(图13C)，并表达OLIG2，这可能是由于未分化的前体细胞所致(图5E，图13E)。分化的GABA能神经元主要表现出与皮质或纹状体生长抑素(+)神经元最密切相关的大脑皮层下MGE和CGE分化状态。然而，观察到一定水平的LGE特异性转录物(图14)。如分层聚类(图13A)所证实的并通过qPCR验证的(图13F)，生物学复制品内的再生性强。通过质谱仪评估的蛋白质表达强调了iPSC源性GABA能神经元内的突触和GABA能机制的表达、神经元标志物以及细胞周期组分的下调(图5F，图15A-15E)。Reactome通路分析强调了GABA合成和释放机制的强富集(图15C、15D)。此外，hiPSC源性GABA能神经元并未增殖(未示出)并且下调了Ki67的表达(图5G)，但确实表达了GAD65(图15E)以及甘氨酸能神经元特异性标志物甘氨酸转运蛋白GlyT2(图15E)、GABA释放所需的GABA转运蛋白(囊泡GABA/甘氨酸转运蛋白VGAT)(图5H)和产生的GABA(图5I)。
由于iPSC源性GABA能(iGABA能)神经元表达GABA能标志物和机制，因此发明人对GABA分泌进行了评估并通过ELISA证实了iGABA能神经元分泌GABA(图6A)。此外，iGABA能神经元表达红藻氨酸、NMDA和AMPA谷氨酸受体亚类的亚基(图6B)。为了测试细胞是否具有响应，用谷氨酸刺激细胞并进行钙成像。观察到了强烈的钙瞬变，并且大多数细胞对谷氨酸和氯化钾两者都具有响应(图6C、6D)。
表1.GABA能神经元相较于hiPSC以及hiPSC源性感觉神经元(图5和13)的RNASeq(经过归一化的LogFPKM RNASEQ)：
Figure BDA0002822466030000661
Figure BDA0002822466030000671
表2.通过qPCR验证所选GABA合成基因(图13)(qPCR Log2倍数变化)。
脑 脊髓 hiPSC 1 hiPSC 2 hiPSC 3 GABA N1 GABA N2 GABA N3 SensN1 SensN2 SensN3
GAD1 9.9 4.9 0.0 -0.1 0.2 8.8 9.0 8.7 4.1 4.0 3.3
GAD2 8.7 4.1 0.0 0.9 1.0 8.1 7.9 8.0 -3.1 -3.2 -2.9
Nkx2.1 3.7 1.8 0.0 2.2 0.1 13.7 13.6 13.5 5.0 4.3 2.1
vGAT 9.4 5.7 0.0 0.5 -0.3 9.7 9.0 9.7 4.2 3.5 3.0
Lhx6 3.9 2.0 0.0 -0.3 -1.5 3.5 4.9 4.9 -0.1 -0.8 -2.1
Sox6 9.0 8.7 0.0 0.0 -1.1 7.7 8.4 9.3 5.8 7.6 7.2
Caltrenin 7.5 5.6 0.0 1.5 6.2 13.1 13.4 11.9 11.7 8.8 0.0
钙结合蛋白 1.6 0.5 0.0 -0.4 4.9 12.5 11.6 11.4 15.1 9.6 11.9
SST 11.3 8.0 0.0 -0.2 4.8 19.4 19.1 18.3 24.3 18.0 20.8
Dcx 3.9 2.1 0.0 0.4 5.2 20.4 18.6 18.7 19.9 14.6 17.9
Pax6 9.2 8.7 0.0 1.1 4.9 14.5 12.4 11.6 26.1 19.8 22.4
b3-Tub 12.4 11.4 0.0 -0.2 7.0 26.9 26.3 25.5 28.3 21.1 23.8
Oligo2 10.2 8.9 0.0 0.5 -1.2 6.4 5.6 5.0 3.9 3.2 2.5
GFAP 14.5 17.2 0.0 0.0 2.9 0.0 -2.5 0.0 0.0 0.0 0.0
vGlut1 10.6 0.8 0.0 -0.6 -1.0 -1.8 -1.8 -2.9 1.9 1.2 1.8
为了评估iGABA能神经元治疗疼痛疾病的翻译潜力，发明人执行了神经性疼痛的保留性神经损伤(SNI)模型(Decosterd和Woolf,2000)，并且然后将iGABA能神经元移植到受损伤的小鼠的脊髓的同侧背角(腰椎增大)中(图6A)。为了避免异种移植响应，发明人使用了免疫受损(NODSCID)接受者。正如所预期的，SNI会在6天内引起NOD scid小鼠的触觉和冷异常性疼痛；分别通过von Frey轻触测定和丙酮响应进行评估。从移植后两周起，观察到持续两个月之久的有效镇痛(研究终点)，这表现为触觉异常性疼痛减少和刺激响应曲线偏移(图7B-7C)。
