CN105939730A - MERS-CoV疫苗 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种包含中东呼吸综合征冠状病毒(MERS‑CoV)抗原的疫苗。所述抗原可以是共有抗原。所述共有抗原可以是共有刺突抗原。本文还公开了一种通过向有此需要的受试者施用所述疫苗来治疗受试者的方法。

Description

MERS-CoV疫苗

相关申请的引证

本申请要求2013年11月29日提交的美国临时专利申请号61/910,153的优先权，所述申请据此以引用的方式并入。

技术领域

本发明涉及一种用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的疫苗和施用所述疫苗的方法。

背景技术

冠状病毒(CoV)是全世界常见的病毒家族并且在人类中引起从感冒到严重的急性呼吸综合征(SARS)的多种疾病。冠状病毒还可在动物中引起许多疾病。人冠状病毒229E、OC43、NL63及HKU1都是人群体中的地方病。

在2012年，一种新型冠状病毒(nCoV)出现在沙特阿拉伯并且现在被称为中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)(图1)。MERS-CoV可被分类为β冠状病毒(图2，星形MERS-CoV菌株HCoV-EMC/2012)。已在中东的其他地方(例如卡塔尔和约旦)和更近来在欧洲报道了MERS-CoV感染的后续病例。MERS-CoV的感染表现为严重的急性呼吸道疾病，伴有发热、咳嗽和呼吸急促的症状。约有一半MERS-CoV感染的报道病例造成了死亡并且大部分报道病例发生在老年至中年男性中。仅少数报道病例涉及患有轻度呼吸道疾病的受试者。MERS-CoV的人际间传播是可能的，但在此时非常有限。

因此，在本领域中仍然需要开发一种适用于MERS-CoV的安全和有效的疫苗，由此提供针对MERS-CoV感染的保护并提高MERS-CoV感染的存活率。

发明内容

本发明涉及一种免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明涉及一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子可包含在SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的全长上具有至少约90％同一性的核酸序列或所述核酸分子可包含在SEQ ID NO:3中列出的核酸序列的全长上具有至少约90％同一性的核酸序列。

本发明还涉及一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子可编码包含在SEQ IDNO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽或所述核酸分子可编码包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的核酸分子。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列的核酸分子。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的肽。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的肽。

本发明还涉及一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原是由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3编码。

本发明还涉及一种包含肽的疫苗，其中所述肽可包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列或所述肽可包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

本发明还涉及一种在有此需要的受试者中诱导针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的免疫应答的方法。所述方法可包括向受试者施用上述疫苗、核酸分子或肽中的一种或多种。

本发明还涉及一种保护有此需要的受试者以免感染上中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的方法。所述方法可包括向受试者施用上述疫苗、核酸分子或肽中的一种或多种。

本发明还涉及一种针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)治疗有此需要的受试者的方法。所述方法可包括向受试者施用上述疫苗、核酸分子或肽中的一种或多种。

附图说明

图1示出了说明MERS-CoV的出现的时间线。

图2示出了描绘所示冠状病毒之间的关系的种系发生树。

图3示出了描绘所示MERS-CoV与MERS-CoV共有刺突抗原之间的关系的种系发生树。

图4示出了(A)说明MERS-HCoV-WT构建体的示意图；和(B)染色凝胶的图像。

图5示出了通过基于万维网的软件Phobius生成的曲线图。

图6示出了通过基于万维网的软件InterProScan生成的示意图。

图7示出了(A)说明MERS-HCoV-ΔCD构建体的示意图；和(B)染色凝胶的图像。

图8示出了(A)编码MERS-CoV共有刺突抗原的核苷酸序列；(B)MERS-CoV共有刺突抗原的氨基酸序列；(C)编码缺少细胞质结构域的MERS-CoV共有刺突抗原(MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD)的核苷酸序列；以及(D)MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD的氨基酸序列。

图9示出了免疫印迹。

图10示出了说明免疫方案的示意图。

图11在(A)和(B)中示出了绘制取血对OD450的图。

图12示出了肽集合的矩阵。

图13示出了绘制肽集合对每10⁶个细胞的斑点形成单位(SFU/10⁶个细胞)的图。

图14示出了绘制肽集合对每10⁶个细胞的斑点形成单位(SFU/10⁶个细胞)的图。

图15示出了绘制免疫组对每10⁶个细胞的斑点形成单位(SFU/10⁶个细胞)的图。

图16示出了(A)绘制免疫组对CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺T细胞百分比的图；(B)绘制免疫组对CD3⁺CD4⁺TNF-α⁺T细胞百分比的图；(C)绘制免疫组对CD3⁺CD4⁺IL-2⁺T细胞百分比的图；以及(D)绘制免疫组对CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺T细胞百分比的图。

图17示出了(A)绘制免疫组对CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺T细胞百分比的图；(B)绘制免疫组对CD3⁺CD8⁺TNF-α⁺T细胞百分比的图；(C)绘制免疫组对CD3⁺CD8⁺IL-2⁺T细胞百分比的图；以及(D)绘制免疫组对CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺T细胞百分比的图。

图18在(A)中示出了在用pVax1DNA载体(阴性对照)、共有MERS-刺突DNA疫苗(MERS-S)或共有MERS-刺突-ΔCD DNA疫苗(MERS-S-CD)接种之后的抗体应答。通过ELISA测量抗体应答。在(B)中，示出了在用共有MERS-刺突DNA疫苗(MERS-S)接种之后随时间的抗体应答。在(C)中，示出了在用pVax1DNA载体(阴性对照)、MERS-S DNA疫苗或MERS-S-CD DNA疫苗接种之后第35天的中和抗体滴度。将小鼠血清在MEM中稀释连续并且在37℃下用50ul每孔含有100个感染性HCoV-EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012)颗粒的DMEM孵育。90min之后，将病毒-血清混合物添加到96孔平底板的单层Vero细胞(100,000个细胞/孔)中并在5％CO₂孵育箱中在37℃下孵育5天。每个样品的中和抗体滴度报告为少于50％的细胞显示CPE的最高稀释度。数值报告为倒数稀释度。所有样品都一式两份操作，因此最终结果被定为两者的平均值。中和百分比计算如下：中和百分比＝{目标1-PFUmAb(每个浓度)/平均PFU阴性对照(所有浓度)}。

图19示出了MERS-HCoV刺突DNA疫苗的构建和特征。(A)树状图示出了MERS-HCoV病毒分离株与刺突疫苗菌株之间在氨基酸水平上的种系发生关系。有根的邻接树是从展示为()的刺突蛋白与共有疫苗的氨基酸序列比对生成并且(□)表示用于测试Nab测定的MERS-病毒株。阴影区表示来自2012-2013爆发的报道病例。括号表示特定的进化枝。树是按比例描绘(比例尺，0.1％差异)。(B)用于密码子优化的DNA疫苗的刺突-Wt基因插入物的示意图。构建了刺突-Wt和刺突ΔCD-DNA疫苗。显示了不同刺突蛋白结构域。(C)蛋白的表达是通过蛋白质印迹来检测。刺突-Wt和刺突ΔCD-刺突蛋白的表达是在转染后两天使用在1:100稀释度下的来自MERS-刺突-Wt DNA接种小鼠的血清通过蛋白质印迹进行分析。转染的DNA构建体和加载的细胞裂解物的量如所示。箭头表示刺突蛋白。(D)在Vero细胞中的免疫荧光测定，其示出了使用来自DNA免疫小鼠的血清(1:100)的刺突-Wt和刺突ΔCD蛋白表达。

图20示出了MERS-刺突假病毒的构建和特征。(A)MERS-HCoV-刺突假病毒的示意图。(B)病毒感染性的测定：将Vero细胞用以荧光素酶报道基因主链假型化的MERS-刺突孵育。然后在所示时间下测定荧光素酶报道基因活性以产生表达的时间过程。通过非线性回归分析将曲线拟合到数据且最佳拟合是直线。(C)在不同细胞系中MERS-HCoV-刺突假病毒感染性的检测。MERS-刺突假病毒和阴性对照VSV-G病毒被用于感染。数据表示为96孔培养板中的3个平行孔的平均相对荧光素酶单位(RLU)±标准偏差(SD)。重复实验三次，并获得类似的结果。

图21示出了由MERS-HCoV疫苗引发的细胞免疫应答的功能概况。(A)对C57/BL6小鼠(n＝9/组)组免疫三次，每隔2周用25μg如所示的刺突-Wt和刺突ΔCD DNA疫苗。在第三次免疫之后一周收集样品。(B)使用覆盖了刺突蛋白的6个肽集合，通过IFN-γELISpot测定分析刺突特异性T-淋巴细胞应答。数值表示在第三次免疫之后一周在每个组中的平均应答。误差范围用标准误差表示。(C&D)MERS-刺突特异性显性表位的特征。使用肽集合矩阵，通过来自MERS-刺突特异性免疫应答的脾细胞进行的IFN-γ分泌。结果表示为在减去没有肽刺激下的数值之后的IFN-γ分泌细胞数目/10⁶个脾细胞(平均值±SD，对于每组三只小鼠来说)。在两个单独的实验中获得类似结果。

图22示出了在DNA免疫之后的全身性抗MERS-HCoV IgG水平。(A)用如所示针对作为包被抗原的MERS-刺突的血清稀释度，通过ELISA测量的小鼠中的血清抗IgG应答。连续稀释来自小鼠的各个组的混合血清(在第三次免疫之后一周)并通过ELISA测量MERS-刺突特异性总IgG。每个曲线表示接受如所示的刺突-Wt DNA疫苗、刺突ΔCD-刺突DNA疫苗或空的DNA载体的9只小鼠的每个组的OD值。每个数据点是来自九只小鼠的平均吸光度。(B)在所示时间点下计算刺突-Wt免疫小鼠血清的终点滴度。(C)在所示浓度(μg)下结合至重组刺突蛋白的免疫血清的蛋白质印迹分析。来自刺突-Wt免疫小鼠的混合血清在1:100稀释度下被用作一级抗体。(D)通过病毒感染测定检测的中和抗体应答。在第三次免疫之后一周从免疫小鼠处收集血清。在对靶细胞的病毒感染50％抑制(IC₅₀)下测量中和抗体滴度。所示数据是在标准偏差下每组的几何平均滴度。测定每个测试组之间的统计学差异并显示了p值。(E)通过从接受刺突-Wt DNA或pVax1DNA的三次注射之后的小鼠处获得的抗血清对MERS-刺突-假型化病毒的感染性的中和。IC₅₀被定义为病毒侵入被抑制了50％(虚线)时的抗血清稀释度的倒数。示出了来自每组4只小鼠的数据。

