CN114849060B - 电刺激在调控生物体内mdk中的应用 - Google Patents

电刺激在调控生物体内mdk中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次公开了电刺激在调控生物体内MDK中的应用，电刺激可以提升血浆或肌肉内的MDK，且不需要外源性添加MDK作为补充。通过本发明可以用于进一步为研究MDK相关的疾病和药物奠定基础，例如神经元、组织修复、免疫疾病等方面的预防、治疗和研究。

Description

电刺激在调控生物体内MDK中的应用
技术领域
本发明涉及一种生物体调控方法，具体涉及一种电刺激在调控生物体内MDK中的应用，属于生物技术与医学技术领域。
背景技术
Midkine(中文：中期因子，英文缩写MDK)是一种分泌型肝素结合生长因子,为低分子量的蛋白质。Midkine在发育过程中发挥着重要作用，并在妊娠中期强烈表达。在成人中，它的表达局限于某些组织。Midkine促进细胞存活和迁移，并深入参与癌症进展、炎症性疾病的发生和损伤组织的修复。
MDK在体外具有多种活性，主要分为以下三类：①神经营养活性，促进神经元的存活；②促进肾上皮细胞和骨髓细胞中细胞因子的表达；③促进胚胎神经元、中性粒细胞和成骨细胞的转移，从而修复受损组织。作为生长因子，MDK可以促进神经元的分化和成纤维细胞的生长1。MDK还可能参与细胞骨架的活动，如促进神经突起再生。也有文献报道MDK既是控制早期伤口表皮扩张和功能的关键生存信号，也是伤口愈合早期中的抗炎细胞因子2。调控MDK表达对于组织修复和早期抗炎具有巨大潜力。
现有技术中未发现调控MDK表达的技术手段，只在一篇文章中提出低频磁场，可以通过移植MDK表达，抑制肿瘤细胞增殖，干扰细胞周期3。
生物电现象是生命活动的基本属性。20世纪20年代早期，Ingvar第一次尝试了电流刺激对神经细胞发育影响的研究，之后出现了大量有关电刺激引起细胞反应的研究。肌肉电刺激法在19世纪初开始作为治疗手段用于临床，防止肌肉萎缩及恢复瘫痪肌的功能等。作为一种物理疗法，电刺激在康复科得到了广泛应用。按刺激的频率可以分为低频脉冲电刺激疗法、中频电刺激疗法和高频电刺激疗法。电刺激可以通过不同的方式：一种是将带有粘性的电极片置于皮肤上(经皮肤电刺激，transcutaneous electrical nervestimulation,TENS)，一种是将电极插入皮肤内(侵入性电刺激，percutaneous electricalnerve stimulation,PENS)4。目前电刺激疗法主要用于缓解神经病理性疼痛、偏头痛等疼痛症状，偏瘫及截瘫患者失神经肌肉功能训练，产后盆底肌康复，改善尿失禁、肌痉、吞咽障碍挛等症状，此外如贴于头皮(经颅电刺激)还可以用于治疗睡眠障碍、认知障碍、精神障碍、癫痫等中枢神经疾病。
现有专利US9352002B2和US8663146B2公开了一种促进血管生长的方法，其在伤口处进行电磁场刺激，同时向该伤患部位施用富含血小板的血浆还包括施用选自血管生成素的分离的血管生成因子(包括Midkine)，从而促进血管生长以促进伤口愈合。但未公开电刺激可以促进体内MDK的积累。
参考文献：
1.Midkine:A multifaceted driver of atherosclerosis.Clin ChimActa.2021Oct；521:251-257.doi:10.1016/j.cca.2021.07.024.
2.Tsai SL,Baselga-Garriga C,Melton DA.Midkine is a dual regulator ofwound epidermis development and inflammation during the initiation of limbregeneration.Elife.2020Jan 14；9:e50765.
3.Wang T,Nie Y,Zhao S,Han Y,Du Y,Hou Y.Involvement of midkineexpression in the inhibitory effects of low-frequency magnetic fields oncancer cells.Bioelectromagnetics.2011Sep；32(6):443-52.
