KR20210065128A - 아프리카 돼지 열병 바이러스 백신 - Google Patents

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페트러스 데오도로스 요하네스 윌렘슨
베르나르드 페트러스 휴베르터스 피터스
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Abstract

본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는 바이러스 입자, 및 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 본 발명의 바이러스 입자를, 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 면역 반응을 자극하는 방법에 관한 것이다.

Description

아프리카 돼지 열병 바이러스 백신
본 발명은 바이러스 분야, 보다 구체적으로 아프리카 돼지 열병 바이러스(ASFV: African Swine Fever Virus)의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 ASFV에 의한 감염에 대항하는 백신의 생성 방법, 및 돼지에서 아프리카 돼지 열병 바이러스의 감염 및/또는 전파를 예방 또는 완화하기 위한 상기 백신의 용도에 관한 것이다.
아프리카 돼지 열병(ASF)은 돼지와 멧돼지에만 감염되기 쉬운 바이러스성 질환이다. 초기 감염 후, 증상이 나타나기까지 2 내지 10일이 소요될 수 있다. 바이러스의 병원성에 따라, 감염된 동물의 30% 내지 100%가 사망한다. 일반적인 증상에는 식욕 감소, 쇠약, 붉은 피부, 안구 점막에 염증 발생, 구토, 혈성 설사 및 열이 포함된다. 또한, 피부는 청색으로 변할 수 있고, 피부 부위는 사멸하고(흑색 얼룩), 출혈이 발생할 수 있다. 또한, 질환은 임신한 모돈에서 자연 유산을 야기할 수 있다. 임의의 사전에 인식가능한 증상이 없이도 급사가 또한 일어날 수 있다. ASF의 증상은 전형적인 돼지 열병의 증상과 유사하다.
돼지는 급성기(acute phase)에 생존할 수 있고, 회복되는 것으로 나타나지만, 바이러스의 장기 보균자(수 개월에서 전체 수명까지)가 되어 바이러스를 다시 배출하고 다른 동물을 감염시킨다.
바이러스는 동물에서 동물로 직접 전파되고, 바이러스가 번식하는 오염된 물질, 예컨대 배설물, 돼지 고기 및 기타 돼지 제품, 쇠파리 및 진드기, 특히 부드러운 진드기 종, 오르니토도로스 무바타(Ornithodoros moubata)를 통해 간접적으로 전파된다. 감염된 돼지로부터의 음식물 쓰레기 또는 찌꺼기는 또한 바이러스 전파에 기여하는 ASF를 함유할 수 있다. 돼지 농장에 대한 경계 유지 및 국제적인 조치와 같은 시도는 질환의 추가 전파를 예방하기 위해 이루어지고 있다. 2007년부터, 동유럽, 중국 및 러시아에서 ASF가 수 회 발생하였다. 최근에, ASF는 벨기에의 멧돼지 집단에서 진단되었다.
ASF는 아스파르비리다에(Asfarviridae) 과에 속하는 큰 이중 가닥 DNA 바이러스에 의해 야기된다. DNA 게놈은 단리물에 따라, 160 내지 210 kbp의 길이로 상당한 차이를 보인다. 게놈은 ASFV 입자의 54개의 구조 단백질 및 100개 초과의 감염 단백질을 지정하는 150 내지 167개의 오픈 판독 프레임을 포함한다(문헌 [Dixon et al., 2013. Virus Res 173: 3―14]). 혈청군 1 내지 8로 명칭된 8개의 혈청군이 현재까지 동정되었으나, 더 많은 것이 존재할 것이다. 바이러스의 복잡성 및 가변성은 ASF 감염에 대항하는 백신의 생성을 복잡하게 하였다. 불활성화된 백신, 서브유닛 백신, 감쇠된 생백신(live vaccine), 및 재조합 감쇠된 생백신을 비롯하여 여러 상이한 접근법이 사용되어 왔다(문헌 [Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi:10.3390/vaccines5040035]).
비활성화된 백신은 아쥬반트의 존재 하에서도 보호를 제공하지 않는 것으로 확인되었다(문헌 [Stone 등, 1967. Am J Vet Res 28: 475―481]; [Blome 등, 2014. Vaccine 32: 3879―3882]).
서브유닛 백신은 보호하지 못하거나 단지 부분적인 보호를 제공하였다. 이는 부분적으로 많은 수의 코딩된 단백질(160 이하) 및 관련 단백질을 선택하는 어려움에 기인할 수 있다. 또한, 많은 수의 ASFV 단백질의 서열은 알려진 단백질과 닮지 않아(문헌 [Dunigan 등, 2006. Virus Research 117: 119-132]), 이러한 단백질의 기능을 예측하는 것을 어렵게 만든다.