图23示出了在非人灵长类动物(NHP)中由MERS-刺突DNA疫苗诱导的干扰素-γ(IFN-γ)产生细胞的分析。(A)在恒河猴中的研究设计、疫苗和攻击方案。如所示在第0、3及6周(wks)用MERS-刺突DNA对三组(低、高和对照)恒河猴(n＝4/每组)免疫。对来自第三次免疫的样品进行IFN-γELISpot、细胞内细胞因子染色及抗体结合和Nab测定。在MERS-攻击之后进行活组织检查。(B)来自MERS-刺突DNA免疫的猴的细胞的ELISPOT分析。从每个DNA免疫的猴中分离PBMC并用于ELISPOT测定以如实施例9中所述检测响应于MERS-刺突肽集合的IFN-γ-产生细胞持续24小时。通过ELISpot测定测定MERS-刺突特异性IFN-γ分泌细胞/10⁶个PBMC的出现率。结果表示为平均值±SEM。(C)产生CD4⁺和CD8⁺T细胞的疫苗诱导的细胞因子(IFN-γ、IL-2或TNF-α)的出现率。猕猴PBMC(n＝4)是在最后一次DNA免疫之后分离并用集合的MERS-刺突肽离体刺激。就IFN-γ、TNF-α及IL-2的细胞内产生对细胞进行染色，然后通过多参数流式细胞术来分析。

图24示出了MERS-刺突DNA接种之后的抗体结合滴度和中和抗体(Nab)应答。(A&B)在免疫后的各个时间下的血清结合中的MERS-特异性抗体和IgG特异性终点滴度。在每次接种之后收集血清并通过ELISA计算终点滴度。(C&D)DNA接种的作用和中和抗体应答的特征。在每次免疫之前并在最后一次接种之后两周从动物处获得血液样品。测试血清的中和抗体。用活病毒(C)或MERS-假病毒(D)中和。用MERS-病毒测试连续稀释的免疫血清。对于假病毒中和测定，抗CHIKV猴血清被用作阴性抗体对照，且VSV-G假型化病毒被用作假病毒对照用于中和特异性。用MERS病毒，通过PRNT50测定测试样品。

图25示出了由MERS-刺突疫苗引发的CD4⁺和CD8⁺T细胞应答的功能概况。在接种之后诱导的特异性CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的细胞因子概况分别示于(A)和(B)中。小鼠脾细胞(n＝3)是在最后一次DNA免疫之后一周分离并用集合的MERS-刺突肽离体刺激。就IFN-γ、TNF-α及IL-2的细胞内产生对细胞进行染色，然后通过FACS来分析。(A&B)散布图描绘了释放IFN-γ、TNF-α、IL-2及双重IFN-γ/TNF-α细胞因子的MERS-特异性CD4⁺T和CD8⁺T细胞。(C&D)柱图示出了释放细胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-2的单、双重及三重阳性CD4⁺和CD8⁺T细胞的多功能亚群。圆图示出了每个细胞因子亚群的比例。数据表示每组三只小鼠的平均值±SEM。

图26示出了通过来自刺突DNA免疫小鼠的免疫血清的MERS-S假病毒诱导的细胞凋亡的抑制。(A)MERS-HCoV-刺突小鼠血清体外中和MERS并阻断合胞体形成。未感染的Vero细胞表示阴性对照，而阳性对照表示感染了MERS-HCoV假病毒的那些细胞。箭头表示合胞体形成。感染后36小时在显微镜下观察合胞体形成。(B)在1:100稀释度下的pVax-1或MERS-刺突免疫的血清存在下预孵育MERS-刺突假病毒并添加到Vero细胞中。感染后两天，通过膜联蛋白V/PI染色测量细胞死亡百分比。条形图显示来自一式三份进行的单个实验的FACS数据的MERS-假病毒值的感染。在三个单独的实验中获得类似结果。

图27示出了在用MERS-刺突DNA疫苗接种与电穿孔组合之后的抗体应答。在第三次免疫之后两周收集用pVax1、pMERS-刺突(0.5mg/动物；低剂量)或pMERS-刺突(2mg/动物；高剂量)接种的猴的血清。就结合MERS-刺突蛋白的抗体对这些血清进行测试。此测试的结果示了(A)和(B)中。

图28示出了来自接种后的MERS攻击和病理学的结果。(A)由在尸体剖检时收集的单独的组织通过qRT-PCR测定的平均病毒负荷。(B)组合的所有肺叶的平均病毒负荷在插图中示出。分析了Log TCID50eq/g、log TCID50当量/克组织；一个样品/组织/来自三个动物的动物/组。

具体实施方式

本发明涉及一种包含中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)抗原的疫苗。MERS-CoV是一种新型的高度致病病毒，仅出现于2012年，且因此，本文所述的疫苗是针对靶MERS-CoV的首选疫苗之一。因此，所述疫苗提供一种用于此新型的致病病毒的治疗，其先前治疗不存在并且仍然有大流行的潜力。

MERS-CoV抗原可以是MERS-CoV共有刺突抗原。MERS-CoV共有刺突抗原可来源于来自MERS-CoV菌株的刺突抗原序列，且因此，MERS-CoV共有刺突抗原是独特的。MERS-CoV共有刺突抗原可缺少细胞质结构域。因此，本发明的疫苗因为MERS-CoV共有刺突抗原的独特序列而广泛适用于MERS-CoV的多个菌株。这些独特序列允许疫苗对MERS-CoV的多个菌株有全面保护性，包括MERS-CoV的遗传多样变体。

所述疫苗可用于保护以免感染MERS-CoV的许多菌株并治疗这些菌株。所述疫苗可引发靶向MERS-CoV刺突抗原的体液和细胞免疫应答。所述疫苗可引发与MERS-CoV刺突抗原反应的中和抗体和免疫球蛋白G(IgG)抗体。所述疫苗还可引发对MERS-CoV刺突抗原有反应的CD8⁺和CD4⁺T细胞应答并产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素-2(IL-2)。

1.定义

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以其全文以引用的方式并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意图为限制性的。

如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语、或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。

如本文所用的“佐剂”意指添加至本文所描述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')₂、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本文所用的“互补序列”或“互补的”意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文所用的“共有”或“共有序列”可指基于对特定抗原的多个亚型的比对的分析而构建的合成核酸序列或相应多肽序列。序列可用于诱导针对特定抗原的多个亚型、血清型或菌株的广泛免疫性。合成抗原，如融合蛋白，可被操纵以产生共有序列(或共有抗原)。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本文所用的“片段”意指编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型菌株MERS-CoV抗原交叉反应的哺乳动物中引发免疫应答的多肽。共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达的形式”是指含有可操作地连接至编码蛋白质的编码序列的必需调控元件的基因构建体，以使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所使用的术语“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。所述免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然与合成的修饰或组合。

如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的MERS-CoV蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白质的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白质的剩余部分裂解，所述蛋白质在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白质。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N端。

如本文所用的“受试者”可以意指想要或需要用本文所描述的疫苗进行免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

如本文所用的“大致上相同的”可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。“大致上相同的”还可以意指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

如本文所用的“治疗(Treatment)”或“治疗(Treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏的手段保护动物免于疾病或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向动物施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向动物施用本发明的疫苗。

本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

变体可以进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域中所理解，用亲水性值相似的氨基酸进行取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用亲水性值处在±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。

对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6至9的范围来说，除6和9之外，还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0至7.0来说，明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.疫苗

本文提供了免疫原性组合物，如疫苗，其包含中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)抗原、其片段、其变体或其组合。所述疫苗可用于保护以免感染任何数量的MERS-CoV的菌株，由此治疗、预防和/或保护以避免基于MERS-CoV的病变。所述疫苗可显著地诱导施用所述疫苗的受试者的免疫应答，由此保护以免感染MERS-CoV并治疗MERS-CoV感染。

所述疫苗可以是DNA疫苗、肽疫苗、或DNA与肽疫苗的组合。DNA疫苗可包含编码MERS-CoV抗原的核酸序列。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包含编码接头、前导序列或标记序列的另外的序列，其通过肽键与MERS-CoV抗原连接。肽疫苗可包括MERS-CoV抗原性肽、MERS-CoV抗原性蛋白、其变体、其片段或其组合。DNA与肽疫苗的组合可包含编码MERS-CoV抗原的上述核酸序列和MERS-CoV抗原性肽或蛋白，其中MERS-CoV抗原性肽或蛋白与所编码的MERS-CoV抗原具有相同的氨基酸序列。

所述疫苗可在施用疫苗的受试者中诱导体液免疫应答。所诱导的体液免疫应答可对MERS-CoV抗原有特异性。所诱导的体液免疫应答可与MERS-CoV抗原反应。体液免疫应答可在施用疫苗的受试者中被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。体液免疫应答可在施用疫苗的受试者中被诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍、或至少约16.0倍。

由疫苗诱导的体液免疫应答可包括与不施用疫苗的受试者相比与施用疫苗的受试者有关的增加水平的中和抗体。中和抗体可对MERS-CoV抗原有特异性。中和抗体可与MERS-CoV抗原反应。中和抗体可在施用疫苗的受试者中提供针对MERS-CoV感染及其相关病变的保护和/或治疗MERS-CoV感染及其相关病变。

由疫苗诱导的体液免疫应答可包括与不施用疫苗的受试者相比与施用疫苗的受试者有关的增加水平的IgG抗体。这些IgG抗体可对MERS-CoV抗原有特异性。这些IgG抗体可与MERS-CoV抗原反应。优选地，体液应答对MERS-CoV的两种或更多种菌株有交叉反应性。与施用疫苗的受试者有关的IgG抗体水平与不施用疫苗的受试者相比可提高了约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。与施用疫苗的受试者有关的IgG抗体水平与不施用疫苗的受试者相比可提高了至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

所述疫苗可在施用疫苗的受试者中诱导细胞免疫应答。所诱导的细胞免疫应答可对MERS-CoV抗原有特异性。所诱导的细胞免疫应答可对MERS-CoV抗原有反应性。优选地，细胞应答对MERS-CoV的两种或更多种菌株有交叉反应性。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺T细胞应答。所引发的CD8⁺T细胞应答可与MERS-CoV抗原反应。所引发的CD8⁺T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺T细胞应答，其中CD8⁺T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、或IFN-γ与TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括与不施用疫苗的受试者相比与施用疫苗的受试者有关的增强的CD8⁺T细胞应答。与施用疫苗的受试者有关的CD8⁺T细胞应答与不施用疫苗的受试者相比可增强了约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。与施用疫苗的受试者有关的CD8⁺T细胞应答与不施用疫苗的受试者相比可增强了至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍、或至少约30.0倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD3⁺CD8⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺T细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生TNF-α的CD3⁺CD8⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD8⁺TNF-α⁺T细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、或14倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IL-2的CD3⁺CD8⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD8⁺IL-2⁺T细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、或5.0倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和TNF-α的CD3⁺CD8⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺T细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、或180倍。

