JP6412131B2 - MERS‐CoVワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、中東呼吸器症候群コロナウィルス(MERS‐CoV)に対するワクチン及び該ワクチンの投与方法に関する。
本出願は、2013年11月29日出願のU.S.Provisional Patent Application No.61/910,153の優先権を主張し、引用により本書に援用する。
コロナウィルス(CoV)は、世界中でよく見られるウィルスの一種であり、人間に風邪から重症急性呼吸器症候群(SARS)に至る疾患をもたらす。コロナウィルスは動物にも多くの病気をもたらしうる。ヒトコロナウィルス229E、OC43、NL63、及びHKU1は、ヒト個体群に特有である。
本発明は、中東呼吸器症候群コロナウィルス(MERS−CoV)抗原を含むワクチンに関する。MERS‐CoVは、2012年に初めて出現した新型の高病原性ウィルスであって、それ故、本書に記載のワクチンは、標的MERS‐CoVに対する最初のワクチンの一つである。従って、当該ワクチンは、従前の治療が存在せず、大流行の可能性が残るこの新型病原性ウィルスに対する治療を提供する。
別段に定めのない限り、本書に用いたすべての専門用語及び科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同義である。矛盾する場合、定義を含む本書が統制する。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本書に記載の方法及び材料と同様または同等の方法及び材料が、本発明の実施または試験に用いられうる。本書に言及したすべての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体を引用して援用する。本書に開示した材料、方法、及び実施例は、一例にすぎず、限定するものではない。
本書では、中東呼吸器症候群コロナウィルス(MERS−CoV)抗原、その断片、その異形、またはこれらの組合せを含むワクチン等の免疫原性組成物を提供する。該ワクチンは、MERS‐CoVのあらゆる株から防御し、それにより、MERS‐CoVに基づく病変を治療、予防、及び/またはそれから防御するために用いられうる。該ワクチンは、該ワクチンを投与された患者の免疫応答を有意に誘導し、MERS‐CoV感染を防ぎ、これを治療する。
に対して特異的でありうる。該中和抗体は、該MERS‐CoV抗原と反応性でありうる。該中和抗体は、該ワクチンを投与された患者において、MERS‐CoV感染及び関連する病変の予防並びに/または治療を提供しうる。
上述したように、該ワクチンは、MERS‐CoV抗原、その断片、その異形、またはこれらの組合せを含む。MERS‐CoVを含めてコロナウィルスは、膜で被包されており、該コロナウィルスの表面に突出スパイクを形成する、スパイク(S)タンパク質として知られる1型膜糖タンパク質を有する。該スパイクタンパク質は、細胞表面に位置するタンパク質、例えば、メタロプロテアーゼアミノペプチダーゼNへの該コロナウィルスの結合を促し、細胞‐ウィルス膜融合を仲介する。具体的には、該スパイクタンパク質は、細胞表面タンパク質への該コロナウィルスの結合を促すS1サブユニットを含む。従って、該スパイクタンパク質の該S1サブユニットは、どの細胞が該コロナウィルスで感染されるかを制御する。該スパイクタンパク質は、ウィルス及び細胞膜の融合を促す膜透過サブユニットであるS2サブユニットも含む。従って、該MERS‐CoV抗原は、MERS‐CoVスパイクタンパク質、MERS‐CoVスパイクタンパク質のS1サブユニット、またはMERS‐CoVスパイクタンパク質のS2サブユニットを含みうる。
該MERS‐CoV抗原は、MERS‐CoVスパイク抗原、その断片、その異形、またはこれらの組合せでありうる。該MERS‐CoVスパイク抗原は、1またはそれ以上のMERS‐CoV株に対する哺乳類の免疫応答を誘発することが可能である。該MERS‐CoVスパイク抗原は、抗MERS‐CoV免疫応答が誘導されうる免疫原として特に有効なエピトープを含みうる。
該MERS‐CoV抗原は、細胞質ドメイン欠損MERS‐CoVスパイク抗原(本書では「MERS‐CoVスパイク抗原ΔCD」とも言う)、その断片、その異形、またはこれらの組合せでありうる。該MERS‐CoVスパイク抗原ΔCDは、1またはそれ以上のMERS‐CoV株に対する哺乳類の免疫応答を誘発することが可能である。該MERS‐CoVスパイク抗原ΔCDは、抗MERS‐CoV免疫応答が誘導されうる免疫原として特に有効なエピトープを含みうる。
該ワクチンは、該抗原をコードする核酸を含む1またはそれ以上のベクターを含みうる。該1またはそれ以上のベクターは、該抗原の発現が可能でありうる。該ベクターは複製起点を含む核酸配列を有しうる。該ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体でありうる。該ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは、宿主のゲノムと合体するベクターのいずれかでありうる。
該ベクターは環状プラスミドまたは線状核酸でありうる。該環状プラスミド及び線状核酸は、適切な患者の細胞の特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。該ベクターは、該抗原をコードするヌクレオチド配列であって、終止シグナルに作動可能に結合していてもよいヌクレオチド配列に作動可能に結合したプロモーターを有しうる。該ベクターは、該ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含みうる。目的の該ヌクレオチド配列を含む該ベクターは、少なくとも1つのその成分が少なくとも1つの他の成分に対して異種であることを意味するキメラでよい。発現カセットにおける該ヌクレオチド配列の発現は、構成プロモーターまたは、宿主細胞がいくつかの特定の外的刺激にさらされたときのみ転写を開始する誘導プロモーターの支配下にあってよい。多細胞生物の場合、該プロモーターは、特定の組織、器官、または発達段階に対しても特異的でありうる。
