KR101768795B1 - 세포활성 및 분화촉진을 위한 맥동형 전자기장 발생 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 1 내지 500mT 의 전자기장 강도와 1000 내지 6000Hz 의 주파수를 갖는 맥동형 전자기장을 처리하여, 상기 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

세포활성 및 분화촉진을 위한 맥동형 전자기장 발생 시스템{System of pulsed electromagnetic field for increasing of the cell activity and inducing of cell-differentiation}

본 발명은 세포활성 및 분화촉진을 위한 맥동형 전자기장 발생시스템 및 이에 따라 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포에 조사하고, 추가적으로 물리적 자극(음파 또는 초음파)을 부여함으로써 신경으로의 분화를 촉진하여 신경재생 효율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

전자기장(electromagnetic field)을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진시키는 다양한 연구들이 보고되고 있다. Fregni 등 (비특허문헌 1)은 다양한 전기 및 전자기장 자극이 척추 손상으로 인한 만성신경통의 통증을 완화시킴을 보고하였고, Ahmadian S 등(비특허문헌 2)은 쥐의 피부에 25 Hz 및 2 mT 하루에 2.5시간을 조사하였을때 피부의 콜라겐이 증가됨을 보고하였다.

이에 더하여, 전자기장을 이용한 골 재생 관련 연구들도 보고되고 있다. Ceccarelli 등(비특허문헌 3)은 75Hz 및 2 mT의 전자기장으로 다양한 중간엽 줄기세포의 골 분화를 촉진시켰고, Sun 등은 15 Hz, 1.8 mT의 전자기장에서 골수유래 중간엽 줄기세포를 배양하여, 알카라이니포스파테이즈(ALP)와 골형성단백질(BMP-2) 등의 발현이 촉진되어 골세포로의 분화가 촉진됨을 보고하였고, Schwartz등은 15Hz, 1.6 mT의 전자기장으로 중간엽 줄기세포의 골분화를 촉진시켰다. 이러한 전자기장을 이용한 골분화 촉진 연구는 7.5∼15 Hz, 0.1∼5mT의 전자기장을 이용하였다 (비특허문헌 4).

최근에는 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 신경질환치료에 줄기세포를 이용한 치료 방법이 부각됨에 따라 신경세포분화촉진을 위한 연구에 전기자극을 이용한 방법들이 보고되고 있다. 종래에 알려진 신경치료 기술로는 뇌조직에 약 10Hz이하의 저주파 에너지를 적용시키기 위한 장치로 환자의 뇌 안에 전극을 이식후 직접 전기자극을 부여하여 전기흐름에 의한 자기장을 야기하는 장치 (특허문헌 1)가 있으며, Zheng은 중추신경계에 자기자극을 주는 방법으로 고주파 또는 복수의 주파수 성분을 조합하여 뇌기능 개선에 사용하려는 기술 (특허문헌 2)을 개발하였다. 또한, Riken은 배아줄기세포에 전기펄스 처리하여 신경세포를 제조하는 기술 (특허문헌 3)을 개발한 바 있으며, Gliner 등은 세포에 전기펄스를 처리하여 신경세포를 제조하는 기술을 개발한 바 있다 (특허문헌 4).

그러나, 상술한 기술들은 전극을 직접 이식하는 방식으로, 전극을 이식하는 수술이 추가되어 환자에게 고통이 수반되며 배아줄기세포의 경우 종양형성의 가능성이 문제가 되어 임상에 적용하는 데 한계가 있다.

