CN111172151B - 一种电信号通过调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电信号通过调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应的方法，包括以下步骤：将细胞或皮肤组织置于A电极和B电极之间，所述A和B电极之间连接有直流电源，且在A电极与B电极之间形成电场，给出足以引导和操纵DCs/LCs细胞迁移和定位的电流，以此通过电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应。本发明的方法有潜力应用于制备新型疫苗佐剂，或将本发明的方法与其他佐剂共同使用调节免疫反应。本发明的方法在不受化学趋向诱导干扰，可用于靶向特异性免疫调节剂和精准癌症治疗，减少临床常见副作用；与目前常用的免疫调节剂相比，本发明的方法可调节范围广，操作条件易于优化，成本低，也有助于减轻患者和社会的经济负担。

Description

一种电信号通过调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免 疫反应的方法及其用途

技术领域

本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种电信号通过调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应的方法及其用途。

背景技术

环境中多样的物理、化学及生物因素都可以影响皮肤免疫。树突状细胞(dendriticcells,DCs)是一种专业的抗原提呈细胞，能够启动对外来抗原的适应性免疫反应，维持T细胞对自身的耐受性。皮肤和淋巴器官是微生物病原体的第一个入口，也是适应性免疫反应的初始位置，此处也是DCs最富集的部位。

皮肤DCs包括表皮的朗格汉斯细胞(Epidermal Langerhans cells,LCs)和真皮的真皮DCs(DDCs)，LCs和DDCs都能够在体内捕获外源抗原和自身抗原，并将其提呈给初始T细胞(Tcell)。不同于其他抗原提呈细胞(APCs)，如巨噬细胞和B细胞，迁移能力是DCs区别于其他APCs的固有特征，DCs可迁移至淋巴器官，并与T淋巴细胞相互作用。

DCs是在多种促炎刺激下被激活的，包括化学因素(接触致敏剂或刺激物)、物理因素(机械刺激、不同谱段的光线或温热等)和生物因素(微生物或组织坏死)。这些炎症刺激可诱导DCs的迁移游走以及抗原摄取，从而促进DCs的成熟。许多DCs在周围淋巴器官遇到抗原并被激活，从而携带抗原迁移到下游淋巴结。因此，调控DCs迁移到淋巴结的途径和机制，在免疫应答和病原体发生中起着重要作用。

人体组织中能产生电场(Electrical Fields,EFs)。如果皮肤细胞间紧密连接(tightjunction)受到破坏，则促使表皮电势差稳态(transepithelial potential)失衡，导致内源性离子流，并形成皮肤的内源性生物电场。研究发现这种内源性电场能促进伤口修复、神经发育、细胞分裂、细胞定向迁移。现在已知，较低的外源电场对皮肤中的角质层细胞、成纤维细胞、皮肤中的中性粒细胞和淋巴细胞都有定向迁移作用。上述细胞在电场作用下定向迁移的现象被称为电趋化性(electrotaxis或galvanotaxis)，其主要机制是电场激活细胞膜蛋白及其下游信号通路，最后作用于细胞骨架蛋白并形成定向迁移。

目前机体免疫领域的重要应用(疫苗、免疫调节剂)：

疫苗是指为了预防、控制某些疾病的发生、流行，由各类病原微生物制作而成、用于人类预防接种的预防性生物制品。与皮肤免疫过程类似，疫苗作为带有致病原(病原微生物及其代谢产物)信息的抗原，进入机体后会刺激人体免疫系统，首先机体识别抗原，继而将其加工成抗原信息，抗原提呈细胞将该信息进行处理、加工和递呈给特异性淋巴细胞(T和B淋巴细胞)，然后淋巴细胞进行识别、活化、增殖、分化最后产生免疫效应分子(抗体和细胞因子)及免疫效应细胞，进而消灭进入机体的相应致病原，以保护疫苗接受者免受这些病原微生物的侵袭。

