JP2021527070A - 細胞組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、GABA作動性ニューロンの移植のための組成物および方法に関する。本発明によるGABA作動性ニューロンおよびそれを含む組成物は、対象の神経系における中枢性抑制を回復させる、または強化するための、ならびに神経機能の障害または異常に関連する神経学的状態、疾患および障害を治療するための細胞ベースの治療として使用することができる。好ましい実施形態では、移植組成物は、GABA作動性ニューロン、GFR−αアゴニスト、および少なくとも1つの細胞死阻害剤を含み、GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞、複能性幹細胞、または前駆細胞を分化することによって作製される。
Description
本発明は、GABA作動性ニューロンの移植のための組成物および方法に関する。
慢性疼痛は、世界中で数十億人もの患者、家族、および介護者の生活の質に大きな影響をもたらしており、現在の治療では、ほとんどの患者の疼痛に適切に対処することができない。世界的には、慢性疼痛は、がん、心臓病、または糖尿病の費用と同様に、年間費用は数兆ドルであると推定されている。重要なことに、慢性疼痛に対する有効な治療の欠如は、例えば、2000年以来、20万を超える人々が処方されたオピオイドの過剰摂取で死亡しているオピオイドの蔓延のように、我々の社会に連鎖的な影響をもたらしてきた。重要なことに、慢性疼痛の発生率は、年齢とともに増加し、癌および糖尿病等の多くの加齢関連疾患と関連しているため、高齢化社会において、慢性疼痛は、明確なかつ満たされていない臨床上の課題である。神経障害性疼痛は、電気ショックと最も類似した性質の灼けるような、刃物で刺すような、およびズキズキする疼痛として現れ得る。
神経障害性疼痛(例えば、坐骨神経痛、腰痛、がん性疼痛、糖尿病性疼痛、偶発的傷害)は、概して、利用可能な治療に難治性であり、最前線の抗神経障害薬は、患者の約25%のみに適切な疼痛緩和を提供する。モルヒネによる治療は、急性の状況においてある程度の疼痛緩和をもたらすか、または痛みから気をそらすことができるが、慢性的なモルヒネ治療計画は、無視することができない中毒および耐性の問題につながる。プレガバリンおよびノルトリプチリン等の非アヘン剤ではある程度の成功を収めているが、これらの薬物は様々な有効性を有し、疼痛の強度に適切に対応することができない。
Wernig et al.,PNAS,105:5856−5861(2008)
Jaenisch et al.,Cell,132:567−582(2008)
Hanna et al.,Cell,133:250−264(2008)
Brambrink et al.,Cell Stem Cell,2:151−159(2008)
Chin et al.,Cell Stem Cell 5:111−123(2009)
神経障害性疼痛に寄与する分子的および生理学的機序に関する何十年という研究にもかかわらず、神経障害性疼痛の原因となる根本的な病理を治療するために何を標的にすべきかはまだ完全に明らかになっていない。慢性疾患を逆転させる、またはさらには解消することができる、より優れた、中毒性のない疼痛治療が必要である。
さらに、対象の神経系における中枢性抑制を回復または強化するための、ならびに低下したもしくは不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能に関連する神経学的状態、疾患および障害を治療するための細胞ベースの治療の提供は、満たされていないニーズに見合う。
本発明は以下を提供する。
[1]哺乳動物に投与するための移植組成物であって、前記移植組成物は、GABA作動性ニューロンの集団、GFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤および壊死阻害剤を含み、前記GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、該細胞がGABA作動性ニューロン表現型を得ることおよびGABAを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物。
[2]GFRαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)およびペルセフィン(PSPN)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NGF、GDNF受容体内因性アゴニスト、BT18、BT13、NT−3、NT−4、CNTF、GFRα1アゴニスト、XIB4035、Trk活性化剤、TrkAアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、TrkBアゴニスト、N−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、BNN−20BNN−27、デオキシゲズニン、7,8−ジヒドロキシフラボン、4’−ジメチルアミノ−7,8−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、HIOC、LM22A−4、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ノルウォゴニン、R7(薬物)、および7,8,3’−ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、[1]の移植組成物。
[3]GFRαアゴニストはGDNFである、[2]の移植組成物。
[4]GDNFは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[3]の移植組成物。
[5]GDNFは、約10ng/mLの濃度で存在する、[4]の移植組成物。
[6]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、およびPD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される、[1]〜[5]のいずれか1つの移植組成物。
[7]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される、[6]の移植組成物。
[8]アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、[6]の移植組成物。
[9]アポトーシス阻害剤はBoc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである、[8]の移植組成物。
[10]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[9]の移植組成物。
[11]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約20μMの濃度で存在す
る、[10]の移植組成物。
[12]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[1]〜[11]のいずれか1つの移植組成物。
[13]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[12]の移植組成物。
[14]壊死阻害剤はMLKL阻害剤である、[12]の移植組成物。
[15]壊死阻害剤はネクロスルホンアミドである、[14]の移植組成物。
[16]ネクロスルホンアミドは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[15]の移植組成物。
[17]ネクロスルホンアミドは、約50nMの濃度で存在する、[16]の移植組成物。
[18]多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、前記哺乳動物から得られる、[1]〜[17]のいずれか1つの移植組成物。
[19]GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞から作製される、[1]〜[18]のいずれか1つの移植組成物。
[20]多能性幹細胞はiPSCである、[19]の移植組成物。
[21]iPSCは、哺乳動物から得られた生検から得られた細胞に由来する、[20]の移植組成物。
[22]生検から得られた細胞は、皮膚線維芽細胞である、[21]の移植組成物。
[23]GABA作動性ニューロンは、前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、
i.約0日目〜約7日目に少なくとも2つのSMAD阻害剤、
ii.約0日目〜約21日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化剤、
iii約0日目〜約14日目にwnt阻害剤、
iv.約7日目〜約14日目にBMP阻害剤、
v.約7日目〜約21日目にGABA作動性種分化要因、ならびに
vi.約21日目〜約27日目にBDNF、GDNF、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせの存在下で培養することによって作製される、[1]〜[22]のいずれか1つの移植組成物。
[24]前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[23]の移植組成物。
[25].前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、LDN193189およびSB431542である、[24]の移植組成物。
[26]LDN193189は約1pM〜100mMの濃度で存在し、SB431542は約1pM〜100mMの濃度で存在する、[25]の移植組成物。
[27]LDN193189は約100nMの濃度で存在し、SB431542は約10μMの濃度で存在する、[26]の移植組成物。
[28]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ、GSA10、パルモルファミン、SAG、およびSAG二塩酸塩からなる群から選択される、[23]〜[27]のいずれか1つの移植組成物。
[29]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤はSAGである、[28]の移植組成物。
[30]SAGは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[29]の移植組成物。
[31]SAGは、約0.1μMの濃度で存在する、[30]の移植組成物。
[32]前記wnt阻害剤は、ICG−001、サリノマイシン、IWR−1、Wnt−C59、ETC−159、iCRT3、IWP2、IWP−4、ピルビニウムパモ酸塩、iCRTl4、FH535、CCT251545、KYA1797K、オウゴニン、NCB−0846、ヘキサクロロフェン、PNU−74654、Ky02ll、トリプトニド、IWP12、Axin、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115−584、ICG−01、クェルセチン、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB−216763、NSC668036、QS11、G007−LK、およびG244LMからなる群から選択される、[23]〜[31]のいずれか1つの移植組成物。
[33]前記wnt阻害剤はIWP2である、[32]の移植組成物。
[34]IWP2は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[33]の移植組成物。[35]IWP2は、約5μMの濃度で存在する、[34]の移植組成物。
[36]前記BMP阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[23]〜[35]のいずれか1つの移植組成物。
[37]前記BMP阻害剤はLDN−193189である、[36]の移植組成物。
[38]LDN−193189は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[37]の移植組成物。
[39]LDN−193189は、約100nMの濃度で存在する、[38]の移植組成物。
[40]前記GABA作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、[23]〜[39]のいずれか1つの移植組成物。
[41]前記GABA作動性種分化要因はFGF8である、[40]の移植組成物。
[42]FGF8は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[41]の移植組成物。[43]FGF8は、約100ng/mLの濃度で存在する、[42]の移植組成物。
[44]前記γセクレターゼ阻害剤は、DAPT、RO4929097、セマガセスタット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ly4ll575、IMR−1、L−685,458、FLI−06、クレニガセスタット、ニロガセスタット、MK−0752、ベガセスタット、BMS299897、コンパウンドW、DBZ、フルリザン、JLK6、MRK560、およびPF3084014臭化水素酸塩からなる群から選択される、[23]〜[43]のいずれか1つの移植組成物。
[45]前記γセクレターゼ阻害剤はDAPTである、[44]の移植組成物。
[46]DAPTは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[45]の移植組成物。[47]DAPTは約2.5μMの濃度で存在する、[46]の移植組成物。
[48]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約1pM〜100mMの濃度で存在するBDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するGDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するDAPTと、を含む、[23]の移植組成物。
[49]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約10ng/mLの濃度で存在するBDNFと、約10ng/mLの濃度で存在するGDNFと、約2.5μMの濃度で存在するDAPTと、含む、[48]の移植組成物。
[50]前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、0日目から約24時間の期間、ROCK阻害剤の存在下で培養される、[23]〜[49]のいずれか1つの移植組成物。
[51]前記GABA作動性ニューロンは有糸分裂後である、[1]〜[50]のいずれか1つの移植組成物。
[52]前記GABA作動性ニューロンは、Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67の転写物を発現する、[1]〜[51]のいずれか1つの移植組成物。
[53]前記GABA作動性ニューロンは、GAD65/67、GlyT2およびVGATを発現する、[1]〜[52]のいずれか1つの移植組成物。
[54]前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がGAD65を発現する、[1]〜[53]のいずれか1つの移植組成物。
[55]前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がVGATを発現する、[1]〜[54]のいずれか1つの移植組成物。
[56]前記GABA作動性ニューロンは、インビボでGABAを分泌することができる、[1]〜[55]のいずれか1つの移植組成物。
[57]前記GABA作動性ニューロンは、レシピエントの神経系と機能的に一体化することができる、[1]〜[56]のいずれか1つの移植組成物。
[58]薬学的に許容される担体をさらに含む、[1]〜[57]のいずれか1つの移植組成物。
[59]前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水または水性緩衝液からなる群から選択される、[58]の移植組成物。
[60]前記組成物は、約1000〜1000万細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[1]〜[59]の移植組成物。
[61]前記組成物は、100,000細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[1]〜[60]の移植組成物。
[62]GABA作動性ニューロンはヒト細胞である、[1]〜[61]の移植組成物。[63]哺乳動物の神経系における中枢性抑制を回復または強化する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[64]哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[65]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[64]の方法。
[66]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、[64]の方法。
[67]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[64]の方法。
[68]哺乳動物における神経障害性疼痛を治療する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[69]前記神経障害性疼痛は、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性疼痛、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[68]の方法。
[70]哺乳動物におけるアロディニアを治療する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[71]前記移植組成物は、哺乳動物の中枢神経系に投与される、[63]〜[70]のいずれか1つの方法。
[72]前記投与は、前記哺乳動物の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、[63]〜[71]のいずれか1つの方法。
[73]前記注射は定位注射である、[72]の方法。
[74]哺乳動物はヒトである、[63]〜[73]のいずれか1つの方法。
[75]GABA作動性ニューロンを、それを必要とする対象に送達する方法であって、a)前記対象からの生検を得ることおよび前記生検から細胞を単離することと、
b)ステップa)で単離された細胞からiPSCを作製することと、
c)ステップb)で作製されたiPSCを、前記iPSCをGABA作動性ニューロンに分化させる条件下で培養することであって、前記GABA作動性ニューロンがGABA作動性ニューロン表現型を発現し、GABAを産生する、培養することと、
d)前記対象への注射に好適な移植組成物を調製することであって、前記移植組成物は、ステップc)で作製されたGABA作動性ニューロン、GFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、および薬学的に許容される担体を含む、調製することと、
e)ステップd)で調製された移植組成物を前記対象に投与することと、を含む、方法。[76]前記対象は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能を有する、[75]の方法。
[77]前記対象は、神経学的状態、疾患または障害を有する、[75]の方法。
[78]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[77]の方法。
[79]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される[77]の方法。
[80]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[77]の方法。
[81]前記対象は神経障害性疼痛を有する、[75]の方法。
[82]前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[81]の方法。
[83]前記対象はアロディニアを有する、[75]の方法。
[84]前記移植組成物は、対象の中枢神経系に投与される、[75]〜[83]のいずれか1つの方法。
[85]前記投与は、前記対象の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、[75]〜[84]のいずれか1つの方法。
[86]該注射が、定位注射を介している、[85]に記載の方法。
[87]対象はヒトである、[75]〜[86]のいずれか1つの方法。
[88]GFRαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)およびペルセフィン(PSPN)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NGF、GDNF受容体内因性アゴニスト、BT18、BT13、NT−3、NT−4、CNTF、GFRα1アゴニスト、XIB4035、Trk活性化剤、TrkAアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、TrkBアゴニスト、N−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、BNN−20BNN−27、デオキシゲズニン、7,8−ジヒドロキシフラボン、4’−ジメチルアミノ−7,8−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、HIOC、LM22A−4、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ノルウォゴニン、R7(薬物)、および7,8,3’−ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、[75]〜[87]の方法。
[89]GFRαアゴニストはGDNFである、[88]の方法。
[90]GDNFは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[89]の方法。
[91]GDNFは、約10ng/mLの濃度で存在する、[90]の方法。
[92]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN
−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、およびPD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される、[75]〜[91]のいずれか1つの方法。
[93]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される、[92]の方法。
[94]アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、[93]の方法。
[95]アポトーシス阻害剤はBoc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである、[94]の方法。
[96]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[95]の方法。
[97]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約20μMの濃度で存在する、[96]の方法。
[98]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[75]〜[97]のいずれか1つの方法。
[99]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[98]の方法。
[100]壊死阻害剤は、MLKL阻害剤である、[99]の方法。
[101]壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである、[100]の方法。
[102]ネクロスルホンアミドは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[101]の方法。
[103]ネクロスルホンアミドは、約50nMの濃度で存在する、[102]の方法。[104]前記生検から得られた細胞は、皮膚線維芽細胞である、[21]の方法。
[105]ステップc)で作製されるGABA作動性ニューロンは、前記iPSCsを、i.約0日目〜約7日目に少なくとも2つのSMAD阻害剤、
ii.約0日目〜約21日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化剤、
iii約0日目〜約14日目にwnt阻害剤、
iv.約7日目〜約14日目にBMP阻害剤、
v.約7日目〜約21日目にGABA作動性種分化要因、ならびに
vi.約21日目〜約27日目にBDNF、GDNF、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせの存在下で培養することによって作製される、[1]〜[104]のいずれか1つの方法。
[106]前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、
SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[105]の方法。[107]前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、LDN193189およびSB431542である、[106]の方法。
[108]LDN193189は約1pM〜100mMの濃度で存在し、SB431542は約1pM〜100mMの濃度で存在する、[107]の方法。
[109]LDN193189は約100nMの濃度で存在し、SB431542は約10μMの濃度で存在する、[108]の方法。
[110]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ、GSA10、パルモルファミン、SAG、およびSAG二塩酸塩からなる群から選択される、[105]〜[109]のいずれか1つの方法。
[111]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤はSAGである、[110]の方法。
[112]SAGは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[111]の方法。
[113]SAGは、約0.1μMの濃度で存在する、[112]の方法。
[114]前記wnt阻害剤は、ICG−001、サリノマイシン、IWR−1、Wnt−C59、ETC−159、iCRT3、IWP2、IWP−4、ピルビニウムパモ酸塩、iCRTl4、FH535、CCT251545、KYA1797K、オウゴニン、NCB−0846、ヘキサクロロフェン、PNU−74654、Ky0211、トリプトニド、IWP12、Axin、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115−584、ICG−01、クェルセチン、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB−216763、NSC668036、QS11、G007−LK、およびG244LMからなる群から選択される、[105]〜[113]のいずれか1つの方法。
[115]前記wnt阻害剤はIWP2である、[114]の方法。
[116]IWP2は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[115]の方法。
[117]IWP2は、約5μMの濃度で存在する、[116]の方法。
[118]前記BMP阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[105]〜[117]のいずれか1つの方法。
[119]前記BMP阻害剤はLDN−193189である、[118]の方法。
[120]LDN−193189は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[119]の方法。
[121]LDN−193189は、約100mMの濃度で存在する、[120]の方法。
[122]前記GABA作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、[105]〜[121]のいずれか1つの方法。
[123]前記GABA作動性種分化要因はFGF8である、[122]の方法。
[124]FGF8は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[124]の方法。
[125]FGF8は、約100ng/mLの濃度で存在する、[124]の方法。
[126]前記γセクレターゼ阻害剤は、DAPT、RO4929097、セマガセスタ
ット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ly411575、IMR−1、L−685,458、FLI−06、クレニガセスタット、ニロガセスタット、MK−0752、ベガセスタット、BMS299897、コンパウンドW、DBZ、フルリザン、JLK6、MRK560、およびPF3084014臭化水素酸塩からなる群から選択される、[105]〜[125]のいずれか1つの方法。
[127]前記γセクレターゼ阻害剤はDAPTである、[126]の方法。
[128]DAPTは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[127]の方法。
[129]DAPTは、約2.5μMの濃度で存在する、[128]の方法。
[130]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約1pM〜100mMの濃度で存在するBDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するGDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するDAPTと、を含む、[105]の方法。