감쇠된 생백신은 악성 균주 또는 천연적으로 낮은 악성 균주, 예컨대 OURT88/3(문헌 [Boinas 등, 2004. J Gen Virol 85: 2177-2187]) 및 NH/68(문헌 [Gil 등, 2008. Arch Virol 153: 1845―1854])로부터 수득된다. 이러한 감쇠된 생백신은 흔히 동종 균주에 대해 100% 이하의 보호를 제공하지만, 이종 균주에 대해서는 단지 부분적인 교차 보호만을 제공한다. 또한, 이들은 흔히 허용불가한 부작용, 예컨대 폐렴, 운동 장애, 회저성 초점, 유산 및 심지어 죽음을 유발한다(문헌 [Sanchez-Cordon et al., 2018. Vet J 233: 41―48]; [Arias 등, 2017. Vaccines 5, 35; doi:10.3390/vaccines5040035]).
최근, 허용가능한 안전성 및 효능 수준을 달성하도록 유전자 결실, 또는 유전자 결실의 조합이 유도된, 감쇠된 재조합 생백신에 의해 가장 유망한 결과가 수득되었다. 사용된 개별 균주에 따라, 다양한 수준의 잔류 독성이 조합됨에도 불구하고, 특정한 단리물에 대한 보호가 관찰되었다(문헌 [Sanchez-Cordon 등, 2018. Vet J 233: 41―48]; [Arias 등, 2017. Vaccines 5, 35; doi:10.3390/vaccines5040035]). 이러한 결실 돌연변이의 장기간 유전적 안정성은 알려져 있지 않고, 필드 조건에서 더 큰 시험 결과도 그러하다.
따라서, 효과적이고 안전하고, 다수의 상이한 ASFV 균주에 의한 감염에 대해 보호를 제공하는 백신을 제공하는 것에 대한 요구가 존재한다.
따라서, 본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산 분자, 바람직하게는 재조합 DNA 분자를 제공하고, 상기 T-세포 항원은 프로테아좀 절단에 대한 신호를 함유하는 스페이서, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 스페이서에 의해 분리된다. 상기 폴리에피토프는 바람직하게는 T-세포 항원으로서 2 내지 50개의 펩티드를 포함한다. 상기 폴리에피토프는 바람직하게는 T-세포 항원으로서 2 내지 50개의 노나펩티드, 바람직하게는 표 1에 도시된 바와 같은 노나펩티드 1 내지 13 및 15 내지 20을 포함하고, 이는 약 1 내지 5개의 아미노산 잔기의 스페이서, 바람직하게는 표 2에 도시된 바와 같은 스페이서 서열 1 내지 11에 의해 분리된다.
본 발명의 재조합 분자는 추가로 만능(universal) T-세포 에피토프를 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 분자는 바람직하게는 폴리에피토프의 5'-말단 종료점에서 유비퀴틴에 대한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자를 추가로 제공한다. 상기 바이러스 입자는 마커 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 본 발명의 바이러스 입자를 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 면역 반응을 자극하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 투여는 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 돼지에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자와 조합된다. 상기 재조합 분자는 바람직하게는 비경구적으로, 바람직하게는 근육내 및/또는 피부층 사이에, 바람직하게는 면역 전기천공에 의해 투여된다. 상기 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자는 바람직하게는 약 2주의 간격으로, 바람직하게는 2 내지 4화 투여된다. 바람직한 것은 재조합 핵산 분자 및/또는 바이러스 입자의 적어도 한 번의 투여가 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 합성 T-세포 항원의 투여와 조합되는 것이다. 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 적어도 한 번의 반복된 투여는 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 투여와 함께 조합된다.
본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 분자, 및/또는 본 발명의 바이러스 입자, 및 수의학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 유효 면역화량의 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 본 발명의 바이러스 입자, 및 수의학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 포함하는 백신을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 본 발명의 바이러스 입자를 적어도 하나의 돼지에 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 아프리카 돼지 열병 바이러스의 감염 및/또는 전파를 예방 또는 완화시키는 방법을 제공한다. 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 상기 투여는 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 투여와 함께 바람직하게는 조합된다.
본 발명은 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자를 추가로 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 세트 및 파트의 키트를 추가로 제공한다.
본 발명은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자, 및 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 하나 이상의 바이러스 입자를 포함하는 바이러스 입자의 세트를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자, 및 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 하나 이상의 바이러스 입자를 포함하는 파트의 키트를 추가로 제공한다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 합성 T-세포 항원 및 본 발명의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자를 포함하는 파트의 키트를 추가로 제공한다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스로 차후 감염되는 돼지를 보호하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자, 또는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 세트를 제공한다.