随着基因工程技术和分子免疫学研究的不断发展，各种新型疫苗日益增多。与传统疫苗(如减毒活疫苗、灭活疫苗)相比，新型现代疫苗(如基因疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗和多表位疫苗等)的安全性较高，但是普遍免疫原性较弱，必须依赖佐剂才能诱导足够强的体液免疫和细胞免疫应答，从而发挥出疫苗最佳保护效果。免疫佐剂是指先与抗原或抗原物质混合后注射(同时或预先注射)，能非特异性增强或改善机体对抗原物质特异性免疫应答的一类物质，佐剂具有减少免疫针次、减少抗原用量、增强免疫反应等优点。

人用疫苗佐剂应具有无毒、可降解、无致敏性、使抗原具有持久且高效的免疫活性等特点。目前几种高效佐剂常伴有较高的毒性，从而也限制了现代新型疫苗的上市。目前有美国食品与药物监督管理局(FDA)批准的铝盐佐剂、MF59佐剂、欧盟批准的AS系列(AS03、AS04等)、病毒体、尚处于临床试验阶段的NB001纳米佐剂等几种被批准用于人类。但是一些局部反应、IgE抗体反应和安全性等问题仍不容忽视当前。此外，尚在研发的新型人用疫苗佐剂主要有脂质体、免疫复合物、寡核苷酸、多糖、细胞因子及天然产物(如中草药)等。因此，人用疫苗佐剂仍处于不断探索、研究和开发的阶段。

免疫调节剂是广义上的免疫佐剂，指能调节机体免疫功能的药物，用于治疗免疫功能紊乱引起的疾病。免疫调节剂可增强、抑制、双向调节免疫功能。据此将其分为免疫增强剂(如卡介苗)、免疫抑制剂(如强的松)、双向免疫调节剂(如胸腺五肽)等。

目前较为成熟的免疫调节剂主要来源于人和动物免疫系统的产物(如TNF-α、白细胞介素、干扰素等)、化学合成剂(如左旋咪唑、维生素D、西咪替丁等)、生物制剂(主要由微生物产生，如卡介苗、香菇多糖、单克隆抗体等)、中药或植物来源制剂(如人参、灵芝、雷公滕、青蒿素等)。

疫苗、免疫调节剂的现况及弊端：

目前常用的疫苗佐剂可分为以下几种：

铝盐佐剂：铝盐佐剂是迄今为止应用于人体疫苗最成功、最重要的佐剂，但尚且存在不足：不可冻干；抗原吸附易受物理、化学等性质的影响，常出现不同批次佐剂免疫效果差异大，质量不稳定；注射局部出现红斑、肿胀和硬结；铝盐易在体内蓄积，尤其是在脑部。此外，铝佐剂通常诱导经典的抗体介导的(Th2)应答，但对细胞介导的(Th1)免疫无明显影响，因此对于慢性感染性疾病和癌症相关疫苗意义不大。

MF59乳剂佐剂：MF59佐剂可刺激机体同时产生体液免疫反应与细胞免疫反应，但主要以Th2型免疫应答为主，且发现抗原吸附能力弱，可诱发嗜睡、关节炎等副作用。另外，该佐剂稳定性较差。这些缺点，提示MF59乳剂佐剂仍需要进一步改进。

AS系列佐剂：AS系列佐剂会引起注射部位疼痛、局部炎症反应、诱发炎症性关节炎，而且易出现与抗原混合不均的问他，且生产成本较高。

NB001纳米佐剂：该佐剂对于机体免疫增强有促进作用，但其作用机制尚未阐明，同样存在诱导自身免疫疾病、炎症等不良反应的可能。

免疫调节剂已在疾病防治上应用价值巨大，但经临床应用发现，目前广泛使用的免疫调节剂仍不可避免引发一些副作用，如注射部位疼痛、出现红斑和局部皮疹；静脉给药有少部分患者可出现头痛、发热和血压升高等输液反应；使用糖皮质激素等免疫抑制剂后，因免疫功能被抑制，机体很容易出现感染；使用免疫调节剂时人为干扰了机体免疫反应，很容易造成免疫功能再次紊乱，诱发新的免疫相关疾病；此外部分免疫抑制剂还可导致全身水肿、血小板减少、充血性心力衰竭、肾功能低下、中枢神经系统中毒症状等。