該ベクターは、環状プラスミドでよく、これは、細胞ゲノムへの融合によって標的細胞を形質転換するか、または染色体外に存在する(例えば、複製起点を備えた自己複製プラスミド)。
該ベクターはプロモーターを有しうる。プロモーターは、遺伝子発現を操作し、単離された核酸の発現を調節することが可能な任意のプロモーターでよい。かかるプロモーターは、本書に記載の抗原配列を転写するDNA依存性RNAポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用性配列因子である。異種核酸の発現を指示するのに用いられるプロモーターの選択は、個別の用途による。該プロモーターは、該ベクターで、自然環境での転写開始部位からの距離とほぼ同じ転写開始からの距離に位置してよい。しかしながら、この距離の変動は、プロモーターの機能を損なうことなく調整されうる。
該ワクチンは、さらに、医薬的に許容される賦形剤を含んでよい。該医薬的に許容される賦形剤は、溶媒、担体、または希釈剤等の機能分子でありうる。該医薬的に許容される賦形剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体(ISCOMS)、不完全フロイントアジュバント、モノホスホリルリピドAを含むLPSアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレン及びスクアレン等の小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウィルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の周知のトランスフェクション促進剤を含みうるトランスフェクション促進剤でよい。
該ワクチンを患者に投与することによって、疾患を治療、予防、及び/またはそれから防御することを必要とする患者において、疾患を治療、予防、及び/またはそれから防御する方法もまた本書で提供する。該患者への該ワクチンの投与で、該患者の免疫応答を誘導または誘発できる。該誘導された免疫応答は、疾患、例えばMERS‐CoV感染に関連した病変を治療、予防、及び/またはそれから防御するために利用できる。該誘導された免疫応答は、該ワクチンを投与された患者に1またはそれ以上のMERS‐CoV株に対する耐性を与えた。
該ワクチンは、医薬業者に周知の標準的な技術に従って処方されうる。かかる組成物は、個々の患者の年齢、性別、体重、及び状態等の因子、並びに投与方法を考慮して、医療業者に周知の投与量及び技術で投与されうる。該患者は、哺乳類、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、またはマウスでありうる。
上記ワクチン接種方法を用いて患者を治療するために使用することができるキットを本書に提供する。該キットは、該ワクチンを含みうる。
実施例1
MERS‐CoVコンセンサススパイク抗原
本書の他の部分で記載された通り、図3に示すように多数のMERS‐CoV株が存在し、コンセンサススパイク抗原がこれら多数のMERS‐CoV株の間の相違を説明するために作り出された。従って、該MERS‐CoVコンセンサススパイク抗原は、は、図3に列挙したウィルスのそれぞれのスパイク抗原から得た。該スパイク抗原に基づいた系統樹解析を行い、該MERS‐CoVコンセンサススパイク抗原を、その成分スパイク抗原に関連して掲載した(図3、「MERS‐HCoV‐Consensus」の標識は、MERS‐CoVコンセンサススパイク抗原を示した)。該MERS‐CoVコンセンサススパイク抗原は、N末端免疫グロブリンE(IgE)リーダー配列も含んだ。該MERS‐CoVコンセンサススパイク抗原を構成する核酸及びアミノ酸配列をそれぞれ図8A及び8Bに示す。図8Aにおいて、下線部は該IgEリーダー配列をコードするヌクレオチドを示す。図8Bにおいて、下線部は該IgEリーダー配列を示す。
細胞質ドメイン欠損MERS‐CoVコンセンサススパイク抗原
コロナウィルスからの該スパイク抗原は、膜透過ドメインを有する1型膜糖タンパク質であって、これは、順に、該スパイク抗原の細胞質及び非細胞質ドメインを決める。該MERS‐CoVスパイク抗原における細胞質ドメインの位置を確定するため、ウェブソフトを用いて様々なMERS‐CoVスパイク抗原内のドメインの位置を予測した。具体的には、ウェブソフトPhobius及びInterProScanをこの解析に採用した。Phobius及びInterProScan解析からの代表的な結果をそれぞれ図5及び6に示す。
発現及び液性応答
上述したMERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物を、それぞれの抗原が細胞内で発現すること及び抗体で認識可能であることを確定するために調べた。該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物をpVAX1とともに293T細胞にトランスフェクトした。pVAX1は対照とした。
実施例5〜7の免疫化スケジュール