由于GABA能神经元也参与运动回路系统，因此发明人使用旷场测试对运动行为进行了评估。没有观察到组之间的最大运动速度或平均运动速度的差异(图7D-7E)。此外，使用经过修饰的Basso Mouse量表对小鼠的步态进行了评估。由于混合运动/感觉坐骨神经受损，因此SNI对步态有如所预期的影响。然而，移植后，组之间的步态没有明显变化，这一起表明运动行为没有受到重大干扰(图7F)。由于紧密的解剖学相近关系，植入腰背角的GABA能神经元具有影响定位于脊髓中的自主神经系统核的潜力。然而，没有观察到小鼠膀胱或排便的问题。
为了进一步确认观察到的效果与运动行为无关，将iGABA能神经元移植到原初小鼠中。刺激响应和缩回阈值未见变化，这表明触觉敏感性的降低需要神经损伤(图7H和图16)。这些结果也确认了移植并不能简单地增加感知到任何刺激的强直阈值(图16B)。最后，发明人确认了治疗的特异性，因为神经损伤后将hiPSC源性感觉神经元(i感觉神经元)移植到背角中不能引发镇痛(图7I和图16C)。综上所述，使用成熟的iGABA能神经元移植物增强抑制会促进周围诱导性神经性疼痛的长期镇痛。
为了评估神经元植入脊髓中的潜力，对细胞存活、整合和突触整合的潜力进行了评估(图8)。移植后三周，通过径向迁移对背角薄层I(CGRP+)和II(IB4+)以及其它背薄层中的hiPSC源性GABA能神经元进行了鉴定(图8)。初始地，iGABA能神经元没有迁移到腹脊髓或对侧脊髓(图8)，保留了神经元和GABA能标志物表达，并示出了突触整合潜力的早期证据(图8)。然而，在10周后观察到大量迁移。经过移植的细胞保留了如通过它们与人NCAM1、MAP2、TUBB3的共表达所评估的它们的神经元身份，并表达了表明末端分化的NeuN(图9C-9E)。iGABA能神经元对GABA具有免疫反应性，并保留了VGAT、GAD65/67和突触蛋白表达，这指示经过移植的iGABA能神经元保留合成、包封和释放GABA的能力(图9F-9H)。另外，发现小鼠突触前密度(通过靶向Bassoo并与突触前蛋白质RIM2共定位的小鼠特异性抗体标志的)与iGABA能神经元(通过人特异性细胞质抗体HuCytoplasma标志的)直接并置，这表明在移植物与接受者组织之间形成突触的潜力(图9I)。iGABA能神经元表达关键的突触前蛋白质、Liprin，并且对泛电压门控钙通道抗体具有免疫反应性(图9K-9L)。最后，观察到抑制性突触后标志物桥尾蛋白与人突触蛋白的并置，这表明存在抑制性突触(图9M-9N)。值得注意的是，经过移植的抑制性神经元主要是生长抑素或小白蛋白亚类(图9O-9P)。重要的是，没有观察到畸胎瘤或其它相关异常的形态学证据，并且未能鉴定出iGABA能神经元增殖的证据(细胞不表达活性细胞周期蛋白Ki67)(图9R-9S)，这强调了程序的安全性。
实例6.hiPSC-GABA神经元的增强分化缓解神经性小鼠的疼痛。
根据实例5中所描述方法的改编制备iGABA能神经元。在GABA能分化方案期间，在仅第3周(即，约DIV14到约DIV21)期间、仅第4周(即，约DIV21到约DIV28)期间或在第3周和第4周(即，约DIV14到约DIV28)期间将hiPSC暴露于BMP4。分化后(即，DIV28)，针对生长抑素(SST)和小白蛋白(PVALB)的表达对iGABA能神经元进行评估。然后，如上文所描述的，针对经过BMP4处理的细胞逆转神经性疼痛的能力对所述经过BMP4处理的细胞进行测试，并使用SNI模型将其与未经处理的iGABA能神经元进行比较。
令人惊讶地，发现hiPSC在第3周而不是第4周或第3和4周期间暴露于BMP4导致PAVB表达增加6倍。通过qPCR示出，hiPSC在分化方案的第3周和第4周中的任一周或两周期间的暴露导致SST表达减少50％(图17A、17B)。
令人惊讶地，还发现，当在分化方案的第3周期间暴露于BMP4的iGABA能神经元(富小白蛋白)被移植到SNI小鼠中时，与用未暴露于BMP4的iGABA能神经元处理的SNI小鼠相比，在损伤后5周观察到显著更有效的长期镇痛响应(图17C)。实际上，移植后5周，富小白蛋白的iGABA能神经元与其相应的基线对照相比没有示出显著差异(即，SNI动物的疼痛已经完全回到正常)(图17C)。
利用中枢抑制的核心作用作为神经性疼痛中的关键机制，发明人示出，hiPSC源性GABA能培养物可以被移植到神经性哺乳动物的脊髓中以促进长期的疾病缓解。在本文所描述的研究中，没有观察到对hiPSC源性GABA能神经元移植的明显的行为或生理学不良反应。而且，当被移植到接受者动物中时，GABA能神经元没有分化，展现出经过下调的细胞周期和多潜能性标志物，并且没有形成肿瘤或畸胎瘤，这不仅强调了本发明的组合物和方法的功效，而且强调了其安全性。
这些数据一起示出，中枢抑制是对某些形式的神经性疼痛至关重要的核心原始病理，并切通过抗神经性GABA能移植物加强中枢抑制性平衡可以促进神经性疼痛的长期和潜在治愈性缓解。现有镇痛药需要数小时起作用，并且有些会产生严重的不良作用。这种疗法表示可以提供较长的持续镇痛并且有效地减轻神经性疼痛而无副作用的单程序的可能性。