4.冯(龙天),何祥.电刺激与神经康复[J].中国临床康复,2004,8(31):6977-6979.DOI:10.3321/j.issn:1673-8225.2004.31.100.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过调控电刺激手段调控生物体内MDK的方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种电刺激在调控生物体内MDK中的应用。
电刺激在调控生物体内MDK中的应用在本发明保护范围内。
优选的，所述的电刺激方式为皮肤电刺激。
优选的，所述的电刺激，频率为50-200Hz，电流为2-20mA/cm2，刺激时间为0.5-1h，进一步有优选的，频率为100Hz，电流为6-20mA/cm2，刺激时间为0.5-1h。更进一步的优选为，频率为100Hz，电流为6-20mA/cm2，每天刺激时间为0.5-1h，连续刺激1～10天，优选3天。
本发明所述的生物体为哺乳动物，优选的，所述的生物体为小鼠或人。
通过电刺激使得MDK在血浆或肌肉内的含量提升至原始含量的1.2～1.8倍，优选为1.2～1.5倍。
本发明通过电刺激手段使得生物体自主调控体内的MDK值，不需要额外添加外源生化物质，例如不需要额外添加外源MDK。
通过动物实验，本发明证实电刺激通过激活AMPK，上调MDK。
通过本发明可以用于进一步为研究MDK相关的疾病和药物奠定基础，例如神经元、组织修复、免疫疾病等方面的预防、治疗和研究。也可以通过本发明构建相关生物模型用于上述疾病或者药物的研究。
有益效果：本发明首次发现电刺激可以提升血浆或肌肉内的MDK，且不需要外源性添加MDK作为补充。通过本发明可以用于进一步为研究MDK相关的疾病和药物奠定基础，例如神经元、组织修复、免疫疾病等方面的预防、治疗和研究。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明实施例1中小鼠实验照片。
图2为不同电流强度电刺激小鼠后血浆中的MDK水平。
图3为不同电流强度电刺激小鼠后坐骨神经中的MDK水平。
图4为不同电流强度电刺激小鼠后肌肉组织中的MDK水平。
图5为不同频率电刺激小鼠后坐骨神经中MDK水平。
图6为不同频率电刺激小鼠右腿后，双腿肌肉中MDK水平。
图7为不同时长电刺激小鼠后血浆中MDK水平。
图8为不同时长电刺激后肌肉中MDK水平。
图9为电刺激C2C12细胞后细胞上清中MDK和细胞的MDK受体LRP1水平。
图10为电刺激Raw264.7细胞后细胞中磷酸化AMPK的水平。
具体实施方式
实施例1：
一、实验材料与方法
1.实验材料
1.1实验动物与细胞
成年雄性SPF级ICR小鼠：20-22g，8周龄，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(沪)2018-0006。
所有动物实验均严格按照国际疼痛研究协会伦理委员会和实验动物护理与使用指南(中国科学技术部，2006)的规定进行。所有动物实验均经南京医科大学动物保护和使用委员会批准，旨在最大限度地减少动物痛苦和使用的数量。
实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，每笼4只，室温维持22±1℃，自由饮水摄食，适应环境2天后进行实验。
细胞：RAW264.7小鼠单核细胞系。C2C12小鼠成肌细胞系。
1.2药品与试剂
1.3实验仪器：
2.实验方法
2.1小鼠下肢电刺激
成年雄性ICR小鼠(20-25g)由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。动物预先适应环境，在无病原体的条件下，每个笼子4只，在受控温度(22±2℃)和光周期(12:12-h光-暗循环)下，软垫至少2天。动物被随机分成组。用剃毛刀将小鼠右下肢的毛发剔除，并用脱毛膏脱净毛发。将小鼠固定在固定器中，露出右下肢。电刺激设备由帝诺公司提供。将电极片剪成0.5cm2左右大小后分别贴于小鼠小腿内外两侧，见图1。
2.2细胞的培养与刺激
RAW264.7细胞在补充有10％FBS的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中保持在37℃湿润的5％CO2中。将105个细胞置于6孔板中过夜，然后将电极片插在培养皿两侧进行电刺激。通过免疫印迹分析细胞提取物和沉淀的上清液。
C2C12细胞在补充有10％FBS的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中保持在37℃湿润的5％CO2中。当细胞密度达到40-50％时更换为分化培养基(DMEM high glucose+2％horse serum+1％P/S)。分化完成后，然后将电极片插在培养皿两侧进行电刺激。通过免疫印迹分析细胞提取物和沉淀的上清液。
2.3免疫印迹实验(Western blotting)
2.3.1溶液配方
(1)裂解液：RIPA裂解液，加入磷酸酶抑制剂0.1g/10mL，100X的PMSF在临用前加入；