[131]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約10ng/mLの濃度で存在するBDNFと、約10ng/mLの濃度で存在するGDNFと、約2.5μMの濃度で存在するDAPTと、含む、[105]〜[130]のいずれか1つの方法。
[132]前記iPSCは、0日目から約24時間の期間、ROCK阻害剤の存在下で培養される、[105]〜[131]のいずれか1つの方法。
[133]前記GABA作動性ニューロンは有糸分裂後である、[75]〜[132]のいずれか1つの方法。
[134]前記GABA作動性ニューロンは、Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67の転写物を発現する、[75]〜[133]のいずれか1つの方法。
[135]前記GABA作動性ニューロンは、GAD65/67、GlyT2およびVGATを発現する、[75]〜[134]のいずれか1つの方法。
[136]GABA作動性ニューロンの少なくとも95%がGAD65を発現する、[75]〜[135]のいずれか1つの方法。
[137]前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がVGATを発現する、[75]〜[136]のいずれか1つの方法。
[138]前記GABA作動性ニューロンは、インビボでGABAを分泌することができる、[75]〜[137]のいずれか1つの方法。
[139]前記GABA作動性ニューロンは、レシピエントの神経系と機能的に一体化することができる、[75]〜[138]のいずれか1つの方法。
[140]前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水または水性緩衝液からなる群から選択される、[75]〜[139]のいずれか1つの方法。
[141]前記組成物は、約1000〜1000万細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[75]〜[141]のいずれか1つの方法。
[142]前記組成物は、100,000細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[141]の方法。
[143]対象における不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能を処理するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[144]対象における神経学的状態、疾患または障害を治療するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[145]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[144]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[146]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、[144]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[147]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハン
チントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[144]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[148]対象における神経障害性疼痛を治療するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[149]前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[148]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[150]対象におけるアロディニアを治療するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[151]前記投与は、前記対象の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、[143]〜[150]のいずれか1つによる使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[152]前記注射は定位注射による、[151]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[153]対象はヒトである[143]〜[152]のいずれか1つによる使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[154]対象における神経学的状態、疾患または障害の治療のための薬物の製造のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物の使用。
[155]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[154]の使用。
[156]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、[154]または[155]の使用。
[157]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[156]の使用。
[158]対象における神経障害性疼痛の治療のための薬物の製造のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物の使用。
[159]前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[158]の使用。
[160]対象におけるアロディニアの治療のための薬物の製造のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物の使用。
[161]前記薬物は、前記対象の中枢神経系への投与のために製剤化される、[154]〜[161]のいずれか1つに記載の使用。
[162]前記薬物は、前記対象の脊髄への注射のために製剤化される、[154]〜[161]のいずれか1つに記載の使用。
[163]前記注射は定位注射である、[162]の使用。
[164]対象はヒトである、[154]〜[163]のいずれか1つによる使用。
[1]哺乳動物に投与するための移植組成物であって、前記移植組成物は、GABA作動性ニューロンの集団、GFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤および壊死阻害剤を含み、前記GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、該細胞がGABA作動性ニューロン表現型を得ることおよびGABAを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物。
[2]GFRαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)およびペルセフィン(PSPN)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NGF、GDNF受容体内因性アゴニスト、BT18、BT13、NT−3、NT−4、CNTF、GFRα1アゴニスト、XIB4035、Trk活性化剤、TrkAアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、TrkBアゴニスト、N−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、BNN−20BNN−27、デオキシゲズニン、7,8−ジヒドロキシフラボン、4’−ジメチルアミノ−7,8−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、HIOC、LM22A−4、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ノルウォゴニン、R7(薬物)、および7,8,3’−ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、[1]の移植組成物。
[3]GFRαアゴニストはGDNFである、[2]の移植組成物。
[4]GDNFは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[3]の移植組成物。
[5]GDNFは、約10ng/mLの濃度で存在する、[4]の移植組成物。
[6]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、およびPD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される、[1]〜[5]のいずれか1つの移植組成物。
[7]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される、[6]の移植組成物。
[8]アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、[6]の移植組成物。
[9]アポトーシス阻害剤はBoc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである、[8]の移植組成物。
[10]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[9]の移植組成物。
[11]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約20μMの濃度で存在す
る、[10]の移植組成物。
[12]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[1]〜[11]のいずれか1つの移植組成物。
[13]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[12]の移植組成物。
[14]壊死阻害剤はMLKL阻害剤である、[12]の移植組成物。
[15]壊死阻害剤はネクロスルホンアミドである、[14]の移植組成物。
[16]ネクロスルホンアミドは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[15]の移植組成物。
[17]ネクロスルホンアミドは、約50nMの濃度で存在する、[16]の移植組成物。
[18]多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、前記哺乳動物から得られる、[1]〜[17]のいずれか1つの移植組成物。
[19]GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞から作製される、[1]〜[18]のいずれか1つの移植組成物。
[20]多能性幹細胞はiPSCである、[19]の移植組成物。
[21]iPSCは、哺乳動物から得られた生検から得られた細胞に由来する、[20]の移植組成物。
[22]生検から得られた細胞は、皮膚線維芽細胞である、[21]の移植組成物。
[23]GABA作動性ニューロンは、前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、
i.約0日目〜約7日目に少なくとも2つのSMAD阻害剤、
ii.約0日目〜約21日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化剤、
iii約0日目〜約14日目にwnt阻害剤、
iv.約7日目〜約14日目にBMP阻害剤、
v.約7日目〜約21日目にGABA作動性種分化要因、ならびに
vi.約21日目〜約27日目にBDNF、GDNF、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせの存在下で培養することによって作製される、[1]〜[22]のいずれか1つの移植組成物。
[24]前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[23]の移植組成物。
[25].前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、LDN193189およびSB431542である、[24]の移植組成物。
[26]LDN193189は約1pM〜100mMの濃度で存在し、SB431542は約1pM〜100mMの濃度で存在する、[25]の移植組成物。
[27]LDN193189は約100nMの濃度で存在し、SB431542は約10μMの濃度で存在する、[26]の移植組成物。
[28]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ、GSA10、パルモルファミン、SAG、およびSAG二塩酸塩からなる群から選択される、[23]〜[27]のいずれか1つの移植組成物。
[29]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤はSAGである、[28]の移植組成物。
[30]SAGは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[29]の移植組成物。
[31]SAGは、約0.1μMの濃度で存在する、[30]の移植組成物。
[32]前記wnt阻害剤は、ICG−001、サリノマイシン、IWR−1、Wnt−C59、ETC−159、iCRT3、IWP2、IWP−4、ピルビニウムパモ酸塩、iCRTl4、FH535、CCT251545、KYA1797K、オウゴニン、NCB−0846、ヘキサクロロフェン、PNU−74654、Ky02ll、トリプトニド、IWP12、Axin、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115−584、ICG−01、クェルセチン、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB−216763、NSC668036、QS11、G007−LK、およびG244LMからなる群から選択される、[23]〜[31]のいずれか1つの移植組成物。
[33]前記wnt阻害剤はIWP2である、[32]の移植組成物。
[34]IWP2は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[33]の移植組成物。[35]IWP2は、約5μMの濃度で存在する、[34]の移植組成物。
[36]前記BMP阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[23]〜[35]のいずれか1つの移植組成物。
[37]前記BMP阻害剤はLDN−193189である、[36]の移植組成物。
[38]LDN−193189は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[37]の移植組成物。
[39]LDN−193189は、約100nMの濃度で存在する、[38]の移植組成物。
[40]前記GABA作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、[23]〜[39]のいずれか1つの移植組成物。
[41]前記GABA作動性種分化要因はFGF8である、[40]の移植組成物。
[42]FGF8は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[41]の移植組成物。[43]FGF8は、約100ng/mLの濃度で存在する、[42]の移植組成物。
[44]前記γセクレターゼ阻害剤は、DAPT、RO4929097、セマガセスタット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ly4ll575、IMR−1、L−685,458、FLI−06、クレニガセスタット、ニロガセスタット、MK−0752、ベガセスタット、BMS299897、コンパウンドW、DBZ、フルリザン、JLK6、MRK560、およびPF3084014臭化水素酸塩からなる群から選択される、[23]〜[43]のいずれか1つの移植組成物。
[45]前記γセクレターゼ阻害剤はDAPTである、[44]の移植組成物。
[46]DAPTは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[45]の移植組成物。[47]DAPTは約2.5μMの濃度で存在する、[46]の移植組成物。
[48]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約1pM〜100mMの濃度で存在するBDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するGDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するDAPTと、を含む、[23]の移植組成物。
[49]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約10ng/mLの濃度で存在するBDNFと、約10ng/mLの濃度で存在するGDNFと、約2.5μMの濃度で存在するDAPTと、含む、[48]の移植組成物。
[50]前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、0日目から約24時間の期間、ROCK阻害剤の存在下で培養される、[23]〜[49]のいずれか1つの移植組成物。
[51]前記GABA作動性ニューロンは有糸分裂後である、[1]〜[50]のいずれか1つの移植組成物。
[52]前記GABA作動性ニューロンは、Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67の転写物を発現する、[1]〜[51]のいずれか1つの移植組成物。
[53]前記GABA作動性ニューロンは、GAD65/67、GlyT2およびVGATを発現する、[1]〜[52]のいずれか1つの移植組成物。
[54]前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がGAD65を発現する、[1]〜[53]のいずれか1つの移植組成物。
[55]前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がVGATを発現する、[1]〜[54]のいずれか1つの移植組成物。
[56]前記GABA作動性ニューロンは、インビボでGABAを分泌することができる、[1]〜[55]のいずれか1つの移植組成物。
[57]前記GABA作動性ニューロンは、レシピエントの神経系と機能的に一体化することができる、[1]〜[56]のいずれか1つの移植組成物。
[58]薬学的に許容される担体をさらに含む、[1]〜[57]のいずれか1つの移植組成物。
[59]前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水または水性緩衝液からなる群から選択される、[58]の移植組成物。
[60]前記組成物は、約1000〜1000万細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[1]〜[59]の移植組成物。
[61]前記組成物は、100,000細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[1]〜[60]の移植組成物。
[62]GABA作動性ニューロンはヒト細胞である、[1]〜[61]の移植組成物。[63]哺乳動物の神経系における中枢性抑制を回復または強化する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[64]哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[65]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[64]の方法。
[66]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、[64]の方法。
[67]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[64]の方法。
[68]哺乳動物における神経障害性疼痛を治療する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[69]前記神経障害性疼痛は、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性疼痛、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[68]の方法。
[70]哺乳動物におけるアロディニアを治療する方法であって、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
[71]前記移植組成物は、哺乳動物の中枢神経系に投与される、[63]〜[70]のいずれか1つの方法。
[72]前記投与は、前記哺乳動物の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、[63]〜[71]のいずれか1つの方法。
[73]前記注射は定位注射である、[72]の方法。
[74]哺乳動物はヒトである、[63]〜[73]のいずれか1つの方法。
[75]GABA作動性ニューロンを、それを必要とする対象に送達する方法であって、a)前記対象からの生検を得ることおよび前記生検から細胞を単離することと、
b)ステップa)で単離された細胞からiPSCを作製することと、
c)ステップb)で作製されたiPSCを、前記iPSCをGABA作動性ニューロンに分化させる条件下で培養することであって、前記GABA作動性ニューロンがGABA作動性ニューロン表現型を発現し、GABAを産生する、培養することと、
d)前記対象への注射に好適な移植組成物を調製することであって、前記移植組成物は、ステップc)で作製されたGABA作動性ニューロン、GFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、および薬学的に許容される担体を含む、調製することと、
e)ステップd)で調製された移植組成物を前記対象に投与することと、を含む、方法。[76]前記対象は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能を有する、[75]の方法。
[77]前記対象は、神経学的状態、疾患または障害を有する、[75]の方法。
[78]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[77]の方法。
[79]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される[77]の方法。
[80]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[77]の方法。
[81]前記対象は神経障害性疼痛を有する、[75]の方法。
[82]前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[81]の方法。
[83]前記対象はアロディニアを有する、[75]の方法。
[84]前記移植組成物は、対象の中枢神経系に投与される、[75]〜[83]のいずれか1つの方法。
[85]前記投与は、前記対象の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、[75]〜[84]のいずれか1つの方法。
[86]該注射が、定位注射を介している、[85]に記載の方法。
[87]対象はヒトである、[75]〜[86]のいずれか1つの方法。
[88]GFRαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)およびペルセフィン(PSPN)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NGF、GDNF受容体内因性アゴニスト、BT18、BT13、NT−3、NT−4、CNTF、GFRα1アゴニスト、XIB4035、Trk活性化剤、TrkAアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、TrkBアゴニスト、N−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、BNN−20BNN−27、デオキシゲズニン、7,8−ジヒドロキシフラボン、4’−ジメチルアミノ−7,8−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、HIOC、LM22A−4、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ノルウォゴニン、R7(薬物)、および7,8,3’−ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、[75]〜[87]の方法。
[89]GFRαアゴニストはGDNFである、[88]の方法。
[90]GDNFは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[89]の方法。
[91]GDNFは、約10ng/mLの濃度で存在する、[90]の方法。
[92]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN
−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、およびPD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される、[75]〜[91]のいずれか1つの方法。
[93]アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される、[92]の方法。
[94]アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、[93]の方法。
[95]アポトーシス阻害剤はBoc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである、[94]の方法。
[96]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[95]の方法。
[97]Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンは、約20μMの濃度で存在する、[96]の方法。
[98]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[75]〜[97]のいずれか1つの方法。
[99]壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、[98]の方法。
[100]壊死阻害剤は、MLKL阻害剤である、[99]の方法。
[101]壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである、[100]の方法。
[102]ネクロスルホンアミドは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[101]の方法。
[103]ネクロスルホンアミドは、約50nMの濃度で存在する、[102]の方法。[104]前記生検から得られた細胞は、皮膚線維芽細胞である、[21]の方法。
[105]ステップc)で作製されるGABA作動性ニューロンは、前記iPSCsを、i.約0日目〜約7日目に少なくとも2つのSMAD阻害剤、
ii.約0日目〜約21日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化剤、
iii約0日目〜約14日目にwnt阻害剤、
iv.約7日目〜約14日目にBMP阻害剤、
v.約7日目〜約21日目にGABA作動性種分化要因、ならびに
vi.約21日目〜約27日目にBDNF、GDNF、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせの存在下で培養することによって作製される、[1]〜[104]のいずれか1つの方法。
[106]前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、
SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[105]の方法。[107]前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、LDN193189およびSB431542である、[106]の方法。
[108]LDN193189は約1pM〜100mMの濃度で存在し、SB431542は約1pM〜100mMの濃度で存在する、[107]の方法。
[109]LDN193189は約100nMの濃度で存在し、SB431542は約10μMの濃度で存在する、[108]の方法。
[110]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ、GSA10、パルモルファミン、SAG、およびSAG二塩酸塩からなる群から選択される、[105]〜[109]のいずれか1つの方法。
[111]前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤はSAGである、[110]の方法。
[112]SAGは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[111]の方法。
[113]SAGは、約0.1μMの濃度で存在する、[112]の方法。
[114]前記wnt阻害剤は、ICG−001、サリノマイシン、IWR−1、Wnt−C59、ETC−159、iCRT3、IWP2、IWP−4、ピルビニウムパモ酸塩、iCRTl4、FH535、CCT251545、KYA1797K、オウゴニン、NCB−0846、ヘキサクロロフェン、PNU−74654、Ky0211、トリプトニド、IWP12、Axin、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115−584、ICG−01、クェルセチン、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB−216763、NSC668036、QS11、G007−LK、およびG244LMからなる群から選択される、[105]〜[113]のいずれか1つの方法。