도 1. 서열
1a. 유비퀴틴 및 T-세포 에피토프를 나타내는, 재조합 핵산 분자의 삽입.
1b. ASFDVAC2의 삽입. 볼드체로 나타낸 것은, 유비퀴틴 아미노산 서열, 및 표 1에 제시된 바와 같은 T-세포 항원 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11, 및 18이다. 이탤릭체는 PADRE 아미노산 서열 및 CpG 핵산 서열을 나타낸다.
1c. MVA-p30+B602L 핵산 서열(3106 bp). 5' 말단에서, 대문자의 SwaI 부분, TK의 왼쪽면, 볼드체의 밑줄 친 MVA 13.5L 프로모터, 코작(Kozak) 서열, 볼드체의 균주 E75로부터의 p30 유전자의 코딩 서열, 밑줄 친 FLAG-태그 서열, 이탤릭체의 스탑 코돈, 대문자의 mH5로부터의 종료 서열, 볼드체의 밑줄 친 mH5 초기/후기 프로모터 서열, 코작 서열, 볼드체의 BA71V-B602L(9RL)에 대한 코딩 서열, 밑줄 친 트리플 FLAG-태그 서열, 이탤릭체의 스탑 코돈, 대문자의 C11R의 서열로부터의 종료 서열, TK의 오른쪽면 및 대문자의 SwaI 부위가 나타나 있다.
1d. MVA-p54+EP402R+K205R 핵산 서열(3309 bp). 5' 말단에서, 대문자의 SwaI 부분, TK의 왼쪽면, 볼드체의 밑줄 친 MVA 13.5L 프로모터, 코작 서열, 볼드체의 p54 유전자의 코딩 서열, 밑줄 친 FLAG-태그 서열, 이탤릭체의 스탑 코돈, 대문자의 mH5로부터의 종료 서열, mH5 초기/후기 프로모터 서열, 볼드체의 BA71V-B602L(9RL)에 대한 코딩 서열, 밑줄 친 트리플 FLAG-태그 서열, 이탤릭체의 스탑 코돈, 대문자의 C11R로부터의 종료 서열, 볼드체의 밑줄 친 LEO 프로모터 서열, 코작 서열, 볼드체의 BA71V-K205R 유전자의 코딩 서열, 밑줄 친 FLAG-태그 서열, 이탤릭체의 스탑 코돈, 대문자의 M2L로부터의 종료 서열, TK의 오른쪽면 및 대문자의 SwaI 부위가 나타나 있다.
1e. MVA-p72+A104R 핵산 서열(2992 bp). 5' 말단에서, 대문자의 SwaI 부분, TK의 왼쪽면, 볼드체의 밑줄 친 MVA 13.5L 프로모터, 코작 서열, 볼드체의 p72 유전자의 코딩 서열, 밑줄 친 FLAG-태그 서열, 이탤릭체의 스탑 코돈, 대문자의 mH5로부터의 종료 서열, 볼드체의 밑줄 친 mH5 초기/후기 프로모터 서열, 코작 서열, 볼드체의 BA71V-A140R에 대한 코딩 서열, 밑줄 친 FLAG-태그 서열, 이탤릭체의 스탑 코돈, 대문자의 C11R로부터의 종료 서열, TK의 오른쪽면 및 대문자의 SwaI 부위가 나타나 있다.
도 2. 재조합 핵산 구조체를 이용한 백신접종 결과
2a. 생존율 곡선. 2b. 제시된 접종 후 일(DPC: days post challenge)에서 군당 임상 점수. 백색 컬럼은 죽은 동물을 나타냄. 2c. 제시된 DPC에서 돼지로부터 단리된 말초 혈관 단핵 세포로부터의 ELISPOT 결과. 세포는 제시된 바와 같이 배지, 바이러스 및 펩티드(백신)로 자극되었다.
도 3. 바이러스 구조체를 이용한 백신접종 결과
3a. 생존율 곡선. 3b. 상이한 군에서의 돼지로부터의 평균 사망률 지수. 3c. 세 처리군의 세포-매개 면역 반응. 말초 혈액 단핵 세포를 제시된 접종 후 일(X축: DPC)에 돼지로부터 단리하였다. Y축: ELISPOT로 결정된 바와 같은 인터페론 감마 생산율. 세포는 나타난 바와 같이 배지(음성 대조군), 바이러스(AVP) 및 펩티드로 자극되었다.