此外，目前临床应用的免疫调节剂大多价格不菲，进口制剂尤甚。而患者治疗疾病多需长期使用免疫调节剂，治疗费用高昂，家庭和社会负担较重。因此，通过其他途径调控免疫活性的研究具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种通过电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应的方法。

一种通过电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应的方法，包括以下步骤：将细胞或皮肤组织置于A电极和B电极之间，所述A和B电极之间连接有直流电源，且在A电极与B电极之间形成电场，给出足以引导和操纵DCs/LCs细胞迁移和定位的电流，以此通过电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应。

本发明所述通过电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞而调控机体免疫反应的方法有潜力应用于制备新型疫苗佐剂。

一种新型疫苗佐剂，是单独通过上述电场刺激调节免疫反应或将电场刺激与其他佐剂共同使用调节免疫反应。

一种通过上述电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞与IL-18、IL-18R协同作用刺激DCs/LCs迁移游走而调控机体免疫反应的方法；所述方法在制备新型疫苗佐剂中的用途。

一种新型疫苗佐剂，是通过上述电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞与IL-18、IL-18R协同作用刺激DCs/LCs迁移游走而调控机体免疫反应的方法与其他佐剂共同使用调节免疫反应。

一种通过上述电信号调节皮肤DCs/LCs提呈至T细胞与IL-18、IL-18R协同作用刺激DCs/LCs迁移游走而调控机体免疫反应的方法与基因疫苗联合使用与增强疫苗免疫应答效果的用途。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次创立了体内外施加电场效应的通用方法，可应用于体外细胞实验、在体实验等科学研究，其相关研究发现也为新型疫苗佐剂的研发提供了新设想。

(2)电场刺激定向、快速、高效，可增强抗原吸收和生物利用率；毒性低，提高了疫苗安全性；制作工艺简单，电场刺激只需在疫苗应用时施加于机体，更易于疫苗的制备、运输和储存；生产成本低，有良好的社会效益。

(3)本发明的电场刺激的迁移方式允许新的非侵入性临床应用，在不受化学趋向诱导干扰的情况下，以电的方式引导和操纵组织中的细胞迁移和定位，可用于靶向特异性免疫调节剂和精准癌症治疗，同时会减少目前临床常见的副作用。而且与目前常用的免疫调节剂相比，电场刺激可调节范围广，操作条件易于优化，电场刺激成本较低，也有助于减轻患者和社会的经济负担。

环境中多样的物理、化学及生物因素都可以影响皮肤免疫。调控DCs/LCs的趋化及介导免疫应答过程，可为阐述某些免疫相关皮肤病的发病机理和寻找治疗靶向调控点提供契机。同时精准调控DCs/LCs功能有可能对一些免疫相关性皮肤病(如变态反应性皮肤病、皮肤感染、自身免疫性皮肤病、甚至皮肤肿瘤的)治疗发挥作用。

既往研究发现EFs在机体细胞迁移、细胞分裂、基因表达、胚胎发生、神经生长和伤口愈合等方面均发挥重要作用，曾有体外模型实验表明，与其他趋化作用相比较(如机械趋化、化学趋化和热趋化)，电趋化的导向和方向性优势最为明显。

基于前期电场研究的背景，本发明提供了体内外研究电场效应的通用实验方法，并分别应用于体外细胞实验、体内小鼠实验。利用活细胞观测工作站、核酸及蛋白检测技术设备、流式细胞检测设备、组织化学或免疫学检测设备等，进行体内外实验参数的检测及分析。

研究发现在体外条件下，施加的外源性电场可以调控细胞的定向迁移，电场和IL-18可协同刺激DCs/LCs迁移游走。

在体条件下，我们选取野生型小鼠和基因敲除小鼠(IL-18 KO,IL-18R KO)为研究对象。研究发现电场刺激可增强野生型小鼠接触性超敏反应强度，但基因敲除小鼠接受同样条件电场干预，并未观测到该增强效应，从而表明电场和IL-18、IL-18R共同参与调控机体免疫应答反应，从而影响在免疫反应早期LCs的迁移游走。