[115]前記wnt阻害剤はIWP2である、[114]の方法。
[116]IWP2は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[115]の方法。
[117]IWP2は、約5μMの濃度で存在する、[116]の方法。
[118]前記BMP阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、[105]〜[117]のいずれか1つの方法。
[119]前記BMP阻害剤はLDN−193189である、[118]の方法。
[120]LDN−193189は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[119]の方法。
[121]LDN−193189は、約100mMの濃度で存在する、[120]の方法。
[122]前記GABA作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、[105]〜[121]のいずれか1つの方法。
[123]前記GABA作動性種分化要因はFGF8である、[122]の方法。
[124]FGF8は、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[124]の方法。
[125]FGF8は、約100ng/mLの濃度で存在する、[124]の方法。
[126]前記γセクレターゼ阻害剤は、DAPT、RO4929097、セマガセスタ
ット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ly411575、IMR−1、L−685,458、FLI−06、クレニガセスタット、ニロガセスタット、MK−0752、ベガセスタット、BMS299897、コンパウンドW、DBZ、フルリザン、JLK6、MRK560、およびPF3084014臭化水素酸塩からなる群から選択される、[105]〜[125]のいずれか1つの方法。
[127]前記γセクレターゼ阻害剤はDAPTである、[126]の方法。
[128]DAPTは、約1pM〜100mMの濃度で存在する、[127]の方法。
[129]DAPTは、約2.5μMの濃度で存在する、[128]の方法。
[130]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約1pM〜100mMの濃度で存在するBDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するGDNFと、約1pM〜100mMの濃度で存在するDAPTと、を含む、[105]の方法。
[131]前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約10ng/mLの濃度で存在するBDNFと、約10ng/mLの濃度で存在するGDNFと、約2.5μMの濃度で存在するDAPTと、含む、[105]〜[130]のいずれか1つの方法。
[132]前記iPSCは、0日目から約24時間の期間、ROCK阻害剤の存在下で培養される、[105]〜[131]のいずれか1つの方法。
[133]前記GABA作動性ニューロンは有糸分裂後である、[75]〜[132]のいずれか1つの方法。
[134]前記GABA作動性ニューロンは、Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67の転写物を発現する、[75]〜[133]のいずれか1つの方法。
[135]前記GABA作動性ニューロンは、GAD65/67、GlyT2およびVGATを発現する、[75]〜[134]のいずれか1つの方法。
[136]GABA作動性ニューロンの少なくとも95%がGAD65を発現する、[75]〜[135]のいずれか1つの方法。
[137]前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がVGATを発現する、[75]〜[136]のいずれか1つの方法。
[138]前記GABA作動性ニューロンは、インビボでGABAを分泌することができる、[75]〜[137]のいずれか1つの方法。
[139]前記GABA作動性ニューロンは、レシピエントの神経系と機能的に一体化することができる、[75]〜[138]のいずれか1つの方法。
[140]前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水または水性緩衝液からなる群から選択される、[75]〜[139]のいずれか1つの方法。
[141]前記組成物は、約1000〜1000万細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[75]〜[141]のいずれか1つの方法。
[142]前記組成物は、100,000細胞/マイクロリットルの濃度でGABA作動性ニューロンを含む、[141]の方法。
[143]対象における不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能を処理するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[144]対象における神経学的状態、疾患または障害を治療するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[145]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[144]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[146]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、[144]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[147]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハン
チントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[144]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[148]対象における神経障害性疼痛を治療するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[149]前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[148]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[150]対象におけるアロディニアを治療するための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[151]前記投与は、前記対象の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、[143]〜[150]のいずれか1つによる使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[152]前記注射は定位注射による、[151]による使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[153]対象はヒトである[143]〜[152]のいずれか1つによる使用のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物。
[154]対象における神経学的状態、疾患または障害の治療のための薬物の製造のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物の使用。
[155]神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、[154]の使用。
[156]神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、[154]または[155]の使用。
[157]前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、[156]の使用。
[158]対象における神経障害性疼痛の治療のための薬物の製造のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物の使用。
[159]前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、[158]の使用。
[160]対象におけるアロディニアの治療のための薬物の製造のための、[1]〜[62]のいずれか1つの移植組成物の使用。
[161]前記薬物は、前記対象の中枢神経系への投与のために製剤化される、[154]〜[161]のいずれか1つに記載の使用。
[162]前記薬物は、前記対象の脊髄への注射のために製剤化される、[154]〜[161]のいずれか1つに記載の使用。
[163]前記注射は定位注射である、[162]の使用。
[164]対象はヒトである、[154]〜[163]のいずれか1つによる使用。
本発明によるGABA作動性ニューロンおよびそれを含む組成物は、対象の神経系における中枢性抑制を回復または強化するための、ならびに神経機能障害または異常に関連する神経学的状態、疾患および障害を治療するための細胞ベースの治療に使用することがで
きる。
きる。
定義
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、単一の細胞だけでなく、細胞の集団(すなわち、1つより多く)も指す。集団は、1つの細胞型を含む純粋な集団、例えば、ニューロン細胞の集団または未分化幹細胞の集団であり得る。代替的に、集団は、1つより多くの細胞型を含んでもよく、例えば、混合細胞集団を含んでもよい。集団内の細胞の数を制限することを意図するのではなく、例えば、細胞の混合集団は、少なくとも1つの分化細胞を含み得る。一実施形態において、混合集団は、少なくとも1つの分化集団を含み得る。本発明では、細胞集団が含むことができる細胞型の数に制限はない。
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、単一の細胞だけでなく、細胞の集団(すなわち、1つより多く)も指す。集団は、1つの細胞型を含む純粋な集団、例えば、ニューロン細胞の集団または未分化幹細胞の集団であり得る。代替的に、集団は、1つより多くの細胞型を含んでもよく、例えば、混合細胞集団を含んでもよい。集団内の細胞の数を制限することを意図するのではなく、例えば、細胞の混合集団は、少なくとも1つの分化細胞を含み得る。一実施形態において、混合集団は、少なくとも1つの分化集団を含み得る。本発明では、細胞集団が含むことができる細胞型の数に制限はない。
本明細書で使用される場合、分化中の細胞系の細胞に関して使用される場合、「分化」という用語は、細胞が、1つの細胞型(例えば、複能性、全能性、または多能性の分化可能細胞)から標的分化細胞等の別の細胞型に分化するプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される「細胞分化」という用語は、あまり特化していない細胞(例えば、幹細胞)が、より明確な形態および機能を有する(すなわち、より特化する)ように発達または成熟する特殊分化プロセスまたは経路を指す。
本明細書で使用される場合、「脱分化」または「脱分化した」という用語は、細胞に関して使用される場合、より明確な形態および機能、ならびに/または制限された自己再生および/または増殖能を有するより特化した細胞が、あまり特化しなくなり、より大きな自己再生および/または増殖能または分化能(例えば、複能性、多能性等)を獲得するプロセスを指す。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、脱分化細胞の一例である。したがって、脱分化は、細胞再プログラムのプロセスを指すことができる。
本明細書で使用される場合、細胞に関して「神経細胞分化を誘導する」という用語は、デフォルトの細胞型(遺伝子型および/または表現型)を非デフォルトの細胞型(遺伝子型および/または表現型)に変化させることを指す。したがって、細胞がニューロンの表現型を得ることができるように「細胞におけるニューロンの分化を誘導すること」または「細胞を分化させること」は、細胞がニューロン特性を有するように誘導すること、または細胞の本来の同一性とは異なるニューロン特性、例えば、遺伝子型(すなわち、PCRまたはマイクロアレイ等の遺伝子解析により決定される遺伝子発現の変化)および/または表現型(すなわち、β−IIIチューブリン等のタンパク質、またはβ−IIIチューブリン、微小管結合タンパク質2(MAP2)、シナプシン、神経フィラメント−L、ネスチンおよびN−Cam、Tuj1、GAD65/67、TUj1、GlyT2およびVGATのうちの2つ以上の組み合わせを含む複数のタンパク質の形態、機能および/または発現の変化)等を有する子孫細胞に分裂するように細胞を誘導することを含む。
本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、成熟した有糸分裂後ニューロンの機能特性および/または表現型特性を示す神経系統の分化した系統コミット細胞、または成熟した有糸分裂後ニューロンのさらなる機能特性および/または表現型特性を示すために、インビボまたはインビトロのいずれかでさらなる成熟を必要とする神経系統の分化した系統コミット細胞を指す。ニューロンは、以下のマーカーのうちの1つ以上を発現することができる:β−IIIチューブリン、微小管結合タンパク質2(MAP2)、シナプシン、神経フィラメント−L、ネスチンおよびN−Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2、およびVGAT。「GABA作動性ニューロン表現型」または「GABA作動性ニューロン」は、成熟した有糸分裂後ニューロンの機能特性および/または表現型特性を示し、かつβ−IIIチューブリン、微小管結合タンパク質2(MAP2)、シナプシン、神経フィラメント−L、ネスチンおよびN−Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2、およびVGATのうちの1つ以上を発現し、GABAを産生する、神経系統の分化した系統コミット細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「阻害」、「阻害すること」、および「阻害」という用語は、活性または量の低減、減少、不活性化、下方制御、排除または抑制を指す。したがって、本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、分子の遺伝子もしくはタンパク質発現ならびに/または分子の活性および/もしくは機能に干渉する(すなわち、低減、減少、不活性化、下方制御、排除または抑制する)薬剤を指す。例えば、シグナル伝達分子またはシグナル伝達分子の経路を阻害すること(SMADシグナル伝達の阻害剤等)に関して、阻害剤は、SMADシグナル伝達経路に関与する実体の遺伝子もしくはタンパク質発現、ならびに/またはシグナル伝達分子の活性および/もしくは機能、または分子
もしくは経路のシグナル伝達機能に干渉する薬剤を指す。同様に、BMP、wnt、γセクレターゼ等の阻害剤に関して、阻害剤は、BMP、wnt、γセクレターゼ等の発現または活性または機能に干渉する薬剤を指す。
もしくは経路のシグナル伝達機能に干渉する薬剤を指す。同様に、BMP、wnt、γセクレターゼ等の阻害剤に関して、阻害剤は、BMP、wnt、γセクレターゼ等の発現または活性または機能に干渉する薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、細胞を本発明によって定義される化合物と「接触させる」という用語は、「接触された」細胞を生成するために、化合物が細胞に接触することを可能にする場所に化合物を配置することを指す。接触させることは、任意の好適な方法を用いて達成され得る。例えば、一実施形態において、接触は、化合物を細胞の容器(例えば、試験管、バイアルまたは培養フラスコまたは培養皿等)に添加することによって行われる。接触させることは、化合物を細胞の培養物に添加することによっても達成され得る。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、全能性または多能性または複能性であり、胚性幹細胞、臓器から単離された幹細胞等の1つ以上の異なる細胞型に分化することができる細胞を指す。本明細書で使用される場合、「成体幹細胞」という用語は、出生後の生物に由来する幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「神経幹細胞」または「NSC」または「神経前駆細胞(neural precursor cell)」または「神経前駆細胞(neural
progenitor cell)」は、インビボでニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、およびグリア細胞、ならびに培養中のニューロン細胞子孫およびグリア子孫になることができる細胞を指す。
progenitor cell)」は、インビボでニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、およびグリア細胞、ならびに培養中のニューロン細胞子孫およびグリア子孫になることができる細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、任意の(または複数の)分化細胞型(複数可)に分化することができる細胞株を指す。
本明細書で使用される場合、「複能性」という用語は、少なくとも2つの分化細胞型に分化することができる細胞株を指す。
本明細書で使用される場合、「初代細胞」という用語は、培養物の非存在下で動物の組織(例えば、血液)または器官から直接得られる細胞である。典型的には、必ずしもそうではないが、初代細胞は、老化および/または増殖の停止の前に、インビトロで10回以下の継代を経ることができる。
「誘導多能性幹細胞(iPSC)または(iPS細胞)」は、例えば、体細胞にあまり分化していない表現型を付与する外因性遺伝子を導入することによって、再プログラムまたは「脱分化」された体細胞に関する表記である。次いで、これらの細胞を誘導して、あまり分化していない子孫に分化させることができる。IPS細胞は、2006年に最初に発見されたアプローチの変形例を用いて導出された(Yamanaka,S.et al.Cell,Stem Cell,1:39−49(2007))。例えば、一例では、iPS細胞を作製するために、科学者は、皮膚細胞から開始して、その後、レトロウイルスを用いて細胞DNAに遺伝子を挿入する標準的な実験技法によって修飾した。一例では、挿入された遺伝子は、細胞を胚性幹細胞様状態に維持するために天然調節因子として一緒に作用することが知られているOct4、Sox2、Lif4、およびc−mycであった。これらの細胞は、文献に記載されている。例えば、非特許文献1〜4を参照されたい。そのような細胞は、特定の培養条件(特定の薬剤への曝露)によって作製されてもよく、また様々な異なる出発細胞型から作製されてもよい。非特許文献1〜4は全て、IPSCの教示およびそれらの製造方法のために参照により組み込まれる。
iPS細胞は、胚性幹細胞の多くの特徴を有する。例えば、それらは、生殖細胞株伝達および四倍体相補性を有するキメラを作製する能力を有し、それらはまた、3つの胚性胚
葉から様々な細胞型を含有する奇形腫を形成することもできる。他方では、一部の報告書に示されているように、それらは同一ではない場合がある。例えば、誘導多能性幹細胞および胚性幹細胞が遺伝子発現シグネチャによって区別され得ることを示す非特許文献5を参照されたい。
葉から様々な細胞型を含有する奇形腫を形成することもできる。他方では、一部の報告書に示されているように、それらは同一ではない場合がある。例えば、誘導多能性幹細胞および胚性幹細胞が遺伝子発現シグネチャによって区別され得ることを示す非特許文献5を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語は、初代細胞株、有限細胞株、連続細胞株、および形質転換細胞株を含むが、細胞が培養中に無限の回数の継代ができることを必要としない、インビトロで培養される細胞を指す。細胞株は、自発的に、または形質転換によって作製され得る。
本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養を指す。「培養」という用語は、細胞を成長させるおよび/または維持するおよび/または操作するプロセスを指す。この用語には、連続した細胞株(例えば、不死化表現型を有する)、初代細胞培養物、有限細胞株(例えば、非形質転換細胞)、および卵母細胞および胚を含む、インビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。本明細書で使用される場合、「初代細胞培養物」および「初代培養物」という用語は、例えば、動物またはヒト由来の組織標本または生検から等、インビボで細胞から直接得られた細胞培養物を指す。これらの培養物は、成人ならびに胎児組織に由来し得る。
本明細書で使用される場合、「培養培地」および「細胞培養培地」という用語は、インビトロでの細胞の成長(すなわち、細胞培養物、細胞株等)を支持するのに適した培地を指す。この用語は、任意の特定の培養培地に限定されることを意図するものではない。例えば、この定義は、維持培地だけでなく、細胞の分化または特殊分化のための他の培地も包含することが意図される。実際、この用語は、目的とする細胞培養物および細胞の成長に好適な任意の培養培地を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。細胞分化の文脈において、キットは、幹細胞を接触させるための材料の組み合わせを指してもよく、そのような送達システムは、適切な容器(試験管等)内の反応試薬(例えば、化合物、タンパク質、検出剤(プローブまたは抗体等)、および/または支持材料(例えば、緩衝液、細胞分化を行うための書面による指示書等)を、1つの場所から別の場所へ保管、輸送、または送達することを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬(阻害剤(例えば、SB431542およびLDN193189 wnt阻害剤、bmp阻害剤、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤)ならびに成長因子およびサイトカイン(例えば、GDNF、BDNF))および/または支持材料を含有する1つ以上の収納容器(例えば、箱または袋等)を含む。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境は、限定されないが、試験管および細胞培養物からなり得る。「インビボ」という用語は、天然環境(例えば、動物または細胞)、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のマーカーは、1つのマーカーに限定されなくてもよく、マーカーは、指定されたマーカー群が、細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から識別し得るようなマーカーの「パターン」を指す場合もある。例えば、本発明のニューロンは、ニューロン、例えば、β−IIIチューブリン、ネスチン、N−Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2およびVGATを区別する1つ以上のマーカーを発現する。
本明細書に開示される任意の細胞に関して作製される場合、「〜に由来する」または「〜から確立された」または「〜から分化した」という用語は、任意の操作、例えば、単細胞単離、インビボでの培養、例えば、タンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を用いた処理および/または変異誘発、モルフォゲン等のDNA配列によるトランスフェクション、培養親細胞中に含まれる任意の細胞の選択(連続培養等による)等を用いて、細胞株、組織、または流体中の親細胞から得られた(例えば、単離された、精製された等)細胞を指す。誘導細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン治療の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順等への応答によって混合集団から選択され得る。
本明細書で使用される場合、「神経変性障害」および「神経変性疾患」という用語は、この文書において互換的に使用され、異常な細胞死を特徴とする神経系(例えば、中枢神経系または末梢神経系)の疾患を意味する。神経変性病態の例として、アルツハイマー病、ダウン症候群、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、ピック病、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病(球脊髄性筋萎縮症とも称される)、および脊髄小脳失調症(例えば、1型、2型、3型(マチャド・ジョセフ病とも称される)、6型、7型、および17型))、脆弱性X(レット)症候群、脆弱性XE精神遅滞、フリートライヒ運動失調症、筋緊張性ジストロフィー、脊髄小脳失調症8型、および脊髄小脳失調症12型、アレキサンダー病、アルパース病、筋萎縮性側索硬化症(または運動ニューロン疾患)、遺伝性痙攣性対麻痺、ミトコンドリア病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病(シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病とも称される)、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、虚血脳卒中、クラッベ病、レヴィー小体認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、ならびに脊髄ろうが挙げられる。
「治療」、「治療すること」、「治療する」等の用語は、概して、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを指すために本明細書で使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点から予防的であり得、かつ/または、疾患および/もしくは該疾患に起因する有害作用に対する部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という観点から治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、(a)疾患もしくは症状の素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患もしくは症状が発生するのを防止すること、(b)疾患症状を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること、または(c)疾患症状を軽減すること、すなわち、疾患もしくは症状の退行を引き起こすことを含む。
「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、治療、または治療法が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。
当業者には理解されるように、任意のかつ全ての目的のために、特に、書面による説明を提供する点において、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意のかつ全ての可能な部分範囲およびそれの部分範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、3分の1、4分の1、5分の1、10分の1等に分割することを十分に説明し、かつ可能にするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下3分の1、中3分の1および上3分の1等に容易に分割することができる。当業者には理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より少ない」等の全ての言語は、列挙される数を含み、上述のように、後に部分範囲に分割され得る範囲を指す。
本明細書(特許請求の範囲を含む)において「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含まれる」、または「含んでいる」という用語が使用される場合、それらは、記載される特徴、整数、ステップもしくは構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであり、1つ以上の他の特徴、整数、ステップもしくは構成要素、またはそれらの群の存在を除外するものとして解釈されるべきではない。
本明細書において、先行技術として提供される特許文献または他の事項への言及は、その文献または事項が既知であったこと、またはそれが含有する情報が請求項のいずれかの優先権日の時点で周知の一般知識の一部であったことを認めるものと解釈されるべきではない。
GABA作動性ニューロン移植組成物
侵害受容は、動物が潜在的に有害な刺激を検出して逃避することを可能にする感覚である。哺乳動物において、侵害受容感覚情報は、次いで「疼痛」が経験される中枢神経系において統合され、処理される。このシステムは5億年以上前に初めて進化し、侵害受容の遺伝的構造は強い選択的圧力を受けていると考えられる。ハエ幼虫の侵害防御行動パラダイムは、急性侵害受容のコアの保存された遺伝子構造を定義するための強力なツールとなっている。ハエ幼虫における急性または一過性の侵害受容感作を特徴付ける多くの研究が行われているが、慢性侵害受容状態の調査はまだ可能ではない。
侵害受容は、動物が潜在的に有害な刺激を検出して逃避することを可能にする感覚である。哺乳動物において、侵害受容感覚情報は、次いで「疼痛」が経験される中枢神経系において統合され、処理される。このシステムは5億年以上前に初めて進化し、侵害受容の遺伝的構造は強い選択的圧力を受けていると考えられる。ハエ幼虫の侵害防御行動パラダイムは、急性侵害受容のコアの保存された遺伝子構造を定義するための強力なツールとなっている。ハエ幼虫における急性または一過性の侵害受容感作を特徴付ける多くの研究が行われているが、慢性侵害受容状態の調査はまだ可能ではない。