4.1 정의
본원에서 사용된 바, 용어 "T 세포 에피토프" 또는 "T 세포 항원"은 항원의 세포내 가공 후 면역 시스템에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 나타낸다. 가공 후, T 세포 에피토프는 적어도 하나의 MHC 분자에 결합되고, 항원 제시 세포의 표면에서 MHC-펩티드 복합체로 발현된다. MHC 분류 I 분자에 의해 제시된 T 세포 에피토프는 전형적으로 길이가 8 내지 11개의 아미노산인 반면, MHC 분류 II 분자는 약 12 내지 25개의 아미노산, 바람직하게는 약 13 내지 17 개의 길이의 아미노산의 펩티드를 제시할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 양친매성 프로파일, 서열 모티프, 정량적 매트릭스, 인공 신경망, 지원 벡터 기계, 정량적 구조 활성 관계 및 분자 도킹 시뮬레이션을 기반으로 단백질 내의 잠재적인 T 세포 에피토프를 예측할 수 있는 소프트웨어 프로그램을 이용될 수 있다(문헌 [Desai and Kulkarni-Kale, 2014. Methods Mol Biol 1184: 333-64]). 이러한 프로그램은 IEDB 분석 리소스, ELISpot(네덜란드, 렐리스타트 시 소재, PepScan), RANKPEP(문헌 [Reche 등, 2004. Immunogenetics 56: 405-19]), nHLAPred(문헌 [Bhasin and Raghava, 2007. J Biosci 32: 31-42]), 및 NetMHC([Lundegaard 등, 2008. Nucleic Acids Res 36: W509-12])를 포함한다.
상기 용어가 본 명세서에서 사용되는 바, 바람직한 T 세포 에피토프, 또는 T 세포 항원은, 세포독성 T 세포 에피토프로도 지칭되는, 8 내지 11개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 9개의 아미노산 잔기를 포함하는 MHC 분류 I 에피토프이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "폴리에피토프"는 다수의 에피토프, 예컨대 T 세포 에피토프, 바람직하게는 MHC 분류 I 에피토프를 갖는 생분자, 바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 상기 개별 에피토프는 바람직하게는 링커 서열에 의해 분리된다. 상기 링커 서열은 유연성을 허용하고, 개별 에피토프로의 폴리에피토프의 가공에서 수반될 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "발현 카세트"는 상기 카세트에 존재하는 하나 이상의 오픈 판독 프레임의 발현을 제공하는 핵산 분자를 나타낸다. 바람직하게는, 발현 카세트는 프로모터 서열, 적어도 하나의 오픈 판독 프레임, 및 바람직하게는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' 미번역 영역을 포함한다. 발현 카세트는 인핸서 서열, 하나 이상의 후-전사 조절 구성요소 및/또는 하나 이상의 인트론 서열을 추가로 포함할 수 있다. 진핵 세포의 발현을 위해, 상기 후-전사 조절 구성요소 및/또는 하나 이상의 인트론 서열은 세포질에서 RNA의 번역을 허용하도록 발현 카세트의 전사 산물, 즉 메신저 RNA의 핵 수송을 향상시킬 수 있다. 상기 발현 카세트는 바람직하게는 돼지의 발현에 최적화된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "펩티드"는 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 단백질 분자를 나타낸다. 펩티드는 개별 펩티드로의 단백질의 가공 전 보다 큰 단백질에서 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "단백질"은 50개 초과의 아미노산 잔기를 포함하는 단백질 분자를 나타낸다.
본원에서 사용된 바, 용어 "노나펩티드"는 9개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 나타낸다.