따라서 화학적 방법이 아닌 비침습적인 방법으로 세포의 활성화를 향상시키거나 줄기세포의 신경분화를 향상시키는 새로운 기술이 필요한 실정이며, 이러한 필요에 따라 본 발명자들은 다양한 신경관련 질병을 치료하기 위한 물리자극시스템의 일환으로 중간엽 줄기세포 및 성체줄기세포에 대한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

1. 미국공개특허 US20060205993 2. 일본공개특허 JP2008543388 3. 미국공개특허 US20070065941 4. 미국공개특허 US20050075679

1. Fregni. et al., Cranial electrotherapy stimulation and transcranial pulsed current stimulation: A computer based high-resolution modeling study, NeuroImage, Volume 65, Pages 280-287, 15 January 2013. 2. Ahmadian S et al., Effects of extremely-low-frequency pulsed electromagnetic fields on collagen synthesis in rat skin, Biotechnol. Appl. Biochem. 2006, 43, 71-75. 3. Ceccarelli et al., A Comparative Analysis of the In Vitro Effects of Pulsed Electromagnetic Field Treatment on Osteogenic Differentiation of Two Different Mesenchymal Cell Lineages, BioResearch Open Access, 2013, 2(4): 283-294.　 4. Schwartz Z, Simon BJ, Duran MA, Barabino G, Chaudhri R, Boyan BD. Pulsed electromagnetic fields enhance BMP-2 dependent osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2008; 26(9):1250-1255.

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 맥동형 전자기장을 처리하여, 상기 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포를 신경 세포로 분화시키는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 손상된 조직 및 장기의 세포를 활성화 시키거나, 줄기세포를 손상된 조직 및 장기의 세포를 분화를 촉진하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 1 내지 500mT 의 전자기장 강도와 1000 내지 6000Hz 의 주파수를 갖는 맥동형 전자기장을 처리하여, 상기 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “전자기장”은 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로 전자파와 같은 의미이며, 본 발명에서 사용된 전자기장은 펄스파 형태, 연속파(사인파) 형태, 그리고 충격파 형태를 모두 포함할 수 있다.

특히, 본 발명은 “맥동형 전자기장(Pulsed Electro Magnetic Field)”를 이용한 것으로, 자기장의 파형과 디지털 자료를 출력하고, 이를 아날로그 회로를 통해 전자기장을 증폭시킨 후, 코일에서 발생되는 자기장을 통해 세포의 활성 및 분화를 향상시킬 수 있다.

한편, 맥동형 전자기장 발생장치는 도 1에 도시된 바와 같이, 제어부, 전자기장 증폭부 및 전자기장 코일 발생부를 포함한다. 상기 제어부는 전자기장 파형을 변조하여 출력하는 변환부와 자기장의 세기 및 작동시간을 조절하는 강도조절부를 포함하며, 상기 전자장 증폭부와 코일 발생부는 맥동형 전자기장을 원하는 강도까지 증폭시킬 수 있다(도 1).

특정 양태로서, 상기 코일 발생부는 헬름홀츠방식과 솔레노이드방식 등을 포함하는 전자기장 발생 코일일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 전자기장 강도는 1 내지 500mT일 수 있다. 이와 관련하여, 사용되는 전자기장 강도가 1mT 보다 낮은 경우 세포분화에 효과가 없으며, 500 mT 이상 장시간 노출시키게 되는 경우에는 세포사를 유발할 수 있다. 특정 양태로서, 전자기장 강도는 10 내지 30mT 일 수 있으며, 상술한 전자기장 강도 범위내에서 신경세포로의 분화효율을 증가시킬 수 있으며, 특히, 손상된 신경조직의 재생을 효과적으로 향상시킬 수 있다.

이에 더하여, 본 발명의 전자기장은 1000 내지 6000Hz 일 수 있으며, 바람직하게는 3500 내지 5200Hz 일 수 있으며, 상술한 범위를 벗어나는 경우, 줄기세포의 신경세포 분화능이 떨어지며, 손상된 신경부위의 재생효율이 떨어질 수 있다.

보다 구체적으로, 1000Hz 미만의 주파수에서는 세포분화를 유발하기 위해서는 고강도로 조사해야하는 위험성이 있으며, 6000Hz 를 초과할 때, 장시간 노출시키면 세포사를 유발시킬 수 있다. 상술한 주파수 범위내에서 특히, 3500 내지 5200mT 범위에서 신경세포로의 분화효율을 증가시킬 수 있으며, 손상된 신경조직의 재생을 효과적으로 향상시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “전자파” 는 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로, 전자기파와 같은 의미이며, 고주파수 전자파는 주파수가 높은 파를 의미하며, 보통 1000Hz 이상을 의미한다.