神経障害性損傷は、非侵害性刺激が疼痛を引き起こす可能性がある慢性侵害受容感作をもたらす(「アロディニア」と称される)。疼痛疾患を治療するために標的とされ得る基礎となるコア機構を特定するために、本発明者らは、ショウジョウバエにおける神経障害性「疼痛」反応を調査した。驚くべきことに、本発明者らは、無傷の動物が、42℃を超える温度に対して強い逃避反応を示したが、損傷後、動物は侵害温度よりも低い温度に対して侵害防御反応を示し始めた(すなわち、熱アロディニア)ことに気付いた。この反応の系統的な遺伝的解剖を通じて、本発明者らは、熱アロディニアが保存されたTRPチャネルTrpA1に依存し、中枢GABA作動性抑制の喪失が必要であり、またアロディニアに十分であることを発見した。神経障害性疼痛の関連で脊髄抑制を回復させる治療的可能性の調査を通じて、本発明者らは、驚くべきことに、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)から作製される抑制性GABA作動性ニューロン移植片は、神経障害性対象に移植されると、生存してレシピエントの神経系(例えば、中枢神経系)内に統合するだけでなく、重要なことに、副作用なしに神経障害性疼痛から長期にわたる寛解を提供したことを見出した。
本発明は、本発明によるGABA作動性ニューロンの集団を含む薬学的組成物を提供する。別の態様において、本発明は、GABA作動性ニューロンを作製するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法に従って産生されたGABA作動性ニューロンの集団を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、概して、1つ以上の薬学的に許容されるおよび/または承認された担体、添加剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、希釈剤および/または安定剤を含み得る。そのような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質等であり得る。好適な担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体等の、大きく、緩徐に代謝される分子である。この医薬組成物は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドン等の追加の添加剤、またはインビボ投与に適した抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)等の他の添加物を含有することができる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与されたときに、有害な、アレルギー性の、または他の好ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意の種類の無毒の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤を指す。
一態様において、本発明は、対象における疼痛の治療に使用するための、本発明によるGABA作動性ニューロンの集団を含む薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。本発明はまた、本発明によるGABA作動性ニューロンの集団を含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む疼痛を治療するための方法にも関する。好ましい実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。
本発明の別の態様は、神経変性疾患または中枢もしくは末梢神経系への損傷の治療に使用するための、本明細書に記載の本発明のGABA作動性ニューロンの集団に関する。本発明はまた、上記のような治療有効量のニューロン集団を投与するステップを含む、神経変性疾患または中枢もしくは末梢神経系への損傷を治療するための方法に関する。
本発明の文脈において、「治療すること」または「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、病理の発症を遅延もしくは予防すること、病理の症状の進行、増悪または悪化を逆転、緩和、阻害、減速もしくは停止すること、病理の症状の改善をもたらすこと、および/または病理を治癒することを目的とする方法を指す。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、意図される目的を達成するのに十分な、本明細書に記載の方法に従って調製される移植組成物の任意の量またはGABA作動性ニューロン(またはその集団もしくはその医薬組成物)の数を指す。有効な投薬量および投与計画は、対象の病理の性質に基づいて、適正な医療行為によって容易に決定することができ、病理の症状の程度、および対象となる組織または器官の損傷または変性の程度、ならびに対象の特徴(例えば、年齢、体重、性別、全般的な健康等)を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。
一実施形態において、本発明は、GABA作動性ニューロンの集団、GFRαアゴニストおよび少なくとも1つの細胞死阻害剤を含み、前記GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、該細胞がGABA作動性ニューロン表現型を得ることおよびGABAを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物を対象とする。
一実施形態において、本発明は、GABA作動性ニューロンの集団、GFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤および壊死阻害剤を含み、前記GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、該細胞がGABA作動性ニューロン表現型を得ることおよびGABAを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物を対象とする。
治療のために、本明細書に記載され、かつ例示される方法に従って産生されるiPSC由来GABA作動性ニューロン、および本発明による医薬組成物は、任意の適切な経路を介して投与され得る。用量および投与の回数は、既知の様式で当業者によって最適化され得る。
例えば、投与量は、例えば、体重、投与経路、疾患の重症度等に応じて、例えば、1日1回、1週間に2回、1週間に1回、1ヶ月に2回、1ヶ月に1回、1年に1回、1年に
2回、2、3、4、または5ヶ月ごとに1回の投与頻度で、約100、500、1,000、2,500、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000〜10,000,000個の細胞またはそれ以上(またはそれらの間の任意の整数値)と様々であり得る。一実施形態において、好ましい用量は、100,000細胞/マイクロリットルである。別の実施形態において、本発明の組成物は250万個の細胞を含む。
2回、2、3、4、または5ヶ月ごとに1回の投与頻度で、約100、500、1,000、2,500、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000〜10,000,000個の細胞またはそれ以上(またはそれらの間の任意の整数値)と様々であり得る。一実施形態において、好ましい用量は、100,000細胞/マイクロリットルである。別の実施形態において、本発明の組成物は250万個の細胞を含む。
本明細書に記載される細胞は、移植のために生理学的に適合性のある担体に懸濁させることができる。本明細書で使用される場合、「生理学的に適合性のある担体」という用語は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではない担体を指す。当業者は、生理学的に適合する担体に精通している。好適な担体の例として、細胞培養培地(例えば、イーグル基礎培地)、リン酸緩衝食塩水、ハンクス平衡塩溶液+/−グルコース(HBSS)、および複数の電解質溶液、例えばPlasma−Lyte(商標)A(Baxter)が挙げられる。
一実施形態において、移植組成物中のGFRαアゴニストは、GDNF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NGF、ニュールツリン、アルテミン、ペルセフィン、GDNF受容体内因性アゴニスト、BT18、BT13、NT−3、NT−4、CNTF、GFRα1アゴニスト、XIB4035、Trk活性化剤、TrkAアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、TrkBアゴニスト、N−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、BNN−20BNN−27、デオキシゲズニン、7,8−ジヒドロキシフラボン、4’−ジメチルアミノ−7,8−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、HIOC、LM22A−4、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ノルウォゴニン、R7(薬物)、および7,8,3’−トリヒドロキシフラボンからなる群のいずれか1つ以上から選択される。一実施形態において、GFRαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)、およびペルセフィン(PSPN)からなる群から選択される。好ましい実施形態において、GFRαアゴニストは、GDNFである。
一実施形態において、移植組成物中のアポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az
10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、PD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される。好ましい実施形態において、アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである。
10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、PD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される。好ましい実施形態において、アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである。
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンまたはそれらが由来する細胞のTALENS、CRISPR−Cas9、またはRNAi等による遺伝子操作によって、カスパーゼ遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
一実施形態において、移植組成物中の壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドのうちの
1つ以上から選択される。好ましい実施形態において、壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである。
1つ以上から選択される。好ましい実施形態において、壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである。
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンまたはそれらが由来する細胞のTALEN、CRISPR−Cas9、またはRNAi等による遺伝子操作によって、壊死性遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
別の実施形態において、本発明の移植組成物は、アマンタジン、メマンチン、ケタミン塩酸塩、ペチジン、トラマドール、メタドン、デキストロプロポキシフェン、亜酸化窒素、デキストロメトルファン、AP5、AP7、CPPene、セルフォテル、エタノール、ミノサイクリン、アトモキセチン、AZD6765、アグマチン、クロロホルム、デキストラロルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、ジゾシルピン、エチシクリジン、ガシクリジン、ケタミン(他の形態)、マグネシウム、メトキセチミン、ニトルメマンチン、PD−137899、フェンシクリジン、ロリシクリジン、テノシクリジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプラドール、エトキサドロール、デキソキサドロール、WMS−2539、NEFA、デルセミン、8A−PDHQ、アプチガネル、HU−211、ヒューペルジンA、イボガイン、レマセミド、リンコフィリン、GABAペンチン、ラパスチネル、NRX−1074、7−クロロキヌレン酸、4−クロロキヌレニン、5,7−ジクロロキノキヌレン酸、キヌレン酸、TK−40、1−アミノシクロプロパンカルボン酸、L−フェニルアラニン、およびキセノンからなる群から選択される1つ以上の興奮毒性誘発アポトーシスまたは壊死の阻害剤;ブピバカイン、リドカイン、コカイン、ラモトリジン、パラアルデヒド、スチリペントール、フェノバルビタール、プリミドン、メチルフェノバルビタール、ペントバルビタール、ベンゾジアゼピン(クロバザム、クロナゼパム、クロラゼプ酸、ジアゼパム、ミダゾラム、ロラゼパム、ニトラゼパム、テマゼパム、ニメタゼパム)臭化カリウム、フェルバメート、カルボキサミド(カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、酢酸エスリカルバゼピン、バルプロ酸塩(バルプロ酸、バルプロ酸ナトリウム、ジバルプロエクスナトリウム、ビガバトリン、プロガビド、チアガビン、トピラメート、プレガバリン、エトイン、フェニトイン、メフェニトイン、フォスフェニルトイン、パラメタドン、トリメタジオン、エタジオン、ベカラミド、プリミドン、ブリバラセタム、エチラセタム、レベチラセタム、スレクトラセテム(Slectracetem)、エトスクシミド、フェンスクシミド、メスクシミド、アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド、ゾニサミド、フェネトライド、フェナセミド、バルプロミド、バルノクタミド、ペランパネル、スチリペントール、ピロキシジン(Pyroxidine)、イソフルラン、レボフルラン、CNV1014802、フナピド、プリロカイン、イオントカイン(Iontocaine)、レボブピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、アミロカイン、シクロメチルカイン、α−オイカイン、β−オイカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、オルトカイン、ベンゾカイン、ブタミベ(Butamibe)、クロロプロカイン、ルカイン、ジメトカイン、メプリルカイン、ルカイン、ニトロカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、ノボカイン、プロキシメタカイン、リゾカイン、テトラカイン、ラキサトリジン、三環系抗うつ薬(アミトリプチリン、ノルトリプチリン、DSP−2230、メキシリチン、フルピルチン、ジコノチド、またはアヘンおよびオピオイド、非ステロイド性抗炎症剤、パラセタモール、アセテナリジド、カプサイシン、メントール、大麻およびカニビノイドを含む末梢活性を阻害する任意の薬物から選択される1つ以上の興奮性の阻害剤を含むか、またはそれとともに投与され得る。
供給される必要がある前述のアゴニストおよび阻害剤のそれぞれの量は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、カスパーゼもしくはカスパーゼシグナル伝達の阻害レベル、および/またはアポトーシスもしくは壊死の程度は、日常的なアッセイによって決定
され得る。移植組成物および方法(細胞培養培地およびキットを含むが、これらに限定されない)に使用されるGFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、および壊死阻害剤の濃度は、ニューロン細胞の生存率および機能を考慮して容易に確認され得、これらは両方とも、当業者に既知のアッセイを本明細書に記載のアッセイとともに使用して容易に評価され得、またそれに合うように調整され得る。
され得る。移植組成物および方法(細胞培養培地およびキットを含むが、これらに限定されない)に使用されるGFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、および壊死阻害剤の濃度は、ニューロン細胞の生存率および機能を考慮して容易に確認され得、これらは両方とも、当業者に既知のアッセイを本明細書に記載のアッセイとともに使用して容易に評価され得、またそれに合うように調整され得る。
本発明の実施形態において、前述の阻害剤およびアゴニストは、ピコモル濃度からマイクロモル濃度までの濃度で存在してもよい。
別の実施形態において、本発明の移植組成物のGABA作動性ニューロンは、β−IIIチューブリン、微小管結合タンパク質2(MAP2)、シナプシン、神経フィラメント−L、ネスチンおよびN−Cam、Tuj1、GAD65/67、TUJ1、GlyT2およびVGATのうちの1つ以上を発現する。好ましい実施形態において、GABA作動性ニューロンは、VGATを発現する。別の実施形態において、GABA作動性ニューロンはGlyt2ならびにGAD65およびGAD67を発現する。別の実施形態において、GABA作動性ニューロンはVGAT、Glyt 2ならびにGAD65およびにGAD67を発現する。
別の実施形態において、GABA能性ニューロンはインビボでGABAを産生する。別の実施形態において、GABA作動性ニューロンは、本明細書に示される実施例に記載される濃度でGABAを分泌する。
別の態様において、本発明は、本発明の移植組成物の剤形を提供する。いくつかの実施形態において、これらの剤形は、すぐに投与できる組成物を含む。本明細書で使用される「すぐに投与できる」という用語は、薬物溶液が滅菌されており、直接静脈内注入または注射に好適であり、薬物溶液を患者に非経口投与する前に希釈または再構成の中間ステップが必要とされないことを意味する。薬物水溶液は、剤形の容器から非経口的に直接投与することができる。「すぐに投与できる」という用語は、「すぐに注入できる」または「すぐに注射できる」と同義である。
GABA作動性ニューロンを調製する方法
本発明はまた、GABA作動性ニューロンの作製方法に関し、以下の態様および実施形態が、個別にまたは任意の好適な組み合わせのいずれかで併用されてもよい。
無数の治療用途において幹細胞由来の分化細胞の可能性があるため、培養中の幹細胞の分化を特定の体細胞運命へと導くことまたは促進することは大変に興味深いことである。ヒト幹細胞は、細胞置換療法および治療薬の細胞スクリーニングに大きな可能性を提供する。誘導多能性幹細胞(iPSC)への体細胞リプログラミングの最近の進歩により、再生医療および疾患モデル化のための患者特異的細胞を作製することが可能となった。
現在、驚くべきことに、GABA作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞を、BMPシグナル伝達を活性化する薬剤と接触させることは、GABA作動性ニューロン表現型に向けて前駆細胞の分化を促進し、そのような細胞は、ソマトスタチンの発現を減少させ、パルブアルブミンの発現を増加させることが分かっている。換言すると、BMPシグナル伝達を誘導するこれらの因子は、より好ましい抑制性の表現型を有するGABA作動性ニューロンに対して幹細胞または前駆細胞の分化を誘導または誘導する。したがって、幹細胞または前駆細胞の分化を抑制性GABA作動性ニューロン表現型に向けるために、培養系においてBMPシグナル伝達を増強する因子の使用が想定されている。
したがって、本発明の別の態様によれば、パルブアルブミンの発現が増加したGABA作動性ニューロンを産生するための方法が提供され、該方法は、細胞集団を、BMPシグナル伝達が誘導されない条件下で培養された細胞と比較してパルブアルブミンの発現が上昇したGABA作動性ニューロン表現型を有する細胞に分化させるのに十分な前記細胞集団において、BMPシグナル伝達を誘導するのに十分な時間および条件下で、ニューロン分化中の細胞集団を培養することを含む。
細胞内でBMPシグナル伝達を誘導するいくつかの薬剤が知られているが、好ましい実施形態によれば、分化細胞集団は、細胞集団を、BMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤と接触させることによって、細胞集団をGABA作動性ニューロン表現型および上昇したパルブアルブミンの発現を有する細胞に分化させるのに十分な前記細胞集団において、BMPシグナル伝達を誘導するのに十分な時間および条件下で培養される。好ましくは、1つ以上の薬剤は、BMP I型および/またはII型受容体(複数可)のカノニカルリガンドから選択され、いずれかまたは両方の受容体への結合を介してBMPシグナル伝達を活性化する。別の実施形態において、1つ以上の薬剤は、BMP I型受容体(BMPR−I)およびBMP I型受容体(BMPR−II)に結合し、かつ/またはSMAD1/5/8シグナル伝達経路を活性化する。
一実施形態において、BMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤はBMP4を含む。好ましい実施形態において、BMPシグナル伝達を誘導する薬剤はBMP4である。別の実施形態において、BMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤は、SJ000291942、SJ000063181、およびSJ000370178、イソリキリチゲニン(SJ000286237)、BMP増感剤(PD407824)、BMP2、BMP5、BMP4 BMP6、BMP7、BMP9、BMP10、BMP15、BMP共活性化剤FK506(タクロリムス)、およびCK2.3(CK2阻害剤)、操作されたBMP、内因性BMPアンタゴニストノギンおよびコーディンの阻害剤(抗ノギン、抗コーディン抗体等の中和抗体を含む)、塩酸ファスジル、ロバスタチン、シムバスタチン(BMP発現を増強することができる)、ペントキシフィリン、シルデナフィル、ロリプラム(ホスホジエステラーゼ阻害によりBMPの効果を増強する)からなる群から選択されるベントロモルフィンからなる群から選択される。
別の実施形態において、BMPシグナル伝達および/またはSMAD1/5/8シグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤は、SMURF1(SMURF1の内因性阻害剤)を阻害する。
細胞集団を、ニューロン分化中の細胞に分化させるのに十分な網膜前駆細胞集団におけるBMPシグナル伝達の誘導をもたらすために使用され得る薬剤(複数可)の濃度は、本明細書に記載される方法に従って当業者によって決定され得る。一実施形態において、細胞集団は、約1pM〜約100μMの濃度で存在するBMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤を含む細胞培養培地内で培養される。別の実施形態において、BMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤は、約5ng/mL〜約50ng/mLの濃度で存在する。より好ましくは、BMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤は、約10ng/mLの濃度で存在する。好ましい実施形態において、BMP4は、10ng/mLの量で存在する。
後により詳細に説明されるように、iPSCの集団からGABA作動性ニューロンを調製するプロセスにおいて、本発明者らは驚くべきことに、GABA作動性ニューロン表現型に向かってニューロンの分化または成熟中の細胞を、培養の約14日目〜約21日目の期間中にBMPシグナル伝達を活性化する薬剤に曝露することにより、約14日目〜約2
8日目、または約21日目〜約28日目の間、ソマトスタチンの50%減少までに処理されなかったまたは処理された細胞と比較して、パルブアルブミン発現の6倍の増加を示したことを見出した。
8日目、または約21日目〜約28日目の間、ソマトスタチンの50%減少までに処理されなかったまたは処理された細胞と比較して、パルブアルブミン発現の6倍の増加を示したことを見出した。
さらに驚くべきことに、GABA作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞を、培養の約14日目〜約21日目の期間中にBMPシグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤と接触させると、そのような細胞は、疼痛の治療のために治療的に用いられたときに、著しくより強力な長期鎮痛反応を示すことが見出されている。
したがって、別の実施形態において、GABA作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞は、培養の約14日目〜約21日目の期間中にBMPシグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤と接触させられる。別の実施形態において、GABA作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞は、培養の約14日目〜約21日目の期間にわたってBMPシグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤と接触させられる。好ましい実施形態において、1つ以上の薬剤は、BMPを含む。別の実施形態において、GABA作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞を、培養の約14日目〜約21日目にBMP4と接触させる。
一実施形態において、本発明のGABA能性ニューロンは、以下の手順に従って調製される:
hiPSCをTripLE(Invitrogen)で解離し、超低接着表面を有する結合プレート中の懸濁液で2週間増殖させて胚様体(EB)を形成させる。神経誘導のために、細胞をSMAD阻害剤LDN193189(100nM、0日目〜14日目)およびSB431542(10μM、0日目〜10日目)で処理する。MGE(内側基底核隆起)誘導ために、細胞をWnt阻害剤IWP2(5pM、0日目〜7日目)、SHH活性化剤SAG(Smoothenedアゴニスト0.1pM、0日目〜21日目)、および増殖因子FGF8(100ng/mL、8日目〜21日目)で処理した。分化の初日に、ROCK阻害剤を加える。懸濁液中に2週間置いた後、EBをポリオルニチン(PLO)およびフィブロネクチン(FN)でコーティングした表面に移す。21日目に、EBを解離し、将来的な分化および成熟のために10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、および2.5μM γセクレターゼ阻害剤DAPTを含む分化培地上のPLO/FNコーティングプレートに再播種した。
hiPSCをTripLE(Invitrogen)で解離し、超低接着表面を有する結合プレート中の懸濁液で2週間増殖させて胚様体(EB)を形成させる。神経誘導のために、細胞をSMAD阻害剤LDN193189(100nM、0日目〜14日目)およびSB431542(10μM、0日目〜10日目)で処理する。MGE(内側基底核隆起)誘導ために、細胞をWnt阻害剤IWP2(5pM、0日目〜7日目)、SHH活性化剤SAG(Smoothenedアゴニスト0.1pM、0日目〜21日目)、および増殖因子FGF8(100ng/mL、8日目〜21日目)で処理した。分化の初日に、ROCK阻害剤を加える。懸濁液中に2週間置いた後、EBをポリオルニチン(PLO)およびフィブロネクチン(FN)でコーティングした表面に移す。21日目に、EBを解離し、将来的な分化および成熟のために10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、および2.5μM γセクレターゼ阻害剤DAPTを含む分化培地上のPLO/FNコーティングプレートに再播種した。
前述の手順に従って、超低接着24ウェルプレート(各ウェル=1.9cm2)において、hiPSCを分化させるように誘導してもよい。最適な細胞密度は、ウェル当たり約600,000細胞である。d14に、フィブロネクチンでコーティングした12ウェルプレートに胚様体を播種する(3.8cm2)。1ウェル当たりのEBの最適な数は約10である。次いで、細胞を解離し、d21に再播種する(12ウェルプレート)。最適な細胞密度は、ウェル当たり約30,000細胞である。当業者は、細胞またはEBの最適密度が、異なる形態およびサイズの培養容器(例えば、組織培養フラスコ、ペトリ皿等)に適用され得ることを容易に理解するであろう。
GABAの産生の確認は、GABAに関連する転写物の分析、およびGABAの細胞培養培地への分泌を含む、本明細書に記載および例示される方法を使用して評価され得る。
治療方法
本発明の別の態様は、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害の治療に使用するための、本明細書に記載のGABA作動性ニューロンの集団を含む本発明の移植組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載の移植組成物を、それを必要とする対象
に投与するステップを含む、方法に関する。本発明はまた、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療するための薬物の製造のための、本明細書に記載の移植組成物、または本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団の使用に関する。
本発明の別の態様は、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害の治療に使用するための、本明細書に記載のGABA作動性ニューロンの集団を含む本発明の移植組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載の移植組成物を、それを必要とする対象