본원에서 사용된 바, 용어 "스페이서"는 폴리에피토프의 개별 에피토프 사이에 존재하고, MHC에 의한 개별 에피토프의 제시 및 프로테아좀에 의한 에피토프의 가공 및 유연성을 허용하는, 작은 펩티드, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 적합한 스페이서의 아미노산 서열은 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제20130011424호, 및 문헌 [Toes 등, 2001. J Exp Med 194: 1-12]에서 제공된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "만능(universal) T-세포 에피토프"는 다수의 상이한 MHC 분자에 의해 결합되고, 보여지고, 이에 따라 다수의 개체의 면역 시스템을 활성화시키는 것으로 추정되는 펩티드 서열을 나타낸다. 상기 만능 T-세포 에피토프는 바람직하게는 T-헬퍼 세포 에피토프로도 지칭된 MHC 분류 II 에피토프이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "유비퀴틴에 대한 뉴클레오티드 서열"은 유비퀴틴을 코딩하는 뉴클레오티드 분자를 나타낸다. 유비퀴틴은 무척추 동물에서 포유동물로 진화하는 동안 서열이 많이 보존되어 있는 76개의 아미노산 단백질이다. 유비퀴틴은 ATP-의존성 비리소좀(nonlysosomal) 단백질 분해에 수반된다. 상기 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 아미노산 서열 N-MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG를 발현한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "바이러스 입자"는 감쇠되고 자율적으로 전파될 수 없는 감염성 바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자를 나타낸다. 바이러스 입자의 게놈은 바람직하게는 감염된 세포로부터 상기 입자를 쉐딩(shedding)하는데 관련되는 유전자의 결실을 포함한다. 상기 유전자의 결실은 본 발명에 따른 B-세포 에피토프 및/또는 T-세포 에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는, 예를 들어 재조합 DNA 분자를 코딩하는 외래 유전자의 삽입을 위한 공간을 제공한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "돼지"는 우제류의 수이다아에(Suidae)과의 동물을 나타낸다. 용어 돼지는 가축 돼지와 이의 조상, 일반적인 유라시아 멧돼지(Sus scrofa), 팔라완 수염 돼지, 보르네아 수염 돼지, 헤우드(Heude) 돼지 또는 베트남 와티 돼지, 비사얀(Visayan) 와티 돼지, 셀레베스(Celebes) 와티 돼지, 플로레스(Flores) 와티 돼지, 민도로(Mindoro) 와티 돼지, 필리핀 와티 돼지, 자바(Java) 와티 돼지, 바비루사(babirusa) 및 흑멧돼지를 포함한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "유효량"은 아프리카 돼지 열병 바이러스에 의한 돼지의 차후 감염에 대한 효과를 보이는 본 발명에 따른 재조합 분자 및/또는 본 발명에 따른 하나 이상의 바이러스 입자의 양을 의미한다.
4.2 재조합 핵산 분자
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 상기 T-세포 항원은 프로테아좀 절단에 대한 신호를 함유하는 스페이서, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 스페이서에 의해 분리된다.
상기 핵산 분자, 바람직하게는 RNA 또는 DNA는 바람직하게는 당업자에게 공지된 바와 같은 폴리메라아제, 제한 효소, 및 리가아제의 사용을 포함하는 재조합 기술에 의해 생성된다. 대안적으로, 상기 핵산은 인공 유전자 합성에 의해, 예를 들어 부분적으로 또는 완전히 오버래핑되는 올리고뉴클레오티드의 합성에 의해, 또는 당업자에게 공지된 바와 같은 유기 화학 및 재조합 기술의 조합에 의해 제공된다. 상기 핵산은 바람직하게는 백신 접종된 돼지에서 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트의 발현을 향상시키기 위해 코돈-최적화된다. 추가의 최적화는 암호화 스플라이스 부위의 제거, 암호화 폴리A 테일의 제거 및/또는 mRNA의 바람직하지 않은 접힘을 유도하는 서열의 제거를 포함할 수 있다. 스플라이스 부위 옆의 인트론의 존재는 감염된 세포의 핵으로부터의 수송을 촉진할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 핵산 분자는 비변형된 RNA, 변형된 RNA, 및 바람직하게는 자가-복제 RNA를 포함하는 RNA이다. 상기 자가-복제 RNA는 알파바이러스, 플라비바이러스, 랍도바이러스, 홍역 바이러스 및/또는 플라비바이러스로부터 유래된 것과 같은 RNA 분자의 증폭을 위한 바이러스 시스템을 기반으로 할 수 있다. 상기 RNA는 분자, 예컨대 나노입자, 폴리에틸렌이민, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 립펙타민(lipfectamine) 및 SAINT®과 같은 합성 양이온성 지질을 포함하는 양이온성 지질, 및/또는 키토산으로 복합체화되거나 축합될 수 있다.
발현 카세트는 바람직하게는 예를 들어 바이러스 기원(예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스)의 강한 프로모터 또는 세포, 예컨대 돼지 세포에서 고도로 발현되는 유전자로부터 유래된 프로모터와 같은 높은 발현 수준을 위한 수단을 포함한다(문헌 [Running Deer and Allison, 2004. Biotechnol Prog 20: 880―889]; 미국 특허 제5888809호).
추가로 제공된 것은, 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포이다. 상기 숙주 세포는 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자의 미래의 생성을 위해 성장 또는 저장될 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 박테리아 세포, 예를 들어 대장균이다.
핵산은 바람직하게는 돼지에 투여되기 전에 예를 들어 PBS와 같은 완충 용액에서 가용화된다. 투여는 바람직하게는 동물당 총 1 μg 내지 1 mg의 핵산을 포함한다.
폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 상기 재조합 핵산 분자는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 2 내지 50개의 T-세포 항원, 바람직하게는 5 내지 30개의 T-세포 항원, 보다 바람직하게는 약 20개의 T-세포 항원, 예컨대 18개의 T-세포 항원, 19개의 T-세포 항원, 20개의 T-세포 항원 및 21개의 T-세포 항원을 발현한다. 적합한 T-세포 항원은 바람직하게는 이용가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 예측된다. 바람직한 T-세포 항원은 주요 조직 적합유전자 복합체(MHC: major histocompatibility complex) 분류 I 결합 친화성을 갖는다. 적합한 T-세포 항원의 분석에서 포함되는 바람직한 소프트웨어 프로그램은, 배열에서 삽입 및 결실을 허용하는 인공 신경망을 기반으로 하는 NetMHC(문헌 [Andreatta and Nielsen, 2016. Bioinformatics 32: 511-7])로 지칭된다. 상이한 MHC 분자의 길이 프로파일을 인식할 수 있다. 바람직한 것은 자가면역 질환을 야기할 수 있기 때문에 적합한 T-세포 항원으로서 자가-펩티드가 선택되지 않는 것이다.
상기 2 내지 50개의 T-세포 항원은 프로테아좀 분열에 대한 신호를 함유하는 스페이서, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 스페이서에 의해 분리되는, 6 내지 15개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 11개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 9개의 아미노산 잔기의 펩티드이다. 바람직한 T-세포 항원은 아프리카 돼지 열병 바이러스 단백질 MGF_505-7R, NP1450L, G1340L, B385R, G1211R, E423R, NP1450L, MGF_5059R, E301R, C717R, EP424R, F778R, CP530R, R298L, CP2475L, O174L, MGF_360-2L, NP1450L, M1249L, 및/또는 MGF_360-1l로부터 유래된다.
바람직한 T-세포 항원은 표 1에 제시된 펩티드로부터 선택된다.
Figure pct00001
본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 바람직한 재조합 핵산 분자는 바람직하게는 표 1의 펩티드 1 내지 20, 보다 바람직하게는 펩티드 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 보다 바람직하게는 N-종료 말단으로부터 이 순서로, 펩티드 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11, 18을 코딩한다.
상기 스페이서는 바람직하게는 2개의 아미노산 잔기, 3개의 아미노산 잔기, 및 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 약 1 내지 5개의 아미노산 잔기이다. 바람직한 스페이서는 표 2에 제시된 펩티드를 포함한다.
Figure pct00002
본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 바람직한 재조합 핵산 분자는 바람직하게는 만능 T-세포 에피토프를 코딩한다. 상기 만능 T-세포 에피토프는 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 T-세포 에피토프 전에 위치하여 이러한 T-세포 에피토프에 대한 N-말단에 위치한다. 상기 만능 T-세포 에피토프의 예는 문헌 [Khatun 등., 2017. Chemistry 23: 4233-4254]에 제공된다. 바람직한 만능 T-세포 에피토프는 아미노산 서열 aKXVAAWTLKAAaZC를 갖는, PADRE로 지칭된 비천연 pan DR 에피토프에 의해 제공되고, 상기에서 X는 L-시클로헥실알라닌을 나타내고, Z는 아미노카프로산을 나타낸다(문헌 [Alexander 등., 2000. J Immunol 164: 1625-1633]). 발현 목적을 위해, 서열 AKFVAAWTLKAAAARY를 갖는 유도체가 바람직하게는 사용된다.
본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 바람직한 재조합 핵산 분자는 바람직하게는 폴리에피토프의 5'-종료 말단에서 유비퀴틴을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프에 대한 유비퀴틴의 융합은 프로테아좀에 대한 표적화를 향상시켜 폴리에피토프의 가공을 개선하고, T 세포 반응을 향상시킨다.
바람직한 재조합 핵산 분자는 도 1b에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
4.3 바이러스 입자
본 발명은 본 발명에 따른 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는, 재조합 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 입자를 추가로 제공한다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 발현하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 바이러스 입자를 추가로 제공한다. 상기 B-세포 항원은 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R(pEP402R), A104R(pA104R) 및/또는 B602L(pB602L)로부터 선택된다. 당업자는 용어 "단백질 EP402R"이 pEP402R을 나타내고; 용어 "단백질 A104R"이 pA104R을 나타내고; 용어 "B602L"이 pB602L을 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 상기 B-세포 항원은 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L의 실질적 완전 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아미노산 서열의 예는 균주 Badajoz 1971로부터 포스포단백질 p30에 대한 UniProt 접근 번호 P34204(P30_ASFB7); 균주 Badajoz 1971로부터 엔벨로프 단백질 p54에 대한 UniProt 접근 번호 Q65194; 균주 Badajoz 1971로부터 주요 캡시드 단백질 p70에 대한 UniProt 접근 번호 P22776; 균주 Badajoz 1971로부터 CD2 동족체 EP402R에 대한 UniProt 접근 번호 Q89501; 균주 Badajoz 1971로부터 바이러스 히스톤 유사 단백질 A104R에 대한 UniProt 접근 번호 P68742; 균주 Badajoz 1971로부터 단백질 B602L에 대한 UniProt 접근 번호 Q65169에 의해 제공된다.