为了更为直观检测电场对表皮LCs迁移的影响，我们对小鼠耳部皮肤进行5V加电处理，施加正极电侧的耳表皮LCs数量明显减少，负极侧现象不明显，证明电场可促使LCs从表皮迁移出，而对于IL-18 KO和IL-18R KO小鼠加电前后LCs数量无明显差异。我们进一步研究EFs对小鼠皮肤DCs和LCs的趋化作用,将20V外源电场施加于上述小鼠腹背部皮肤。在加电后48h，检测加电侧腹股沟引流淋巴结中DCs/LCs数量及分布。结果表明，野生小鼠背部正极电场组与对照组相比，DCs/LCs在体内从皮肤迁移至引流淋巴结的数量和比例均有所增加，电场作用下淋巴结内细胞变大；而背部负极电场组较对照组无明显差异。但对基因敲除小鼠皮肤进行电场刺激，加电与对照相比，DCs/LCs的数量和比例并未发现明显差异。进一步证实了在体状态下电场和IL-18可协同刺激LCs的定向迁移游走，且迁移与电场电极方向有关。

因此，我们认为电场和IL-18协同作用对在体和离体条件下，均可促进了DCs和LCs的定向迁移游走能力。

基于上述，这种电场的优先迁移可能允许新的非侵入性临床应用，在不受化学趋向诱导干扰的情况下，以电的方式引导和操纵组织中的细胞迁移和定位，可用于靶向特异性和精准癌症治疗，进而可能对癌症的临床治疗有所启示。

另外还有研究发现，基因疫苗注射后立即应用短脉冲电流，可显著提高转染效率和随后的疫苗特异性免疫反应。与该发现一致，我们的研究也建立了EFs增加DCs对细胞因子(IL-18,IL-18R)反应活性的理论基础。这些发现对发高效疫苗所必需的新型佐剂技术具有重要提示意义。

附图说明

图1为体外细胞加电、小鼠在体加电直流电源发生装置图。

图2-1为实施例1中体外细胞加电模式图。

图2-2为实施例1中体外细胞加电模型图。

图2-3为KG-1细胞加电后IL-18R荧光显微示踪图

图2-4为电场刺激激KG-1细胞细胞、控制IL-18R在细胞膜偏位分布和刺激LCs游走图，其中A为电场可激活KG-1细胞IL-18下游信号通路MAP38，进而刺激KG-1细胞产生干扰素数据分析图，B为电场可控制IL-18R在细胞膜偏位分布数据分析图，C为电场可刺激LCs游走数据分析图。

图2-5为电场和IL-18协同作用刺激LCs游走数据分析图。

图2-6为电场和IL-18单独或共同作用于3D培养LCs的迁移情况数据分析图。

图2-7为电场和IL-18单独或共同作用于表皮外植体LCs的迁移情况数据分析图。

图3-1为实施例2、3、4中小鼠体外加电模型图(包括电源发生装置、小鼠麻醉装置)图。

图3-2为实施例2、4中小鼠腹背部加电细节图，其中A为小鼠腹部备皮及扣式导电电极贴片放置图，B为背部电极贴片放置图。

图3-3为实施例3小鼠耳部加电细节图。

图3-4为实施例2小鼠腹股沟淋巴结摘取解剖图。

图3-5为鼠腹背部加电处理后48h腹股沟引流淋巴结中DCs/LCs数量及比例、内MHCII-high细胞变大数据分析图，其中A,B为小鼠腹背部加电处理后48h，检测加电可使腹股沟引流淋巴结中DCs/LCs数量及比例均有所增加数据分析图，C为小鼠腹背部加电处理后48h，检测加电可使腹股沟引流淋巴结中内MHCII-high细胞变大数据分析图。