図10に示した免疫化レジメンに従って、C57/BL6マウスに、pVAX1、MERS‐HCoV‐WT構築物、またはMERS‐HCoV‐ΔCDで免疫を与えた。0日目で各マウスにそれぞれのワクチンを筋肉注射(IM)で与え、続いて電気穿孔した。具体的には、各マウスをトリブロモエタノール‐アバチンで麻酔し、前脛骨筋(TA)の部位の毛を小動物クリッパーで剃り、皮膚を露出させた。該ワクチンは、IM注入によって、最終体積30〜50μLで投与した。次に滅菌CELLECTRA3P IDアレイを該皮膚から、該IM注入部位の周囲の筋肉に挿入した。該CELLECTRA 3P IDアレイは、長さが3mmで、成形プラスチックで一つにされた3つの26ゲージ針電極を含んでいた。該針電極は、CELLECTRA電気穿孔装置にCELLECTRA3Pを適用して装着された。該筋肉への該アレイの挿入後、短い電気パルスを供給し、該免疫を与えたマウスをそれぞれのケージに入れ、蘇生するまで注意深く観察した。上記免疫化手順を14日目及び28日目に繰り返した。従って、0日目の免疫化は刺激の免疫化であって、14日目及び28日目の免疫化は追加の免疫化であった。35日目に、該マウスを殺処分し、後述する実施例5〜7の通り免疫分析を行った。
IgG抗体反応
該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物によって誘導された液性免疫応答をさらに調べるため、実施例4に記載したようにマウスに免疫を与えた。該免疫化レジメンの開始前に前採血し、該免疫化レジメンの21日目及び35日目にも採血した。該前採血及び採血は後眼窩静脈叢法で得た。
CD8+T細胞応答
上述したように、該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物は各々、該MERS‐CoVスパイク抗原に対して有意な液性免疫応答を誘導した。該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐CoV‐ΔCD構築物が細胞性免疫応答も誘導するかどうかを確認するため、マウスに実施例4に記載のように免疫を与えた。該免疫化レジメンの35日目の殺処分の後、CD8+T細胞の抗原特異的応答をインターフェロン‐ガンマ(IFN‐γ)ELISpot分析を用い、該全コンセンサスMERS‐CoVスパイク抗原のアミノ酸配列を網羅するペプチドプールのマトリクスで分析した。該ペプチドプールのマトリクスは図12に示し、また、該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物で誘導されたCD8+T細胞応答によって認識された優性エピトープの同定を容易にした。このペプチドプールのマトリクスは、該MERS‐HCoV‐WTスパイク抗原の全長にわたるペプチドスキャンから得、該ペプチドは11アミノ酸が重複する15量体であった。
多官能細胞性免疫応答
上述したように、該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物は、該MERS‐CoVスパイク抗原に反応性で特異的なCD8+T細胞応答を誘導した。該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物で誘導された細胞性免疫応答をさらに調べるため、免疫化後の該T細胞の官能性を調べた。具体的には、上記実施例4に記載した免疫化レジメンに従って、pVAX1、MERS‐HCoV‐WT構築物、またはMERS‐HCoV‐ΔCD構築物でマウスに免疫を与えた。該免疫化レジメンの35日目、殺処分したマウスから脾細胞を単離した。単離された脾細胞を、全コンセンサスMERS‐CoVスパイク抗原由来のペプチドを含むペプチドプールで、インビトロで刺激した。該ペプチドプール及び該脾細胞を5時間ともに培養した。その後細胞を、IFN‐γ、腫瘍壊死因子アルファ(TNF‐α)、及びインターロイキン‐2(IL‐2)の細胞内産生について染色し、蛍光活性化細胞選別装置(FACS)で分類した。
中和抗体
上記実施例5に記載したように、該MERS‐HCoV‐WT及びMERS‐HCoV‐ΔCD構築物は液性免疫応答を誘導した。誘導された液性免疫応答をさらに調べるため、pVAX1、MERS‐HCoV‐WT構築物、またはMERS‐HCoV‐ΔCD構築物で免疫を与えたマウスの中和抗体濃度を調べた。具体的には、血清を最小必要量の媒体で希釈し、ウェル当たり感染性HCoV‐EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012)を100粒含むDMEM50μlとともに37°Cで培養した。90分後、該ウィルス‐血清混合物を、96ウェルの平底プレート中のベロ細胞の単層(100,000細胞/ウェル)に加え、5%CO2インキュベーター中、37°Cで5日間培養した。各検体の中和抗体力価は、該細胞の50%未満がCPEを示した最大希釈として示した。値は、希釈の逆数で示した。該検体はすべて重複して実験を行い、最終結果は該2つの検体の平均とした。
実施例10〜19の材料及び方法
細胞培養、プラスミド、及びMERS‐HCoV‐Spikeタンパク質の発現 HEK293T細胞(ATCC#:CRL‐N268)及びVero‐E6細胞(ATCC#:CRL‐1586)はFBS10%のDMEM(DMEM)で増殖させた。該MERS‐HCoV‐Spike WT及びSpikeΔCDプラスミドDNA構築物は、該MERS Spikeタンパク質(S)の最適化コンセンサス配列をコードした。さらに、Ig重鎖イプシロン‐1シグナルペプチドを各配列のN末端と結合させ、N末端のメチオニンと置き換え、発現を促進した。各遺伝子は、マウスでの発現用に、コドン最適化及びRNA最適化を含めて、遺伝的に最適化した。該最適化された遺伝子は、次に、サイトメガロウィルス前初期(CMV)プロモーター(GenScript)の支配下、修飾pVax1哺乳類発現ベクターにサブクローンした。これらMERS‐HCoV‐Spike WT及びSpikeΔCDプラスミドDNA構築物の構造も上記実施例1及び2に記載した。