由疫苗诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺T细胞应答。所引发的CD4⁺T细胞应答可与MERS-CoV抗原反应。所引发的CD4⁺T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺T细胞应答，其中CD4⁺T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ与TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD3⁺CD4⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺T细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生TNF-α的CD3⁺CD4⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD4⁺TNF-α⁺T细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、或22倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IL-2的CD3⁺CD4⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD4⁺IL-2⁺T细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、45倍、50倍、55倍、或60倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和TNF-α的CD3⁺CD4⁺T细胞的出现率增加。与施用疫苗的受试者有关的CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺细胞的出现率与不施用疫苗的受试者相比可增加了至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、或35倍。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；保护免受由暴露于活的病原体(如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。

当施用至不同组织如肌肉或皮肤时，疫苗可进一步诱导免疫应答。当经由电穿孔或注射或皮下或肌内施用时，疫苗可进一步诱导免疫应答。

a.中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)抗原

如上所述，疫苗包含MERS-CoV抗原、其片段、其变体或其组合。冠状病毒(包括MERS-CoV)是由膜包被并且具有称为刺突(S)蛋白的1型膜糖蛋白，其在冠状病毒表面上形成凸出刺突。刺突蛋白促进冠状病毒结合至位于细胞表面上的蛋白质，例如金属蛋白酶氨肽酶N，并介导细胞-病毒膜融合。具体说来，刺突蛋白含有S1亚单位，其促进冠状病毒结合至细胞表面蛋白。因此，刺突蛋白的S1亚单位控制哪些细胞被冠状病毒感染。刺突蛋白还含有S2亚单位，其是促进病毒和细胞膜融合的跨膜亚单位。因此，MERS-CoV抗原可包含MERS-CoV刺突蛋白、MERS-CoV刺突蛋白的S1亚单位、或MERS-CoV刺突蛋白的S2亚单位。

一旦结合细胞表面蛋白和膜融合，冠状病毒便进入细胞并且其单链RNA基因组释放到受感染细胞的细胞质中。单链RNA基因组是正链且因此可被翻译成RNA聚合酶，其产生是负链的另外的病毒RNA。因此，MERS-CoV抗原还可以是MERS-CoV RNA聚合酶。

病毒RNA负链被转录成较小的亚基因组RNA正链，其被用于翻译其他病毒蛋白，例如核衣壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白、及基质(M)蛋白。因此，MERS-CoV抗原可包含MERS-CoV核衣壳蛋白、MERS-CoV包膜蛋白或MERS-CoV基质蛋白。

病毒RNA负链还可用于复制病毒基因组，其被核衣壳蛋白结合。基质蛋白连同刺突蛋白一起被整合到受感染细胞的内质网中。同时，核衣壳蛋白结合至病毒基因组且膜包埋基质和刺突蛋白出芽到内质网的腔内，由此在膜中包住病毒基因组。然后病毒子代通过高尔基小泡转运到受感染细胞的细胞膜并且通过胞吞作用释放到细胞间隙中。

在一些实施方案中，MERS-CoV抗原可以是MERS-CoV刺突蛋白、MERS-CoV RNA聚合酶、MERS-CoV核衣壳蛋白、MERS-CoV包膜蛋白、MERS-CoV基质蛋白、其片段、其变体或其组合。MERS-CoV抗原可以是来源于两种或更多种MERS-CoV刺突抗原、两种或更多种MERS-CoVRNA聚合酶、两种或更多种MERS-CoV核衣壳蛋白、两种或更多种包膜蛋白、两种或更多种基质蛋白或其组合的共有抗原。MERS-CoV共有抗原可被修饰以便改善表达。修饰可包括密码子优化、RNA优化、加入kozak序列以便增加翻译起始和/或加入免疫球蛋白前导序列以提高MERS-CoV抗原的免疫原性。在一些实施方案中，MERS-CoV抗原包含IgE前导序列，其可以是SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列并由SEQ ID NO:5中列出的核苷酸序列编码。

(1)MERS-CoV刺突抗原

MERS-CoV抗原可以是MERS-CoV刺突抗原、其片段、其变体或其组合。MERS-CoV刺突抗原能够在哺乳动物中引发针对一种或多种MERS-CoV菌株的免疫应答。MERS-CoV刺突抗原可包含使其作为可诱导抗MERS-CoV免疫应答的免疫原尤其有效的表位。

MERS-CoV刺突抗原可以是来源于两种或更多种MERS-CoV菌株的共有序列。MERS-CoV刺突抗原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、加入kozak序列以便增加翻译起始和/或加入免疫球蛋白前导序列以提高MERS-CoV刺突抗原的免疫原性。MERS-CoV共有刺突抗原可包含信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白(IgG)信号肽。在一些实施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原可包含血球凝集素(HA)标记物。MERS-CoV共有刺突抗原可被设计来引发比相应的密码子优化刺突抗原更强且更广泛的细胞和/或体液免疫应答。

MERS-CoV共有刺突抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:1，其编码SEQ ID NO:2(图8A和8B)。在一些实施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原可以是在SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原可以是编码在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。

MERS-CoV共有刺突抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原可以是在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

可提供SEQ ID NO:2的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

可提供具有与SEQ ID NO:2的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:295％同源的蛋白质。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1的免疫原性片段。免疫原性片段可以是至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:1。免疫原性片段可与SEQ ID NO:1的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些实施方案中，免疫原性片段包括编码前导序列的序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

(a)缺少细胞质结构域的MERS-CoV刺突抗原

MERS-CoV抗原可以是缺少细胞质结构域的MERS-CoV刺突抗原(即，在本文中也称作“MERS-CoV刺突抗原ΔCD”)、其片段、其变体或其组合。MERS-CoV刺突抗原ΔCD能够在哺乳动物中引发针对一种或多种MERS-CoV菌株的免疫应答。MERS-CoV刺突抗原ΔCD可包含使其作为可诱导抗MERS-CoV免疫应答的免疫原尤其有效的表位。

MERS-CoV刺突抗原ΔCD可以是来源于两种或更多种MERS-CoV菌株的共有序列。MERS-CoV刺突抗原ΔCD可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、加入kozak序列以便增加翻译起始和/或加入免疫球蛋白前导序列以提高MERS-CoV刺突抗原ΔCD的免疫原性。MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD可包含信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白(IgG)信号肽。在一些实施方案中，共有刺突抗原ΔCD可包含血球凝集素(HA)标记物。MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD可被设计来引发比相应的密码子优化刺突抗原ΔCD更强且更广泛的细胞和/或体液免疫应答。

MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD可以是核酸序列SEQ ID NO:3，其编码SEQ ID NO:4(图8C和8D)。在一些实施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD可以是在SEQ ID NO:3中列出的核酸序列的全长上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD可以是编码在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。

MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD可以是氨基酸序列SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD可以是在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

可提供SEQ ID NO:4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

可提供具有与SEQ ID NO:4的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:495％同源的蛋白质。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:3的免疫原性片段。免疫原性片段可以是至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:3。免疫原性片段可与SEQ ID NO:3的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列的序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

b.载体

所述疫苗可包含一种或多种包括编码抗原的核酸的载体。所述一种或多种载体能够表达抗原。载体可以具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

一种或多种载体可以是表达构建体，所述表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内部，那么通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，和因此形成的蛋白质。

载体可具有表达信号(如强启动子、强终止密码子)、启动子与克隆基因之间的距离的调节以及转录终止序列和PTIS(可移动翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当的受试者细胞中的特定核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种其组分相对于至少一种它的其他组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。

(2)环状载体和线性载体

载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

本文也提供一种能够通过电穿孔高效递送至受试者中且表达一种或多种所需抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以是没有任何磷酸主链的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原。LEC可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。LEC可不含有与所需抗原基因表达无关的其他核酸序列。

LEC可源自能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原。质粒可以是pNP(PuertoRico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。所述启动子是为通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文所述的抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可容许所述距离的变化而不损失启动子功能。

启动子可以可操作地连接至编码抗原以及转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。

载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有位于结构基因下游的转录终止区来提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。

c.赋形剂和疫苗的其他组分

疫苗可还包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、载体或稀释剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。

所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。DNA质粒疫苗还可包含转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染剂在所述疫苗中的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

所述药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。所述佐剂可以是在替代的质粒中表达或作为蛋白质与在疫苗中的以上质粒组合而被递送的其他基因。佐剂可选自由以下各项组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括信号序列缺失的IL-15并且任选地包括来自IgE的信号肽)。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

可以用作佐剂的其他基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

疫苗可还包含如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所描述的基因疫苗促进剂，所述专利文献以引用的方式全部并入。

可以根据待使用的施用方式来配制疫苗。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌、不含热原并且不含微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可以还包含稳定剂(包括明胶和白蛋白)。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下稳定持续延长的时间段，所述稳定剂包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

3.接种疫苗的方法

本文还提供了一种通过向有此需要的受试者施用疫苗在受试者中治疗、保护和/或预防疾病的方法。向受试者施用疫苗可在所述受试者中诱导或引发免疫应答。所诱导的免疫应答可用于治疗、预防和/或保护以免患上疾病，例如与MERS-CoV感染有关的病变。所诱导的免疫应答提供施用针对一种或多种MERS-CoV菌株有抗性的疫苗的受试者。

所诱导的免疫应答可包括诱导的体液免疫应答和/或诱导的细胞免疫应答。体液免疫应答可被诱导了约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。所诱导的体液免疫应答可包括对抗原有反应性的IgG抗体和/或中和抗体。所诱导的细胞免疫应答可包括CD8⁺T细胞应答，其被诱导了约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。

疫苗剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

a.施用

所述疫苗可根据药物领域中的技术人员熟知的标准技术来配制。这类组合物可通过医学领域技术人员熟知的技术以考虑到如具体受试者的年龄、性别、体重和条件及施用途径的剂量来施用。受试者可以是哺乳动物，如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。

可以预防性地或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用疫苗。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用疫苗。将足够实现此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于例如所施用的疫苗方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况以及处方医师的判断。

所述疫苗可通过如下文献中所述本领域中公知的方法来施用：Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等人(美国专利号5,580,859，1996年12月3日授权)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日授权)；以及Carson等人(美国专利号5,679,647，1997年10月21日授权)，所有文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以例如使用疫苗枪将疫苗的DNA与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如表达载体的施用途径。

可以经由多种途径来递送疫苗。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌肉内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于疫苗的DNA来说，可以将疫苗递送至个体的组织的间隙空间(Felgner等，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。还可以将疫苗施用至肌肉，或可以经由皮内或皮下注射或经皮(如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用疫苗的表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等，美国专利号5,679,647，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。

还可以配制疫苗，用于经由鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有例如在约10微米至约500微米范围中的颗粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制剂可以是鼻用喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器进行气雾剂施用。制剂可以包含疫苗的水性溶液或油性溶液。

疫苗可以是液体制剂，如混悬剂、糖浆或酏剂。疫苗还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌混悬剂或乳剂。