Claims (52)

1.一种用于施用于哺乳动物的移植物组合物，所述移植物组合物包括GABA能神经元群、GFRα激动剂和至少一种细胞死亡抑制剂，其中所述GABA能神经元是通过在允许多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞获得GABA能神经元表型并产生GABA的条件下在体外分化所述细胞而产生的。
2.根据权利要求1所述的移植物组合物，其包括细胞凋亡抑制剂和细胞坏死抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元是通过在存在以下的情况下培养所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞来产生的：
i.从约第0天到约第7天存在至少两种SMAD抑制剂；
ii.从约第0天到约第21天存在音猬因子(sonic hedgehog)通路的激活剂；
iii.从约第0天到约第14天存在wnt抑制剂；
iv.从约第7天到约第14天存在BMP抑制剂；
v.从约第7天到约第21天存在GABA能物种形成因子；以及
vi.从约第21天到约第27天存在包括BDNF、GDNF和γ分泌酶抑制剂的神经元成熟生长因子的组合。
4.根据权利要求3所述的移植物组合物，其中所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞是在从约第14天到约第21天的时间段期间存在激活BMP信号传导的一种或多种药剂的情况下培养的。
5.根据权利要求4所述的移植物组合物，其中所述激活BMP信号传导的一种或多种药剂包括BMP4。
6.根据前述权利要求中任一项所述的移植物组合物，其中所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞是从所述哺乳动物获得的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的移植物组合物，其中所述GABA能神经元是由多潜能干细胞产生的。
8.根据权利要求7所述的移植物组合物，其中所述多潜能干细胞是iPSC。
9.根据前述权利要求中任一项所述的移植物组合物，其中所述GFRα激动剂选自由以下组成的组：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、青蒿素(Artemin，ARTN)和Persephin(PSPN)、脑源性神经营养因子(BDNF)、NGF、GDNF受体内源性激动剂、BT18、BT13、NT-3、NT-4、CNTF、GFRα1激动剂、XIB4035、Trk激活剂、TrkA激动剂、藤黄胺(GamobogicAmine)、阿米替林(Amitriptyline)、TrkB激动剂、N-乙酰血清素(N-Acetylserotonin)、阿米替林、BNN-20BNN-27、脱氧葛杜宁(Deoxygedunin)、7,8-二羟基黄酮、4'-二甲基氨基-7,8-二羟基黄酮、香叶木素(Diosmetin)、HIOC、LM22A-4、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、去甲汉黄芩素(Norwogonin)、R7(药物)和7,8,3'-三羟基黄酮。
10.根据权利要求9所述的移植物组合物，其中所述GFRα激动剂是GDNF。
11.根据权利要求2到10中任一项所述的移植物组合物，其中所述细胞凋亡抑制剂选自以下中的一种或多种：选自由Boc-Asp(OMe)氟甲基酮、IDN-8066、7053、7436 19656556M867 IDN-5370IDN-7866普那卡生(pralnacasan)z-Vad-FMK、YVAD-FMK、c-DEVD-CHO、Ac-YVAD-CHO、Ac-DVAD-FMK、Q-Vd-OPh、CrmA(牛痘病毒蛋白)、p35(杆状病毒蛋白)、Z-ATAD-FMK、INF-4E、Z-DQMD-FMK、Az 10417808、Z-LEED-FMK、ZVDK-FMK、z-IETD-FMK、INf-39、Belnacasan、Ac-DEVD-CHO和恩利卡生(Emricasan)组成的组的胱天蛋白酶抑制剂；或选自由钙蛋白酶抑制剂1、Calpeptin、E64、MDL28170、MG101、乙酰-钙蛋白酶抑制蛋白和PD150606组成的组的胱天蛋白酶激活剂的抑制剂。
12.根据权利要求10所述的移植物组合物，其中所述细胞凋亡抑制剂是广谱胱天蛋白酶抑制剂。
13.根据权利要求12所述的移植物组合物，其中所述细胞凋亡抑制剂是Boc-Asp(OMe)氟甲基酮。