雌のC57BL‐6マウス(6〜8週齢;Jackson Laboratories)をこれらの実験に用い、3つの実験群に分けた。動物はすべて、National Institutes of Health(Bethesda)及びUniversity of Pennsylvania(米国ペンシルベニア州フィラデルフィア)Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)のガイドラインに従って、温度管理され、光周期の施設で飼育した。免疫化はすべて生体内低侵襲EP供給技術(MID‐EP)にて、前脛骨筋(25μg)に総体積25μl投与した。
抗原特異的T細胞応答は、IFN‐γELISpotを用いて測定した。つまり、PVDFの96ウェルプレート(ミリポア)を精製抗マウスIFN‐γ捕捉抗体で被覆し、4°Cで24時間培養した(R&D Systems)。翌日、プレートを洗浄し、1%BSAと5%シュークロースで2時間ブロックした。該免疫化マウスから20万の脾細胞を各ウェルに加え、5%CO2中37°Cで、RPMI1640(負の制御)、ConA(5ug/mL;正の制御)、または特異的ペプチド抗原(Ag)(10μg/ml;GenScript)の存在下、一夜刺激した。ペプチドプールは、11アミノ酸が重複する15量体のペプチドからなっていた(GenScript)。刺激から24時間後、該細胞を洗浄し、ビオチニル化抗マウスIFN‐γAb(R&D Systems)とともに4°Cで24時間培養した。該プレートを洗浄し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(R&D Systems)を各ウェルに加え、室温で2時間培養した。該プレートを洗浄し、5‐ブロモ‐4‐クロロ‐3’‐インドリルリン酸p‐トルイジン塩及びニトロブルーテトラゾリウムクロリド(Chromogen 呈色試薬;R&D Systems)を各ウェルに加えた。該プレートをその後蒸留水ですすぎ、室温で一夜乾燥させた。自動ELISpot読取機(CTL Limited)でスポットを数えた。
脾細胞を96ウェルプレートに添加し(1×106/ウェル)、プールされたMERS抗原ペプチドで、Protein Transport Inhibitor Cocktail(Brefeldin A及びMonensin;eBioscience)の存在下、メーカーの説明書に従って37C/5%CO2で5〜6時間刺激した。Cell Stimulation Cocktail(さらにタンパク質輸送阻害剤)(ホルボール12‐ミリスチン酸13‐アセテート(PMA)、イオノマイシン、ブレフェルジンA及びモネンシン;eBioscience)を正の制御として用い、R10培地を負の制御として用いた。すべての細胞をその後、メーカーの説明書(BD)通りに表面及び細胞内タンパク質について染色した。つまり、蛍光色素標識抗体での表面染色前に該細胞をFACS緩衝液(アジ化ナトリウム0.1%及びFCS1%含有PBS)で洗浄した。細胞をFACS緩衝液で洗浄し、固定化し、BD Cytofix/Ctyoperm TM(BD)を用いてメーカーのプロトコルに従って透過化し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色に用いた:LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell 染色キット(Invitrogen)、CD19(V450;クローン1D3;BD Biosciences)CD4(FITC;クローンRM4−5;ebioscience)、CD8(APC‐Cy7;クローン53-6.7;BD Biosciences);CD44(A700;クローンIM7;Biolegend)。細胞内染色については、以下の抗体を用いた:IFN‐γ(APC;クローンXMG1.2;Biolegend)、TNF‐α(PE;クローンMP6‐XT22;ebioscience)、CD3(PerCP/Cy5.5;クローン145-2C11;Biolegend);IL‐2(PeCy7;クローンJES6‐SH4;ebioscience)。データはすべてLSRII流動細胞計測器(BD Biosciences)を用いて集め、FlowJoソフト(Tree Star)及びSPICE v5を用いて解析した。FlowJoソフトを用いてブールゲーティングを行い、ワクチン接種した動物からのT細胞の多官能性を調べた。
酵素結合免疫吸着分析(ELISA)を用いてマウス血清の力価を測定した。つまり、精製組み換えヒトベータコロナウィルスSpikeタンパク質2c EMC/2012(分岐群A)(Sino Biological Inc.)5μg/mlを用いて96ウェルのマイクロタイタープレート(Nalgene Nunc International、イリノイ州ネイパービル)を4°Cで一夜被覆した。FBS10%のPBSでブロックした後、プレートを0.05%PBST(Tween20入りPBS)で4回洗浄した。免疫化マウスの血清検体を連続的に1%FBS、0.2%PBSTで希釈し、該プレートに添加し、その後室温で1時間培養した。プレートは再度0.05%PBSTで4回洗浄し、メーカーの説明書(シグマアルドリッチ)に従って希釈したHRP標識抗マウスIgGとともに室温で1時間培養した。結合酵素はOPD(o‐フェニレンジアミン二塩酸塩)錠剤をメーカーの説明書(SIGMAFAST;シグマアルドリッチ)に従って加えることで検出した。反応は15分後に2NのH2SO4を添加して停止した。プレートはその後、96Microplate Luminometer(GLOMAX;Promega)にて、450nmの光学濃度を読み取った。検体はすべて繰り返してプレートにした。終点力価は、3以上の正常血清からの平均吸光度プラス3標準偏差より高い吸光度値の最大希釈として決定した。