본 발명의 실시예에서 저강도의 조건에서 고주파수의 전자기장을 이용하여 성체 줄기세포를 배양하였을 때, 저주파수를 이용하였을 때 보다 신경세포 관련 mRNA 발현과 단백질 발현이 더욱 더 증가한 것을 확인하였으며, 특히, 10mT 의 전자기장 강도일 때, 3500 내지 5200Hz 의 주파수를 처리한 성체 줄기세포에서 신경관련 단백질의 발현이 가장 높게 증가한 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 방법을 적용한 경우, 성체 줄기세포가 신경세포로의 분화를 더욱 더 향상시킬 수 있음을 관찰할 수 있었다.

본 발명의 전자기장은 10 내지 360분/일간 3 내지 30일간 처리될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 300분/일간 3 내지 15일, 가장 바람직하게는 15 내지 180분/일간 5 내지 15일 동안 처리될 수 있다.

여기서, “줄기세포” 란 미분화 세포로서 오랜 기간 동안 분열을 하고 자기 갱신 (self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 역분화 줄기세포(iPS), 적분화 줄기세포로 나누며, 신경줄기세포(neural stem cell)는 신경전구세포를 포함한다.

한편, “성체 줄기세포” 는 중간엽 줄기세포도 포함하며, 성체 줄기세포는 치주인대세포, 치수줄기세포, 골수유래 중간엽 줄기세포, 제대유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 상기 성체 줄기세포는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 제한 없이 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “신경세포” 는 슈반세포(Schwann), 성상세포(Astrocytes), 희소돌기아교세포(Oligodendrocytes), 신경(Neuron)을 모두 포함하며, 본 발명의 방법으로 분화된 신경세포는 성상세포, 슈반세포 또는 희소돌기아교세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 맥동형 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경세포로의 분화 평가를 하였으며, 상기 맥동형 전자기장에서 강도에 따른 분화 효율을 평가하였다. 또한, 마우스 뇌졸중 모델에 중간엽 줄기세포 주입후 운동회복 능력을 평가하고 조직을 분석하였다.

그 결과, 맥동형 전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포는 액포형성 또는 세포막 붕괴와 같은 세포사 관련 형태가 관찰되지 않아 본 연구의 주파수 및 강도가 세포에 독성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었고, 분화유도배지를 이용한 (+) control 군에 비해 10mT 맥동형 전자기장을 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz 그리고 6.0kHz 조사한 세포에서 형태학적인 변화가 관찰되었다. 그리고, (-)control 군에 비해 나머지 세포에서 neuroD1 이 발현된 세포가 일부 관찰되었다 (도 2).

또한, 배양 후 세포를 각각 회수하여 중간엽줄기세포의 표현형을 FACS 분석한 결과 (-)control 에 비해 중간엽줄기세포로서의 항원발현이 줄어듦으로서 특정 세포로 분화가 진행되고 있음을 확인할 수 있었고, 특히, 5.2kHz와 6.0kHz 주파수에서 세포의 분화유도가 많이 진행됨을 알 수 있었다(도 3).

또한, 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz 주파수의 맥동형 전자기장에서 배양한 성체줄기세포에서 신경관련 Neuro D1, MAP 2, NF-L, 그리고 Tau mRNA 발현이 증가하였으며, 6.0kHz부터는 오히려 mRNA 발현이 줄어 주파수에 범위 따른 분화 효과에 차이가 있음을 알 수 있었다(도 4).

이에 더하여, 10mT (100G) 맥동형 전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포에서 2mT (20G) 강도 보다 신경세포 관련 NeuroD 단백질 발현이 증가하였으며, 시냅틱 관련 SNAP25와 synapsin발현도 함께 증가된 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 p-ERK 활성를 통하여 진행됨을 알 수 있었다(도 5).