图3-6为小鼠耳部皮肤加电后耳部表皮LCs分布荧光标记图

图3-7为小鼠耳部皮肤加电后耳部表皮LCs分布及数量数据分析图

图3-8为加电对WT和IL-18 KO小鼠接触性超敏反应强度的影响数据分析图。

图3-9为加电对WT和IL-18R KO小鼠接触性超敏反应强度的影响数据分析图。

图3-10为检测加电对接触性超敏反应小鼠的脾脏淋巴细胞培养上清Th1、Th2、Th17等相关细胞因子影响数据分析图。

具体实施方式

实施例1体外细胞加电实验

由于具备敏感性的同源人类DCs细胞群难以分离和维持，目前已建立几种细胞系来促进DC的研究，本实施例采用其中之一：KG-1细胞(一种细胞因子反应性的CD34+髓单核细胞细胞系)。

(1)体外细胞加电所需试剂、耗材：

①导电溶液Steinberg’s solution配制：dH2O 500ml，NaCl 3.4g,KCl0.05g,Ca(NO3).4H2O 0.08g,MgSO4.7H2O 0.205g,Trisasorf of buffer0.56g，按照上述比例混合溶解,加HCl调节PH至7.4

②导电玻璃盐桥制备：由中通的玻璃管加热弯曲制成图加电所需形状

③导电电极：将Ag丝或者AgCl丝放入Steinberg’s solution导电液

④琼脂导电盐桥凝胶制备：100ml Steinberg’s solution，2g Agarose粉末混合加热至完全溶解，灌注至上述玻璃盐桥，冷却凝固后即可使用

⑤加电装置制备：特定的直流或交变电源发生器

(2)加电细胞准备：将一定密度的细胞悬液置于培养皿内，根据细胞贴壁时间，约0.5-1.5h后进行盖片处理，完成细胞导电室。绝缘胶制备好加电槽，两侧加入含有HEPES的完全细胞培养基(HEPES维持稳定PH)，无菌导电盐桥一侧置入培养基内，另一侧置入Steinberg’s solution导电液内，接通电源即可进行加电。

(3)加电参数：

①电场类型：直流电场或者交变电场(分别配备相应电源发生器即可)

②电压：50-500mV

③加电持续时间：15min-12h

本实施例采用电场方向感知和迁移模型对实验数据进行总结，首次揭示了EF诱导的KG-1/DCs对细胞因子的反应机制，及其对DC迁移的影响。利用实时荧光显微示踪发现EFs能控制IL-18R在细胞表面的重新分布，使之偏位分布于电场正极方向的细胞膜(图2-3，图2-4B)。

我们还发现EFs能通过激活IL-18下游信号通路MAP38(图2-4A右)而刺激树突状细胞前体细胞KG-1细胞产生干扰素(图2-4A左)。IL-18R受电场控制，偏位分布于电场正极方向的细胞膜(图2-4B)。电场和IL-18协同作用刺激LC游走(图2-4C，图2-5)。

当观察EFs或IL-18单独或共同作用于3D培养LCs的迁移情况时，我们发现EFs和IL-18都不能改变LCs的迁移速度。然而，EFs和IL-18协同增加了LCs迁移速度。此外，还发现EFs也增加了LCs对IL-18的敏感性，因此在EFs存在的情况下，LCs向IL-18的来源定向迁移(图2-6)。

此外，我们以表皮外植体为模型，研究IL-18、EFs或两者同时刺激下LCs的迁移情况。发现EFs和IL-18协同作用可促进LCs从耳部表皮外植体迁移出，而IL-18和EFs单独作用下，对LCs的迁移均无明显影响。此外，实验还发现在EFs和IL-18诱导LC迁移大约需要40分钟，这表明细胞需要先被致敏或激活，以建立起必要的调节能力，然后才能启动电趋向性(图2-7)。

也就是说，在受体极化机制激活的趋化梯度存在时，施加EFs可以调控细胞的定向迁移，并且EFs和IL-18可协同作用刺激DCs/LCs定向迁移游走。

实施例2小鼠在体加电实验一

基于体外细胞加电实验的研究结果，我们认为开展局部电刺激小鼠皮肤，可消除体外实验部分的某些干扰因素，为EFs作用效果提供明确的答案。同时，转基因小鼠对于支持和验证假设意义重大，因此进一步对IL-18和IL-18R基因敲除小鼠的确认，将显著提高本研究的可靠性。