に投与するステップを含む、方法に関する。本発明はまた、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療するための薬物の製造のための、本明細書に記載の移植組成物、または本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団の使用に関する。
本発明の文脈において、「治療すること」または「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、病理の発症を遅延もしくは予防すること、病理の症状の進行、増悪または悪化を逆転、緩和、阻害、減速もしくは停止すること、病理の症状の改善をもたらすこと、および/または病理を治癒することを目的とする方法を指す。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、意図される目的を達成するのに十分な、本発明による移植組成物の任意の量を指す。有効な投薬量および投与計画は、対象の病理の性質に基づいて、適正な医療行為によって容易に決定することができ、病理の症状の程度、および対象となる組織または器官の損傷または変性の程度、ならびに対象の特徴(例えば、年齢、体重、性別、全般的な健康等)を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。
治療のために、本発明による移植組成物は、任意の適切な経路を介して投与し得る。用量および投与の回数は、既知の様式で当業者によって最適化され得る。
一実施形態において、本発明は、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療する方法を提供する。別の実施形態において、神経学的状態、疾患または障害は、抑制の回復または強化を必要とする興奮毒性に関連する。一実施形態において、神経学的状態、疾患または障害は、神経障害性疼痛(慢性神経障害性疼痛を含む)、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、CBD、FTLD、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される。
一実施形態において、本明細書に記載されるGABA作動性ニューロンまたは本明細書に記載されるGABA作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の中枢神経系に投与される。一実施形態において、GABA作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の脊髄に投与される。別の実施形態において、GABA作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の脳に投与される。別の実施形態において、GABA作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の後根神経節に投与される。
本発明が、哺乳動物における神経学的状態、疾患もしくは障害の治療に使用するための、または哺乳動物における神経学的状態、疾患もしくは障害の治療のための薬物の製造に使用するための、本明細書に記載のGABA作動性ニューロンの集団を含む本発明の移植組成物、または本明細書に記載のGABA作動性ニューロンの集団に関する場合、組成物または薬物は、対象の中枢神経系への投与のために製剤化され得る。一実施形態において、移植組成物または薬物は、対象の脊髄への投与のために製剤化される。別の実施形態において、移植組成物または薬物は、対象の脳への投与のために製剤化される。別の実施形態において、移植組成物または薬物は、対象の後根神経節への投与のために製剤化される。
一実施形態において、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の方法に従って調製され
るGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疼痛を治療する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、対象における疼痛の治療のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、対象の疼痛の治療のための薬物の製造のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物の使用を提供する。好ましい実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。
るGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疼痛を治療する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、対象における疼痛の治療のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、対象の疼痛の治療のための薬物の製造のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物の使用を提供する。好ましい実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。
一実施形態において、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象において神経興奮に関連する疾患または障害を治療することを含む方法を提供する。一実施形態において、本発明は、神経興奮に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象において、その治療のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、神経興奮に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象において、その治療のための薬物の製造のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるGABA作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物の使用を提供する。
キット
本発明は、本明細書に記載の移植組成物の調製のためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも1つのGFRαアゴニスト、および少なくとも1つの細胞死阻害剤を、GABA作動性ニューロンの集団とともに提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも1つのGFRαアゴニスト、少なくとも1つのアポトーシス阻害剤、および少なくとも1つの壊死阻害剤を、GABA作動性ニューロンの集団とともに提供する。
本発明は、本明細書に記載の移植組成物の調製のためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも1つのGFRαアゴニスト、および少なくとも1つの細胞死阻害剤を、GABA作動性ニューロンの集団とともに提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも1つのGFRαアゴニスト、少なくとも1つのアポトーシス阻害剤、および少なくとも1つの壊死阻害剤を、GABA作動性ニューロンの集団とともに提供する。
別の実施形態において、このキットは、GABA作動性ニューロンの集団の代わりに、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、細胞を分化させてGABA作動性ニューロン表現型を得るためおよびGABAを産生するための本明細書に記載の細胞培養試薬とともに含む。別の実施形態において、キットは、BMPシグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤をさらに含む。一実施形態において、BMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤はBMP4を含む。好ましい実施形態において、BMPシグナル伝達を誘導する薬剤はBMP4である。別の実施形態において、BMPシグナル伝達を誘導する1つ以上の薬剤は、SJ000291942、SJ000063181、およびSJ000370178、イソリキリチゲニン(SJ000286237)、BMP増感剤(PD407824)、BMP2、BMP5、BMP4 BMP6、BMP7、BMP9、BMP10、BMP15、BMP共活性化剤FK506(タクロリムス)、およびCK2.3(CK2阻害剤)、操作されたBMP、内因性BMPアンタゴニストノギンおよびコーディンの阻害剤(抗ノギン、抗コーディン抗体等の中和抗体を含む)、塩酸ファスジル、ロバスタチン、シムバスタチン(BMP発現を増強することができる)、ペントキシフィリン、シルデナフィル、ロリプラム(ホスホジエステラーゼ阻害によりBMPの効果を増強する)からなる群から選択されるベントロモルフィンからなる群から選択される。
別の実施形態において、BMPシグナル伝達および/またはSMAD1/5/8シグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤は、SMURF1(SMURF1の内因性阻害剤)を阻害する。
別の実施形態において、このキットは、本明細書に記載の方法に従って多能性幹細胞、
または複能性幹細胞もしくは前駆細胞からGABA作動性ニューロンを分化するための指示書、およびそのようなGABA作動性ニューロンを含む移植組成物の調製のための指示書をさらに含む。
または複能性幹細胞もしくは前駆細胞からGABA作動性ニューロンを分化するための指示書、およびそのようなGABA作動性ニューロンを含む移植組成物の調製のための指示書をさらに含む。
阻害剤およびアゴニストに加えて、本発明のキットは以下のうちの1つ以上をさらに含み得る:培養培地、少なくとも1つの細胞培養培地サプリメント、1つ以上の遺伝子産物の発現を阻害または増加させるための薬剤、およびニューロン分化のマーカーの発現を検出するための少なくとも1つの薬剤。
好ましい実施形態において、キット内のGFRαアゴニストは、GDNF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NGF、ニュールツリン、アルテミン、ペルセフィン、GDNF受容体内因性アゴニスト、BT18、BT13、NT−3、NT−4、CNTF、GFRα1アゴニスト、XIB4035、Trk活性化剤、TrkAアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、TrkBアゴニスト、N−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、BNN−20BNN−27、デオキシゲズニン、7,8−ジヒドロキシフラボン、4’−ジメチルアミノ−7,8−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、HIOC、LM22A−4、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ノルウォゴニン、R7(薬物)、および7,8,3’−トリヒドロキシフラボンからなる群のいずれか1つから選択される。一実施形態において、GFRαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)、およびペルセフィン(PSPN)からなる群から選択される。好ましい実施形態において、GFRαアゴニストは、GDNFである。
一実施形態において、移植組成物中のアポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az
10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、PD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される。好ましい実施形態において、アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである。
10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、PD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される。好ましい実施形態において、アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである。
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、TALENS、CRISPR−Cas9、またはRNAi等によるGABA作動性ニューロンの遺伝子操作によって、カスパーゼ遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
一実施形態において、キット内の壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、ネクロスルホンアミドのうちの1つ以上から選択される。好ましい実施形態において、壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである。
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、TALEN、CRISPR−Cas9、またはRNAi等によるGABA作動性ニューロンの遺伝子操作によって、壊死性遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
別の実施形態において、本発明の移植組成物は、アマンタジン、メマンチン、ケタミン塩酸塩、ペチジン、トラマドール、メタドン、デキストロプロポキシフェン、亜酸化窒素、デキストロメトルファン、AP5、AP7、CPPene、セルフォテル、エタノール、ミノサイクリン、アトモキセチン、AZD6765、アグマチン、クロロホルム、デキストラロルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、ジゾシルピン、エチシクリジン、ガシクリジン、ケタミン(他の形態)、マグネシウム、メトキセチミン、ニトルメマンチン、PD−137899、フェンシクリジン、ロリシクリジン、テノシクリジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプラドール、エトキサドロール、デキソキサドロール、WMS−2539、NEFA、デルセミン、8A−PDHQ、アプチガネル、HU−211、ヒューペルジンA、イボガイン、レマセミド、リンコフィリン、GABAペンチン、ラパスチネル、NRX−1074、7−クロロキヌレン酸、4−クロロキヌレニン、5,7−ジクロロキノキヌレン酸、キヌレン酸、TK−40、1−アミノシクロプロパンカルボン酸、L−フェニルアラニン、およびキセノンからなる群から選択される1つ以上の興奮毒性誘発アポトーシスまたは壊死の阻害剤;ブピバカイン、リドカイン、コカイン、ラモトリジン、パラアルデヒド、スチリペントール、フェノバルビタール、プリミドン、メチルフェノバルビタール、ペントバルビタール、ベンゾジアゼピン(クロバザム、クロナゼパム、クロラゼプ酸、ジアゼパム、ミダゾラム、ロラゼパム、ニトラゼパム、テマゼパム、ニメタゼパム)臭化カリウム、フェルバメート、カルボキサミド(カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、エスリカルバゼピン)、酢酸、バルプロ酸塩(バルプロ酸、バルプロ酸ナトリウム、ジバルプロエクスナトリウム、ビガバトリン、プロガビド、チアガビン、トピラメート、プレガバリン、エトイン、フェニトイン、メフェニトイン、フォスフェニルトイン、パラメタドン、トリメタジオン、エタジオン、ベカラミド、プリミドン、ブリバラセタム、エチラセタム、レベチラセタム、スレクトラセテム(Slectracetem)、エトスクシミド、フェンスクシミド、メスクシミド、アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド、ゾニサミド、フェネトライド、フェナセミド、バルプロミド、バルノクタミド、ペランパネル、スチリペントール、ピロキシジン(Pyroxidine)、イソフルラン、レボフルラン、CNV1014802、フナピド、プリロカイン、イオントカイン(Iontocaine)、レボブピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、アミロカイン、シクロメチルカイン、α−オイカイン、β−オイカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、オルトカイン、ベンゾカイン、ブタミベ(Butamibe)、クロロプロカイン、ルカイン、ジメトカイン、メプリルカイン、ルカイン、ニトロカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、ノボカイン、プロキシメタカイン、リゾカイン、テトラカイン、ラキサトリジン、三環系抗うつ薬(アミトリプチリン、ノルトリプチリン、DSP−2230、メキシリチン、フルピルチン、ジコノチド、またはアヘンおよびオピオイド、非ステロイド性抗炎症剤、パラセタモール、アセテナリジド、カプサイシン、メントール、大麻およびカニビノイドを含む末梢活性を阻害する任意の薬物から選択される1つ以上の興奮性の阻害剤を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載の治療方法に従って使用される場合、キットを提供する。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の非限定的な実施例によって例示される。いくつかの態様では、実施例に記載される1つ以上の実施形態は、概して、上記の1つ以上の実施形態と組み合わせて適用可能であり得ることを理解されたい。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施態様には限定されない。
実験モデルと対象の詳細
動物
マウスは、ARC(Animal Resource Centre、ARC)から入手した10週齢までの雄NOD.PRKDSCID ARCであり、施設および設備に2週間馴化させた。全ての動物実験は、処置について盲検化されて実施され、治療群への割り付けは、行動データおよび健康状態について盲検化された実験者によって疑似ランダムに行われた。マウスを12時間の明暗サイクルで飼育し、全ての段階で標準飼料および水を自由摂取させた。全てのマウスを特別な無菌施設内に維持し、全ての取り扱いおよび実験には無菌法を使用した。全ての行動は、1人の男性治験責任医師によって行われた。全ての実験は、Animal ethics protocol 938の下、University of Sydney Animal Ethics Committeeによって承認されたものであった。実験デザインおよび記録は、ARRIVEガイドラインによって規定され、Australian National Health and Medical Research Councilガイドラインに準拠する。
動物
マウスは、ARC(Animal Resource Centre、ARC)から入手した10週齢までの雄NOD.PRKDSCID ARCであり、施設および設備に2週間馴化させた。全ての動物実験は、処置について盲検化されて実施され、治療群への割り付けは、行動データおよび健康状態について盲検化された実験者によって疑似ランダムに行われた。マウスを12時間の明暗サイクルで飼育し、全ての段階で標準飼料および水を自由摂取させた。全てのマウスを特別な無菌施設内に維持し、全ての取り扱いおよび実験には無菌法を使用した。全ての行動は、1人の男性治験責任医師によって行われた。全ての実験は、Animal ethics protocol 938の下、University of Sydney Animal Ethics Committeeによって承認されたものであった。実験デザインおよび記録は、ARRIVEガイドラインによって規定され、Australian National Health and Medical Research Councilガイドラインに準拠する。
ショウジョウバエの系統
ハエは、12/12時間の明暗サイクル下、25℃で、標準的なコーンミール、酵母、およびスクロース寒天培地で飼育した。Canton S(BDSC 64349)、painless(EP(2)2451)(BDSC 27895)、ppk−Gal4(BDSC 32078)、UAS−CD8−GFP(BDSC 5130)、UAS−Dcr2、UAS−破傷風毒素(活性、BDSC 28838および不活性BDSC 28839)、UAS−p35(BDSC 5072)、およびUAS−ラミン−GFP(BDSC 7376)のハエは、BDSCライブラリーから入手した。wlll8(VDRC 60000)、UAS−TrpAl−RNAi(VDRC 37249)、UAS−RDL−RNAi(VDRC 41101)、UAS−GRD−RNAi(VDRC 5329)、UAS−D−GABA−B−R1 −RNAi(VDRC 101440)、UAS−D−GABA−B−R2−RNAi(VDRC 110268およびVDRC 1785)、UAS−D−GABA−B−R3−RNAi(VDRC 50176)、UAS−LCCH3−RNAi(VDRC 37408)のハエは、VDRC RNAiライブラリーから入手した。
ハエは、12/12時間の明暗サイクル下、25℃で、標準的なコーンミール、酵母、およびスクロース寒天培地で飼育した。Canton S(BDSC 64349)、painless(EP(2)2451)(BDSC 27895)、ppk−Gal4(BDSC 32078)、UAS−CD8−GFP(BDSC 5130)、UAS−Dcr2、UAS−破傷風毒素(活性、BDSC 28838および不活性BDSC 28839)、UAS−p35(BDSC 5072)、およびUAS−ラミン−GFP(BDSC 7376)のハエは、BDSCライブラリーから入手した。wlll8(VDRC 60000)、UAS−TrpAl−RNAi(VDRC 37249)、UAS−RDL−RNAi(VDRC 41101)、UAS−GRD−RNAi(VDRC 5329)、UAS−D−GABA−B−R1 −RNAi(VDRC 101440)、UAS−D−GABA−B−R2−RNAi(VDRC 110268およびVDRC 1785)、UAS−D−GABA−B−R3−RNAi(VDRC 50176)、UAS−LCCH3−RNAi(VDRC 37408)のハエは、VDRC RNAiライブラリーから入手した。
ヒト多能性幹細胞株
ATCC−BXS0116 hiPSC株を本試験に使用した(ATCC、ACS 1030)。
ATCC−BXS0116 hiPSC株を本試験に使用した(ATCC、ACS 1030)。
実験方法
成体熱侵害受容アッセイ系
成体熱侵害受容アッセイ系は、透明なポリスチレンの試験チャンバー(高さ0.3cm、直径5.5cm、透明なプラスチックの蓋)、可変加熱素子(Model AHP−1200DCP、部品番号9−34KB−1−0A1、ThermoElectric Cooling America(TECA)Corp.、IL,USA)、動画記録設定、および行動分析ソフトウェアから構成される。動画は、上から単一カメラで記録した(Canon EOS,700D、l8−55mmレンズ):動画は、10匹のハエの行動軌跡を含む。
成体熱侵害受容アッセイ系
成体熱侵害受容アッセイ系は、透明なポリスチレンの試験チャンバー(高さ0.3cm、直径5.5cm、透明なプラスチックの蓋)、可変加熱素子(Model AHP−1200DCP、部品番号9−34KB−1−0A1、ThermoElectric Cooling America(TECA)Corp.、IL,USA)、動画記録設定、および行動分析ソフトウェアから構成される。動画は、上から単一カメラで記録した(Canon EOS,700D、l8−55mmレンズ):動画は、10匹のハエの行動軌跡を含む。
ハエ損傷モデル
vannasはさみを使用して、右中脚を腿節部で切断した。ハエは、脚切断時に7日齢であり、1、7、および14日後に試験を行った。10匹のハエの各セットを、氷上で軽度に麻酔してから行動チャンバーに入れた。最初に表面を25℃に設定した。ハエを試験チャンバーに順応させ、次いで、ベースラインの25℃での応答を記録した。表面温度
を2分間25℃に維持し、次いで2分間30℃に上昇させ、次いで同様に2分間35°C、2分間38°C、最終的には1分間42℃まで上昇させた。29fps画像/秒に設定して装置の上に配置したビデオ録画カメラを使用して、ハエの観察を記録した。録画された動画を用いて処置を盲検化して、ジャンプ行動を手動でスコア化した。動く速度は、個々のハエを追跡するCtraxソフトウェアおよびパッケージを使用して測定した。各実験で、3バッチの10匹のハエを試験したところ、3つの独立した群(n=9)で結果が繰り返された。単一比較のためのt検定およびANOVAを用いて統計分析を行った後、多重比較のためのチューキーの事後検定を行った。
vannasはさみを使用して、右中脚を腿節部で切断した。ハエは、脚切断時に7日齢であり、1、7、および14日後に試験を行った。10匹のハエの各セットを、氷上で軽度に麻酔してから行動チャンバーに入れた。最初に表面を25℃に設定した。ハエを試験チャンバーに順応させ、次いで、ベースラインの25℃での応答を記録した。表面温度
を2分間25℃に維持し、次いで2分間30℃に上昇させ、次いで同様に2分間35°C、2分間38°C、最終的には1分間42℃まで上昇させた。29fps画像/秒に設定して装置の上に配置したビデオ録画カメラを使用して、ハエの観察を記録した。録画された動画を用いて処置を盲検化して、ジャンプ行動を手動でスコア化した。動く速度は、個々のハエを追跡するCtraxソフトウェアおよびパッケージを使用して測定した。各実験で、3バッチの10匹のハエを試験したところ、3つの独立した群(n=9)で結果が繰り返された。単一比較のためのt検定およびANOVAを用いて統計分析を行った後、多重比較のためのチューキーの事後検定を行った。
電気生理学的記録
氷を用いてハエを麻酔し、腹側を下にしてワックス支持体に固定した。刺激器(定電圧型刺激アイソレータ、モデルDS2A−Mk.II、Digitimer)に接続された2本のタングステン刺激電極を両眼に配置して巨大線維系(GFS)を活性化した。同様に、2本のタングステン刺激電極を右(同側)または左(対側)脚のフェルミスセグメント(fermis segment)の中央にも配置して、脚を通るGFSの侵害受容逃避を活性化した。目を通るGFSの場合、最大刺激強度15V未満でハエに20回の単一刺激を与えた。脚刺激による侵害受容逃避の場合、最大刺激強度は60V未満であった。全ての実験で、刺激持続時間を10μsで一定に維持した。タングステン接地電極をハエ腹部に配置した。(卓上電源PSU 130−LASCARを用いて)水酸化ナトリウム5M中で研磨したタングステン記録電極を、ハエの左背面の背縦走筋(DLM)線維に配置して、シナプス後電位(PSP)を記録した。各群の少なくとも9匹のハエのPSPをMicroelectrode AC Amplifier、モデル1800(A−M System)で記録し、0.5kHzでフィルタリングし、1kHzでデジタル化した。PSPは、AxoGraphソフトウェア(AxoGraph Scientific、Berkeley,CA)を使用して分析した。脚を刺激することによって測定された反応が中枢神経系によって媒介されたかどうかを判定するために、ハエの頭部を除去して、記録のために同様の設定を用いた。マン・ホイットニーの順位和検定を用いて反応潜時および持続時間の差を決定した。
氷を用いてハエを麻酔し、腹側を下にしてワックス支持体に固定した。刺激器(定電圧型刺激アイソレータ、モデルDS2A−Mk.II、Digitimer)に接続された2本のタングステン刺激電極を両眼に配置して巨大線維系(GFS)を活性化した。同様に、2本のタングステン刺激電極を右(同側)または左(対側)脚のフェルミスセグメント(fermis segment)の中央にも配置して、脚を通るGFSの侵害受容逃避を活性化した。目を通るGFSの場合、最大刺激強度15V未満でハエに20回の単一刺激を与えた。脚刺激による侵害受容逃避の場合、最大刺激強度は60V未満であった。全ての実験で、刺激持続時間を10μsで一定に維持した。タングステン接地電極をハエ腹部に配置した。(卓上電源PSU 130−LASCARを用いて)水酸化ナトリウム5M中で研磨したタングステン記録電極を、ハエの左背面の背縦走筋(DLM)線維に配置して、シナプス後電位(PSP)を記録した。各群の少なくとも9匹のハエのPSPをMicroelectrode AC Amplifier、モデル1800(A−M System)で記録し、0.5kHzでフィルタリングし、1kHzでデジタル化した。PSPは、AxoGraphソフトウェア(AxoGraph Scientific、Berkeley,CA)を使用して分析した。脚を刺激することによって測定された反応が中枢神経系によって媒介されたかどうかを判定するために、ハエの頭部を除去して、記録のために同様の設定を用いた。マン・ホイットニーの順位和検定を用いて反応潜時および持続時間の差を決定した。
免疫組織化学的研究および画像化
ハエの脳およびVNCに対する免疫蛍光法を記載されるように行った。抗GABA抗体(A2052、SigmaAldrich)を1:500の希釈率で使用し、nc82抗体(Developmental studies Hybridoma Bank)を1:75の希釈率で使用し、切断カスパーゼ−3抗体(Aspl75、Cell Signaling Technology)を1:500の希釈率で使用した。二次抗体(Thermo FisherのAlexa 488、Alexa 555およびAlexa
647)は、1/500の希釈率で使用した。0.6μm間隔で40X NA 1.30油浸対物レンズを備えたLeica DMI 6000 SP8共焦点顕微鏡を使用して共焦点切片を撮像した。上面写真は、ImageJ(NIH;http://rsbwebov/i]/)で画像スタックの最大投影を行うことにより作製し、接線方向の側面画像は、ImageJおよびLeica Application Suite X,LASXソフトウェアを使用して作製した。ImageJの3Dオブジェクトカウンタ機能を使用してGABA焦点を定量化した。脚の画像化は2.34μm間隔の16X/0.5IMM対物レンズで行い、附節領域の画像は、同じ共焦点顕微鏡の、0.6μm間隔の40X油浸対物レンズで取得した。ImageJを使用して、脚で保持された樹状突起の長さを測定することにより、脚のppk+ニューロンの神経障害を評価した。