14.根据权利要求2到13中任一项所述的移植物组合物，其中所述细胞坏死抑制剂选自由以下组成的组：MS-1、IM-54、GSK-872、7-Cl-O-Nec1、坏死抑制蛋白-1(Necrostatin-1)和坏死性磺酰胺(Necrosulfonamide)。
15.根据权利要求14所述的移植物组合物，其中所述细胞坏死抑制剂是MLKL抑制剂。
16.根据权利要求15所述的移植物组合物，其中所述细胞坏死抑制剂是坏死性磺酰胺。
17.一种用于产生GABA能神经元群的方法，所述方法包括：在存在以下的情况下在体外培养多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞：
i.从约第0天到约第7天存在至少两种SMAD抑制剂；
ii.从约第0天到约第21天存在音猬因子通路的激活剂；
iii.从约第0天到约第14天存在wnt抑制剂；
iv.从约第7天到约第14天存在BMP抑制剂；
v.从约第7天到约第21天存在GABA能物种形成因子；以及
vi.从约第21天到约第27天存在包括BDNF、GDNF和γ分泌酶抑制剂的神经元成熟生长因子的组合；
使得所述细胞获得GABA能神经元表型并产生GABA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞是在从约第14天到约第21天的时间段期间存在激活BMP信号传导的一种或多种药剂的情况下培养的。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述激活BMP信号传导的一种或多种药剂包括BMP4。
20.根据权利要求1到16中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到19中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元是有丝分裂期后的。
21.根据权利要求1到16或20中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到20中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元表达Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67的转录物。
22.根据权利要求1到16或20到21中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到21中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元表达GAD65/67、GlyT2和VGAT。
23.根据权利要求1到16或20到22中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到22中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元群中的至少95％表达GAD65。
24.根据权利要求1到16或20到23中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到23中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元群中的至少95％表达VGAT。
25.根据权利要求1到16或20到24中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到24中任一项所述的方法，其中所述GABA能神经元能够在体内分泌GABA。
26.根据权利要求3到16或20到25中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到25中任一项所述的方法，其中所述至少两种SMAD抑制剂选自由以下组成的组：橙皮素(Hesperetin)、SB431542、SB525334、Galunisertib、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN-193189、LDN-193189HCl、RepSox、A 83-01、DMH1、LDN-212854、ITD 1、LY364947、SD-208、EW-7197、ML347、K02288、A 77-01、SIS3、LDN-214117、R-268712、吡非尼酮(Pirfenidone)、头蛋白(Noggin)、腱蛋白、Gremlin、DAN蛋白和GDF3。
27.根据权利要求26所述的移植物组合物或方法，其中所述至少两种SMAD抑制剂是LDN193189和SB431542。