(1)研究对象选取：C57BL/6小鼠(野生型，WT)，基因敲除IL-18 KO和IL-18RKO小鼠

(2)小鼠在体加电所需耗材：

①皮肤导电电极贴片：皮肤导电电极贴选取可直接接触皮肤的医用导电材料，如一次性扣式心电电极贴片，并根据加电部位对其进行修剪以便于将电极安置于小鼠体表

②加电装置制备：特定的直流或交变电源发生器

(3)加电小鼠准备：

①小鼠加电处皮肤备皮：电推子插电剃除加电部位鼠毛，尽量剃除干净，勿损伤皮肤；电动剃须刀剃除绒毛

②抓取小鼠并绷紧背部皮肤，100ul FITC溶液点状均匀涂抹于小鼠腹部

③FITC涂抹后2个小时，采用吸入式麻醉机Isoflurance(异氟烷)麻醉小鼠，维持其生命稳态，在皮肤加电部位放置导电电极贴片，即可开始进行加电。本发明创新设计的皮肤加电方式，可对小鼠进行不同部位、不同电极方向的加电刺激。

(4)加电参数：

①电场类型：直流电场或者交变电场(分别配备相应电源发生器即可)。

②电压：2-20V

③加电持续时间：15min-3h

(5)加电后48h或72h对小鼠腹股沟引流淋巴结进行处理：

①取小鼠腹部双侧淋巴结：颈椎脱位法处死小鼠，剪开并剥离腹部皮肤，使腹膜延展并充分暴露引流淋巴结，镊子取出淋巴结

②研磨淋巴结：2片载玻片磨砂面相对研磨淋巴结，力度轻柔，直至研磨干净，收集研磨后的细胞悬液

③过滤细胞悬液：对上述细胞悬液滤网过滤，得到细胞悬液

④流式染色：流式抗体进行细胞表面染色和细胞内染色

⑤流式细胞仪上机检测相关参数

基于上述实验，我们研究EFs对小鼠皮肤DCs和LCs的趋化作用,将20V直流电场(DC+组：背部正极腹部负极组，DC-组：背部负极腹部正极组)、连续2小时作用于C57BL/6小鼠、IL-18 KO和IL-18R KO小鼠、FITC处理过的腹部皮肤。在加电处理后48h，检测加电侧腹股沟引流淋巴结中DCs/LCs数量及分布。从引流淋巴结中制备单一细胞悬液，以流式细胞分析方法检测引流淋巴结中LCs数量、比例、细胞大小等。结果发现，WT小鼠DC+组与对照组相比，DCs/LCs在体内从皮肤迁移至引流淋巴结的数量和比例均有所增加(图3-5A,B)，电场作用下淋巴结内MHCII-high细胞变大(图3-5C)；DC-组较对照组无明显差异。但IL-18 KO和IL-18R KO小鼠体内的相关数据，并未发现明显差异。

因此，我们认为电场和IL-18协同作用促进了小鼠皮肤DCs和LCs的迁移游走能力，并且电极方向会影响该过程。

实施例3小鼠在体加电实验二

为了更为直观检测EFs对表皮LCs迁移的影响，我们对小鼠耳部皮肤进行加电处理，采用荧光标记的办法显示耳部表皮LCs的分布及数量，并分析加电前后LCs的变化。

(1)研究对象选取：C57BL/6小鼠(野生型，WT)，基因敲除IL-18 KO和IL-18RKO小鼠

(2)小鼠在体加电所需耗材：

①耳部皮肤导电电极贴片：同样选取可直接接触皮肤的医用导电材料，如一次性扣式心电电极贴片，并根据小鼠耳部修剪至适宜大小，并将正负电极进行焊接，以耳夹式结构置于小鼠耳部