ハエの脳およびVNCに対する免疫蛍光法を記載されるように行った。抗GABA抗体(A2052、SigmaAldrich)を1:500の希釈率で使用し、nc82抗体(Developmental studies Hybridoma Bank)を1:75の希釈率で使用し、切断カスパーゼ−3抗体(Aspl75、Cell Signaling Technology)を1:500の希釈率で使用した。二次抗体(Thermo FisherのAlexa 488、Alexa 555およびAlexa
647)は、1/500の希釈率で使用した。0.6μm間隔で40X NA 1.30油浸対物レンズを備えたLeica DMI 6000 SP8共焦点顕微鏡を使用して共焦点切片を撮像した。上面写真は、ImageJ(NIH;http://rsbwebov/i]/)で画像スタックの最大投影を行うことにより作製し、接線方向の側面画像は、ImageJおよびLeica Application Suite X,LASXソフトウェアを使用して作製した。ImageJの3Dオブジェクトカウンタ機能を使用してGABA焦点を定量化した。脚の画像化は2.34μm間隔の16X/0.5IMM対物レンズで行い、附節領域の画像は、同じ共焦点顕微鏡の、0.6μm間隔の40X油浸対物レンズで取得した。ImageJを使用して、脚で保持された樹状突起の長さを測定することにより、脚のppk+ニューロンの神経障害を評価した。
HiPSCの培養およびGABA介在ニューロンまたは感覚ニューロンへの分化
mTESRl培地(Stem Cell technologies)中のマトリゲルでコーティングした表面上にHiPSCを維持した。
mTESRl培地(Stem Cell technologies)中のマトリゲルでコーティングした表面上にHiPSCを維持した。
Kim TG et al.,Stem Cells,2014に記載されるプロトコルを適合させたものを用いて、HiPSCをGABA介在ニューロンに分化させた。簡潔に述べると、hiPSCをTripLE(Invitrogen)で解離し、超低接着表面を有する結合プレート中の懸濁液で2週間増殖させて胚様体(EB)を形成させた。神経誘導のために、細胞をSMAD阻害剤LDN193189(100nM、0日目〜14日目)およびSB431542(10μM、0日目〜10日目)で処理した。MGE(内側基底核隆起)誘導ために、細胞をWnt阻害剤IWP2(5μM、0日目〜7日目)、SHH活性化剤SAG(Smoothenedアゴニスト0.1μM、0日目〜21日目)、および増殖因子FGF8(100ng/mL、8日目〜21日目)で処理した。分化の初日にのみ、ROCK阻害剤を加える。懸濁液中に2週間置いた後、EBをポリオルニチン(PLO)およびフィブロネクチン(FN)でコーティングした表面に移した。21日目に、EBを解離し、将来的な分化および成熟のために10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、および2.5μM γセクレターゼ阻害剤DAPTを含む分化培地上のPLO/FNコーティングプレートに再播種した。
マイトマイシンCを省略したことを除いて、Young GT et al.,Molecular Therapy,2014に記載されるプロトコルに従って、感覚ニューロンでHiPSCを分化させた。
移植のための細胞調製
HiPSC由来GABA介在ニューロンを分化25日目に解離し、10ng/mLのGDNF、20μMのBoc−Asp(OMe)フルオロメチルケトン(広域カスパーゼ阻害剤−アポトーシス阻害剤)および50nMのネクロスルホンアミド(MLKL阻害剤−壊死阻害剤)を含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)から作製された注入培地に、最終濃度100,000細胞/マイクロリットルで再懸濁した。
HiPSC由来GABA介在ニューロンを分化25日目に解離し、10ng/mLのGDNF、20μMのBoc−Asp(OMe)フルオロメチルケトン(広域カスパーゼ阻害剤−アポトーシス阻害剤)および50nMのネクロスルホンアミド(MLKL阻害剤−壊死阻害剤)を含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)から作製された注入培地に、最終濃度100,000細胞/マイクロリットルで再懸濁した。
オープンフィールド
マウスを、飼育ケージの中で、2つの上向きの照明光源で均一に照らされた暗室に馴化させた。携帯電話の露出計(Motorola)により、ボックスの各コーナーの光を測定した。各試験機会にマウスの行動を5分間記録した。次いで、Topscan行動分析ソフトウェアにより行動を分析した。
マウスを、飼育ケージの中で、2つの上向きの照明光源で均一に照らされた暗室に馴化させた。携帯電話の露出計(Motorola)により、ボックスの各コーナーの光を測定した。各試験機会にマウスの行動を5分間記録した。次いで、Topscan行動分析ソフトウェアにより行動を分析した。
SNI改変Bassoマウスのスケール
Bassoの改変形態を用いて移植後の歩行運動を評価した。端的に述べると、マウスを足首の動き(3匹、動きなし=0、時折動く=1、頻繁に動く=2、常に動く=3)、足底接地((3匹、接地しない=0、時折接地する=1、頻繁に接地する=2、常に接地する=3)、協調((3匹、協調しない=0、時折協調する=1、頻繁に協調する=2、常に=3)、および足の回転(平行=2、回転=1、歩行せず=0)についてスコア化した。マウスは、動画から両側でスコア化した。
Bassoの改変形態を用いて移植後の歩行運動を評価した。端的に述べると、マウスを足首の動き(3匹、動きなし=0、時折動く=1、頻繁に動く=2、常に動く=3)、足底接地((3匹、接地しない=0、時折接地する=1、頻繁に接地する=2、常に接地する=3)、協調((3匹、協調しない=0、時折協調する=1、頻繁に協調する=2、常に=3)、および足の回転(平行=2、回転=1、歩行せず=0)についてスコア化した。マウスは、動画から両側でスコア化した。
von Frey
マウスを3つの別々の日に馴化させた。次いで、疼痛のベースライン評価のために、マウスを異なる3日間で試験した。ベースライン閾値は、試験の後半2日間の閾値の平均として定義されている。von Freyフィラメントを足蹠の腓腹部分に押し当て、各刺激閾値(0.04〜2.0g)で10回適用した。100%の反応に達するまで各フィラメントに対する反応を記録した。試験の50%に反応を引き起こす最小フィラメントとして報告される。マウスは、神経部分損傷の6日後、およびその後は1週間ごとに評価した。
マウスを3つの別々の日に馴化させた。次いで、疼痛のベースライン評価のために、マウスを異なる3日間で試験した。ベースライン閾値は、試験の後半2日間の閾値の平均として定義されている。von Freyフィラメントを足蹠の腓腹部分に押し当て、各刺激閾値(0.04〜2.0g)で10回適用した。100%の反応に達するまで各フィラメントに対する反応を記録した。試験の50%に反応を引き起こす最小フィラメントとして報告される。マウスは、神経部分損傷の6日後、およびその後は1週間ごとに評価した。
アセトン
1mlのインスリン注射器からの約30ulの放出を用いて、マウス後足にアセトンの液滴を塗布した。1分間の間に舐めるおよび噛むのに費やした時間を記録した。
1mlのインスリン注射器からの約30ulの放出を用いて、マウス後足にアセトンの液滴を塗布した。1分間の間に舐めるおよび噛むのに費やした時間を記録した。
神経部分損傷
0.8L/分の酸素で3%イソフルランを用いてマウスを麻酔し、続いて維持のために2%イソフルランで麻酔した。麻酔の深さは、つま先反射および眼瞼反射の不在によって確認した。角膜への損傷を防ぐために眼には潤滑剤を与えた。皮膚をメスで切開し、筋肉を鈍的に切開して左坐骨神経を分離した。神経の脛骨および総腓骨部分をエチロン4−0ナイロン縫合糸材料(Johnson and Johnson International)で結紮し、腓腹神経に触れないように注意して神経の一部を除去した。次いで、創傷クリップ(Reflex、FineScience Tools)で切開を閉じた。皮下注射により、NOD SCIDマウスに1日0.9%の生理食塩水(Pfizer)中2.5mg/kgのエンロフロキサシン(Baytril、Bayer)を7日間与えた。運動行動を4〜5日後に評価し、疼痛行動を6日目に評価した。
0.8L/分の酸素で3%イソフルランを用いてマウスを麻酔し、続いて維持のために2%イソフルランで麻酔した。麻酔の深さは、つま先反射および眼瞼反射の不在によって確認した。角膜への損傷を防ぐために眼には潤滑剤を与えた。皮膚をメスで切開し、筋肉を鈍的に切開して左坐骨神経を分離した。神経の脛骨および総腓骨部分をエチロン4−0ナイロン縫合糸材料(Johnson and Johnson International)で結紮し、腓腹神経に触れないように注意して神経の一部を除去した。次いで、創傷クリップ(Reflex、FineScience Tools)で切開を閉じた。皮下注射により、NOD SCIDマウスに1日0.9%の生理食塩水(Pfizer)中2.5mg/kgのエンロフロキサシン(Baytril、Bayer)を7日間与えた。運動行動を4〜5日後に評価し、疼痛行動を6日目に評価した。
インビボ椎弓切除術および脊髄細胞注射
マウスを、腹腔内注射によりケタミン(Ketamil)/キシラジンカクテル(100mg/8mg/kg)で麻酔した。麻酔の深さは、つま先のピンチと眼瞼反射の不在によって定期的に監視される。呼吸速度、体温および粘膜再灌流も監視した。低体温および低酸素をそれぞれ防止するために、手技中に37℃の加熱プレートで体温を維持し、酸素0.8〜1L/分を与えた。背面に沿って切開を行い、眼科用vannasばね式はさみ(World Precision instruments)を使用して、慎重な椎弓根切開によりL1を除去する。後中心の脊髄動脈を目印として用いて損傷と同側に、定位固定装置(Kopf)と、カスタム設計された針(ポイントスタイル4および30度の角度を有する29ゲージ、1.5インチ長)を備えたハミルトンシリンジとを使用して、腰椎後角を標的とする2μlの注射を行った。簡潔に述べると、デジタル定位監視デバイスを使用して、硬膜が最初に穿刺されるまで針を前進させ、次いで下げた。2μlの溶液をゆっくりと注入し、流出を防止するために5分間所定の位置に留置した。浅筋膜をVicryl 5−0逆三角針縫合糸(ジョンソンおよびジョンソン)を使用して縫合し、2〜3個の創傷クリップで切開を閉じた。ブピバカイン8mg/kg(Pfizer)を注射し、創傷縁の周囲で皮下/皮膚洗浄し、エンロフロキサシンを10日間毎日与えた。手術の6日後に、疼痛行動を最初に評価した。実験期間中、マウスを毎日監視した。手技の直後に、40℃に加温した生理食塩水(Pfizer)をマウスに与えた。手技後2時間ごとにマウスを監視し、完全回復するまで加温した。
マウスを、腹腔内注射によりケタミン(Ketamil)/キシラジンカクテル(100mg/8mg/kg)で麻酔した。麻酔の深さは、つま先のピンチと眼瞼反射の不在によって定期的に監視される。呼吸速度、体温および粘膜再灌流も監視した。低体温および低酸素をそれぞれ防止するために、手技中に37℃の加熱プレートで体温を維持し、酸素0.8〜1L/分を与えた。背面に沿って切開を行い、眼科用vannasばね式はさみ(World Precision instruments)を使用して、慎重な椎弓根切開によりL1を除去する。後中心の脊髄動脈を目印として用いて損傷と同側に、定位固定装置(Kopf)と、カスタム設計された針(ポイントスタイル4および30度の角度を有する29ゲージ、1.5インチ長)を備えたハミルトンシリンジとを使用して、腰椎後角を標的とする2μlの注射を行った。簡潔に述べると、デジタル定位監視デバイスを使用して、硬膜が最初に穿刺されるまで針を前進させ、次いで下げた。2μlの溶液をゆっくりと注入し、流出を防止するために5分間所定の位置に留置した。浅筋膜をVicryl 5−0逆三角針縫合糸(ジョンソンおよびジョンソン)を使用して縫合し、2〜3個の創傷クリップで切開を閉じた。ブピバカイン8mg/kg(Pfizer)を注射し、創傷縁の周囲で皮下/皮膚洗浄し、エンロフロキサシンを10日間毎日与えた。手術の6日後に、疼痛行動を最初に評価した。実験期間中、マウスを毎日監視した。手技の直後に、40℃に加温した生理食塩水(Pfizer)をマウスに与えた。手技後2時間ごとにマウスを監視し、完全回復するまで加温した。
灌流
深く麻酔したマウスを、神経損傷の4週間後に屠殺した。胸部を開き、心臓を露出させ、翼付カテーテル(Griener Bio−one)を左心室に挿入した。シリンジドライバを使用して、25mlの0.1Mリン酸緩衝液(PB、pH7.4、Sigma)、続いて0.1M PB中25mlの4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA、Sigma)をマウスに灌流した。脊椎組織を注射部位まで少なくとも2mm吻側および尾側で除去した。組織をPFA中で2〜4時間固定した後、30%(w/v)スクロース中で一晩凍結保護した。得られた組織をクライオモールドに適合するように切断し、O.C.T(VWR)に包埋して瞬間凍結した。クライオスタット(Thermo Fisher)で脊髄を16〜20μmに薄片化した。
深く麻酔したマウスを、神経損傷の4週間後に屠殺した。胸部を開き、心臓を露出させ、翼付カテーテル(Griener Bio−one)を左心室に挿入した。シリンジドライバを使用して、25mlの0.1Mリン酸緩衝液(PB、pH7.4、Sigma)、続いて0.1M PB中25mlの4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA、Sigma)をマウスに灌流した。脊椎組織を注射部位まで少なくとも2mm吻側および尾側で除去した。組織をPFA中で2〜4時間固定した後、30%(w/v)スクロース中で一晩凍結保護した。得られた組織をクライオモールドに適合するように切断し、O.C.T(VWR)に包埋して瞬間凍結した。クライオスタット(Thermo Fisher)で脊髄を16〜20μmに薄片化した。
抗体染色
細胞を室温で10%ホルマリン(Sigma−Aldrich、HT5011)で15分間固定し、列挙した抗体および希釈液を使用して、特定のニューロンマーカーについて
染色した。適切なAlexa Fluor二次抗体(Thermo Fisher Scientific Life Sciences、1:500)を使用し、Hoechst 33342(1:5,000、Thermo Fisher Scientific
Life Sciencesカタログ番号H3570)で核を可視化した。
細胞を室温で10%ホルマリン(Sigma−Aldrich、HT5011)で15分間固定し、列挙した抗体および希釈液を使用して、特定のニューロンマーカーについて
染色した。適切なAlexa Fluor二次抗体(Thermo Fisher Scientific Life Sciences、1:500)を使用し、Hoechst 33342(1:5,000、Thermo Fisher Scientific
Life Sciencesカタログ番号H3570)で核を可視化した。
脊髄染色のために、凍結切片を20分間室温に平衡化した。次いで、切片をPBS中で5分間3回すすいだ。スライドを室温のブロッキング溶液中で1時間ブロックした(PBS、ウシ血清アルブミン(2%)、および0.3%のTriton×100)。一次抗体をブロック溶液中で希釈して添加し、加湿チャンバー内で一晩、4℃でインキュベートした。列挙した希釈液に適切な二次抗体を添加した。最後に、スライドをPBS中でそれぞれ15分間3回洗浄し、退色防止効果を有するマウント液Vectashieldとともにカバーガラスで覆った。
RNA核外抽出
Favorgen Blood/Cultured Cell Total RNAキット(Favorgen Biotech Corp.)を使用することにより、全RNAをhiPSCおよびGABA作動性ニューロン培養物から回収した。On−Column DNase I Digestion Set(Sigma)を使用して溶液中のDNaseでRNAを処理し、試料当たり40UのRibosafe RNase阻害剤(Bioline)で維持した。RNAの質および量を、吸光度分光法(Nanodrop、Thermo Fisher Scientific Life Sciences)、Agilentバイオアナライザー、およびアガロースゲル電気泳動によって評価した。
Favorgen Blood/Cultured Cell Total RNAキット(Favorgen Biotech Corp.)を使用することにより、全RNAをhiPSCおよびGABA作動性ニューロン培養物から回収した。On−Column DNase I Digestion Set(Sigma)を使用して溶液中のDNaseでRNAを処理し、試料当たり40UのRibosafe RNase阻害剤(Bioline)で維持した。RNAの質および量を、吸光度分光法(Nanodrop、Thermo Fisher Scientific Life Sciences)、Agilentバイオアナライザー、およびアガロースゲル電気泳動によって評価した。
qPCR
定量化後、qRT−PCRのためのSuperscript III First−Strand Synthesis SuperMix(Thermo Fisher Scientifical Life Scienciences)を用いて1μgのRNAを逆転写した。SYBR Select Master Mixを使用して、合計2μlのcDNAをqPCRに用いた。リアルタイムPCRは、LightCycler 480 Instrument II (Roche Life Science)で実行した。全ての遺伝子のためのサイクリングプログラムは以下の通りである:
−1.95℃ 10’初期変性ステップ
−2.95℃ 30’’
−3.58℃ 30’’
−4.72℃ 30’‘2に移動して35サイクル
−5.融解曲線分析。
定量化後、qRT−PCRのためのSuperscript III First−Strand Synthesis SuperMix(Thermo Fisher Scientifical Life Scienciences)を用いて1μgのRNAを逆転写した。SYBR Select Master Mixを使用して、合計2μlのcDNAをqPCRに用いた。リアルタイムPCRは、LightCycler 480 Instrument II (Roche Life Science)で実行した。全ての遺伝子のためのサイクリングプログラムは以下の通りである:
−1.95℃ 10’初期変性ステップ
−2.95℃ 30’’
−3.58℃ 30’’
−4.72℃ 30’‘2に移動して35サイクル
−5.融解曲線分析。
プライマー配列は以下の通りである:
GAD1 FWD:CACAAGGCGACTCTTCTCTTC_
GAD1 RVR:GCGGACCCCAATACCACTAAC
GAD2 FWD:TTTTGGTCTTTCGGGTCGGAA
GAD2 RVR:TTCTCGGCGTCTCCGTAGAG
VGAT FWD:ACGTCCGTGTCCAACAAGTC
VGAT RVR:AAAGTCGAGGTCGTCGCAAT
SST FWD ACCCAACCAGACGGAGAATGA
SST RVR GCCGGGTTTGAGTTAGCAGA
SOX 6 FWD:GGATGCAATGACCCAGGATTT
SOX6 RVR:GGATGCAATGACCCAGGATTT
カルレチニンFWD :ACTTTGACGCAGACGGAAATG
カルレチニンRVR :GAAGTTCTCTTCGGTTGGCAG
カルビンジンFWD :GGCTCCATTTCGACGCTGA
カルビンジンRVR :GCCCATACTGATCCACAAAAGTT_
TUBB3 FWD:GGCCAAGGGTCACTACACG
TUBB3 RVR:GCAGTCGCAGTTTTCACACTC
LHX6 FWD:GGGCGCGTCATAAAAAGCAC
LHX6 RVR:TGAACGGGGTGTAGTGGATGT
OLIG2 FWD:CCAGAGCCCGATGACCTTTTT
OLIG2 RVR:CACTGCCTCCTAGCTTGTCC
NKX2.1 FWD:AGCACACGACTCCGTTCTC
NKX2.1 RVR:GCCCACTTTCTTGTAGCTTTCC
PAX6 FWD:TGGGCAGGTATTACGAGACTG
PAX6 RVR:ACTCCCGCTTATACTGGGCTA
GAD1 FWD:CACAAGGCGACTCTTCTCTTC_
GAD1 RVR:GCGGACCCCAATACCACTAAC
GAD2 FWD:TTTTGGTCTTTCGGGTCGGAA
GAD2 RVR:TTCTCGGCGTCTCCGTAGAG
VGAT FWD:ACGTCCGTGTCCAACAAGTC
VGAT RVR:AAAGTCGAGGTCGTCGCAAT
SST FWD ACCCAACCAGACGGAGAATGA
SST RVR GCCGGGTTTGAGTTAGCAGA
SOX 6 FWD:GGATGCAATGACCCAGGATTT
SOX6 RVR:GGATGCAATGACCCAGGATTT
カルレチニンFWD :ACTTTGACGCAGACGGAAATG
カルレチニンRVR :GAAGTTCTCTTCGGTTGGCAG
カルビンジンFWD :GGCTCCATTTCGACGCTGA
カルビンジンRVR :GCCCATACTGATCCACAAAAGTT_
TUBB3 FWD:GGCCAAGGGTCACTACACG
TUBB3 RVR:GCAGTCGCAGTTTTCACACTC
LHX6 FWD:GGGCGCGTCATAAAAAGCAC
LHX6 RVR:TGAACGGGGTGTAGTGGATGT
OLIG2 FWD:CCAGAGCCCGATGACCTTTTT
OLIG2 RVR:CACTGCCTCCTAGCTTGTCC
NKX2.1 FWD:AGCACACGACTCCGTTCTC
NKX2.1 RVR:GCCCACTTTCTTGTAGCTTTCC
PAX6 FWD:TGGGCAGGTATTACGAGACTG
PAX6 RVR:ACTCCCGCTTATACTGGGCTA
RNA配列決定
Novogeneは、同社の標準的なインハウス方法に従ってRNA配列決定を行った。IlluminaのNEBNext Ultra RNAライブラリー調製キットを使用してライブラリー調製を行った。HiSeq PE Cluster Kit cBot−HS(Illumina)を使用してインデックスコード化試料をクラスタリングし、得られたライブラリーをIllumine hiseqプラットフォーム上で配列決定し、125/150BP対のペアエンドリードを生成した。
Novogeneは、同社の標準的なインハウス方法に従ってRNA配列決定を行った。IlluminaのNEBNext Ultra RNAライブラリー調製キットを使用してライブラリー調製を行った。HiSeq PE Cluster Kit cBot−HS(Illumina)を使用してインデックスコード化試料をクラスタリングし、得られたライブラリーをIllumine hiseqプラットフォーム上で配列決定し、125/150BP対のペアエンドリードを生成した。
RNA配列決定分析
アダプターを含むリード、ポリ−N、および低品質リードを除去することによりクリーンリードを得た。全ての下流データ解析は、クリーンデータに対して行った。Bowtie v2.2.3を使用してリファレンスゲノムのインデックスを生成し、TopHat
v2.0.12を使用してペアエンドのクリーンリードをリファレンスゲノムに整列させた。HTSeq v0.6.1を使用して、各遺伝子にマッピングされたリード数をカウントし、次いで、遺伝子長および遺伝子にマッピングされたリードカウント数に基づいてFPKMを計算した。生リードカウントをRのDESeq2パッケージに入力し、差異発現を評価した。ヒートマップによる視覚化のために、FPKMを最大値FPKMに正規化した。得られたp値をBenjamani Hochbergによって調整し、0.05未満の調整p値を有する遺伝子を差次的に発現されたものとして評価した。
アダプターを含むリード、ポリ−N、および低品質リードを除去することによりクリーンリードを得た。全ての下流データ解析は、クリーンデータに対して行った。Bowtie v2.2.3を使用してリファレンスゲノムのインデックスを生成し、TopHat
v2.0.12を使用してペアエンドのクリーンリードをリファレンスゲノムに整列させた。HTSeq v0.6.1を使用して、各遺伝子にマッピングされたリード数をカウントし、次いで、遺伝子長および遺伝子にマッピングされたリードカウント数に基づいてFPKMを計算した。生リードカウントをRのDESeq2パッケージに入力し、差異発現を評価した。ヒートマップによる視覚化のために、FPKMを最大値FPKMに正規化した。得られたp値をBenjamani Hochbergによって調整し、0.05未満の調整p値を有する遺伝子を差次的に発現されたものとして評価した。
フローサイトメトリー分析
細胞をTryPLE(Invitrogen)で解離させ、10%ホルマリン(Sigma−Aldrich、HT5011)中で20分間固定し、ブロッキング緩衝液(3%
BSAおよび0.3%Triton X100を含むPBS)とともにインキュベートした。ブロックされた細胞を、ブロッキング緩衝液中で30分間、一次抗体(共役した抗β3チューブリン抗体−Alexa Fluor 488、Abcamまたは抗GAD65抗体、Abcam)とともにインキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、さらに30分間、Alexa Fluor 594と共役した二次抗体(Abcam)とともにインキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を3% BSAでPBS中に再懸濁し、分析した。GAD−65用のマウスIgGアイソタイプ対照抗体を同じ条件下で使用した。非標識対照も対照として使用した。FACSAria(BD Biosciences)を使用して、取得した10,000の事象を収集した。Flowjoソフトウェアを使用して生データを分析した。
細胞をTryPLE(Invitrogen)で解離させ、10%ホルマリン(Sigma−Aldrich、HT5011)中で20分間固定し、ブロッキング緩衝液(3%
BSAおよび0.3%Triton X100を含むPBS)とともにインキュベートした。ブロックされた細胞を、ブロッキング緩衝液中で30分間、一次抗体(共役した抗β3チューブリン抗体−Alexa Fluor 488、Abcamまたは抗GAD65抗体、Abcam)とともにインキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、さらに30分間、Alexa Fluor 594と共役した二次抗体(Abcam)とともにインキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を3% BSAでPBS中に再懸濁し、分析した。GAD−65用のマウスIgGアイソタイプ対照抗体を同じ条件下で使用した。非標識対照も対照として使用した。FACSAria(BD Biosciences)を使用して、取得した10,000の事象を収集した。Flowjoソフトウェアを使用して生データを分析した。
ELISA
DIV25のGABA作動性ニューロンを培地中に3日間放置した。培地を吸引し、ラ
ットγアミノ酪酸のELISA(MyBioSource)を用いて試験した。GraphPad Prismを使用した4ポイントのロジスティック回帰を用いて、製造業者の指示に従って吸光度値を変換した。
DIV25のGABA作動性ニューロンを培地中に3日間放置した。培地を吸引し、ラ
ットγアミノ酪酸のELISA(MyBioSource)を用いて試験した。GraphPad Prismを使用した4ポイントのロジスティック回帰を用いて、製造業者の指示に従って吸光度値を変換した。
GABA対誘導多能性幹細胞プロテオミクス
GABAニューロンは、本明細書に記載される方法によって誘導した。DIV25に、それらを氷冷リン酸緩衝生理食塩水中で3回穏やかに洗浄することによって溶解した。変性溶解緩衝液(4% SDS、20mMリン酸ナトリウム6.0、100mM NaCl、完全プロテアーゼ阻害剤(EDTA不含、Roche)、10mM NaF、10mMピロリン酸ナトリウム、2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、60mM B−グリセロリン酸)をウェルに添加し、細胞スクレーパーを使用して掻き取り、試料を65℃で10分間加熱した。次いで、試料をQ.Sonica 800で超音波処理した(30秒の超音波処理オン/オフサイクル、合計10分間の超音波処理、18℃で80%の振幅)。
GABAニューロンは、本明細書に記載される方法によって誘導した。DIV25に、それらを氷冷リン酸緩衝生理食塩水中で3回穏やかに洗浄することによって溶解した。変性溶解緩衝液(4% SDS、20mMリン酸ナトリウム6.0、100mM NaCl、完全プロテアーゼ阻害剤(EDTA不含、Roche)、10mM NaF、10mMピロリン酸ナトリウム、2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、60mM B−グリセロリン酸)をウェルに添加し、細胞スクレーパーを使用して掻き取り、試料を65℃で10分間加熱した。次いで、試料をQ.Sonica 800で超音波処理した(30秒の超音波処理オン/オフサイクル、合計10分間の超音波処理、18℃で80%の振幅)。
タンパク質の消化、ペプチド精製および定量化−トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP)を添加することによって、タンパク質(100ug)を最終濃度10mMに還元した。ThermoMixer−C (Eppendorf)内で、タンパク質試料を1000rpmで10分間65℃に加熱した。室温に冷却してから、N−エチルマレイミド(NEM)を最終濃度で画分に添加し、室温で30分間インキュベートさせた。画分を緩衝液交換し、以前に記載されたSP3法を用いてトリプシンで消化した(Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.Hughes CS,Foehr S,Garfield DA,Furlong EE, Steinmetz LM,Krijgsveld J.Mol Syst Biol.2014 Oct 30;10:757.doi:10.15252/msb.20145625)。.