疫苗可以掺入脂质体、微球体或其他聚合物基质中(Felgner等人，美国专利号5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology,第I卷至第III卷(第二版，1993)，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体。

可以经由电穿孔，如通过美国专利号7,664,545中所描述的方法来施用疫苗，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可经由微创设备来进行电穿孔。

微创电穿孔设备(“MID”)可以是用于将以上所描述的疫苗和相关流体注射至身体组织中的装置。所述设备可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将DNA注射至所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的DNA分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。

MID可在不使用针的情况下将疫苗注射至组织中。MID可将疫苗作为小的流或射流以使得疫苗穿透组织的表面并且进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创电穿孔设备的实例和使用它们的方法在公布的美国专利申请号20080234655、美国专利号6,520,950、美国专利号7,171,264、美国专利号6,208,893、美国专利号6,009,347、美国专利号6,120,493、美国专利号7,245,963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中进行描述，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。这类无针注射器可商购获得。可在本文中利用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783、4,447,223、5,505,697及4,342,310中所述的那些，这些专利的内容各自以引用的方式并入本文。

可以使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需的疫苗引入(例如注射)至待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以导致疫苗渗透至组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力进行喷射。

无针注射器非常适合于将疫苗递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有疫苗的液体推送至表面并且进入受试者的皮肤或粘膜中。可以使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可具有将组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改良的结果。例如于题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开针阵列，其中可在治疗性处理过程中对多对针产生脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统在美国专利号6,763,264中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。或者，可使用单针设备，所述设备允许DNA注射和使用类似于正常注射针的单针电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。

MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可介于0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲的两个或更多个针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及电穿孔和患者数据的全面记录和储存。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。所述MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，所述系统在美国专利号7,328,064中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell PA)设备和系统，其是便于将大分子(如DNA)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极、皮下针、提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器，以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入到身体或植物中所选定的组织中。然后经由皮下针将大分子递送到选定组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极中。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过度加热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率消耗而得以最小化。Cellectra设备和系统在美国专利号7,245,963中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将流体(本文所描述的疫苗)注射至所述身体组织中。优点是：在插入针的同时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。

此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。可以根据需要出于文件编制目的通过控制单元来储存这一数据。

应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者的皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。

可通过本发明的装置将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。

装置还包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于用户操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。

用户可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示以自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以例如采用为预设针插入深度(如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。

感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动至肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。可以根据需要进一步记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体的体积。

装置可还包括：用于支撑针的底座和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一后方位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二前方位置时，针延伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入患者的皮肤中，所以这对于用户来说是有利的。

如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。可以例如通过伺服马达来激活活塞驱动部件。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，例如可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率流体递送的的封闭容器来代替注射管和活塞系统。

以上所描述的装置可以用于任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可还包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这一点是尤其有利的，因为它意味着电场被施加至与所注射的流体相同的面积上。电穿孔在传统上存在的问题在于很难使电极与先前注射的流体准确对准，且因此使用者已倾向于在较大区域注射体积大于所需的流体且在较大区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间重叠。使用本发明，可减少所注射流体的体积和所施加电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。

4.试剂盒

本文提供了一种试剂盒，其可用于使用如上所述的接种方法治疗受试者。所述试剂盒可包含所述疫苗。

试剂盒还可包含用于进行如上所述的接种方法和/或如何使用试剂盒的说明书。试剂盒中所容纳的说明书可附于包装材料上或可作为包装插入物包括在内。虽然说明书通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此类。本公开涵盖能够储存说明书并且将它们传达给最终用户的任何介质。所述媒介包括但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、磁片盒)、光学媒介(例如，CD ROM)等等。本文所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的网站(internet site)的地址。

本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。

5.实施例

实施例1

MERS-CoV共有刺突抗原

如本文中别处所述，MERS-CoV的多个菌株如图3所示存在并且生成共有刺突抗原以说明这多个MERS-CoV菌株之间的差异。因此，MERS-CoV共有刺突抗原来源于图3中所列的病毒的相应刺突抗原。基于刺突抗原进行种系发生分析并且相对于其组分刺突抗原(图3，标记“MERS-HCoV-共有”表示MERS-CoV共有刺突抗原)放置MERS-CoV共有刺突抗原。MERS-CoV共有刺突抗原还含有N端免疫球蛋白E(IgE)前导序列。包含MERS-CoV共有刺突抗原的核酸和氨基酸序列分别示于图8A和8B中。在图8A中，下划线指示编码IgE前导序列的核苷酸。在图8B中，下划线指示IgE前导序列。

kozak序列被置于编码MERS-CoV共有刺突抗原的核酸序列的5’端上且所得核酸序列被插入pVAX1载体(Life Technologies,Carlsbad,CA)的BamHI与XhoI位点之间(图4A，所得构建体命名为MERS-HCoV-WT)。此核酸序列向pVAX1载体中的正确插入是通过BamHI和XhoI消化、接着凝胶电泳来证实(图4B)。在图4B中，泳道M指示标记，泳道1是未消化的MERS-HCoV-WT构建体，且泳道2是消化的MERS-HCoV-WT构建体。消化产生预期的片段大小，表明MERS-HCoV-WT构建体包含pVAX1载体和插入的核酸序列(即，核酸序列含有kozak序列并编码MERS-CoV共有刺突抗原)。

此MERS-HCoV-WT构建体的构建和特征也在下文的实施例9和10中描述。

实施例2

缺少细胞质结构域的MERS-CoV共有刺突抗原

来自冠状病毒的刺突抗原是1型膜糖蛋白，其具有跨膜结构域，所述结构域又界定刺突抗原的细胞质和非细胞质结构域。为了确定细胞质结构域在MERS-CoV刺突抗原中的位置，基于万维网的软件被用于预测结构域在各种MERS-CoV刺突抗原内的位置。具体说来，基于万维网的软件Phobius和InterProScan被用于此分析中。来自Phobius和InterProScan分析的代表性结果分别示于图5和6中。

由MERS-CoV刺突抗原的此结构域分析生成第二MERS-CoV共有刺突抗原，其缺少细胞质结构域。具体说来，编码MERS-CoV共有刺突抗原的核酸序列(描述于实施例1中，图8A，SEQ ID NO:1)被修饰以插入两个终止密码子以使得翻译的蛋白质不含有细胞质结构域(即，MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD)。

MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD的核酸和氨基酸序列分别示于图8C和8D中。在图8C中，下划线指示编码IgE前导序列的核苷酸且双下划线指示两个插入的终止密码子(相对于SEQ ID NO:1，其防止细胞质结构域的翻译)。在图8D中，下划线指示IgE前导序列。示出所得构建体MERS-HCoV-ΔCD的示意图示于图7A中。

用BamHI和XhoI消化MERS-HCoV-ΔCD构建体，接着凝胶电泳以证实插入物存在于pVAX1载体中(图7B)。在图7B中，泳道M指示标记，泳道1是未消化的MERS-HCoV-ΔCD构建体，且泳道2是消化的MERS-HCoV-ΔCD构建体。消化产生预期的片段大小，表明MERS-HCoV-ΔCD构建体包含pVAX1载体和插入的核酸序列(即，核酸序列含有kozak序列并编码MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD)。

此MERS-HCoV-ΔCD构建体的构建和特征也在下文的实施例9和10中描述。

实施例3

表达和体液应答

检查上述MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体以确定相应的抗原在细胞内表达并且可被抗体识别。MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体连同pVAX1一起被转染到293T细胞中。pVAX1充当对照。

在转染后两天制备细胞裂解物并且在5-15％SDS凝胶上电泳。具体说来，将10μg、25μg及50μg细胞裂解物加载到单独的孔中，细胞裂解物是从用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-ΔCD构建体转染的293T细胞处获得。然后使用来自用MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠的血清进行免疫印迹分析。在从用pVAX1(图9，泳道标记的pVAX1)转染的293T细胞处获得的细胞裂解物中没有检测到蛋白条带。对于MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体两者，检测到对应于相应抗原的预测分子量的蛋白条带，由此证实来自MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体的相应抗原的表达(图9)。

免疫印迹还显示来自用MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠的血清识别MERS-CoV共有刺突抗原和MERS-CoV共有刺突抗原ΔCD两者，而不识别细胞裂解物中的其他蛋白质(如通过在从用pVAX1转染的293T细胞处获得的细胞裂解物中没有观察到条带来证明)。因此，此血清对共有刺突抗原有特异性。免疫印迹还显示MERS-HCoV-WT构建体是免疫原性的并产生强的体液应答。

实施例4

实施例5-7的免疫程序

按照图10中示出的免疫方案，用pVAX1、MERS-HCoV-WT构建体、或MERS-HCoV-ΔCD来免疫C57/BL6小鼠。在第0天，向每只小鼠肌内(IM)给予其相应的疫苗，接着电穿孔。具体说来，用三溴乙醇-阿佛丁使每只小鼠麻醉并且使用小家畜剪剃去位于胫骨前肌(TA)肌肉区域处的毛发以暴露皮肤。经由IM注射以30至50μL的最终体积施用疫苗。然后将无菌CELLECTRA 3P ID阵列穿过皮肤插入到IM注射部位周围的肌肉中。CELLECTRA 3P ID阵列包括三个26号针-电极，其长度为3mm并且通过模制塑料保持在一起。针-电极被连接至具有CELLECTRA 3P应用的CELLECTRA电穿孔装置。在阵列插入到肌肉中之后，递送瞬时电脉冲并且将免疫的小鼠置于其相应的笼中并仔细观察直到苏醒。在第14天和第28天重复以上免疫程序。因此，在第0天的免疫是初始免疫且在第14和28天的免疫是加强免疫。在第35天，处死小鼠并且进行如下实施例5-7中所述的免疫分析。

实施例5

IgG抗体应答

为了进一步检查由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导的体液免疫应答，如上实施例4中所述使小鼠免疫。在免疫方案开始之前获得免疫前取血并且在免疫方案的第21天和第35天也获得取血。免疫前取血和取血经由眼眶后方法获得。

检查来自用MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠的免疫前取血、第21天取血和第35天取血以测定与来源于全长共有刺突抗原的肽有免疫反应性的IgG抗体的水平。具体来说，将来自免疫前取血和每次取血的血清1:50稀释并添加到用混合肽集合包被的ELISA板中。混合肽集合含有来源于全长共有刺突抗原的不同部分的肽。具体来说，混合肽集合是如下实施例6和图15中所述6个线性肽集合1-6的等量混合物。

如图11A所示，MERS-HCoV-WT构建体引发高水平的IgG抗体，所述IgG抗体与来源于全长共有刺突抗原的肽有免疫反应性。图11A中的数据是来自于4只小鼠的血清并且表示平均值±平均标准误差(SEM)。这些数据显示(经由免疫前取血与取血的比较)MERS-HCoV-WT构建体诱导约4倍至约6倍IgG抗体水平的增加，IgG抗体识别来源于全长共有刺突抗原的肽。