②加电装置制备：特定的直流或交变电源发生器

(3)加电小鼠准备：

①小鼠加电皮肤备皮：耳部加电皮肤可不做特殊处理

②电极放置：在小鼠耳部放置自制耳夹式导电电极贴片，采用吸入式麻醉机Isoflurance(异氟烷)麻醉小鼠，维持其生命稳态，即可开始进行加电。

(4)加电参数：

①电场类型：直流电场或者交变电场(分别配备相应电源发生器即可)。

②电压：2-10V

③加电持续时间：15min-3h

(5)加电后对小鼠耳部进行处理：

①摘取小鼠耳部皮片：颈椎脱位法处死小鼠，脱毛膏进行耳部脱毛，沿耳缘剪下加电侧和未加电侧耳部

②分离耳部皮片：将耳部皮片钝性分离，一分为二，刮除耳部软骨；EDTA 4℃过夜消化，分离真表皮，获取耳部表皮皮片

③封闭、固定、荧光抗体染色：选取LCs特异性抗体进行染色(MHC-II等)

④铺片、荧光显微镜观察拍照

⑤表皮皮片免疫细胞计数分析

上述实验研究发现，加电组(DC,5V，正极侧)与对照组相比，LCs数量明显减少，即DC正极促使表皮LCs从表皮迁移出。而在IL-18 KO和IL-18R KO小鼠体内，加电前后LCs数量无明显差异(图3-6,3-7)。进一步证实EFs和IL-18可协同刺激在体状态下LCs的迁移游走。

实施例4小鼠在体加电实验三

我们同样选取C57BL/6小鼠(野生型，WT)、基因敲除IL-18 KO和IL-18RKO小鼠为研究对象，针对EFs对小鼠体内DCs/LCs迁移的影响是否与体外结果一致，继续进行验证。

(1)小鼠选取：C57BL/6小鼠(野生型，WT)，基因敲除IL-18 KO和IL-18RKO小鼠

(2)小鼠在体加电所需耗材：

①皮肤导电电极贴片：皮肤导电电极贴选取可直接接触皮肤的医用导电材料，如一次性扣式心电电极贴片，并根据加电部位对其进行修剪以便于将电极安置于小鼠体表。

②加电装置制备：特定的直流或交变电源发生器

(3)加电小鼠准备：

①小鼠加电皮肤备皮：电推子插电剃除腹部鼠毛，尽量剃除干净，勿损伤皮肤；电动剃须刀剃除绒毛。

②抓取小鼠并绷紧背部皮肤，100ul FITC溶液点状均匀涂抹于小鼠腹部。

③FITC涂抹后2个小时，在加电部位放置导电电极贴片，采用吸入式麻醉机Isoflurance(异氟烷)麻醉小鼠，维持其生命稳态，即可开始进行加电。本发明创新设计的皮肤加电方式，可对小鼠进行不同部位、不同电极方向的加电刺激。

(4)加电参数：

①电场类型：直流电场或者交变电场(分别配备相应电源发生器即可)

②电压：2-20V

③加电持续时间：15min-3h

(5)加电后对小鼠耳部进行处理：

①加电后第6天测量记录小鼠耳部厚度，并取20ul FITC溶液点状均匀涂抹于小鼠耳部。

②分别于第7、8、9天测量测量记录小鼠耳部厚度。

(6)加电后对小鼠脾脏进行处理：

①获取并研磨脾脏：加电后第9天，颈椎脱位处死小鼠，腹部解剖，摘取脾脏。将每个脾脏剪成2-3份，2片载玻片磨砂面相对挤压、研磨脾脏，力度轻柔，直至研磨干净，将含有细胞的液体收集入培养皿。

②收集细胞得到细胞悬液：将培养皿内液体进行滤网过滤，得到细胞悬液。

③裂解红细胞：上述细胞悬液离心，弃上清。手指弹拨离心管底部，使细胞松散,每管加入5ml红细胞裂解液。室温条件裂解4-5min后，每管加入10ml培养基终止裂解。

④洗细胞：10ml培养基离心，洗3次。每次加入10ml培养基重悬细胞。

⑤培养细胞：离心后10ml完全培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至标记好的无菌小培养皿，箱培养2-3小时，使贴壁细胞贴壁。