28.根据权利要求3到16或20到27中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到27中任一项所述的方法，其中所述音猬因子信号传导的激活剂选自由以下组成的组：音猬因子、GSA10、嘌吗啡胺(Purmorphamine)、SAG和SAG二盐酸盐。
29.根据权利要求28所述的移植物组合物或方法，其中所述音猬因子信号传导的激活剂是SAG。
30.根据权利要求3到16或20到29中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到29中任一项所述的方法，其中所述wnt抑制剂选自由以下组成的组：ICG-001、沙利霉素(Salinomycin)、IWR-1、Wnt-C59、ETC-159、iCRT3、IWP2、IWP-4、恩波酸吡维铵(PyrviniumPamoate)、iCRT14、FH535、CCT251545、KYA1797K、汉黄芩素(Wogonin)、NCB-0846、六氯酚(Hexachrorophene)、PNU-74654、Ky0211、雷公藤内酯酮(Triptonide)、IWP12、轴蛋白(Axin)、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115-584、ICG-01、槲皮素(Quercetin)、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB-216763、NSC668036、QS11、G007-LK和G244LM。
31.根据权利要求30所述的移植物组合物或方法，其中所述wnt抑制剂是IWP2。
32.根据权利要求3到16或20到31中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到31中任一项所述的方法，其中所述BMP抑制剂选自由以下组成的组：橙皮素、SB431542、SB525334、Galunisertib、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN-193189、LDN-193189HCl、RepSox、A 83-01、DMH1、LDN-212854、ITD 1、LY364947、SD-208、EW-7197、ML347、K02288、A77-01、SIS3、LDN-214117、R-268712、吡非尼酮、头蛋白、腱蛋白、Gremlin、DAN蛋白和GDF3。
33.根据权利要求32所述的移植物组合物或方法，其中所述BMP抑制剂是LDN-193189。
34.根据权利要求3到16或20到33中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到33中任一项所述的方法，其中所述GABA能物种形成因子选自由成纤维细胞生长因子组成的组。
35.根据权利要求34所述的移植物组合物或方法，其中所述GABA能物种形成因子是FGF8。
36.根据权利要求3到16或20到35中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到35中任一项所述的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂选自由以下组成的组：DAPT、RO4929097、塞美司他(Semagecestat)、阿加司他(Avagacestat)、二苯并氮杂环庚三烯(Dibenzazipine)、Ly411575、IMR-1、L-685、458、FLI-06、Crenigacestat、尼罗司他(Nirogacestat)、MK-0752、贝加司他(Begacestat)、BMS299897、化合物W、DBZ、左旋氟比洛芬(Flurizan)、JLK6、MRK560和PF3084014氢溴酸盐。
37.根据权利要求36所述的移植物组合物或方法，其中所述γ分泌酶抑制剂是DAPT。
38.根据权利要求3到16或20到37中任一项所述的移植物组合物或根据权利要求17到29中任一项所述的方法，其中所述多潜能干细胞或多能干细胞或祖细胞是在从第0天开始存在Rock抑制剂的情况下培养的，持续约24小时的时间段。
39.一种根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群。
40.一种恢复或加强哺乳动物的神经系统中的中枢抑制的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群。
41.一种治疗哺乳动物的神经学病状、疾病或病症或异常性疼痛的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群。