也检查来自用MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫的小鼠的免疫前取血、第21天取血及第35天取血以测定与来源于全长共有刺突抗原的肽有免疫反应性的IgG抗体的水平。将来自免疫前取血和每次取血的血清1:50稀释并添加到用混合肽集合包被的ELISA板中。混合肽集合含有来源于全长共有刺突抗原的不同部分的肽。具体来说，混合肽集合是如下实施例6和图15中所述6个线性肽集合1-6的等量混合物。

如图11B所示，MERS-HCoV-ΔCD构建体引发高水平的IgG抗体，所述IgG抗体与来源于全长共有刺突抗原的肽有免疫反应性。图11B中的数据是来自于4只小鼠的血清并且表示平均值±SEM。这些数据显示(经由免疫前取血与取血的比较)MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导约6倍至约8倍IgG抗体水平的增加，IgG抗体识别来源于全长共有刺突抗原的肽。

概括地说，图11A和11B中的数据显示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体两者引发高水平的IgG抗体，所述IgG抗体与来源于全长共有刺突抗原的肽有免疫反应性。这些数据还显示MERS-HCoV-ΔCD构建体引发比MERS-HCoV-WT构建体更高水平的免疫反应性IgG抗体。因此，如通过IgG抗体应答所测量，MERS-HCoV-ΔCD构建体比MERS-HCoV-WT构建体的免疫原性更强。

实施例6

CD8⁺T细胞应答

如上所述，MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体各自诱导针对MERS-CoV刺突抗原的显著体液免疫应答。为了确定MERS-HCoV-WT和MERS-CoV-ΔCD构建体是否还诱导细胞免疫应答，如上实施例4中所述使小鼠免疫。在免疫方案第35天的处死之后，使用干扰素-γ(IFN-γ)ELISpot测定分析CD8⁺T细胞的抗原特异性应答，其中肽集合的矩阵覆盖全长共有MERS-CoV刺突抗原的氨基酸序列。肽集合的矩阵示于图12中并且还有利于鉴别由CD8⁺T细胞应答识别的显性表位，CD8⁺T细胞应答是由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导。此肽集合矩阵来源于在MERS-HCoV-WT刺突抗原全长上的肽扫描并且所述肽是具有11个氨基酸重叠的15聚体。

具有此肽集合矩阵的IFN-γELISpot测定的结果对于分别MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体示于图13和14中。在图13和14中，数据表示平均值±SEM。两个构建体诱导显著的CD8⁺T细胞应答，其中显性表位驻留在集合18、19、20及21(图13和14，圆圈)中。另一个表位驻留在集合4中。因此，这些数据表明MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导对刺突抗原肽亚群有反应性的强细胞免疫应答。

为了进一步检查CD8⁺T细胞应答，按照以上实施例4中所述的免疫方案，用25μg的pVAX1、MERS-HCoV-WT构建体或MERS-HCoV-ΔCD构建体使小鼠免疫。用pVAX1的免疫充当对照。在免疫方案第35天的处死之后，使用IFN-γELISpot测定检查从三组小鼠分离的CD8⁺T细胞的抗原特异性应答。具体说来，用6个不同的肽集合刺激CD8⁺T细胞。这些肽集合1-6覆盖图12的矩阵中所示的肽。

如图15所示，由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导的细胞免疫应答的强度是根据用于刺激从相应的小鼠分离的CD8⁺T细胞的肽集合而变化。对于MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体两者，肽集合1引发类似于对照pVAX1的CD8⁺T细胞应答，由此指示肽集合1不含刺激CD8⁺T细胞的表位。肽集合1-6引发来自从用pVAX1免疫的小鼠分离的CD8⁺T细胞的类似应答。

肽集合2、3及4引发来自从用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫的小鼠分离的CD8⁺T细胞的相当的应答。另外，与pVAX1对照相比，当用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫小鼠时，对肽集合2、3及4的CD8⁺T细胞应答显著更高(图15)。具体说来，与对照pVAX1相比，当用MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫小鼠时，对肽集合2、3及4的CD8⁺T细胞应答要高约7倍。与对照pVAX1相比，当用MERS-HCoV-WT构建体免疫小鼠时，对肽集合2、3及4的CD8⁺T细胞应答要分别高约7.5倍、约9倍及约10倍。因此，这些数据显示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体不同于对照pVAX1，其诱导对肽集合2、3及4内所含肽的显著的CD8⁺T细胞应答。

与肽集合1、2、3及4相比，肽集合5和6引发来自从用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫的小鼠分离的CD8⁺T细胞的更强的应答(图15)。另外，与对照pVAX1相比，当用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫小鼠时，对肽集合5和6的CD8⁺T细胞应答显著更高。具体说来，与对照pVAX1相比，当用MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫小鼠时，对肽集合5和6的CD8⁺T细胞应答要分别高约9倍和约11倍。与对照pVAX1相比，当用MERS-HCoV-WT构建体免疫小鼠时，对肽集合5和6的CD8⁺T细胞应答要分别高约13倍和约15倍。因此，这些数据显示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体不同于对照pVAX1，其诱导对肽集合5和6内所含肽的显著的CD8+T细胞应答。

概括地说，以上数据显示用MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体的免疫诱导对刺突抗原肽亚群有特异性和反应性的显著的细胞免疫应答。

实施例7

多功能细胞免疫应答

如上所述，MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导对MERS-CoV刺突抗原有反应性和特异性的CD8⁺T细胞应答。为了进一步检查由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导的细胞免疫应答，检查免疫之后T细胞的功能性。具体说来，按照以上实施例4中所述的免疫方案，用pVAX1、MERS-HCoV-WT构建体、或MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫小鼠。在免疫方案第35天，将脾细胞从被处死的小鼠中分离。用含有来源于全长共有MERS-CoV刺突抗原的肽的肽集合体外刺激分离的脾细胞。将肽集合与脾细胞一起孵育5小时。然后就IFN-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素-2(IL-2)的细胞内产生对细胞染色并通过荧光激活细胞分选(FACS)来分选。

图16A、16B、16C及16D示出了在刺激的脾细胞群中分别产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者的CD3⁺CD4⁺T细胞的测量的出现率。图16A-16D中的数据表示对于每个组，脾细胞是从3只小鼠中分离。图16A-16D中的数据表示平均值±SEM。产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者的CD3⁺CD4⁺T细胞的出现率与对照pVAX1组相比在MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD组中显著增加。

具体说来，与对照pVAX1相比，CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD和MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠中分离的脾细胞群中分别要高约6倍和约13倍(图16A)。与对照pVAX1相比，CD3⁺CD4⁺TNF-α⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD和MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠中分离的脾细胞群中分别要高约6倍和约11倍(图16B)。与对照pVAX1相比，CD3⁺CD4⁺IL-2⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD和MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠中分离的脾细胞群中分别要高约12.5倍和约30倍(图16C)。与对照pVAX1相比，CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD和MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠中分离的脾细胞群中分别要高约7.5倍和约17.5倍(图16D)。因此，这些数据显示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体不同于对照pVAX1，其诱导多功能的T细胞应答，其中增加数量的CD3+CD4+T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者。

图17A、17B、17C及17D示出了在受刺激的脾细胞群中分别产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者的CD3⁺CD8⁺T细胞的测量的出现率。图17A-17D中的数据表示对于每个组，脾细胞是从4只小鼠中分离。图17A-17D中的数据还表示平均值±SEM。与对照pVAX1相比，产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者的CD3⁺CD8⁺T细胞的出现率在MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD组中显著增加。

具体说来，与对照pVAX1相比，CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD和MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠分离的脾细胞群中分别要高约8倍和约13倍(图17A)。与对照pVAX1相比，CD3⁺CD8⁺TNF-α⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD或MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠分离的脾细胞群中要高约7倍(图17B)。与对照pVAX1相比，CD3⁺CD8⁺IL-2⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD或MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠分离的脾细胞群中要高约2.5倍(图17C)。与对照pVAX1相比，CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺T细胞的出现率在从用MERS-HCoV-ΔCD和MERS-HCoV-WT构建体免疫的小鼠分离的脾细胞群中分别要高约50倍和约90倍(图17D)。因此，这些数据显示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体不同于对照pVAX1，其诱导多功能的T细胞应答，其中增加数量的CD3⁺CD8⁺T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者。

概括地说，上述数据显示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体显著地诱导产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者的多功能CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞。MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体支持比对照pVAX1更大的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞两者的多功能性。因此，共有构建体能够引发对MERS-CoV刺突抗原有反应性的多功能的细胞免疫应答。

实施例8

中和抗体

如上实施例5中所述，MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体诱导体液免疫应答。为了进一步检查所诱导的体液免疫应答，检查与用pVAX1、MERS-HCoV-WT构建体、或MERS-HCoV-ΔCD构建体免疫的小鼠有关的中和抗体水平。具体地说，将血清在最低必需培养基中稀释并在37℃下用50μl每孔含有100个感染性HCoV-EMC/2012(Human CoronavirusErasmus Medical Center/2012)颗粒的DMEM孵育。90分钟之后，将病毒-血清混合物添加到96孔平底板的单层Vero细胞(100,000个细胞/孔)中并在5％CO₂孵育箱中在37℃下孵育5天。每个样品的中和抗体滴度被报道为少于50％的细胞显示CPE的最高稀释度。数值报告为倒数稀释度。所有样品都一式两份操作，以使得最终结果被定为两个样品的平均值。

结果在以下表1中示出。用MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-ΔCD构建体的免疫不同于对照pVAX1，其诱导显著水平的对MERS-CoV刺突抗原有反应性的中和抗体。

表1：中和抗体的滴度。

概括地说，本文实施例中提供的数据表明MERS-HCoV-WT和MERS-CoV-ΔCD构建体是有效的疫苗，其显著诱导对MERS-CoV刺突抗原有反应性的体液和细胞免疫应答两者。所诱导的体液免疫应答包括与缺少共有抗原的构建体(即pVAX1)相比增加的IgG抗体和中和抗体滴度，这些抗体与MERS-CoV刺突抗原有免疫反应性。所诱导的细胞免疫应答包括与缺少共有抗原的构建体(即pVAX1)相比增强的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞应答，这些细胞应答产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ和TNF-α两者。

实施例9

实施例10-19的材料和方法

细胞培养、质粒及MERS-HCoV-刺突蛋白的表达。将HEK293T细胞(ATCC#：CRL-N268)和Vero-E6细胞(ATCC#：CRL-1586)在具有10％FBS的DMEM(DMEM)中生长。MERS-HCoV-刺突WT和刺突ΔCD质粒DNA构建体编码MERS刺突蛋白(S)的优化的共有序列。另外，Ig重链ε-1信号肽被融合至每个序列的N末端，替代N末端甲硫氨酸，其促进表达。为在小鼠中表达而在遗传上优化每个基因，包括密码子-和RNA-优化。然后，优化基因在巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子(GenScript)的控制下被亚克隆到修饰的pVax1哺乳动物表达载体中。这些MERS-HCoV-刺突WT和刺突ΔCD质粒DNA构建体的构建也如上实施例1和2中所述。