특히, 10mT(100G) 맥동전자기장을 조사한 세포에서 MAP-2 가 강하게 발현되었으며, 10mT의 강도에서 분화효율이 향상됨을 관찰 할 수 있었다(도 6).

또한, 본 발명의 일 실시예에 따라 10mT 에서 50Hz 와 4000Hz 의 주파수의 전자기장에서 중간엽 줄기세포의 신경 및 시냅틱 관련 마커를 웨스턴 블롯(western blot)으로 발현을 분석한 결과, 50Hz보다 4.0kHz에서 신경세포 관련 NeroD1과 NF-L 단백질 발현이 증가하였으며, 시냅틱관련 synapsin 발현도 함께 증가된 것을 알 수 있었다. 즉, 본 발명은 맥동형 전자기장이 10mT 의 강도일 때, 저주파 보다는 고주파를 조사할 때, 중간엽 줄기세포의 신경분화를 활발하게 유도함을 알 수 있었다(도 7).

또한, 뇌손상 동물의 회복능력을 평가한 결과, 4.2kHz, 10mT 맥동형 전자기장 처리군에서 신경 관련 MAP 2, Neuro D1, 그리고 p-ERK의 발현이 증가되었고(도 8), 맥동형 전자기장을 조사한 마우스가 비조사군에 비해 운동능력이 크게 향상됨을 확인할 수 있었다(도 9).

결과적으로, 본 발명은 뇌손상 환부에 4.2kHz, 10mT (100G) 맥동형 전자기장을 하루 180분씩 조사함으로써 손상된 신경조직의 치료 효율을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는 손상된 신경 조직 치료 효율 향상을 위한 시스템을 제공한다. 상기 조성물은 통상의 방법에 따라 체내에 적합한 세포를 투여할 수 있으며, 상기 세포는 1회 또는 수회 투여에 의해 치료 효과를 극대화할 수 있는 효과적인 투여량은 포함한다. 상기 세포는 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다.

상기 손상된 신경 조직은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 및 말초신경으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환, 바람직하게는 신경질환으로부터 유래된 것일 수 있으며, 본 발명에 따른 분화된 신경세포 또는 신경줄기세포는 신경질환에서 신경세포의 기능을 회복함으로써 신경질환 치료용 시스템으로서 기능을 할 수 있다

또한, 본 발명은 세포주입 없이 손상된 신경조직 및 장기에 전자기장을 조사함으로서 손상된 세포의 활성을 향상시키거나, 줄기세포의 신경 관련 세포로의 분화를 촉진하는 방법으로 이용될 수 있다.

본 발명에 따라 세포의 활성을 향상시키거나 줄기세포의 분화를 촉진함으로서, 신경세포나 신경줄기세포를 용이하게 분화시킬 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분화된 줄기세포를 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 및 말초신경 손상 등의 신경질환치료에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포 활성 향상 및 줄기세포분화를 촉진시키는 맥동형 전자기장 발생 시스템의 내부 구성도를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 neuroD1 단백질 발현을 면역화학 염색으로 관찰한 결과를 나타낸. 도면이다((-)control: 비조사군(증식용배지), (+)control: 비조사군(유도배지), 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz, 6.0kHz : 10mT 전자기장 주파수(유도배지)).
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 분화효율을 FACS로 CD73을 분석한 결과를 나타낸 도면이다((-)control: 비조사군(증식용배지), (+)control: 비조사군(유도배지), 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz, 6.0kHz : 10mT 전자기장 주파수(유도배지)).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 신경관련 mRNA발현을 분석한 결과를 나타낸 도면이다 ((-)control: 비조사군(증식용배지), (+)control: 비조사군(유도배지), 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz, 6.0kHz : 10mT 전자기장 주파수(유도배지)).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 4.0kHz주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 강도(2mT와 10mT)에 따른 신경 및 시냅틱 관련 마커 웨스턴 블롯의 발현 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 4.0kHz 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 강도(2mT와 10mT)에 따른 MAP-2 발현을 면역화학 염색으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 맥동형 전자기장에서 50Hz와 4.0kHz주파수의 전자기장에서 중간엽줄기세포의 신경 및 시냅틱 관련 마커 웨스턴 블롯의 발현 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 10mT 맥동형 전자기장 처리 후 헤마톡실린&이오신(Hematoxylin & Eosin) 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 10mT 맥동형 전자기장 처리 후 손상부위에서 발현되는 신경관련 단백질을 웨스턴 블롯의 발현 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 10mT 맥동형 전자기장 처리 후 로타로드를 이용한 운동능력을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하기 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정 하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