(2)细胞裂解液：含有40mM的HEPES(酸碱度为7.5)、120mM的NaCl、50mM的NaF、10mM的焦磷酸钠、10mM的甘油磷酸钠、1mM的EDTA、0.5mM的原钒酸钠，与1％Triton X-100，PMSF在使用前现加现用(浓度为1mM)。
(3)5X Loading buffer；
(4)1.5M Tris-HCl,pH＝8.8：称Tris 18.16g溶解后，调pH 8.8，定容至100mL；
(5)1M Tris-HCl,pH＝6.8：称Tris 12.11g溶解后，调pH 6.8，定容至100mL；
(6)1X电泳缓冲液：称Tris 3.02g，甘氨酸18.8g，SDS 1g，溶解后定容至1000mL；
(7)1X转膜液冲液：称Tris 5.82g，甘氨酸2.93g，甲醇200mL，溶解后定容至1000ml；
(8)TBST：NaCl 8g，Tris2.42g，调pH 7.6，定容至1000ml，配制10X，临用前稀释，加1mL吐温-20。
2.3.2实验步骤
(1)坐骨神经样本制备：
取坐骨神经，加裂解液，每个样本加入200μl含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液。剪碎后用组织研磨机对坐骨神经样本进行匀浆，置于液氮，冻融后再次匀浆，重复三次后，于4℃、13000rpm高速离心15min，吸取上清即为蛋白样本。预留2uL检测蛋白浓度。剩下的上清液加5X Loading Buffer，涡旋均匀，100℃水浴加热5min，冷却至室温，-80℃冰箱保存；
(2)血浆样本制备：
取血浆10μl，加裂解液，每个样本加入200μl含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液，震荡涡旋后冰上静置半小时。预留2uL检测蛋白浓度。剩下的上清液加5XLoading Buffer，涡旋均匀，100℃水浴加热5min，冷却至室温，-80℃冰箱保存；
(3)肌肉样本制备：
取肌肉组织，加裂解液，每个样本加入200μl含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液。剪碎后用组织研磨机对肌肉组织进行匀浆，置于液氮，冻融后再次匀浆，重复三次后，于4℃、13000rpm高速离心15min，吸取上清即为蛋白样本。预留2uL检测蛋白浓度。剩下的上清液加5X Loading Buffer，涡旋均匀，100℃水浴加热5min，冷却至室温，-80℃冰箱保存；
(4)细胞样本制备：
细胞经药物处理一定时间后，吸弃培养基，用PBS润洗一遍，吸尽培养板中残留液体后，每孔加入80μl含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂PMSF的WB/IP裂解液，在细胞表面铺匀，培养板水平放置于冰上裂解30min，细胞刮收取裂解的细胞，转移至1.5ml EP管，于4℃、13000rpm高速离心15min，吸取上清即为胞浆蛋白样本。预留2uL检测蛋白浓度。剩下的上清液加5X Loading Buffer，涡旋均匀，100℃水浴加热5min，冷却至室温，-80℃冰箱保存；
(3)测定蛋白浓度：
将上述预留的2ul上清液取1ul加入去离子水19ul，加入200uL BCA工作液(A：B液体积比为50:1)，涡旋均匀，放置37℃孵育箱30min，酶标仪570nm测定数值，制作标曲，测定蛋白浓度；
(4)SDS-PAGE电泳：
根据分子量选择合适的分离胶浓度，先灌分离胶至总玻璃板高度的3/4，总量约3.5mL，从左到右均匀加入异丙醇，利用异丙醇的重力压平分离胶。30min后，待下层分离胶完全凝固后倾倒上层的异丙醇，加入浓缩胶并立刻插入梳齿，排净气泡。30min后待浓缩胶凝固后拔出梳齿，插入电泳槽，加满电泳缓冲液。依次上样，注意记下上样顺序；电泳80V，待样品跑出浓缩胶改变电压至120V，直至跑到分离胶底部；
(5)转膜：根据标记的位置，切下目的蛋白所在位置的胶，剪取合适大小的PVDF膜，胶为负极，膜为阳极，恒流300mA，100min转膜；
(6)封闭：转膜结束立即取出，用TBST稀释的5％牛血清白蛋白和5％脱脂牛奶封闭PVDF膜，放在摇床上慢慢摇晃2小时。一抗孵育：5％牛血清白蛋白用TBST稀释，按抗体说明书稀释抗体，将抗体封进装有条带的膜中，排净气泡，4℃冰箱旋转过夜，孵育结束用TBST洗PVDF膜3次，每次10分钟，再加入用TBST按1:5000稀释过的二抗，室温反应2h，孵育结束再用TBST洗3次，每次10分钟；
(7)曝光与显色：将ECL发光显色液A瓶与B瓶1:1混合均匀。将条带平铺在凝胶成像仪的曝光台，膜表面均匀撒上显影液，反应1-2分钟，运行设定的程序进行曝光显色。
2.4数据处理与分析
使用GraphPad Prism 6软件(GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行所有统计分析。蛋白质表达的改变采用方差分析(one-way ANOVA)进行分析，然后采用Bonferroni的事后测试。结果以平均值±SEM表示。P值＜0.05被认为是显著的。
二、实验结果