상기 B-세포 항원은 바람직하게는 예를 들어 p30 및 B602L; p72 및 A104R) 및/또는 p54 및 EP402R에 대한 탠덤 발현 카세트, 또는 예를 들어 p54 및 EP402R 및 K205R) 발현 카세트의 발현에 대한 트리플 발현 카세트를 사용하여 발현된다. B-세포 항원을 코딩하는 DNA 구조체는 당업자에게 공지된 바와 같이 합성으로 생성될 수 있고, 예를 들어 GenScript로부터 수득될 수 있다. B-세포 항원 코딩 영역은 바람직하게는 유전자의 발현을 구동하기 위해 상이한 MVA 프로모터 및 전사-종료 서열로 클로닝된다. 또한, 상기 B-세포 항원은 바람직하게는 단백질 발현의 검출을 허용하기 위해 서열 태그와 제공된다. 적합한 태그는 문헌 [Chatterjee, 2006. Cur Opin Biotech 17, 353―358]에 제시된 바와 같이, 6xHis 태그, c-myc 도메인(EQKLISEEDL), 헤마글루티닌 태그(YPYDVPDYA), 말토오스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스페라아제, 말토오스 결합 단백질, FLAG 태그 단백질, 비오틴 수용체 펩티드, 스트렙타비딘 결합 펩티드 및 칼모듈린 결합 펩티드를 포함한다. FLAG 태그가 바람직한 태그이다. 상기 태그는 바람직하게는 B-세포 항원의 C-말단에 존재한다.
상기 재조합 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자의 전달을 위한 벡터로서 사용될 수 있는 바이러스 입자는, 아데노 연관 바이러스, 렌티바이러스, 예를 들어 몰로니(Moloney) 설치류 백혈병 바이러스, 비장-병소 형성 바이러스, 골수증식성 사르코마 바이러스, 설치류 줄기 세포 바이러스, 또는 SFG 감마 레트로바이러스를 기반으로 하는 것과 같은 레트로바이러스 기반 벡터(문헌 [Riviere et al., 1995. PNAS 92: 6733-6737]), 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 변형된 백시니아 앙카라(문헌 [MVA; Mackowiak 등., 1999. Adv Vet Med 41: 571―583]; [Cottingham 등, 2008. PLoS One 20:e1638]) 또는 카나리 폭스바이러스와 같은 폭스바이러스, 아레나바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스(문헌 [Kortekaas 등, 2010. Vaccine 28: 2271-2276]) 및/또는 리프트 밸리 열병 바이러스와 같은 부냐바이러스(문헌 [Wichgers Schreur 등., 2014. J Virol 88: 10883―10893])를 기반으로 하는 입자를 포함한다.
바람직한 바이러스 입자는 폭스바이러스를 기반으로 한다. 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 문헌 [Cottingham 등., 2008. PLoS One 20:e1638]에 기재된 것과 같은 변형된 백시니아 앙카라(MVA: Modified Vaccinia Ankara) 기반 입자이다. MVA에서 바람직한 발현 카세트는 예를 들어 미국 특허 제20150299267호에 기재된 바와 같이 MVA 13.5 프로모터 서열을 포함한다. 발현 카세트는 바람직하게는 당업자에게 공지된 절차에 따라 박테리아 인공 염색체(BAC: Bacterial Artificial Chromosome) 재조합을 이용하여 MVA(약독화된 천연두) 백신 벡터의 TK-유전자로 삽입된다.