실시예 1. 맥동형 전자기장 발생 시스템 설계

실시예 1.1 코일부 설계

본 실시예에서 맥동형 전자기장 발생을 위한 코일부는 코일굵기 1.2mm, 코일지름 300mm 의 형상으로 설계하였다.

실시예 1.2 제어부 설계

본 실시예에서 맥동형 전자기장 발생을 위한 제어부는 2.0kHz 부터 7.0kHz 까지 주파수 변환이 가능하고, 0.5mT 부터 10mT 의 강도를 조절할 수 있도록 설계하였다.

실시예 2. 맥동형 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 배양

실시예 2.1 성체 중간엽줄기세포 배양

중간엽줄기세포는 Lonza(Wailersville, MD) 사에서 계대수 2의 인간 성체 중간엽줄기세포를 구입하여 해동한 뒤 증식용 배지인 DMEM 배지 (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 에 10%(v/v) FBS 를 넣은 배지에 넣고 800rpm 으로 5분간 원심분리 하였다. 그 후에 원심분리로 얻어진 상등액은 버리고, 남은 세포를 다시 증식용 배지 10ml 가 들어있는 100mm 배양접시에 접종한 후 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃로 유지되는 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실시예 2.2 10mT 맥동형 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경세포로의 분화 평가

실시예 2.1 에서 배양한 계대수 5의 중간엽줄기세포를 60mm 배양디쉬에 0.25×10⁵/디쉬 접종하였으며, 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃ 의 CO₂ 배양기에서 8일간 배양하였다.

전자기장은 1일 1회, 180분간 조사하였고, 조사할 경우 전자기장 공간에 60mm 배양접시를 위치시킨 후, 각각 (-)control: 비조사군(증식용배지), (+)control: 비조사군(유도배지), 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz, 6.0kHz: 10mT 주파수(유도배지)의 맥동형 전자기장을 7일간 조사하였다. 이때, 유도배지는 3% FBS(Fetal bovine serum), 10ng/ml EGF(Epidermal Growth Factor), 10uM forskolin 을 넣은 DMEM 배지를 사용하였다.

맥동형 전자기장 조사후 성체중간엽줄기세포의 신경분화 관련 단백질 발현을 평가하기위해 neuroD1 면역화학염색을 실시한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포는 액포형성 또는 세포막 붕괴와 같은 세포사 관련 형태가 관찰되지 않아 본 발명의 주파수 및 강도가 세포에 독성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었고, 분화유도배지를 이용한 양성 대조군((+)control)에 비하여 10mT 맥동형 전자기장을 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz 및 6.0kHz 조사한 세포에서 형태학적인 변화가 관찰되었다. 그리고, 음성대조군((-) control) 군에 비하여 나머지 세포에서 neuroD1 이 발현된 세포가 일부 관찰되었다.

배양 후 세포를 각각 회수하여 중간엽줄기세포의 표현형을 FACS 분석하였다.

한편, 도 3은 전자기장 강도가 10mT 일 때, 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz 및 6.0kHz 의 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 분화효율을 FACS 로 CD73을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3을 참조하면, 상기 중간엽줄기세포의 표현형을 FACS 분석한 결과 음성대조군((-) control) 에 비해 중간엽줄기세포로서의 항원발현이 줄어듦으로서 특정 세포로 분화가 진행되고 있음을 확인할 수 있었고, 특히, 5.2kHz 와 6.0kHz 주파수에서 세포의 분화유도가 많이 진행되었음을 알 수 있었다.