⑥收集B和T细胞：十字交叉摇晃培养皿使不贴壁的B和T细胞重悬，转移至25ml培养瓶，培养，进行细胞计数。

⑦抗体包板：anti-CD3、anti-CD28溶液包板，4℃过夜。

⑧洗板、铺板：无菌的PBS洗板3次。每孔加入细胞密度在2x 10⁶/ml、200μl细胞悬液，培养。

⑨收取细胞上清：分别收取24h、48h细胞上清。并将其转移至-80℃冰箱冻存。

⑩细胞因子检测：择期应用CBA技术检测细胞上述细胞上清Th1、Th2、Th17相关细胞因子表达。

我们检测不同时间点EFs对不同基因型小鼠接触性超敏反应强度的影响。实验发现：对于WT小鼠，与不加电对照组相比，EFs(DC 20V：直流电，电压20V；背部正极腹部负极)对激发耳肿胀度有促进作用；而在IL-18 KO和IL-18RKO小鼠体内，EFs与不加电对照组相比，耳肿胀度均无明显差异(图3-8，图3-9)。我们认为EFs刺激可增强小鼠接触性超敏反应强度，并且该过程需要IL-18与IL-18R参与，二者共同调控机体免疫应答反应，从而在反应早期LC的游走过程中发挥作用。

在小鼠接触性超敏反应模型中，我们进一步检测了EFs对LCs促进脾脏T淋巴细胞分化的影响。

检测接触性超敏反应小鼠的脾脏淋巴细胞培养上清Th1、Th2、Th17等相关细胞因子，发现对于WT小鼠，加电组与对照组相比，Th1相关细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF)，Th2相关细胞因子(IL-4、IL-6和IL-10)，Th17相关细胞因子(IL-17A)的表达均不同程度增加(图3-10)，而对于IL-18 KO和IL-18R KO小鼠而言，上述细胞因在表达量差异并不明显。初步发现EFs可增强LCs对脾脏细胞T淋巴细胞Th1、Th2、Th17的分化，该过程需要IL-18和IL-18R的参与。

本发明确认电场刺激是一种很独特的可促进免疫细胞定向迁移的方法，电场作用可调控免疫细胞的迁移数量、时间和方向。传统意义上，机体在受到抗原刺激后，主要依靠DCs/LCs主动迁移游走到引流淋巴结，进而与T细胞参与相关免疫反应，这一自然过程主要依赖于机体自身免疫力。但当外界对机体施加电场刺激后，免疫细胞可大量、快速、有方向性进行迁移，更多细胞被激活并高效参与抗原捕捉、免疫应答，从而有助于更精确地调节免疫反应。

这种电场刺激的迁移方式允许新的非侵入性临床应用，在不受化学趋向诱导干扰的情况下，以电的方式引导和操纵组织中的细胞迁移和定位，可用于靶向特异性免疫调节剂和精准癌症治疗，同时会减少目前临床常见的副作用。而且与目前常用的免疫调节剂相比，电场刺激可调节范围广，操作条件易于优化，电场刺激成本较低，也有助于减轻患者和社会的经济负担。

因此无论是将电场刺激作为佐剂单独应用于某些新疫苗，还是与现有铝盐佐剂或其他类型佐剂混合使用，都有可能更精准地调节疫苗免疫应答，放大原有疫苗免疫效应，减少既往疫苗佐剂引发的不良反应，从而为研制出拥有自主知识产权的新型疫苗佐剂提供新思路和新策略。

总之，本发明的电场干预手段为DCs/LCs或其他免疫细胞的定位或迁移提供了新的方法，进而有助于增强免疫反应或者抗肿瘤反应、开发新型免疫调节剂、将电场作为新型佐剂应用于优化疫苗的生产。

Claims (1)

1.电场刺激和IL-18在促进体外培养的LCs细胞迁移中的用途。