对于体外表达研究，使用TurboFectin 8.0试剂，按照制造商方案(OriGene)进行转染。简言之，细胞在35-mm平皿中生长至80％汇合并用3μg刺突质粒转染。转染后48小时收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，然后悬浮在细胞裂解缓冲液(Cell SignalingTechnology)中以通过蛋白质印迹分析验证刺突蛋白的表达。

小鼠和免疫。将雌性C57BL-6小鼠(6-8周龄；Jackson Laboratories)用于这些实验中并分成三个实验组。根据美国国家卫生研究院(Bethesda)和University ofPennsylvania(Philadelphia,PA,USA)的动物保护和使用委员会(IACUC)的指南，所有动物都被圈养在温度控制的、光循环机构中。所有免疫都通过体内最小侵入性EP递送技术(MID-EP)以25μl的总体积递送至胫骨前肌(25μg)中。

从免疫小鼠制备脾的单细胞悬浮液。简言之，将来自刚施以安乐死的小鼠的脾单独收集在10ml补充有10％FBS(R10)的RPMI 1640中，然后经由桨式掺混机(STOMACHER 80桨式掺混机；A.J.Seward and Co.Ltd.,London,England)在高速下处理60秒。处理过的脾样品经由45μm尼龙过滤器过滤，然后在室温下在800x g下离心10分钟。将细胞沉淀在室温下再悬浮于5ml ACK裂解缓冲液(Life Technology)中5分钟，然后添加PBS以终止反应。在室温下，将样品再次在800x g下离心10分钟。将细胞沉淀以1×10⁷个细胞/ml的浓度悬浮于R10中，然后穿过45μm尼龙过滤器，之后用于酶联免疫吸附斑点(ELISpot)测定和流式细胞分析中。

ELISpot分析。使用IFN-γELISpot测定抗原特异性T细胞应答。简言之，用纯化的抗小鼠IFN-γ捕获抗体包被PVDF 96孔板(Millipore)并在4℃下孵育24h(R&D Systems)。次日，洗涤板并且用1％BSA和5％蔗糖阻断2h。将来自免疫小鼠的二十万个脾细胞添加到每个孔中并在RPMI 1640(阴性对照)、Con A(5ug/mL；阳性对照)或特异性肽抗原(Ag)(10μg/ml；GenScript)存在下在5％CO₂和37℃下刺激过夜。肽集合由重叠11个氨基酸的15聚体肽(GenScript)组成。刺激24h之后，将细胞洗涤并在4℃下用生物素化抗小鼠IFN-γAb(R&DSystems)孵育24h。洗涤板，添加链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(R&D Systems)到每个孔中并在室温下孵育2h。洗涤板，添加5-溴代-4-氯代-3’-吲哚磷酸对甲苯胺盐和氯化硝基蓝四氮唑(色原显色试剂；R&D Systems)到每个孔中。然后用蒸馏水冲洗板并且在室温下干燥过夜。通过自动ELISpot读数器(CTL Limited)计数斑点。

流式细胞术和细胞内细胞因子染色(ICCS)测定。将脾细胞添加到96孔板(1×10⁶/孔)中并且根据制造商说明书，在蛋白转运抑制剂混合物(布雷菲德菌素A和莫能菌素；eBioscience)存在下在37C/5％CO₂下用合并的MERS抗原肽刺激5-6h。细胞刺激混合物(加蛋白转运抑制剂)(佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐(PMA)、离子霉素、布雷菲德菌素A以及莫能菌素；eBioscience)被用作阳性对照且R10培养基被用作阴性对照。然后如由制造商说明书(BD)所述就表面和细胞内蛋白质对所有细胞染色。简言之，将细胞在FACS缓冲液(含有0.1％叠氮化钠和1％FCS的PBS)中洗涤，之后用荧色物缀合的抗体进行表面染色。将细胞用FACS缓冲液洗涤，固定并且使用BD Cytofix/Ctyoperm TM(BD)，根据制造商方案进行透化，接着进行细胞内染色。以下抗体被用于表面染色：LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell染色试剂盒(Invitrogen)、CD19(V450；克隆1D3；BD Biosciences)、CD4(FITC；克隆RM4-5；ebioscience)、CD8(APC-Cy7；克隆53-6.7；BD Biosciences)、CD44(A700；克隆IM7；Biolegend)。对于细胞内染色，使用以下抗体：IFN-γ(APC；克隆XMG1.2；Biolegend)、TNF-α(PE；克隆MP6-XT22；ebioscience)、CD3(PerCP/Cy5.5；克隆145-2C11；Biolegend)、IL-2(PeCy7；克隆JES6-SH4；ebioscience)。使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)收集所有数据并且使用FlowJo软件(Tree Star)和SPICE v5来分析。使用FlowJo软件进行布尔门控(Boolean gating)以检查来自接种动物的T细胞的多功能性。

免疫原特异性ELISA。酶联免疫吸附测定(ELISA)被用于测定小鼠血清的滴度。简言之，在4℃下将5μg/ml的纯化重组人冠状病毒-刺突蛋白2c EMC/2012(分化体A)(SinoBiological Inc.)用于包被96孔微量滴定板(Nalgene Nunc International,Naperville,IL)过夜。在用PBS中的10％FBS阻断之后，用0.05％PBST(在PBS中的Tween20)洗涤板4次。在1％FBS、0.2％PBST中连续稀释来自免疫小鼠的血清样品，添加到板中，然后在室温下孵育1h。在0.05％PBST中再次洗涤板4次，然后在室温下用根据制造商说明书(Sigma Aldrich)稀释的HRP-缀合的抗小鼠IgG孵育1h。根据制造商说明书(SIGMAFAST；Sigma Aldrich)，通过添加OPD(邻苯二胺二盐酸盐)检测结合酶。15分钟之后通过添加2N H₂SO₄终止反应。然后在96微板光度计(GLOMAX；Promega)上，在450nm的光密度下对板进行读数。一式两份铺板所有样品。终点滴度被确定为具有超过平均吸光度值至少三个正常血清加三个标准偏差的吸光度值的最高稀释度。

间接免疫荧光测定(IFA)。对于用MERS-HCoV-刺突质粒转染的细胞，将载玻片用冰冷的丙酮固定5min。然后在37℃下用在PBS中的5％脱脂乳阻断非特异性结合30min。然后在PBS中洗涤载玻片5min且随后用来自免疫小鼠的血清在1:100稀释度下孵育。1h孵育之后，如上所述洗涤载玻片并且在37℃下用在含有1ug/mL和4 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的PBS中稀释的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)孵育30min。冲去未结合的抗体之后，用Prolong Gold抗衰减剂(Invitrogen)安装盖玻片，并且在共焦显微镜(LSM710；Carl Zeiss)下观察载玻片。使用Zen软件(Carl Zeiss)分析所得图像。

MERS-HCoV-刺突假病毒颗粒的制备。合成密码子优化的共有MERS-HCoV刺突基因并且亚克隆到pVax1载体中。制备MERS-HCoV-刺突假病毒。具体地说，将2×10⁶个HEK293T细胞接种于10-cm组织培养板中并使用TurboFectin 8.0(OriGene)转染剂在约80％汇合下用表达MERS-刺突或VSV-G蛋白的质粒转染。为了产生HIV/MERS-刺突假颗粒，将来自各种分化体的10μg pNL Luc E-R-(NIH-AIDS-Reagent Program)和10μg pVax1-MERS-刺突共转染到细胞中。12小时之后，除去转染培养基并替换为新鲜培养基持续大约12h并且在37℃下孵育细胞24-48h。收集含有假病毒粒子的培养基，过滤并且在SW41转子中在40,000rpm下通过在TNE缓冲液(10mM Tris、135mM NaCl、2mM EDTA，pH 8.0)中制备的20％蔗糖垫浓缩假病毒粒子1h。将沉淀再悬浮于500μL TNE缓冲液中过夜，等分并储存在-80℃下。

中和测定。计算50％组织培养感染性剂量(TCID₅₀)并且病毒的标准浓度(即100TCID₅₀)在整个研究中被用于中和试验，该中和试验是用来自MERS-HCoV DNA免疫动物的小鼠血清进行。简言之，将小鼠血清在MEM中稀释连续并且在37℃下用50ul每孔含有100个感染性HCoV-EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012)颗粒的DMEM孵育。90min之后，将病毒-血清混合物添加到96孔平底板的单层Vero细胞(100,000个细胞/孔)中并在5％CO₂孵育箱中在37℃下孵育5天。每个样品的中和抗体滴度被报道为少于50％的细胞显示CPE的最高稀释度。数值报告为倒数稀释度。所有样品都一式两份操作，因此最终结果被定为两者的平均值。中和百分比计算如下：中和百分比＝{目标1-PFU mAb(每个浓度)/平均PFU阴性对照(所有浓度)}。生成中和曲线并使用GraphPad Prism 5分析。用S形剂量-反应(可变斜率)拟合的非线性回归被用于测定IC₅₀和IC₈₀。包括阳性和阴性对照血清以验证测定。

对于中和试验，在4℃下将MERS-刺突假颗粒(50ng)用连续稀释的小鼠血清预孵育30min，然后一式三份添加到细胞中。感染后三天读取CPE。完全地保护细胞以免一半孔中有CPE的最高血清稀释度被定为中和抗体滴度。对于基于荧光素酶的测定，在感染后两天将MERS-刺突假颗粒感染的细胞在50μl蛋白裂解缓冲液和100μl荧光素酶底物中裂解。在96微板光度计(GLOMAX；Promega Corporation)中测量荧光素酶活性。

细胞活力测定和膜联蛋白V/FITC测定。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴(MTT，5mg/ml，Sigma)测定细胞活力。在96孔板中在每孔2.5×10³个细胞的密度下开始培养。48h孵育以后，将细胞用MERS-假病毒感染并且培养48h。孵育之后，将15μl MTT试剂添加到每个孔中并且在黑暗中在37℃下孵育4h。吸出上清液并且在37℃下伴随温和的搅拌将甲晶体溶于100μl DMSO中持续15min。使用光度计读数器(GLOMAX；Promega)在540nm下测量每孔的吸光度。分析来自三个独立实验的数据，然后针对仅含有培养基(0％)和未处理的细胞(100％)的孔的吸光度进行归一化。用Prism GraphPad软件，由S形剂量反应曲线计算IC₅₀值。