그 다음으로, 배양 후 세포를 각각 회수하여 신경세포 관련 Neuro D1, MAP 2, NF-L, 그리고 Tau mRNA 발현을 분석하였다.

도 4는 전자기장 강도가 10mT 일 때, 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz 및 6.0kHz 의 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 신경관련 mRNA 발현을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 4를 참조하면, 대조군과 비교하였을 때, 10mT 맥동형 전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포에서 신경세포 관련 mRNA 발현이 증가하였으며, 특히, 3.5kHz, 4.2kHz, 5.2kHz 주파수에서 배양한 성체줄기세포에서 신경관련 mRNA 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 6.0kHz 주파수에서는 mRNA 발현이 줄어 주파수에 범위에 따른 분화 효과에 차이가 있음을 알 수 있었다.

즉, 배양한 성체줄기세포에서 상기 신경 단백질이 가장 강하게 발현됨에 따라, 1일 1회 180분씩 10mT 강도의 전자기장을 처리하고, 3.5kHz, 4.2kHz와 5.2kHz 의 주파수를 처리하였을 때 성체줄기세포의 신경분화를 활발하게 유도함을 알 수 있었다.

실시예 2.3 맥동형 전자기장에서 강도에 따른 분화 효율 평가

전자기장 처리는 배양기간 동안 1일 1회, 180분간 조사하였고, 전자기장 공간에 두개의 60mm 배양접시를 위치시킨 후, 주파수를 각각 4.2kHz 를 고정시키고, 2mT(20G)와 10mT(100G)의 전자기장 강도로 7일간 조사하여 분화 효율을 비교 평가하였다.

도 5는 4.2kHz 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 강도(2mT, 10mT)에 따른 신경 및 시냅틱 관련 마커 웨스턴(western) 발현 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 5를 참조하면, 10mT 맥동형 전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포에서 2mT 강도보다 신경세포 관련 NeuroD 단백질 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 시냅틱관련 SNAP25와 synapsin 발현도 함께 증가된 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 4.2kHz 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 강도가 2mT 보다 10mT 일 때 분화효율이 향상된 것을 확인할 수 있었다.

도 6은 4.2kHz 주파수의 맥동형 전자기장에서 중간엽줄기세포의 강도(2mT, 10mT)에 따른 MAP-2 발현을 면역화학 염색으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6을 참조하면, 전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포는 액포형성 또는 세포막 붕괴와 같은 세포사 관련 형태가 관찰되지 않았으며, 분화유도배지만을 이용한 양성대조군((+) control) 에 비하여 맥동형 전자기장을 조사한 세포에서 형태학적인 변화가 관찰되었으며, 특히, 10mT 맥동전자기장을 조사한 세포에서 MAP-2가 강하게 발현된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2.4 10mT 맥동형 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경세포로의 분화 평가

실시예 2.1에서 배양한 계대수 5의 중간엽줄기세포를 60mm 배양디쉬에 0.25×10⁵/디쉬 접종하였으며, 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃ 의 CO₂ 배양기에서 8일간 배양하였다.

전자기장은 1일 1회, 180분간 조사하였고, 조사할 경우 전자기장 공간에 60mm 배양접시를 위치시킨 후, 각각 (+)control: 비조사군(유도배지), 50Hz, 4.0kHz 주파수(유도배지)의 맥동형 전자기장을 5일간 조사하였다. 이때, 유도배지는 3% FBS(Fetal bovine serum), 10ng/ml EGF(Epidermal Growth Factor), 10uM forskolin 을 넣은 DMEM 배지를 사용하였다.