MERS‐HCoV‐Spikeプラスミドでトランスフェクトした細胞については、スライドガラスを氷冷アセトンで5分間固定化した。その後非特異的結合をスキムミルク5%入りPBSで、37°Cで30分間ブロックした。該スライドガラスを次にPBSに入れ5分間洗浄し、続いて免疫化マウスの血清で、1:100希釈で培養した。1時間培養後、スライドガラスを上述の通り洗浄し、4 6‐ジアミジノ‐2‐フェニルインドール(DAPI)1ug/mLを含むPBSで希釈したAlexa Fluor488ヤギ抗マウスIgG(Invitrogen)で、37°Cで30分間培養した。未結合の抗体を洗い流した後、Prolong Gold退色防止試薬(Invitrogen)をカバースリップに載せ、該スライドガラスを共焦点顕微鏡(LSM710;Carl Zeiss)下で観察した。得られた画像を、Zenソフト(Carl Zeiss)を用いて解析した。
コドン最適化コンセンサスMERS‐HCoV Spike遺伝子を合成し、pVax1ベクターにサブクローン化した。MERS‐HCoV‐Spike偽ウィルスが得られた。具体的には、2×106のHEK293T細胞を10cmの組織培養プレートに播種し、TurboFectin8.0(OriGene)トランスフェクション試薬を用いて、約80%集密でMERS‐SpikeまたはVSV‐Gタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。HIV/MERS‐Spike偽粒子を産生するため、pNL Luc E‐R‐(NIH‐AIDS‐Reagent Program)10μg及び各種分岐群からのpVax1‐MERS‐Spike10μgを細胞に共トランスフェクトした。12時間後、トランスフェクション培地を取り除き、新鮮培地で約12時間置換し、細胞を37°Cで24〜48時間培養した。該偽ウィルス含有培地を採取し、ろ過し、偽ウィルスはSW41ロータにて40,000rpmで1時間、TNE緩衝液(Tris10mM、NaCl135mM、EDTA2mM、pH8.0)で調製した20%シュークロースクッションを介して濃縮した。該ペレットをTNE緩衝液500μLに一夜再懸濁し、分割して−80°Cで保管した。
50%組織培養感染量(TCID50)を算出し、ウィルスの標準濃度(すなわち、100TCID50)を、MERS‐HCoV DNA免疫化動物由来のマウス血清で行った本研究を通して中和試験に用いた。つまり、該マウス血清をMEMで連続的に希釈し、感染性HCoV‐EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012)をウェル当たり100粒含むDMEM50ulとともに37°Cで培養した。90分後、該ウィルス‐血清混合物を、96ウェルの平底プレート中のベロ細胞の単層(100,000細胞/ウェル)に加え、5%CO2インキュベーター中、37°Cで5日間培養した。各検体の中和抗体力価は、細胞の50%未満がCPEを示す最大希釈として示した。値は、希釈の逆数で示す。検体はすべて重複して実験を行い、最終結果は2つの値の平均とした。中和率は次のように算出した:中和率={目的のmAbの1‐PFU(各濃度)/負の制御の平均PFU(全濃度)}。GraphPad Prism5を用いて中和曲線を作り、解析した。S字型用量‐反応(可変勾配)による非線形回帰フィッティングを用いてIC50及びIC80を測定した。正及び負の制御の血清はこの分析を認証するために含めた。
細胞生存率は3‐(4,5‐ジメチルチアゾール‐2‐イル)‐2,5‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT、5mg/ml、シグマ)を用いて測定した。培養はウェル当たりの細胞密度2.5×103で96ウェルのプレートで開始した。培養48時間後、細胞をMERS偽ウィルスで感染させ、48時間培養した。培養後、MTT試薬15μlを各ウェルに加え、37°Cで4時間、暗所で培養した。上清を吸引し、ホルマザン結晶をDMSO100μlに37°Cで15分間緩やかに攪拌しながら溶解した。ウェル当たりの540nm吸光度をLuminometer Reader(GLOMAX;Progema)を用いて測定した。データは、3つの独立した実験から解析し、培地のみ(0%)及び未処理細胞(100%)を含むウェルの吸光度に対して正規化した。IC50値は、S字型用量‐反応曲線からPrism GraphPadソフトを用いて算出した。
3群のアカゲザルに、3回(刺激及び2回の追加)、3週あけて(0、3、6週目)投与した。第1群及び第2群のアカゲザルは、EP装置での筋肉内免疫化にて、該MERS‐Spike(N=4)ワクチンを発現するDNAワクチンを、合計で0.5mg及び2mg/投与受けた。第1群及び第2群は、全コンセンサスMERS Spike抗原を受けた。第3群のアカゲザルは、対照ワクチン(pVax1)を合計で2mg/投与受けた。これらの研究におけるDNAワクチンの該投与量と免疫化レジメンは、あらかじめアカゲザルで最適になるように決定した。血液を各投与の後に採取して血清抗体並びに中和及び全身性T細胞応答を分析した。動物は、ケタミンHCL(10〜30mg/kg)の筋肉注射で麻酔した。該ワクチンを各大腿部(接種ごとに大腿部につき1注入部位)投与し、筋肉内(IM)経路で供給した。IM投与のため、DNA注入の直後、0.5A定電流の持続時間52msの3パルスをパルス間隔1sでかけた。