1.电刺激增加血浆中MDK释放。图2显示不同电流强度电刺激小鼠后血浆中的MDK水平。电刺激小鼠右下肢(100Hz，1小时，连续三天)，处死老鼠，取血(n＝4)。Western blot检测血浆中MDK水平。分别以三种电流强度刺激小鼠右下肢，结果显示，2-20mA/cm2的平均电流强度均可引起血浆MDK上升，6mA/cm2时产生的MDK水平最高。
2.电刺激增加了坐骨神经中MDK表达。图3显示不同电流强度电刺激小鼠后坐骨神经中的MDK水平，电刺激小鼠右下肢(100Hz，1小时，连续三天)，处死老鼠，取坐骨神经(n＝4)。Western blot检测坐骨神经中MDK、磷酸化的AMPK和MDK受体LRP1水平。分别以三种电流强度刺激小鼠右下肢，6mA/cm2时坐骨神经中产生的MDK水平及MDK受体LRP1表达最高，而AMPK活性无明显变化。
3.电刺激增加了肌肉组织中MDK表达。图4显示不同电流强度电刺激小鼠后肌肉组织中的MDK水平，电刺激小鼠右下肢(100Hz，1小时，连续三天)，处死老鼠，取右腿肌肉组织(n＝4)。Western blot检测肌肉组织中MDK、磷酸化的AMPK和MDK受体LRP1水平。分别以三种电流强度刺激小鼠右下肢，MDK和AMPK活化呈现出电流剂量依赖性增加的趋势，其中6mA/cm2时MDK受体LRP1表达最高。
4.电刺激可以增加坐骨神经MDK表达。图5显示不同频率电刺激小鼠后坐骨神经中的MDK水平，电刺激小鼠右下肢(6mA/cm2，1小时，连续三天)，处死老鼠，取坐骨神经(n＝5)。Western blot检测坐骨神经中MDK、MDK受体LRP1水平，P＜0.05vs 0Hz。分别以三种频率刺激小鼠右下肢，结果表明坐骨神经中MDK和LRP1水平对电刺激的频率变化不敏感。
5.电刺激可以增加肌肉MDK表达。图6显示不同频率电刺激小鼠后肌肉中的MDK水平，电刺激小鼠右下肢(6mA/cm2，1小时，连续三天)，处死老鼠，分别取左腿和右腿肌肉(n＝3)。Western blot检测双腿中MDK水平。分别以三种频率刺激小鼠右下肢，结果表明不同频率对于肌肉中MDK水平影响不大。电刺激不会影响到远隔部位肌肉中MDK的水平。
6.电刺激可以电刺激增加血浆中MDK释放。图7显示电刺激小鼠后血浆中的MDK水平。电刺激小鼠右下肢(100Hz，6mA/cm2，连续三天)，处死老鼠，取血(n＝4)。Western blot检测血浆中MDK水平。分别以三种时程电刺激刺激小鼠右下肢，每天电刺激1h时全身血液中MDK水平最高。
7.电刺激可以增加肌肉MDK表达。图8显示电刺激小鼠后肌肉中的MDK水平，电刺激小鼠右下肢(100Hz，6mA/cm2，连续三天)，处死老鼠，取右腿肌肉(n＝4)。Western blot检测右腿中MDK、LRP1和磷酸化AMPK水平。每天电刺激0.5h即可引起肌肉中MDK水平升高，并且随电刺激时长的增加而增加。但是每天电刺激1.5h时部分小鼠出现了皮肤损伤。0.5h-1.5h的电刺激可以增加AMPK的激活和LRP1水平。
8.电刺激可以增加C2C12成肌细胞MDK释放。图9为电刺激C2C12细胞(20Hz，100μA)，(n＝3)，Western blot检测细胞上清中MDK水平和细胞的MDK受体LRP1水平，P＜0.05vs0h。分别电刺激肌肉细胞0.5h，1h，6h和12h后，结果表明，电刺激0.5h和1h时，肌肉细胞释放MDK较多，MDK受体LRP1水平最高。
9.电刺激可以激活巨噬细胞AMPK活化。图10为电刺激Raw264.7细胞(20Hz，100μA)，(n＝3)，Western blot检测Raw264.7细胞中磷酸化AMPK的水平，P＜0.05vs0h。电刺激0.5h时对巨噬细胞AMPK磷酸化水平最高至2倍。
本发明提供了一种电刺激在调控生物体内MDK中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (4)

1.电刺激在调控生物体内MDK中的应用；其中，所述的电刺激方式为贴肤电刺激；所述的电刺激，频率为50-200Hz，电流为2-20mA/cm2，刺激时间为0.5-1h；所述的生物体为健康的哺乳动物；通过电刺激使得MDK在肌肉内的含量提升至原始含量的1.2～1.8倍；通过电刺激手段使得生物体自主调控体内的MDK值，不需要额外添加外源生化物质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的电刺激，频率为100Hz，电流为6-20mA/cm2，刺激时间为0.5-1h。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物体为小鼠或人。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，不需要额外添加外源MDK。
CN202210492296.8A 2022-05-07 2022-05-07 电刺激在调控生物体内mdk中的应用 Active CN114849060B (zh)

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