LC−MS/MSおよびスペクトルの解析
Thermo Fisher Scientific EasyLC 1000 UHPLCを使用して、4%(体積/体積)ギ酸中のペプチド(注入体積3μL、約1000ngのペプチド)を、1.9μmの粒子を含む50cm×75μmの逆相C18カラム(Dr.Maisch GmbH)に一体型エミッタで直接注入した。ペプチドは、300nL分−1の流量で90分間にわたって5%アセトニトリルから30%アセトニトリルへの勾配で分離した。ペプチドを+2.3kVでエレクトロスプレーイオン化によりイオン化した。HCDフラグメンテーションを使用して、Q−Exactive質量分析計(Thermo Fisher Scientific)上でタンデム質量分析を実行した。使用したデータ依存的取得法により、勾配の任意の1点において、上位20個の最も豊富なイオンのMS/MSスペクトルを取得した。全ての生のMSデータは、PRIDEパートナーリポジトリを介して、データセット識別子PXD00XXXX、ユーザ名:reviewerXXXX@ebi.ac.uk、パスワード:XXXXXで、ProteomeXchange Consortium(http://proteomecentral.proteomexchange.org)に寄託した。質量分析器によって生成された生データを、MaxQuantを使用して分析した。ペプチドおよびタンパク質レベルの同定はどちらも、標的−デコイに基づく戦略を用いて1%の偽発見率に設定した。ペプチド同定のために検索エンジンに供給されたデータベースは、2017年9月30日にダウンロードされたHuman Swissprotデータベースであった。前駆体イオンの質量公差を4.5ppmに設定し、MS/MS質量公差を20 ppmに設定した。酵素をトリプシンに設定し(C末端からR/Kへの切断)、ミス切断は最大2回とした。N/Qの脱アミド化、Mの酸化、N末端ピロ−E/Q、タンパク質N末端アセチル化を可変修飾として設定した。C上のN−エチルマレイミドを固定修飾として検索した。MaxQuantからの出力は、上記と同じ識別子でProteomeXchange Co
nsortiumにアップロードされている。
Thermo Fisher Scientific EasyLC 1000 UHPLCを使用して、4%(体積/体積)ギ酸中のペプチド(注入体積3μL、約1000ngのペプチド)を、1.9μmの粒子を含む50cm×75μmの逆相C18カラム(Dr.Maisch GmbH)に一体型エミッタで直接注入した。ペプチドは、300nL分−1の流量で90分間にわたって5%アセトニトリルから30%アセトニトリルへの勾配で分離した。ペプチドを+2.3kVでエレクトロスプレーイオン化によりイオン化した。HCDフラグメンテーションを使用して、Q−Exactive質量分析計(Thermo Fisher Scientific)上でタンデム質量分析を実行した。使用したデータ依存的取得法により、勾配の任意の1点において、上位20個の最も豊富なイオンのMS/MSスペクトルを取得した。全ての生のMSデータは、PRIDEパートナーリポジトリを介して、データセット識別子PXD00XXXX、ユーザ名:reviewerXXXX@ebi.ac.uk、パスワード:XXXXXで、ProteomeXchange Consortium(http://proteomecentral.proteomexchange.org)に寄託した。質量分析器によって生成された生データを、MaxQuantを使用して分析した。ペプチドおよびタンパク質レベルの同定はどちらも、標的−デコイに基づく戦略を用いて1%の偽発見率に設定した。ペプチド同定のために検索エンジンに供給されたデータベースは、2017年9月30日にダウンロードされたHuman Swissprotデータベースであった。前駆体イオンの質量公差を4.5ppmに設定し、MS/MS質量公差を20 ppmに設定した。酵素をトリプシンに設定し(C末端からR/Kへの切断)、ミス切断は最大2回とした。N/Qの脱アミド化、Mの酸化、N末端ピロ−E/Q、タンパク質N末端アセチル化を可変修飾として設定した。C上のN−エチルマレイミドを固定修飾として検索した。MaxQuantからの出力は、上記と同じ識別子でProteomeXchange Co
nsortiumにアップロードされている。
タンパク質アッセイ
製造業者(Thermo Scientific)の指示に従ってビシンコニン酸タンパク質アッセイを使用して、試料タンパク質濃度を決定した。
製造業者(Thermo Scientific)の指示に従ってビシンコニン酸タンパク質アッセイを使用して、試料タンパク質濃度を決定した。
ウェスタンブロット
抽出されたヒト幹細胞タンパク質およびラダー10μg(着色済みSeeBlue Plus 2、ThermoFisherカタログ番号LC5925)を8〜12%(w/v)SDS−ポリアクリルアミドゲル(S5)で電気泳動させた(1時間、150V)。次いで、ニトロセルロース膜(Li−Cor)に35Vで1.5時間、分離したタンパク質のウェット式転写を行い、次いでPBS中の5%(w/v)乾燥脱脂乳中でブロックし、5% BSA、0.1% PBS Tween−20、および0.02%アジ化ナトリウムブロッキング緩衝液(TableXXX)に溶解した一次抗体中、4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ニトロセルロース膜を、適切なフルオロフォア共役二次抗体とともにインキュベートした(表を参照)。Odyssey(登録商標)赤外線イメージングシステム(Li−Cor Biosciences)を使用してブロットを可視化した。Coomassie染色(InstaBlue Commassie、Sigma Aldrich、カタログ番号ISB1L)のために、10μgのタンパク質を、フィブロネクチンおよびマトリゲル対照とともに150Vで1時間電気泳動させ、Coomassie染色液中で、室温で一晩インキュベートした。2時間の脱染後、Odyssey(登録商標)赤外線イメージングシステムを使用してゲルを画像化した。
抽出されたヒト幹細胞タンパク質およびラダー10μg(着色済みSeeBlue Plus 2、ThermoFisherカタログ番号LC5925)を8〜12%(w/v)SDS−ポリアクリルアミドゲル(S5)で電気泳動させた(1時間、150V)。次いで、ニトロセルロース膜(Li−Cor)に35Vで1.5時間、分離したタンパク質のウェット式転写を行い、次いでPBS中の5%(w/v)乾燥脱脂乳中でブロックし、5% BSA、0.1% PBS Tween−20、および0.02%アジ化ナトリウムブロッキング緩衝液(TableXXX)に溶解した一次抗体中、4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ニトロセルロース膜を、適切なフルオロフォア共役二次抗体とともにインキュベートした(表を参照)。Odyssey(登録商標)赤外線イメージングシステム(Li−Cor Biosciences)を使用してブロットを可視化した。Coomassie染色(InstaBlue Commassie、Sigma Aldrich、カタログ番号ISB1L)のために、10μgのタンパク質を、フィブロネクチンおよびマトリゲル対照とともに150Vで1時間電気泳動させ、Coomassie染色液中で、室温で一晩インキュベートした。2時間の脱染後、Odyssey(登録商標)赤外線イメージングシステムを使用してゲルを画像化した。
データ解析
プロテオミクスデータをスチューデントt検定によって分析し、Benjamani Hochberg手順を用いて偽発見について調整した。
プロテオミクスデータをスチューデントt検定によって分析し、Benjamani Hochberg手順を用いて偽発見について調整した。
実施例1.神経障害性「疼痛」は、損傷に対する保存された反応である。
遺伝的に扱いやすい無脊椎動物における慢性的な「疼痛」を調査するために、発明者らは、成体のショウジョウバエにおける神経損傷モデルを確立した。ハエにおいて、≧42℃の表面温度は、数分以内に強い侵害受容反応または死亡を引き起こす。この挙動を利用して、本発明者らは、侵害受容の閾値を調査するためにハエのホットプレート逃避パラダイムを開発した。野生型(Canton S)ショウジョウバエは、表面を25〜38℃に設定した場合、最小限の逃避反応を示した(図1A、および図示せず)。しかしながら、動物を侵害性の熱(42℃)に曝露した場合、損傷のないハエは強い侵害受容逃避反応を示し、動物は約3回の逃避反応/ハエ/分を示した(図1A)。ショウジョウバエのTrpAファミリーメンバーであるTrpA1(Neely et al.,2011;Zhong et al.,2012)およびpainless(Neely et al.,2010;Tracey et al.,2003)は、ハエの幼虫および成虫の急性熱侵害受容に必要であるため、本発明者らは、これらの受容体がこの反応にも関与しているかどうかを調べた。実際、TrpA1およびpainlessの両方が、侵害性温度(42℃)での急性逃避行動に必要であった(図1A)。
遺伝的に扱いやすい無脊椎動物における慢性的な「疼痛」を調査するために、発明者らは、成体のショウジョウバエにおける神経損傷モデルを確立した。ハエにおいて、≧42℃の表面温度は、数分以内に強い侵害受容反応または死亡を引き起こす。この挙動を利用して、本発明者らは、侵害受容の閾値を調査するためにハエのホットプレート逃避パラダイムを開発した。野生型(Canton S)ショウジョウバエは、表面を25〜38℃に設定した場合、最小限の逃避反応を示した(図1A、および図示せず)。しかしながら、動物を侵害性の熱(42℃)に曝露した場合、損傷のないハエは強い侵害受容逃避反応を示し、動物は約3回の逃避反応/ハエ/分を示した(図1A)。ショウジョウバエのTrpAファミリーメンバーであるTrpA1(Neely et al.,2011;Zhong et al.,2012)およびpainless(Neely et al.,2010;Tracey et al.,2003)は、ハエの幼虫および成虫の急性熱侵害受容に必要であるため、本発明者らは、これらの受容体がこの反応にも関与しているかどうかを調べた。実際、TrpA1およびpainlessの両方が、侵害性温度(42℃)での急性逃避行動に必要であった(図1A)。
次に、本発明者らは、ハエを損傷させ、損傷によって熱逃避反応プロファイルが変化するかどうかを調べた。本発明者らは、野生型動物の右中脚を切断し(図1B)、動物を回復させ、次いで異なる温度での逃避反応を評価した。無傷の動物は、38℃の表面に曝露されたときに最小限の逃避試行を示したが、切断後のハエは有意により多くの逃避行動を示した(図1C)。この反応は、損傷直後には見られなかったが、損傷から約7日後に最初に明らかになり、14日を過ぎても持続した(図1C、図S1AおよびB)。損傷により侵害温度(42℃)での逃避反応は変化せず、痛覚過敏反応であると考えられたが、侵
害温度よりも低い温度に対する感作(38℃)に限定されており、「有痛性」の行動反応が非侵害性刺激によって誘発される熱アロディニアと一致していた(図1D、図S1AおよびB)。全体的な速度の分析は、脚切断後の動きに大きな変化を示さず、観察された表現型は、活性の一般的な差異によるものではないことを示した(図1E)。総合すると、これらのデータは、ショウジョウバエが重度の損傷に応答してアロディニアを示すことを示している。
害温度よりも低い温度に対する感作(38℃)に限定されており、「有痛性」の行動反応が非侵害性刺激によって誘発される熱アロディニアと一致していた(図1D、図S1AおよびB)。全体的な速度の分析は、脚切断後の動きに大きな変化を示さず、観察された表現型は、活性の一般的な差異によるものではないことを示した(図1E)。総合すると、これらのデータは、ショウジョウバエが重度の損傷に応答してアロディニアを示すことを示している。
実施例2.アロディニアは、ppk+感覚ニューロン中のTrpA1によって媒介される。
幼虫において、ppk+感覚ニューロンは、動物の体をタイル状に覆い、急性侵害熱反応を伝達する(Zhong et al.,2010)。成体のハエにおいて、本発明者らは、ppk+ニューロンが脚の同様の感覚構造に組織化されており(図2A)、ppk+細胞体は、脚に沿って位置し(図2B)、ppk+ニューロンは、末梢に、ならびに腹側神経索(VNC)および脳に向かって投射を送る(図2C、図8C〜図E)ことを観察した。重要なことに、本発明者らがUAS破傷風毒素でppk+ニューロンからのシナプス出力を遮断したとき、動物は損傷後にアロディニアをもはや呈しなかった(図2D)が、それ以外の場合は同等の移動度を示した(図示せず)。さらに、対照動物は、損傷後38℃まで感作性逃避反応を示したが、painlessおよびTrpA1変異動物の両方は、この影響に完全に耐性を有し(図2E)、42℃では感作すら示さなかった。最後に、ppk+感覚ニューロン中でTrpA1 RNAiを駆動することは、アロディニアを抑制するのに十分であり(図2F)、TrpA1変異体バックグラウンド上でppk+感覚ニューロン中に特異的にTrpA1を再導入することによって感作が完全にレスキューされた(図2G)。したがって、ハエにおいて、神経障害性アロディニアは、ppk+侵害受容感覚ニューロンで特異的に発現される保存された感覚受容性TRPチャネルTrpA1を必要とする。
幼虫において、ppk+感覚ニューロンは、動物の体をタイル状に覆い、急性侵害熱反応を伝達する(Zhong et al.,2010)。成体のハエにおいて、本発明者らは、ppk+ニューロンが脚の同様の感覚構造に組織化されており(図2A)、ppk+細胞体は、脚に沿って位置し(図2B)、ppk+ニューロンは、末梢に、ならびに腹側神経索(VNC)および脳に向かって投射を送る(図2C、図8C〜図E)ことを観察した。重要なことに、本発明者らがUAS破傷風毒素でppk+ニューロンからのシナプス出力を遮断したとき、動物は損傷後にアロディニアをもはや呈しなかった(図2D)が、それ以外の場合は同等の移動度を示した(図示せず)。さらに、対照動物は、損傷後38℃まで感作性逃避反応を示したが、painlessおよびTrpA1変異動物の両方は、この影響に完全に耐性を有し(図2E)、42℃では感作すら示さなかった。最後に、ppk+感覚ニューロン中でTrpA1 RNAiを駆動することは、アロディニアを抑制するのに十分であり(図2F)、TrpA1変異体バックグラウンド上でppk+感覚ニューロン中に特異的にTrpA1を再導入することによって感作が完全にレスキューされた(図2G)。したがって、ハエにおいて、神経障害性アロディニアは、ppk+侵害受容感覚ニューロンで特異的に発現される保存された感覚受容性TRPチャネルTrpA1を必要とする。
実施例3.末梢神経障害性損傷は、中央機構を介してアロディニアを引き起こす
ハエは高温表面上に置かれたときに「ジャンプ」逃避反応を示し、この反応は損傷後の感作を示すため、次に、本発明者らは、脚の感覚ニューロンを活性化することが逃避反応回路を直接トリガーすることができるかどうかを調査した。本発明者らは、無傷のハエの中脚の侵害受容感覚子を刺激し、ショウジョウバエ逃避反応回路の最終ステップである背縦走筋(DLM)からの細胞内記録によって逃避反応を評価した(図3A)。無傷の脚の刺激は、強い逃避反応を引き起こした(図3A)。巨大線維反応は、脳の関与なしに生じ得る(図9A)。しかしながら、本発明者らは、逃避反応につながる脚の刺激が局所反射ではなく、高次脳機能を必要とすることを見出した(図9B)。興味深いことに、中脚の切断は非侵害性の熱に対する行動感作を引き起こしたが、本発明者らが損傷脚を直接刺激したときには反応を観察されなかった(図3B)。それと一致して、本発明者らは、損傷脚における近位ppk+感覚ニューロンの段階的神経障害を7日間にわたって確認し(図3C、Dで定量化)、哺乳動物における末梢神経切断後に、軸索切除されたニューロンの同様の変性損失が観察される(Tandrup et al.,2000)。
ハエは高温表面上に置かれたときに「ジャンプ」逃避反応を示し、この反応は損傷後の感作を示すため、次に、本発明者らは、脚の感覚ニューロンを活性化することが逃避反応回路を直接トリガーすることができるかどうかを調査した。本発明者らは、無傷のハエの中脚の侵害受容感覚子を刺激し、ショウジョウバエ逃避反応回路の最終ステップである背縦走筋(DLM)からの細胞内記録によって逃避反応を評価した(図3A)。無傷の脚の刺激は、強い逃避反応を引き起こした(図3A)。巨大線維反応は、脳の関与なしに生じ得る(図9A)。しかしながら、本発明者らは、逃避反応につながる脚の刺激が局所反射ではなく、高次脳機能を必要とすることを見出した(図9B)。興味深いことに、中脚の切断は非侵害性の熱に対する行動感作を引き起こしたが、本発明者らが損傷脚を直接刺激したときには反応を観察されなかった(図3B)。それと一致して、本発明者らは、損傷脚における近位ppk+感覚ニューロンの段階的神経障害を7日間にわたって確認し(図3C、Dで定量化)、哺乳動物における末梢神経切断後に、軸索切除されたニューロンの同様の変性損失が観察される(Tandrup et al.,2000)。
損傷脚の残りの部分は重度の感覚性ニューロパチーを示し、刺激に反応しなかったため、代わりに、本発明者らは、切断したハエの対側の損傷していない脚を刺激し、逃避反応の活性化を評価した(図3E)。驚くべきことに、損傷の7日後、本発明者らは、対向脚を刺激しているときに明らかな変化を観察し、全体的な逃避反応速度は0.2ms速く生じ(図3F、Gで定量化)、反応持続時間は0.2ms長く持続した(図3F、Hで定量化)。本発明者らが求心性感覚入力をバイパスして、下行逃避回路を直接刺激したときに、依然として全増強反応速度の50%が観察されたため(0.1ミリ秒速い、図9C)、この侵害受容逃避回路の上行および下行成分の両方に損傷後の変化が生じたことになる。総合すると、これらのデータは、末梢損傷が、感覚性ニューロパチー、対側感作、および
侵害受容逃避回路の経験駆動型可塑性をもたらすことを示している。
侵害受容逃避回路の経験駆動型可塑性をもたらすことを示している。
実施例4.中枢におけるGABA作動性抑制の喪失は神経障害性アロディニアを引き起こす
ppk+感覚ニューロンは、脚からショウジョウバエCNSの「前角」に投射する(図2A〜図2C、図8C〜図8E)。侵害受容ニューロン(ppk+)およびGABA作動性ニューロンを共標識することにより、本発明者らは、VNCにおけるこれらの2つの集団間の密接な相互作用を観察した。重要なことに、損傷の7日後、発明者らは、第2のVNC葉の同側および対側の両方の部分において、GABA免疫反応性の劇的な約40%の低下を観察した(図4A〜図4B、図9D、横断面、9Eで定量化):この損失は、主にVNC中線に沿って生じた。VNCの第1の葉および第3の葉においても、GABA焦点の有意ながら軽度の低減が生じた(図10A〜図10B)が、損傷した動物の脳においてGABA焦点の数の差は観察されなかった(図10C)、すなわち、GABA免疫反応性の喪失がVNCに局在していた。ハエの脚にGABA作動性の核または投射が観察されなかったため、GABA作動性ニューロンの喪失は、これらの細胞の直接的な損傷に起因するものではなかった(図示せず)。TrpA1はGABA作動性焦点の喪失には必要なかったが(図示せず)、ppk+感覚ニューロン(ppk−Gal4駆動UAS−破傷風毒素)からのシナプス出力を遮断することによりVNC GABA焦点の喪失が完全に妨げられ(図4C、9Fで定量化)、この損傷の神経障害性が確認された。
ppk+感覚ニューロンは、脚からショウジョウバエCNSの「前角」に投射する(図2A〜図2C、図8C〜図8E)。侵害受容ニューロン(ppk+)およびGABA作動性ニューロンを共標識することにより、本発明者らは、VNCにおけるこれらの2つの集団間の密接な相互作用を観察した。重要なことに、損傷の7日後、発明者らは、第2のVNC葉の同側および対側の両方の部分において、GABA免疫反応性の劇的な約40%の低下を観察した(図4A〜図4B、図9D、横断面、9Eで定量化):この損失は、主にVNC中線に沿って生じた。VNCの第1の葉および第3の葉においても、GABA焦点の有意ながら軽度の低減が生じた(図10A〜図10B)が、損傷した動物の脳においてGABA焦点の数の差は観察されなかった(図10C)、すなわち、GABA免疫反応性の喪失がVNCに局在していた。ハエの脚にGABA作動性の核または投射が観察されなかったため、GABA作動性ニューロンの喪失は、これらの細胞の直接的な損傷に起因するものではなかった(図示せず)。TrpA1はGABA作動性焦点の喪失には必要なかったが(図示せず)、ppk+感覚ニューロン(ppk−Gal4駆動UAS−破傷風毒素)からのシナプス出力を遮断することによりVNC GABA焦点の喪失が完全に妨げられ(図4C、9Fで定量化)、この損傷の神経障害性が確認された。
カスパーゼの薬理学的阻害は、GABA損失を防止し、げっ歯類における神経障害性疼痛の発生を抑制することができるため(Scholz et al.,2005)、本発明者らは、ハエにおける中枢GABAの調節におけるカスパーゼの役割を評価した。インタクトな動物は、VNCにおいてほとんどGABA/活性カスパーゼ共標識を示さなかった(Gad1−Gal4>>UAS−ラミン−GFPによって標識されたGABA能性ニューロン;図4D、10Eで定量化)。損傷後、VNC中のGABA作動性核の総数が劇的に減少した(10Dで定量化)一方、Gad1/活性カスパーゼ二重陽性細胞の数は有意に増加した(図4D、10Eで定量化)。GABA作動性細胞喪失がカスパーゼ依存性事象であるかどうかを直接試験するために、本発明者らは、GABA作動性ニューロンにおいて特異的にカスパーゼ阻害剤p35の発現を駆動した(Gad1−Gal4>UAS−p35)。カスパーゼを遮断しても、ハエVNC中のGABA焦点のベースライン数は変化しなかったが、Gad1+GABA作動性ニューロン中のp35の異所性発現は、神経損傷後のGABA焦点の喪失を完全に阻止した(図4E、10Fで定量化)。次に、本発明者らは、GABA作動性(+)細胞喪失を阻止することが、損傷した動物における全体的な侵害受容回路に機能的な結果をもたらしたかどうかを試験した。侵害受容逃避回路は、親対照株(UAS−p35/+)において反応潜時および持続時間の向上を示したが、GABA作動性細胞死を抑制すると(Gad1−Gal4>UAS−p35)、損傷後の侵害受容逃避回路における全ての変化が完全に遮断された(図4F〜図4G)。重要なのは、親対照株は、脚切断後に神経障害性アロディニアを示したのに対し、カスパーゼ媒介性GABA作動性細胞死を遮断することにより、この反応が完全に抑制されたことである(図4H)。逆に、代謝性GABA−B−R2またはイオンチャネル型GABA/グリシン受容体サブユニットであるディルドリン抵抗性(Rdl)の侵害受容器特異的(ppk−Gal4)RNAiノックダウンは、損傷のない動物において侵害温度よりも低い温度(38℃)に反応してアロディニアを促進し、逃避行動を増強し得る(図4I、図10G)。総合すると、これらのデータは、ハエにおいて、中枢GABAの喪失が必要であり、熱アロディニアに十分であることを示す。
実施例5.iPSC由来のGABA作動性移植片は、神経障害性疼痛を治療的に処理することができる
本発明者らのハエ神経障害性研究は、神経障害性疼痛を駆動する基礎となる中心的な病
理として中枢性抑制の喪失を強調する。同様に、哺乳類の疼痛知覚において、GABAを産生する抑制性介在ニューロンは、脊髄における疼痛の中枢ゲーティングに重要な役割を果たす。この目的のために、本発明者らは、このアプローチの治療的な実行可能性を評価するための前臨床GABA作動性移植プロトコルを開発した。細胞置換療法は、自己材料の移植を必要とするため、本発明者らは、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)の潜在的有用性を調査した。
本発明者らのハエ神経障害性研究は、神経障害性疼痛を駆動する基礎となる中心的な病
理として中枢性抑制の喪失を強調する。同様に、哺乳類の疼痛知覚において、GABAを産生する抑制性介在ニューロンは、脊髄における疼痛の中枢ゲーティングに重要な役割を果たす。この目的のために、本発明者らは、このアプローチの治療的な実行可能性を評価するための前臨床GABA作動性移植プロトコルを開発した。細胞置換療法は、自己材料の移植を必要とするため、本発明者らは、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)の潜在的有用性を調査した。
GABA作動性ニューロンを、上述のプロトコルによりインビトロでhiPSCから分化させた(図5Bに示す)。hiPSCをTripLE(Invitrogen)で解離し、超低接着表面を有する結合プレート中の懸濁液で2週間増殖させて胚様体(EB)を形成させる。神経誘導のために、細胞をSMAD阻害剤LDN193189(100nM、0日目〜14日目)およびSB431542(10μM、0日目〜10日目)で処理する。MGE(内側基底核隆起)誘導ために、細胞をWnt阻害剤IWP2(5μM、0日目〜7日目)、SHH活性化剤SAG(Smoothenedアゴニスト0.1μM、0日目〜21日目)、および増殖因子FGF8(100ng/mL、8日目〜21日目)で処理した。分化の初日に、ROCK阻害剤を加える。懸濁液中に2週間置いた後、EBをポリオルニチン(PLO)およびフィブロネクチン(FN)でコーティングした表面に移す。21日目に、EBを解離し、将来的な分化および成熟のために10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、および2.5μM γセクレターゼ阻害剤DAPTを含む分化培地上のPLO/FNコーティングプレートに再播種した。分化プロトコルは、28日以内に、hiPSCのGABA作動性(GAD65/67+)ニューロン(TUBB3+)への分化を効率的に促進した(図5C)。
FACSによって、分化条件は、TUBB3発現プロファイルおよびGAD65+細胞の純粋集団における全体的なシフトを促進した(約95%純粋、図5D)。移植材料の分子プロファイルをさらに特徴付けるために、DIV25のhiPSC由来のGABA作動性ニューロンおよび親hiPSCにおいてRNA配列決定を行った。GABA作動性特異性を確認するために、hiPSC由来感覚ニューロンのトランスクリプトームも分析した。分化したGABA作動性ニューロンは、GABA特異的転写物およびソマトスタチンサブタイプマーカーを発現した(図5E、図13B)。HiPSC由来のGABA作動性ニューロンはまた、増殖または多能性マーカーを下方制御し(図5E、図13D)、グルタミン酸受容体を上方制御し(図13C)、おそらく未分化前駆細胞に起因してOLIG2を発現した(図5E、図13E)。分化したGABA作動性ニューロンは、主に、皮質または線条体ソマトスタチン(+)ニューロンと最も密接に関連する外套下部MGEおよびCGE分化状態を示す。しかしながら、ある程度のレベルのLGE特異的転写物が観察された(図14)。階層的クラスタリングによって実証され(図13A)およびqPCRによって検証されたように(図13F)、生物学的反復実験内で再現性が強かった。質量分析法によって評価されたタンパク質の発現により、iPSC由来のGABA作動性ニューロン内における、シナプスおよびGABA作動性機構、ニューロンマーカーの発現、ならびに細胞周期成分の下方制御が明らかになった(図5F、図15A〜図15E)。Reactome経路分析により、GABA合成および放出機械の強力な濃縮があきらかになった(図15C、図15D)。さらに、hiPSC由来のGABA作動性ニューロンは、増殖しておらず(図示せず)、Ki67の発現を下方制御したが(図5G)、GAD65(図15E)、およびグリシン作動性ニューロン特異的マーカーであるグリシン輸送体GlyT2(図15E)、GABA放出に必要なGABA輸送体(小胞GABA/グリシン輸送体VGAT)(図5H)を発現し、GABAを産生した(図5I)。
iPSC由来のGABA作動性(iGABA作動性)ニューロンはGABA作動性マーカーおよび機構を発現するため、本発明者らはGABA分泌を評価し、ELISAによってiGABA作動性ニューロンがGABAを分泌することを確認した(図6A)。さらに
、iGABA作動性ニューロンは、カイニン酸、NMDA、およびAMPAグルタミン酸受容体サブクラスのサブユニットを発現する(図6B)。細胞が応答性であるかどうかを試験するために、グルタミン酸で細胞を刺激し、カルシウムイメージングを行った。強力なカルシウム一過性を観察し、細胞の大部分はグルタミン酸および塩化カリウムの両方に応答した(図6C、図6D)。