3群のアカゲザルに、3回(刺激及び2回の追加)、3週あけて(0、3、6週目)投与した。第1群及び第2群のアカゲザルは、EP装置での筋肉内免疫化にて、MERS‐Spike(N=4)ワクチンを発現するDNAワクチンを、合計で0.5mg及び2mg/投与受けた。第3群のアカゲザルは、対照ワクチン(pVax1)を合計で2mg/投与受けた。これらの研究におけるDNAワクチンの該投与量と免疫化レジメンは、あらかじめアカゲザルで最適になるように決定した。血液を各投与の後に採取して血清抗体並びに中和及び全身性T細胞応答を分析した。動物は、ケタミンHCL(10〜30mg/kg)の筋肉注射で麻酔した。該ワクチンを各大腿部(接種ごとに大腿部につき1注入部位)投与し、筋肉内(IM)経路で供給した。IM投与のため、DNA注入の直後、0.5A定電流の持続時間52msの3パルスをパルス間隔1sでかけた。
4〜6歳の健康なアカゲザル(Macara mulatta)12匹に、すでに定着しているように(Falzarano et al Nature Medicine 19,1313−1317(2013))気管内、鼻腔内、口腔、及び眼球経由の組合せでMERS‐CoVを合計で7×106TCID50接種した。動物は、非盲検法で、ランダムに処理または未処理群に割り当てた。
免疫応答を評価するための該動物実験は少なくとも3回繰り返し、各マウスの応答を統計分析に対する個体のデータ点とみなした。データはすべて平均±標準偏差として示した。動物実験及び各種免疫分析から得たデータはGraphPadのone−way ANOVAを用いて調べ、差異はp<0.05で有意と見なした。GraphPad Prism v.5.0(GraphPad Software,Inc.)を統計分析に用いた。
MERS‐HCoV Spike及びSpikeΔCDタンパク質のクローニングと発現
MERS‐HCoV Spike遺伝子のコンセンサス配列は、GenBank‐NCBIデータベースにある16のSpikeゲノム配列から作った。免疫原の設計については、分岐群AとB両方からの配列を該コンセンサス配列に含め、得られたコンセンサス配列をMERS‐HCoVの分岐群AとBのウィルス株をまたがる中和活性を測定することで分析した。図19Aに示すように、MERS‐HCoV‐Spikeコンセンサス配列の系統的位置は分岐群B象限の中心に置かれたが、これは、多くの配列がこの分岐群に含まれるためである。さらに、MERS Spike糖タンパク質の2つのコンセンサス配列が設計されたが、ここでは一つの構築物の細胞質ドメイン配列は完全なままであり、第二の構築物の細胞質ドメインが切り取られた。これらの構築物をそれぞれ、MERS‐HCoV Spike(Spike‐Wt)及び細胞質部分欠損(SpikeΔCD)とした。どちらの免疫原に対しても、mRNA核外輸送促進のための高効率IgEリーダーペプチド配列追加を含むいくつかの修飾をして生体内発現を向上させた。該挿入物は、pVax1ベクターにサブクローンした(図19B)。これらSpike‐Wt及びSpikeΔCD DNA構築物の構造も上記実施例1及び2に記載する。
MERS‐HCoV DNA構築物による機能発現及び感染
該コンセンサス配列免疫原の機能性(例えば、ウィルス結合及び侵入)を測定するため、偽ウィルス発現系を開発して、該コンセンサス構築物のウィルス侵入性を分析した。具体的には、MERS‐HCoV偽ウィルス粒子を、MERS‐Spike抗原をコードするプラスミド及び、HIV‐1エンベロープを発現しないHIV‐1ルシフェラーゼレポータープラスミドで、293T細胞を共トランスフェクションして製造した(図20A)。粒子は293T細胞を各種MERS‐Spike遺伝子+レンチウィルスゲノム断片でトランスフェクションすることによって製造した。これは頑丈なウィルス粒子形成を引き起こす。MERS‐Spike媒介感染を特徴づけるため、該コンセンサスMERS‐Spike偽ウィルスと同調して感染した細胞のルシフェラーゼ活性を測定して経時的解析を行った(図20B)。図20Cに見られるように、MERS‐CoVの機能的受容体を発現したベロ細胞及びA549細胞の細胞株の偽ウィルス粒子による接種は、強いルシフェラーゼシグナルを産生し、該偽ウィルスによる増殖感染を示した。これらの実験は、標的細胞に入り、中和抗体の検出に対する偽ウィルスに基づいた阻害分析を確立したSpikeタンパク質を有するMERS偽ウィルスの開発を示した。
マウスにおけるMERS‐HCoV DNAワクチンの免疫原性の増加
該コンセンサス及び修飾Spike糖タンパク質の免疫原性を調べるため、構築物を、そのC57BL/6マウスでの筋肉注射後の免疫応答誘発能について解析した。雌のC57BL/6マウス(n=9)を3つのDNAプラスミド:Spike‐Wt、SpikeΔCD、または対照pVax1ベクターのうちの1種25μgでワクチン接種した。各免疫化の直後、適応電気穿孔(EP)システムを用いた。図21Aに示すように、動物に2週間の間隔で3回ワクチン接種し、3回目の免疫化の1週間後に免疫応答を測定した。
MERS‐Spikeワクチンで誘導されたT細胞応答は多官能性であった
該誘導されたT細胞応答の表現型をさらに確定するため、多官能性T細胞応答を評価した。多染性フローサイトメトリーを用いてCD4+及びCD8+T細胞の両方において抗原特異的形式で誘導されたIFN‐γ、IL‐2、及びTNF‐αの産生を測定した。MERS‐Spike特異的IL‐2、TNF‐α、及びIFN‐γ分泌CD4+及びCD8+T細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルをそれぞれ図25A及び25Bに示す。該構築物はCD8+T細胞から同等な応答を生み出し、該全長構築物はIL‐2、TNF‐α、及びIFN‐γを分泌する有意により高い割合のCD4+T細胞を誘導した。
マウスにおけるMERS‐HCoV‐Spikeワクチン接種で誘導された十分な結合抗体反応及び中和抗体(Nab)反応