使用膜联蛋白V-FITC检测试剂盒I(BD Biosciences)，根据制造商说明书进行膜联蛋白V-FITC结合测定。用MERS-假病毒感染细胞12h。胰酶消化之后对细胞计数并用冷PBS洗涤两次。将细胞沉淀以1×10³个细胞/ml的密度再悬浮于100μl结合缓冲液中并在黑暗中在室温下用5μl FITC-缀合的膜联蛋白-V和5μl PI孵育15min。将四百微升的1x结合缓冲液添加到每个样品管中，并且立即通过流式细胞仪(BD Biosciences)分析样品。使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。

非人灵长类动物(NHP)免疫和MERS攻击。三组恒河猴接受3个剂量(初始和2次加强)，相隔3周施用(第0、3、6周)。组1和2猕猴通过用EP装置肌内免疫接受总共0.5mg和2mg/剂量的表达MERS-刺突(N＝4)疫苗的DNA疫苗。组1和2接受全长共有MERS刺突抗原。组3猕猴接受总共2mg/剂量的对照疫苗(pVax1)。先前确定用于这些研究中的DNA疫苗的剂量和免疫方案在恒河猴中是最佳的。在每个剂量之后收集血液以分析血清抗体和中和及全身性T细胞应答。用氯胺酮HCL(10–30mg/kg)肌内麻醉动物。向每条大腿(每次接种每条大腿一个注射部位)施用疫苗并且通过肌内(IM)途径递送。DNA注射之后即刻，对IM施用施加在具有52ms脉冲宽度(脉冲之间为1s)的0.5A恒定电流下的3个脉冲。

NHP攻击。三组恒河猴接受3个剂量(初始和2次加强)，相隔3周施用(第0、3、6周)。组1和2猕猴通过用EP装置肌内免疫接受总共0.5mg和2mg/剂量的表达MERS-刺突(N＝4)疫苗的DNA疫苗。在3只猕猴的组中接受总共2mg/剂量的对照疫苗(pVax1)。先前确定有待用于这些研究中的DNA疫苗的剂量、免疫方案在恒河猴中是最佳的。在每个剂量之后收集血液以分析血清抗体和中和及全身性T细胞应答。用氯胺酮HCL(10–30mg/kg)肌内麻醉动物。向每条大腿(每次接种每条大腿一个注射部位)施用疫苗并且通过IM途径递送。DNA注射之后即刻，对IM施用施加在具有52ms脉冲宽度(脉冲之间为1s)的0.5A恒定电流下的3个脉冲。

攻击：将年龄在4-6岁的12只健康的恒河猴(rhesus macaques/Macaca mulatta)通过如先前所建立的组合的气管内、鼻内、经口及眼部途径用总共7×10⁶TCID50的MERS-CoV接种(Falzarano等人Nature Medicine 19,1313–1317(2013)。将动物以非盲方式随机分配给治疗组或未治疗组。

统计分析。重复评估免疫应答的动物实验至少三次并且每个小鼠的应答被记为统计分析的单独的数据点。所有数据都表示为平均值±标准偏差。通过使用来自GraphPad的单向ANOVA检查从动物研究和各种免疫测定获得的数据；差异被视为在p<0.05下是显著的。将GraphPad Prism v.5.0(GraphPad Software,Inc.)用于统计分析。

实施例10

MERS-HCoV刺突和刺突ΔCD蛋白的克隆和表达

由在GenBank-NCBI数据库中保藏的16个刺突基因组序列生成MERS-HCoV刺突基因的共有序列。对于免疫原设计，来自分化体A和B两者的序列被包括在共有序列中，且通过测量在MERS-HCoV的分化体A和B病毒株中的中和活性对所得共有序列进行测试。如图19A所示，MERS-HCoV-刺突共有序列的种系发生位置是在分化体B四分体的中心，这归因于落在此分化体内的多重序列。此外，设计MERS刺突糖蛋白的两个共有序列，其中一个构建体的细胞质结构域序列是完整无缺的并且第二构建体的细胞质结构域是截短的。这些构建体分别被称为MERS-HCoV刺突(刺突-Wt)及截短的细胞质部分(刺突ΔCD)。对于两个免疫原，做出几个修饰以增加体内表达，包括加入高效IgE前导肽序列以促进表达和mRNA输出。然后将插入物亚克隆到pVax1载体中(图19B)。这些刺突-Wt和刺突ΔCD DNA构建体的构建也如上实施例1和2中所述。

将质粒单独转染到293T细胞中，并且通过蛋白质印迹评估刺突蛋白的表达。对来自免疫小鼠的刺突-Wt蛋白有特异性的小鼠抗血清被用于检测刺突蛋白由质粒转染的细胞裂解物的表达。在转染后48小时，提取蛋白裂解物。在刺突-Wt和刺突ΔCD转染的细胞中检测到MERS-刺突蛋白(140kDa)的强特异性条带，而没有在来自用对照载体(空的pVax1质粒)转染的细胞的裂解物中检测到(图19C)。

另外，使用免疫荧光测定(IFA)研究转染后刺突蛋白的表达和定位。使用小鼠刺突抗血清的IFA显示强信号存在于细胞质中(图19D)。正信号未在用pVax1载体转染的完整细胞中检测到。全长构建体(刺突-Wt)和细胞质结构域突变构建体(刺突ΔCD)两者类似地定位在转染细胞内。这些结果表明MERS-HCoV构建体强烈地在哺乳动物细胞中表达的能力并且由这些构建体诱导的抗体可结合其靶抗原。

实施例11

MERS-HCoV DNA构建体的功能性表达和感染

为了测定共有序列免疫原的功能性(例如，病毒结合和进入)，开发了一种假病毒表达系统以测试共有构建体的病毒进入性质。具体地说，MERS-HCoV假病毒颗粒通过用编码MERS-刺突抗原的质粒和不表达HIV-1包膜的HIV-1荧光素酶报道基因质粒共转染293T细胞而产生(图20A)。通过用各种MERS-刺突基因+慢病毒基因组片段转染293T细胞产生颗粒。这造成了稳固的病毒颗粒形成。为了表征MERS-刺突介导的感染，通过在同步感染了共有MERS-刺突假病毒的细胞中测量荧光素酶活性进行时程分析(图20B)。如图20C所示，对于具有假病毒颗粒的MERS-CoV表达功能性受体的Vero细胞和A549细胞的细胞系接种产生强荧光素酶信号，表明用假病毒的生产性感染。这些实验示出了具有刺突蛋白的MERS假病毒粒子的发展，其进入靶细胞并为中和抗体的检测建立基于假病毒的抑制测定。

实施例12

MERS-HCoV DNA疫苗在小鼠中增强的免疫原性

为了研究共有和修饰的刺突糖蛋白的的免疫原性，分析构建体在C57BL/6小鼠肌内注射之后引发免疫应答的能力。用25μg的三种DNA质粒中的一种来免疫雌性C57BL/6小鼠(n＝9)：刺突-Wt、刺突ΔCD或对照pVax1载体。在每次免疫之后即刻，使用自适应电穿孔(EP)系统。在两周间隔时间下接种动物三次，并且如图21A中所述在第三次免疫之后一周测量免疫应答。

通过使用标准ELISpot测定来评估细胞介导免疫以监测在用编码MERS-刺突糖蛋白的整个蛋白区域的肽集合进行抗原特异性体外再刺激之后来自免疫小鼠的脾细胞分泌细胞因子的能力。第三次免疫之后一周进行ELISpot测定。如图21B所示，来自刺突-Wt以及免疫的刺突ΔCD接种的脾细胞诱导针对多个肽集合的强细胞免疫应答。集合2和5中的肽在两种构建体下都表现出显性。

基于这些T细胞应答，针对覆盖整个MERS-刺突蛋白的31个不同集合的详细作图。产生含有具有11个氨基酸重叠并且覆盖刺突蛋白残基的15聚体肽的227个肽集合。使用矩阵形式制备31个肽集合并进行测试。在用肽再刺激之后，检测到针对刺突蛋白上的几个区域的强CD8⁺T细胞应答(图21C和图21D)。存在显示超过100个斑点的15个矩阵集合，表明MERS-刺突引发广泛的细胞免疫应答。鉴别来自氨基酸301-334的区域中的四-肽-集合。重要的是，刺突-Wt以及刺突-ΔCD免疫原对覆盖肽集合4-6、11-13、18-21及29-31的4个主要区域有反应。然而，显性集合似乎覆盖18-21。这些集合包括在氨基酸307-321处(RKAWAAFYVYKLQPL(SEQ ID NO:7))的计算机鉴别的CD8⁺T-淋巴细胞免疫显性表位，其可以是两种抗原的显性应答(图21C和21D)。

实施例13

MERS-刺突疫苗诱导的T细胞应答是多功能的

为了进一步确定诱导的T细胞应答的表型，评价多功能T细胞应答。多色流式细胞术被用于测量在CD4⁺和CD8⁺两种T细胞中以抗原特异性方式诱导的IFN-γ、IL-2及TNF-α的产生。分泌MERS-刺突-特异性IL-2、TNF-α及IFN-γ的CD4⁺和CD8⁺T细胞的代表性流式细胞术概况分别示于图25A和25B中。构建体产生来自CD8⁺T细胞的相当的应答；全长构建体诱导显著更高百分比的分泌IL-2、TNF-α及IFN-γ的CD4⁺T细胞。

比较针对MERS-HCoV-刺突以及MERS-HCoVΔCD疫苗构建体的疫苗诱导的CD4⁺和CD8⁺T细胞应答的强度。使用布尔门控，评价单独的细胞产生多个细胞因子的能力，即疫苗诱导的CD4⁺和CD8⁺T细胞应答的多功能性(图25C和25D)。此分析显示CD8⁺T细胞应答在全长或截短的刺突蛋白疫苗组中是类似的，然而，CD4⁺T细胞应答的强度在全长刺突抗原疫苗组中更大。鉴别七个不同的刺突特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞群。虽然三、双及单功能细胞的比例在这两个疫苗组之间稍微变化，但在两个组中观察到以下趋势：总强度有利于在CD4⁺以及CD8⁺T细胞应答诱导中的全长构建体。当应答接着进一步被分成7个可能的功能组合时，观察到在两个接种组中的CD8⁺T细胞是类似的，例外的是产生IFN-γ的CD8⁺T细胞的诱导，其在强度上也有利于全长构建体(图25C和25D)。

实施例14

MERS-HCoV-刺突接种在小鼠中诱导充分的结合抗体应答以及中和抗体(Nab)应答

还检查了通过两种构建体对体液免疫的诱导。在小鼠中的DNA免疫之前和之后获得血清样品。就结合至重组刺突抗原以及在功能性抗体研究中对抗刺突体液免疫应答进行分析。如图18A和22A所示，与用质粒主链免疫的对照动物相比，所有的接种动物都诱导特异性抗体应答。类似于CD4⁺T细胞应答，结合抗体活性在量化为终点滴度的全长免疫动物中要更强(图18B和22B)。由免疫小鼠产生的抗体在蛋白质印迹测定中同样结合至MERS-刺突重组(图22C)。总的来说，这些数据表明刺突DNA疫苗诱导特异性抗体产生以及特异性地结合至靶刺突抗原的抗体。