、iGABA作動性ニューロンは、カイニン酸、NMDA、およびAMPAグルタミン酸受容体サブクラスのサブユニットを発現する(図6B)。細胞が応答性であるかどうかを試験するために、グルタミン酸で細胞を刺激し、カルシウムイメージングを行った。強力なカルシウム一過性を観察し、細胞の大部分はグルタミン酸および塩化カリウムの両方に応答した(図6C、図6D)。
疼痛疾患を治療するためのiGABA作動性ニューロンの翻訳可能性を評価するために、本発明者らは、神経障害性疼痛の神経部分損傷(SNI)モデル(Decosterd
and Woolf,2000)を行った後、iGABA作動性ニューロンを損傷マウスの脊髄の同側後角(腰膨大)に移植した(図6A)。異種移植片反応を回避するために、本発明者らは免疫不全(NODSCID)レシピエントを用いた。予想通り、SNIは6日以内にNOD scidマウスにおいて接触性アロディニアおよび冷アロディニアを引き起こした:von Freyのライトタッチアッセイおよびアセトン反応によってそれぞれ評価された。移植後2週間から、(試験のエンドポイントである)2ヶ月まで持続した強力な鎮痛が観察された。これは、接触性アロディニアの低減および刺激反応曲線のシフトとして現れた(図7B〜図7C)。
and Woolf,2000)を行った後、iGABA作動性ニューロンを損傷マウスの脊髄の同側後角(腰膨大)に移植した(図6A)。異種移植片反応を回避するために、本発明者らは免疫不全(NODSCID)レシピエントを用いた。予想通り、SNIは6日以内にNOD scidマウスにおいて接触性アロディニアおよび冷アロディニアを引き起こした:von Freyのライトタッチアッセイおよびアセトン反応によってそれぞれ評価された。移植後2週間から、(試験のエンドポイントである)2ヶ月まで持続した強力な鎮痛が観察された。これは、接触性アロディニアの低減および刺激反応曲線のシフトとして現れた(図7B〜図7C)。
GABA作動性ニューロンは運動回路にも関与するため、本発明者らは、オープンフィールド試験を用いて運動行動を評価した。動作の最大速度または平均移動速度のいずれにおいても、群間差は観察されなかった(図7D〜図7E)。さらに、改変されたBassoマウススケールを用いてマウスの歩行を評価した。SNIは、坐骨の運動神経/感覚神経の損傷が混在することに起因して、予想通り、歩行に影響を及ぼした。しかしながら、移植後に群間の歩行における肉眼的変化は観察されず、総合すると、運動行動への大きな干渉がないことが示唆される(図7F)。解剖学的に近接しているため、腰椎後角に移植されたGABA作動性ニューロンは、脊髄に位置する自律神経系の核に影響を及ぼす可能
性がある。しかしながら、マウスにおいて膀胱または排便に関する問題は観察されなかった。
性がある。しかしながら、マウスにおいて膀胱または排便に関する問題は観察されなかった。
観察された影響が運動行動と無関係であることをさらに確認するために、iGABA作動性ニューロンをナイーブマウスに移植した。刺激反応および離脱閾値に変化は見られず、触覚感度の低下には神経損傷が必要であることが示唆された(図7Hおよび図16)。また、これらの結果によって、移植片が、任意の刺激が認識される緊張性閾値(tonic threshold)を単純に増加させないことも確認された(図16B)。最後に、本発明者らは、神経損傷後にhiPSC由来の感覚ニューロン(iSensoryニューロン)を後角に移植しても鎮痛をもたらすことができなかったため、治療の特異性を確認した(図7Iおよび図16C)。総合すると、成熟したiGABA作動性ニューロン移植片を用いて抑制を増強することにより、末梢誘発性神経障害性疼痛からの長期鎮痛が促進される。
ニューロンが脊髄に生着する可能性を評価するために、細胞の生存率、組込み、およびシナプス統合の可能性を評価した(図8)。移植から3週間後、我々は、放射状移動を介して後角ラミナI(CGRP+)およびII(IB4+)、ならびに他の背側ラミナにおけるhiPSC由来のGABA作動性ニューロンを同定した(図8)。当初、iGABA作動性ニューロンは腹側または対側の脊髄に移動せず(図8)、ニューロンおよびGABA作動性マーカー発現を保持し、シナプス統合の可能性の初期の証拠を示した(図8)。しかしながら、10週間後に実質的な移動が観察された。移植された細胞は、それらのヒトNCAM1、MAP2、TUBB3の共発現によって評価されたようにニューロン同一性を保持し、NeuNを発現し、最終分化が示唆された(図9C〜図9E)。iGABA作動性ニューロンは、GABAに対して免疫反応性であり、VGAT、GAD65/67、およびシナプシンの発現を保持し、移植されたiGABA作動性ニューロンがGABAを合成、パッケージ、および放出する能力を保持すること示唆された(図9F〜図9H)。加えて、マウスのシナプス前密度(バスーンを標的とするマウス特異的抗体を特徴とし、シナプス前タンパク質RIM2と共局在する)が、iGABA作動性ニューロン(ヒト特異的細胞質抗体、ヒト細胞質を特徴とする)と直接並置しており、移植片とレシピエント組織との間にシナプスを形成する可能性が示唆されることが見出された(図9I)。iGABA作動性ニューロンは、重要なシナプス前タンパク質であるリプリンを発現し、汎電位依存性(pan−voltage gated)カルシウムチャネル抗体に対して免疫反応性であった(図9K〜図9L)。最後に、抑制性シナプス後マーカーであるゲフィリンのヒトシナプシンへの並置が観察され、抑制性シナプスの存在が示唆された(図9M〜N)。注目すべきことに、移植された抑制性ニューロンは、主に、ソマトスタチンまたはパルブアルブミンサブクラスであった(図9O〜図9P)。重要なことに、奇形腫または他の関連する異常の形態学的証拠は観察されず、iGABA作動性ニューロンの増殖の証拠を特定することができなかった(細胞は活性細胞周期タンパク質Ki67を発現しなかった)(図9R〜図9S)ため、この手技の安全性が強調される。
実施例6。神経障害性マウスにおける疼痛を緩和するためのhiPSC−GABAニューロンの分化の増強。
iGABA作動性ニューロンを、実施例5に記載の方法を適合させることによりした。GABA作動性分化プロトコル中、3週目のみ(すなわち、約DIV14〜約DIV21)、4週目のみ(すなわち、約DIV21〜約DIV28)、または3週目および4週目(すなわち、約DIV14〜約DIV28)、hiPSCをBMP4に曝露した。分化(すなわち、DIV28)後、iGABA作動性ニューロンを、ソマトスタチン(SST)およびパルブアルブミン(PVALB)の発現について評価した。次いで、BMP4処理細胞を、神経障害性疼痛を逆転する能力について試験し、前述のSNIモデルを使用して
、非処理iGABA作動性ニューロンと比較した。
、非処理iGABA作動性ニューロンと比較した。
驚くべきことに、4週目、または3週目および4週目ではなく、3週目中にhiPSCをBMP4に曝露すると、PAVB発現の6倍の増加につながることが分かった。分化プロトコルにおける3週目および4週目のいずれかまたは両方の間のhiPSCの曝露は、qPCRによって示されるSST発現の50%の減少をもたらした(図17A、図17B)。
驚くべきことに、分化プロトコル(パルブアルブミン濃縮)の第3週の間にBMP4に曝露されたiGABA作動性ニューロンをSNIマウスに移植したときに、SNIマウスがBMP4に曝露されなかったiGABA作動性ニューロンで処理した場合と比較して、損傷後5週間で有意により強力な長期鎮痛反応が観察されたことも分かった(図17C)。実際、パルブアルブミン濃縮iGABA作動性ニューロンで処理した動物は、移植後5週間にそれぞれのベースライン対照と比較して有意な差を示さなかった(すなわち、疼痛はSNI動物において完全に正常に戻る)(図17C)。
神経障害性疼痛における重要な機構としての中枢脱抑制の中心的な役割を利用して、本発明者らは、hiPSC由来のGABA作動性培養物を神経障害性哺乳動物の脊髄に移植して、長期持続性の疾患緩和を促進することができることを示す。本明細書に記載の研究では、hiPSC由来のGABA作動性ニューロン移植に対する明らかな行動または生理学的有害反応は観察されなかった。さらに、GABA作動性ニューロンは分裂しておらず、レシピエント動物に移植した際に、細胞周期および多能性マーカーを下方制御し、腫瘍または奇形腫を形成せず、有効性だけでなく、本発明の組成物および方法の安全性も明らかになった。
総合すると、これらのデータは、中枢性抑制が、いくつかの形態の神経障害性疼痛にとって中心となる根源的な病理であり、抗神経障害性GABA作動性移植片によって中枢性抑制トーンを強化することは、神経障害性疼痛からの長期的かつ潜在的に治癒的な緩和を促進することができることを示している。既存の鎮痛剤は数時間作用し、中には重篤な副作用をもたらすものもある。この治療法は、より長期的な鎮痛を提供し、副作用なしに神経障害性疼痛を効果的に緩和する単一の手技の可能性を表している。
Claims (52)
- 哺乳動物に投与するための移植組成物であって、前記移植組成物は、GABA作動性ニューロンの集団、GFRαアゴニストおよび少なくとも1つの細胞死阻害剤を含み、
前記GABA作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、前記細胞がGABA作動性ニューロン表現型を得ることおよびGABAを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物。 - アポトーシス阻害剤および壊死阻害剤を含む、請求項1に記載の移植組成物。
- 前記GABA作動性ニューロンは、前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、
i.約0日目〜約7日目に少なくとも2つのSMAD阻害剤、
ii.約0日目〜約21日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化因子、
iii.約0日目〜約14日目にwnt阻害剤、
iv.約7日目〜約14日目にBMP阻害剤、
v.約7日目〜約21日目にGABA作動性種分化要因、ならびに
vi.約21日目〜約27日目にBDNF、GDNFおよびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせ、
の存在下で培養することによって作製される、請求項1または2に記載の移植組成物。 - 前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、約14日目〜約21日目の期間中にBMPシグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤の存在下で培養される、請求項3に記載の移植組成物。
- BMPシグナル伝達を活性化する前記1つ以上の薬剤はBMP4を含む、請求項4に記載の移植組成物。
- 前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、前記哺乳動物から得られる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の移植組成物。
- 前記GABA作動性ニューロンは多能性幹細胞から作製される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の移植組成物。
- 前記多能性幹細胞はiPSCである、請求項7に記載の移植組成物。
- 前記GFRαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)およびペルセフィン(PSPN)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、NGF、GDNF受容体内因性アゴニスト、BT18、BT13、NT−3、NT−4、CNTF、GFRα1アゴニスト、XIB4035、Trk活性化因子、TrkAアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、TrkBアゴニスト、N−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、BNN−20BNN−27、デオキシゲズニン、7,8−ジヒドロキシフラボン、4’−ジメチルアミノ−7,8−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、HIOC、LM22A−4、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ノルウォゴニン、R7(薬物)、および7,8,3’−トリヒドロキシフラボンからなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の移植組成物。
- 前記GFRαアゴニストはGDNFである、請求項9に記載の移植組成物。
- 前記アポトーシス阻害剤は、Boc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンIDN−8066、7053、7436 1965 6556 M867 IDN−5370 IDN−7866プラルナカサンz−Vad−FMK、YVAD−FMK、c−DEVD−CHO、Ac−YVAD−CHO、Ac−DVAD−FMK Q−Vd−OPh、CrmA(牛痘ウイルスタンパク質)、p35(バキュロウイルスタンパク質)、Z−ATAD−FMK、INF−4E、Z−DQMD−FMK、Az 10417808、Z−LEED−FMK、ZVDK−FMK、z−IETD−FMK、INf−39、ベルナカサン、Ac−DEVD−CHO、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤;またはカルパイン阻害剤1、カルペプチン、E64、MDL28170、MG101、アセチル−カルパスタチン、およびPD150606からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの1つ以上から選択される、請求項2〜10のいずれか一項に記載の移植組成物。
- 前記アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、請求項10に記載の移植組成物。
- 前記アポトーシス阻害剤はBoc−Asp(OMe)フルオロメチルケトンである、請求項12に記載の移植組成物。
- 前記壊死阻害剤は、MS−1、IM−54、GSK−872、7−Cl−O−Nec1、ネクロスタチン−1、およびネクロスルホンアミドからなる群から選択される、請求項2〜13のいずれか一項に記載の移植組成物。
- 前記壊死阻害剤はMLKL阻害剤である、請求項14に記載の移植組成物。
- 前記壊死阻害剤はネクロスルホンアミドである、請求項15に記載の移植組成物。
- 多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、前記細胞がGABA作動性ニューロン表現型を得てGABAを産生するように、
i.約0日目〜約7日目に少なくとも2つのSMAD阻害剤、
ii.約0日目〜約21日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化因子、
iii.約0日目〜約14日目にwnt阻害剤、
iv.約7日目〜約14日目にBMP阻害剤、
v.約7日目〜約21日目にGABA作動性種分化要因、ならびに
vi.約21日目〜約27日目にBDNF、GDNF、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせ、
の存在下で、インビトロで培養することを含む、GABA作動性ニューロンの集団を産生する方法。 - 前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、約14日目〜約21日目の期間中にBMPシグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤の存在下で培養される、請求項17に記載の方法。
- 前記BMPシグナル伝達を活性化する1つ以上の薬剤はBMP4を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記GABA作動性ニューロンは有糸分裂後である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GABA作動性ニューロンは、Nkx2.1、vGAT、GAD65、GAD67の転写物を発現する、請求項1〜16もしくは20のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GABA作動性ニューロンは、GAD65/67、GlyT2、およびVGATを発現する、請求項1〜16もしくは20〜21のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がGAD65を発現する、請求項1〜16もしくは20〜22のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GABA作動性ニューロンの集団の少なくとも95%がVGATを発現する、請求項1〜16もしくは20〜23のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GABA作動性ニューロンは、インビボでGABAを分泌することができる、請求項1〜16もしくは20〜24のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つのSMAD阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、請求項3〜16もしくは20〜25のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つのSMAD阻害剤はLDN193189およびSB431542である、請求項26に記載の移植組成物または方法。
- 前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子は、ソニックヘッジホッグ、GSA10、パルモルファミン、SAG、およびSAG二塩酸塩からなる群から選択される、請求項3〜16もしくは20〜27のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子はSAGである、請求項28に記載の移植組成物または方法。
- 前記wnt阻害剤は、ICG−001、サリノマイシン、IWR−1、Wnt−C59、ETC−159、iCRT3、IWP2、IWP−4、ピルビニウムパモ酸塩、iCRT14、FH535、CCT251545、KYA1797K、オウゴニン、NCB−0846、ヘキサクロロフェン、PNU−74654、Ky0211、トリプトニド、IWP12、アキシン、GSK、WAY316606、Shizokaol D、BC2059、PKF115−584、ICG−01、クェルセチン、DCA、LY2090314、CHIR99021、SB−216763、NSC668036、QS11、G007−LK、およびG244LMからなる群から選択される、請求項3〜16もしくは20〜29のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜29のいずれか一項に記載
の方法。 - 前記wnt阻害剤はIWP2である、請求項30に記載の移植組成物または方法。
- 前記BMP阻害剤は、ヘスペレチン、SB431542、SB525334、ガルニセルチブ、GW788388、LY2109761、SB505124、LDN−193189、LDN−193189 HCl、RepSox、A 83−01、DMH1、LDN−212854、ITD 1、LY364947、SD−208、EW−7197、ML347、K02288、A 77−01、SIS3、LDN−214117、R−268712、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、DANタンパク質、およびGDF3からなる群から選択される、請求項3〜16もしくは20〜31のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記BMP阻害剤はLDN−193189である、請求項32に記載の移植組成物または方法。
- 前記GABA作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、請求項3〜16もしくは20〜33のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GABA作動性種分化要因はFGF8である、請求項34に記載の移植組成物または方法。
- 前記γセクレターゼ阻害剤は、DAPT、RO4929097、セマガセスタット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ly411575、IMR−1、L−685,458、FLI−06、クレニガセスタット、ニロガセスタット、MK−0752、ベガセスタット、BMS299897、コンパウンドW、DBZ、フルリザン、JLK6、MRK560、およびPF308401臭化水素酸塩からなる群から選択される、請求項3〜16もしくは20〜35のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記γセクレターゼ阻害剤はDAPTである、請求項36に記載の移植組成物または方法。
- 前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、0日目から約24時間の期間、ROCK阻害剤の存在下で培養される、請求項3〜16もしくは20〜37のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、細胞集団。
- 請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団を、前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の神経系における中枢性抑制を回復させる、または強化する方法。
- 請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団を、前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における神経学的状態、疾患もしくは障害、またはアロディニアを治療する方法。
- 対象における不十分な抑制性介在ニューロンの活性または興奮性ニューロン機能の増大を処置するための、請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団。
- 対象における神経学的状態、疾患もしくは障害、またはアロディニアを治療するための、請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団。
- 対象における神経学的状態、疾患もしくは障害、またはアロディニアを治療する薬物の製造のための、請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、の使用。
- 前記神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、請求項41に記載の方法、請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項43に記載の使用のために請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項44に記載の使用。
- 前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患(ALS、SMA)、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー(進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症(CBD)、前頭側頭型認知症、ALSを伴うFTLD)、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄傷害、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、請求項41に記載の方法、請求項1〜16もしくは20〜36のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項43に記載の使用のために請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項44に記載の使用。
- 前記神経障害性疼痛は、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性疼痛、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連することを特徴とする、請求項45に記載の方法、請求項1〜16または20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項45に記載の使用のために請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項45に記載の使用。
- 前記移植組成物、前記治療有効量の細胞集団または前記薬物が、前記哺乳動物の中枢神経系に投与されるかまたは中枢神経系への投与のために製剤化される、請求項40、41、もしくは45〜47のいずれか一項に記載の方法、請求項1〜16、もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項42、43、もしくは45〜47に記載の使用のために請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項44〜47のいずれか一項に記載の使用。
- 前記移植組成物、前記治療有効量の細胞集団または前記薬物は、前記哺乳動物の脊髄に注射されるか、または注射用に製剤化される、請求項40、41もしくは45〜47のいずれか一項に記載の方法、請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項42、43もしくは45〜47に記載の使用のために請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請
求項44〜47のいずれか一項に記載の使用。 - 前記注射は定位注射である、請求項49に記載の方法、請求項1〜16もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項49に記載の使用のために請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項49に記載の使用。
- 前記哺乳動物はヒトである、請求項40、41、もしくは45〜50のいずれか一項に記載の方法、請求項1〜16、もしくは20〜38のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項42、43、もしくは45〜50に記載の使用のために請求項17〜38のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項44〜50のいずれか一項に記載の使用。
- それを必要とする対象にGABA作動性ニューロンを送達する方法であって、
a)前記対象からの生検を得て、前記生検から細胞を単離する工程と、
b)ステップa)で単離された細胞からiPSCを作製する工程と、
c)ステップb)で作製されたiPSCを、前記iPSCをGABA作動性ニューロンに分化させる条件下で培養する工程であって、前記GABA作動性ニューロンがGABA作動性ニューロン表現型を発現し、GABAを産生するものであることと、
d)前記対象への注射に好適な移植組成物を調製する工程であって、前記移植組成物は、ステップc)で作製されたGABA作動性ニューロン、GFRαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、および薬学的に許容される担体を含むものであることと、
e)ステップd)で調製された移植組成物を前記対象に投与する工程と、を含む方法。
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