42.一种根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群，其用于治疗受试者的抑制性中间神经元活性不足或兴奋性神经元功能增强。
43.一种根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群，其用于治疗受试者的神经学病状、疾病或病症或异常性疼痛。
44.一种根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群的用途，其用于制造用于治疗受试者的神经学病状、疾病或病症或异常性疼痛的药物。
45.根据权利要求41所述的方法、用于根据权利要求43所述的用途的根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群或根据权利要求44所述的用途，其中所述神经学病状、疾病或病症选自神经退行性疾病、神经学损伤或神经性疼痛。
46.根据权利要求41所述的方法、用于根据权利要求43所述的用途的根据权利要求1到16或20到36中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群或根据权利要求44所述的用途，其中所述神经学病状、疾病或病症选自由以下组成的组：慢性神经性疼痛、慢性炎性疼痛、慢性功能障碍性疼痛、癫痫、运动神经元病(ALS、SMA)、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sDisease)、中风、多发性硬化症、τ蛋白病(进行性核上性麻痹、皮克氏病(Pick's disease)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆症、伴有ALS的FTLD)、亨廷顿氏病(Huntington'sdisease)、酒精戒断和酒精中毒、糖尿病诱导的脑损伤、颅脑损伤、偏头痛、头痛、丛集性头痛、脊髓损伤、缺血性损伤、化学疗法诱导的疼痛和化学疗法诱导的神经病、精神分裂症、慢性抑郁症、迟发性运动障碍、双相情感障碍和神经病。
47.根据权利要求45所述的方法、用于根据权利要求45所述的用途的根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群或根据权利要求45所述的用途，其中所述神经性疼痛与坐骨神经痛、背痛、癌痛、糖尿病性疼痛、意外损伤、脊髓损伤、周围神经损伤相关。
48.根据权利要求40、41或45到47中任一项所述的方法、用于根据权利要求42、43或45到47所述的用途的根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群或根据权利要求44到47中任一项所述的用途，其中所述移植物组合物、所述治疗有效量的细胞群或所述药物施用于或被调配用于施用于所述哺乳动物的中枢神经系统。
49.根据权利要求40、41或45到47中任一项所述的方法、用于根据权利要求42、43或45到47所述的用途的根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群或根据权利要求44到47中任一项所述的用途，其中所述移植物组合物、所述治疗有效量的细胞群或所述药物被注射到或被调配用于注射到所述哺乳动物的脊髓中。
50.根据权利要求49所述的方法、用于根据权利要求49所述的用途的根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群或根据权利要求49所述的用途，其中所述注射是立体定向注射。
51.根据权利要求40、41或45到50中任一项所述的方法、用于根据权利要求42、43或45到50所述的用途的根据权利要求1到16或20到38中任一项所述的移植物组合物或治疗有效量的根据权利要求17到38中任一项所述的方法产生的细胞群或根据权利要求44到50中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
52.一种将GABA能神经元递送到有需要的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从所述受试者获得活检物并从所述活检物中分离出细胞；
b)由在步骤a)中分离出的细胞产生iPSC；
c)在将所述iPSC分化成GABA能神经元的条件下培养在步骤b)中产生的所述iPSC，其中所述GABA能神经元表达GABA能神经元表型并产生GABA；
d)制备适合于注射到所述受试者的移植物组合物，所述移植物组合物包括在步骤c)中产生的所述GABA能神经元、GFRα激动剂、细胞凋亡抑制剂、细胞坏死抑制剂和药学上可接受的载剂；
e)向所述受试者施用在步骤d)中制备的所述移植物组合物。
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