該2つの構築物による液性免疫誘導も調べた。マウスでのDNA免疫化の前と後に血清検体を採取した。抗Spike液性免疫応答を組み換えSpike抗原に対する結合について、及び機能的抗体研究において解析した。図18A及び22Aに示すように、ワクチン接種したすべての動物は、プラスミド骨格で免疫化された対照動物と比較して特異的抗体反応を誘導した。CD4+T細胞応答と同様、結合抗体活性は終点力価として定量して、全長免疫化動物においてより強かった(図18B及び22B)。免疫化マウスで作り出された該抗体は、ウェスタンブロット分析において該MERS‐Spike組み換えタンパク質にも結合した(図22C)。総合的に、これらのデータは、該Spike DNAワクチンは、特異的抗体産生及び、該標的Spike抗原に特異的に結合した抗体を誘導したことを示した。
抗MERS‐HCoV‐Spike血清はMERSウィルスに対する中和活性を実証した
該Spike‐WtまたはSpikeΔCDワクチンのいずれかで免疫化されたマウスの血清の中和活性を、分岐群A株ウィルスであるHCoV‐EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012)でのウィルス中和分析で評価した。血清は、Spike‐WtまたはSpikeΔCD及び負の制御のpVax1のいずれかでワクチン接種したマウス(n=9/群)から採取した。図18C及び22Dに示すように、どちらのワクチンも、対照ベクター(pVax1)単独で免疫化したマウスからの血清力価より有意に高い中和抗体力価を誘導した(p=0.0018)。該抗体結合分析と同様、著しく違わないが、該欠損構築物は全長構築物よりも低い濃度の中和応答を誘導すると思われた。
MERS‐Spike DNAワクチン接種後のサルの末梢血での多官能性T細胞産生
MERSチャレンジに対するワクチン有効性も前臨床非ヒト霊長類モデルで評価した。本研究を下記表2に要約する。
液性免疫応答の検出
ワクチン接種した動物から、3回目の免疫化の2週間後に得た血清において、MERS‐spike特異的抗体が検出された。最初に、MERS‐Spikeタンパク質全長を用いて該MERS‐Spike特異的ELISAを行った。結合ELISAの結果を図24A、27A、及び27Bに示す。ワクチン接種前(0日目)のすべての血清はELISAではMERS‐Spike特異的抗体に対して陰性であった。MERS‐Spikeでの3回目の免疫化の後、低投与量及び高投与量群は高力価抗体が産生されたことを示した。10,000を超える終点MERS‐spike特異的抗体力価が、MERS‐Spikeタンパク質での低及び高投与量のワクチン免疫化サルのいずれにおいても観察された(図24B)。従って、該ワクチンを受けた動物は、該ワクチンを受けなかった動物(すなわちpVax1対照群)と異なり、MERS‐Spike抗原特異的液性免疫応答を有する。
非ヒト霊長類(NHP)における交差中和抗体反応能力の増加
MERS‐HCoVのラボ適合ストックに対する中和抗体(Nab)もまた、前採血及び3回目の免疫化後の両方から測定した。サルはIM‐EPによって、総DNA500ugまたは2mgのいずれかで3回免疫を与えられ、生MERS‐EMC/2012分離株(分岐群A)に対するNabを高濃度で示した(図24C)。MERS‐CoVゲノムは、系統発生的に2つの分岐群、分岐群A及びBの集団に分類された。この交差分岐群中和活性を分析するため、Spikeタンパク質の複数の分岐群を発現し、すべての他のMERS‐CoV分岐群に対して中和活性を誘発した該MERS偽ウィルスで交差中和を行った(図24D)。このようにして、該コンセンサスMERS‐Spikeを発現するDNAでのワクチン接種は、MERS‐CoVに対するより高い抗体力価及びより耐久性のNab応答の開発につながった。同時に、これらの発見は、該MERS‐Spike DNAワクチン接種は、MERS‐Spikeタンパク質に結合するだけでなく機能的に活性でもあるポリクローナル抗体を作り出し、MERS中和抗体を誘発したことを示した。
ワクチン接種後のMERSチャレンジ及び病理生物学
MERS‐CoV接種アカゲザルの臨床的観察を評価するために実験を設計した。
表3:MERS‐CoVを接種されたアカゲザルの肺における1〜6dpiの放射線画像所見。画像作成及び臨床的観察を1、3、5、及び6日目に行った。
1.核酸分子を含むワクチンであって、(a)前記核酸分子が、配列番号1に記載の核酸配列の全長の少なくとも約90%相同の核酸配列を含む、または、(b)前記核酸分子が、配列番号3に記載の核酸配列の全長の少なくとも約90%相同の核酸配列を含むワクチン。
Claims (35)
- 核酸分子を含む免疫原性組成物であって、
(a)前記核酸分子が、配列番号1に記載の核酸配列の全長の少なくとも約90%相同の核酸配列を含む、または、
(b)前記核酸分子が、配列番号3に記載の核酸配列の全長の少なくとも約90%相同の核酸配列を含む、免疫原性組成物。 - 前記核酸分子が、配列番号1に記載の核酸配列を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記核酸分子が、配列番号3に記載の核酸配列を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 請求項1に記載の免疫原性組成物であって、さらに、
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%相同のアミノ酸配列を含むペプチド、または、