实施例15

对MERS-HCoV-刺突的抗血清证明针对MERS病毒的中和活性

用分化体A株病毒HCoV-EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus MedicalCenter/2012)，经由病毒中和测定评价来自用刺突-Wt或刺突ΔCD疫苗免疫的小鼠的血清的中和活性。从用刺突-Wt或刺突ΔCD和阴性对照pVax1免疫的小鼠(n＝9/组)处收集血清。如图18C和22D所示，两种疫苗诱导显著高于来自用对照载体(pVax1)单独免疫的小鼠的血清滴度的中和抗体滴度(p＝0.0018)。类似于抗体结合测定，尽管不是显著不同，但截短的构建体似乎诱导比全长构建体水平更低的中和应答。

由于中和测定因此时缺乏可利用的全长病毒而受限，所以利用如上所述的假颗粒中和测定来测试抗血清中和MERS-刺突假病毒的能力。如图22E所示，MERS-刺突-Wt接种小鼠(n＝4)抗血清通过50％中和Ab滴度在120至960和更高范围内的MERS-刺突假病毒有效地抑制Vero细胞的感染。此外，使用基于MERS-假病毒的抑制测定，就针对MERS-CoV感染的不同分化体的中和活性对以上血清进行评估(参见图24D)。图24D示出了针对MERS-CoV感染的接种血清的中和抗体的检测。简言之，从接种动物处收集在第三次免疫之后两周的猕猴血清并且在Vero细胞中分MERS-低和高剂量两个组进行基于MERS-CoV假病毒的抑制测定。在接种后40小时通过荧光素酶活性量化假病毒进入。

结果表明来自这些血清的中和抗体如通过假病毒抑制测定所测试示出了更广泛的抑制。总体说来，这些结果与从使用野生型MERS-HCoV的中和测定处获得的结果一致并且进一步示出了由此疫苗诱导的抗体应答的交叉保护性质。

实施例16

多功能T细胞在MERS-刺突DNA接种之后的猕猴的外周血液中的产生

还在临床前非人灵长类动物模型中评价针对MERS-攻击的疫苗功效。此研究概述于下表2中。

表2

如实施例9(图23A)中所述用MERS-刺突疫苗免疫三组(低、高及对照)动物(每组四只印度恒河猴)。为了确定MERS-刺突疫苗对T细胞应答的影响，ELISpot测定被用于对响应于用来源于全长MERS-刺突蛋白的重叠肽集合的刺激分泌IFN-γ的接种动物的血液中的T细胞进行计数。三次免疫之后，存在于接种动物血液和低剂量组中的总疫苗应答中的MERS-刺突特异性T细胞的数目是在600与1,100SFU/百万PBMC之间，而高剂量组示出在100与1500SFU/百万PBMC之间，一只动物除外且大多数接种动物具有阳性IFN-γ应答。结果显示为堆叠组平均应答±平均标准误差(图23B和23C)。这些数据表明MERS-刺突疫苗诱导与不接受所述疫苗的动物(即pVax1对照组)相比多功能的特异性T细胞应答。

实施例17

体液免疫应答的检测

在从第三次免疫两周之后的接种动物处获得的血清中检测到MERS-刺突特异性抗体。首先，利用全长MERS-刺突蛋白进行MERS-刺突特异性ELISA。结合ELISA结果示于图24A、27A及27B中。通过ELISA，所有预接种(第0天)的血清就MERS-刺突特异性抗体而言是阴性的。在用MERS-刺突第三次接种之后，低剂量和高剂量组显示产生高滴度抗体。在具有MERS-刺突蛋白的低和高剂量疫苗免疫猴中都观察到超过10,000的终点MERS-刺突特异性抗体滴度的显著提高(图24B)。因此，不同于没有接受疫苗的动物(即pVax1对照组)，接受疫苗的动物具有MERS-刺突抗原特异性体液免疫应答。

实施例18

在非人灵长类动物(NHP)中交叉中和抗体应答的增强的能力

同样从取血前及第三次免疫之后测量针对MERS-HCoV的实验室修改储备液的中和抗体(Nab)。通过IM-EP，用500ug或2mg总DNA免疫猴子三次并且示出了高水平的针对活MERS-EMC/2012分离株(分化体A)的Nab(图24C)。MERS-CoV基因组在种系发生上被分为2个分化体，分化体A和B簇。为了测试此交叉分化体中和活性，通过表达多个刺突蛋白分化体并引发针对所有其他MERS-CoV分化体的中和活性的MERS-假病毒进行交叉中和(图24D)。因此，用表达共有MERS-刺突的DNA的接种导致产生更高的抗体滴度和针对MERS-CoV的更持久的Nab应答。总之，这些发现表明MERS-刺突DNA接种产生多克隆抗体，其不仅结合至MERS-刺突蛋白，而且具有功能活性并引发MERS中和抗体。

实施例19

接种后的MERS攻击和病理学

设计实验来评价用MERS-CoV接种的恒河猴的临床观察。

如上表2所示，在第10周用MERS鼻内(i.n.)攻击NHP，之后在第12周进行分析。此12周分析包括x射线数据/病理学分析。

用pVax1DNA载体免疫的对照组在此期间在所有肺叶中都具有肉眼损害且在攻击之后第5天在较低肺叶中具有显著的病变。对照组中的此宏观病理学与MERS感染一致。表3概述了动物的病理学。概括地说，MERS-刺突DNA接种动物与对照动物组相比示出了不存在肉眼损害的改善的临床参数，由此表明MERS-刺突DNA疫苗提供针对MERS感染的保护。

表3：在用1与6dpi之间的MERS-CoV接种的恒河猴肺脏中的辐射图像发现。在第1、3、5及6天进行图像和临床观察。

¹用pVax1免疫。²用MERS-刺突(高)免疫。³用MERS-刺突(低)免疫。

6.条款

条款1.一种包含核酸分子的疫苗，其中：(a)所述核酸分子包含在SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的全长上具有至少约90％同一性的核酸序列；或(b)所述核酸分子包含在SEQ ID NO:3中列出的核酸序列的全长上具有至少约90％同一性的核酸序列。

条款2.条款1的疫苗，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。

条款3.条款1的疫苗，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。

条款4.条款1的疫苗，其还包含：(a)包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽；或(b)包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽。

条款5.条款1的疫苗，其中所述核酸分子包含表达载体。

条款6.条款1的疫苗，其中所述核酸分子并入病毒颗粒中。

条款7.条款1的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。

条款8.条款1的疫苗，其还包含佐剂。

条款9.一种包含核酸分子的疫苗，其中：(a)所述核酸分子编码包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽；或(b)所述核酸分子编码包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽。

条款10.条款9的疫苗，其中所述核酸分子编码包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的肽。

条款11.条款9的疫苗，其中所述核酸分子编码包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的肽。

条款12.条款9的疫苗，其还包含：(a)包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽；或(b)包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列的肽。

条款13.条款9的疫苗，其中所述核酸分子包含表达载体。

条款14.条款9的疫苗，其中所述核酸分子并入病毒颗粒中。

条款15.条款9的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。

条款16.条款9的疫苗，其还包含佐剂。

条款17.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。

条款18.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。

条款19.一种肽，其包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。

条款20.一种肽，其包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

条款21.一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原是由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3编码。

条款22.条款21的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:1编码。

条款23.条款21的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:3编码。

条款24.条款21的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

条款25.条款24的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。

条款26.条款24的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

条款27.一种包含肽的疫苗，其中(a)所述肽包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列；或(b)所述肽包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

条款28.条款27的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。

条款29.条款27的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

条款30.一种在有此需要的受试者中诱导针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用条款1、9、21或27的疫苗。

条款31.条款30的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

条款32.一种保护有此需要的受试者以免感染中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的方法，所述方法包括向所述受试者施用条款1、9、21或27的疫苗。

条款33.条款32的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

条款34.一种治疗有此需要的受试者的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的方法，所述方法包括向所述受试者施用条款1、9、21或27的疫苗，其中所述受试者由此对一种或多种MERS-CoV菌株有抗性。

条款35.条款34的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。

所公开的实施方案的各种改变和改进对本领域技术人员是显而易见的。在不偏离其本质和范围的前提下，可进行与包括但不限于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的此类改变和改进。

Claims (35)

1.一种包含核酸分子的免疫原性组合物，其中：

(a)所述核酸分子包含在SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述核酸序列；或

(b)所述核酸分子包含在SEQ ID NO:3中列出的核酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述核酸序列。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:1中列出的所述核酸序列。

3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:3中列出的所述核酸序列。

4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包含：

(a)包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列的肽；或

(b)包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列的肽。

5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含表达载体。

6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子并入病毒颗粒中。

7.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。

8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

9.一种包含核酸分子的免疫原性组合物，其中：

(a)所述核酸分子编码包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列的肽；或

(b)所述核酸分子编码包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列的肽。

10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含SEQ ID NO:2中列出的所述氨基酸序列的所述肽。

11.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含SEQ ID NO:4中列出的所述氨基酸序列的所述肽。

12.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其还包含：

(a)包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列的肽；或

(b)包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列的肽。

13.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含表达载体。

14.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子并入病毒颗粒中。

15.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。

16.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

17.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。

18.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。

19.一种肽，其包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。

20.一种肽，其包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

21.一种包含抗原的免疫原性组合物，其中所述抗原是由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3编码。

22.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是由SEQ ID NO:1编码。

23.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是由SEQ ID NO:3编码。

24.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4中列出的氨基酸序列。

25.如权利要求24所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2中列出的所述氨基酸序列。

26.如权利要求24所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4中列出的所述氨基酸序列。

27.一种包含肽的免疫原性组合物，其中

(a)所述肽包含在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列；或

(b)所述肽包含在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的全长上具有至少约90％同一性的所述氨基酸序列。

28.如权利要求27所述的免疫原性组合物，其中所述肽包含SEQID NO:2中列出的所述氨基酸序列。

29.如权利要求27所述的免疫原性组合物，其中所述肽包含SEQID NO:4中列出的所述氨基酸序列。

30.一种诱导有此需要的受试者中针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1、9、21或27所述的免疫原性组合物。

31.如权利要求30所述的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

32.一种保护有此需要的受试者以免感染中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1、9、21或27所述的免疫原性组合物。

33.如权利要求32所述的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

34.一种治疗有此需要的受试者的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1、9、21或27所述的免疫原性组合物，其中所述受试者由此对一种或多种MERS-CoV菌株有抗性。

35.如权利要求34所述的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。