그리고, 전자기장의 조사후에 성체중간엽줄기세포의 신경분화 관련 단백질 발현을 평가하기 위해 웨스턴 블롯(western blot)으로 분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 7을 참조하면, 10mT(100G)전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포에서 50Hz보다 4.0kHz에서 신경세포 관련 NeroD1과 NF-L 단백질 발현이 증가하였으며, 시냅틱관련 synapsin발현도 함께 증가된 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 p-ERK 활성를 통하여 진행됨을 알 수 있었다.

즉, 배양한 성체줄기세포에서 상기 신경 단백질이 가장 강하게 발현됨에 따라, 1일 1회 180분씩 10mT 강도의 전자기장을 처리하였을 때, 저주파인 50Hz보다 고주파의 4.0kHz으로 주파수를 처리하였을 때 성체줄기세포의 신경분화를 활발하게 유도함을 알 수 있었다.

실시예 3. 뇌졸중 동물모델을 이용한 맥동형 전자기장 효능 평가

실시예 3.1 소동물 뇌졸중 모델 제작

뇌졸중 동물모델 제작을 위해 2주령(20g) 마우스를 사용하였고, 마취제는 졸레틸(Zoletil^TM, 250mg/5cc, Virbac) 0.1cc/100g(50mg/kg)과 럼푼(Rompun 2%, Bayer) 0.025~0.04/100g(5~10mg/kg)을 섞어 복강투여로 마취하였다. 뇌졸중 모델 제작 방법은 광화학적 방법을 이용하였으며 다음과 같다.

전신적 광활성 염색물질 Rose Bengal (10mg/ml) 300㎕를 투여하고 두개골을 통해 광선줄기(Light beam, K: 1500 LCD(SCHOTT), 532nm 파장)로 빛을 15분간 투사하여(irrdiation) 뇌졸중을 유발하였다.

실시예 3.2 소동물 모델을 이용한 맥동형 전자기장의 뇌졸중 치료 효과

전자기장 효과를 평가하기 위해 뇌졸중 마우스에 4.2kHz, 10mT 맥동형 전자기장을 29일간 1일 180분씩 조사하였다.

운동능력을 평가하기 위해 로타로드평가를 5일 간격으로 실시하여 운동회복시간을 측정하였으며, 30일 후 안락사하여 뇌경색 부위의 조직을 채취하여 헤마톡실린 & 이오신 (Hematoxylin & Eosin), 웨스턴 블롯(Western Blot) 염색을 시행하였다.

그 후에, 헤마톡실린 & 이오신의 염색한 결과물과 웨스턴 블롯의 발현을 분석하였으며, 로타로드를 이용한 운동능력을 평가하였다.

도 8은 헤마톡실린 & 이오신 (Hematoxylin & Eosin)의 염색 결과를 나타내는 도면이다. 헤마톡실린 & 이오신의 염색결과, 손상된 뇌 조직 부위가 관찰되었으며, 대조군과 본 발명에서 4.2kHz, 10mT 맥동형 전자기장을 조사한 실험군과는 형태학적인 큰 차이를 보이지 않았다.

도 9는 맥동 전자기장 조사에 따른 뇌손상병변의 신경마커 관련 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 통하여 분석한 결과이다. 맥동형 전자기장 처리군에서 신경관련 MAP 2, Neuro D1 그리고 p-EPK 발현이 증가됨을 알 수 있었다.

도 10은 맥동 전자기장 조사에 따른 운동 회복 능력을 평가한 그래프로서, 4.2kHz, 10mT 맥동형 전자기장을 조사한 마우스가 비조사군에 비해 운동능력이 크게 향상됨을 확인할 수 있었다.

Claims (8)

1. 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 10mT 의 전자기장 강도와 3500 내지 5200Hz 의 주파수를 갖는 맥동형 전자기장을 10 내지 360분/일간 3 내지 30일 동안 처리하여, 상기 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 중간엽 줄기세포는 배아 유래 또는 성체조직 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 중간엽 줄기세포는 골수유래, 지방유래, 제대혈 유래 또는 제대유래인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   상기 분화시킨 신경세포는 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 또는 척수손상 치료에 사용되는 것인 방법.

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