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%相同のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、前記免疫原性組成物。 - 前記核酸分子が発現ベクターを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記核酸分子がウィルス粒子に組み込まれる、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 核酸分子を含む免疫原性組成物であって、
(a)前記核酸分子が、配列番号2に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%
相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、または、
(b)前記核酸分子が、配列番号4に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%
相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、免疫原性組成物。 - 前記核酸分子が、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む前記ペプチドをコードする、
請求項9に記載の免疫原性組成物。 - 前記核酸分子が、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む前記ペプチドをコードする、
請求項9に記載の免疫原性組成物。 - 請求項9に記載の免疫原性組成物であって、
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%相同のアミノ酸配列を含むペプチド、または、
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%相同のアミノ酸配列を含むペプチドをさらに含む、前記免疫原性組成物。 - 前記核酸分子が発現ベクターを含む、請求項9に記載の免疫原性組成物。
- 前記核酸分子が、ウィルス粒子に組み込まれる、請求項9に記載の免疫原性組成物。
- 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項9に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項9に記載の免疫原性組成物。
- 配列番号1に記載の核酸配列を含む核酸分子。
- 配列番号3に記載の核酸配列を含む核酸分子。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
- 配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
- 抗原を含む免疫原性組成物であって、前記抗原が、配列番号1または配列番号3によってコードされる、免疫原性組成物。
- 前記抗原が、配列番号1によってコードされる、請求項21に記載の免疫原性組成物。
- 前記抗原が、配列番号3によってコードされる、請求項21に記載の免疫原性組成物。
- 前記抗原が、配列番号2または配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の免疫原性組成物。
- 前記抗原が、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の免疫原性組成物。
- 前記抗原が、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の免疫原性組成物。
- ペプチドを含む免疫原性組成物であって、
(a)前記ペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%
相同のアミノ酸配列を含む、または、
(b)前記ペプチドが、配列番号4に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約90%
相同のアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。 - 前記ペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の免疫原性組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の免疫原性組成物。
- 中東呼吸器症候群コロナウィルス(MERS‐CoV)に対する免疫応答を、それを必要とする患者において誘導するための、請求項1、9、21、または27に記載の免疫原性組成物であって、前記患者に投与される、免疫原性組成物。
- 投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも1つを含む、請求項30に記載の免疫原性組成物。
- 中東呼吸器症候群コロナウィルス(MERS‐CoV)による感染を、それを必要とする患者において防御するための、請求項1、9、21、または27に記載の免疫原性組成物であって、前記患者に投与される、免疫原性組成物。
- 投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも1つを含む、請求項32に記載の免疫原性組成物。
- 中東呼吸器症候群コロナウィルス(MERS‐CoV)に対する治療を必要とする患者を治療するための、請求項1、9、21、または27に記載の免疫原性組成物であって、前記患者がそれによって1またはそれ以上のMERS‐CoV株に対して耐性になる、免疫原性組成物。
- 投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも1つを含む、請求項34に記載の免疫原性組成物。
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