상기 바이러스 입자는 바람직하게는 진핵 세포에서 생성된다. 상기 진핵 세포는 바람직하게는 예를 들어 효모 세포 및 닭 섬유아세포와 같은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 쉽게 감염 및/또는 형질 감염될 수 있는 세포이다. 상기 진핵 세포는 바람직하게는 곤충 세포 또는 포유류 세포이다. 적합한 곤충 세포는 예를 들어 Sf9 및 Sf21과 같은 난소 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포, 드로스필라 슈나이더(Drosophila Schneider) 2 세포 및 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) C6/36 세포를 포함한다. 적합한 포유류 세포는 예를 들어 새끼 햄스터 신장 세포, 인간 배아 신장 세포, 예컨대 HEK293 및 자유형 HEK293FTM 세포(ThermoFisher Scientific), VERO 세포, MDCK 세포, CHO 세포, HeLa 및 PER.C6 세포를 포함한다(문헌 [Fallaux, F. J. 등, 1998. Hum Gene Ther 9: 1909-1917]). 바람직한 세포는 인간 배아 신장 세포, 예컨대 HEK293 및 프리스타일 HEK293FTM 세포이다.
일 실시형태에서, 상기 바이러스 입자는 마커 단백질을 추가로 포함한다. 상기 마커 단백질은 본 발명에 따른 바이러스 입자를 수여받은 돼지의 식별을 허용한다. 상기 마커 단백질은 야생형 ASFV로 감염된 돼지로부터 백신접종된 돼지를 구별하는 것을 허용한다. 상기 마커 단백질은 바람직하게는 형광 단백질, 베타-글루쿠로니다아제, 베타-갈락토시다아제, 가우시아 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제 및/또는 분비된 알칼리 포스포타아제이다. 당업자는 상기 마커 단백질에 대한 코딩 서열이 본 발명에 따른 바이러스 입자의 게놈에 존재하여 마커 단백질이 본 발명의 바이러스 입자를 수여받은 세포에서 발현된다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 세트를 추가로 제공한다.
본 발명은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자, 및 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 하나 이상의 바이러스 입자를 포함하는 바이러스 입자의 세트를 추가로 제공한다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자를 포함하는 파트의 키트를 제공한다.
상기 B-세포 항원은 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된다. 상기 B-세포 항원은 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L의 실질적 완전 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아미노산 서열의 예는 균주 Badajoz 1971로부터 포스포단백질 p30에 대한 UniProt 접근 번호 P34204(P30_ASFB7); 균주 Badajoz 1971로부터 엔벨로프 단백질 p54에 대한 UniProt 접근 번호 Q65194; 균주 Badajoz 1971로부터 주요 캡시드 단백질 p70에 대한 UniProt 접근 번호 P22776; 균주 Badajoz 1971로부터 CD2 동족체 EP402R에 대한 UniProt 접근 번호 Q89501; 균주 Badajoz 1971로부터 바이러스 히스톤 유사 단백질 A104R에 대한 UniProt 접근 번호 P68742; 균주 Badajoz 1971로부터 단백질 B602L에 대한 UniProt 접근 번호 Q65169에 의해 제공된다.
본 발명은 본 발명에 따른 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자, 및 바람직하게는 본 발명에 따른 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 하나 이상의 바이러스 입자를 포함하는 파트의 키트를 추가로 제공한다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 합성 T-세포 항원 및 본 발명에 따른 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자를 포함하는 파트의 키트를 추가로 제공한다.
4.4 돼지에서 면역 반응의 자극 방법
본 발명은 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 본 발명의 바이러스 입자를, 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자, 및/또는 제6항 또는 제7항의 바이러스 입자와, 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자를 함께, 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 본 발명의 바이러스 입자는 조성물, 바람직하게는 약학 조성물에 제공된다.
재조합 핵산 분자 및/또는 바이러스 입자는, 주사, 국소 수동 확산 또는 이온 삼투를 위한 패치, 전기 천공, 열 미세천공, 비강 분무기, 에어로졸 상부 흡입기 및 폐 흡입, 초음파천공법, 화학물질, 및 기계적 마모, 및 동적/탄동 전달을 포함하여 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 돼지에게 투여될 수 있다(문헌 [Weniger 등, 2018. Vaccine 36: 427-437]).
바람직하게는, 재조합 핵산 분자 및/또는 바이러스 입자는 비경구적으로, 예컨대 주사에 의해 투여된다. 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자 및/또는 바이러스 입자는 바람직하게는 종래의, 비독성의 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트 또는 비히클과 제제화된다. 본원에서 사용된 바, 용어 "비경구적"은 피하, 피내 또는 피부층 사이, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 핵산 분자는 보다 바람직하게는 전기천공에 의해, 보다 바람직하게는 근육내/피부층 사이 전기천공에 의해 돼지에게 투여된다. 전기천공은, 예를 들어 50 μl 플라스미드 제제의 망투(Mantoux) 전달에 의해 만들어진 피부 수포 위에 압착되는, 1.5 mm 간격의 0.43 mm 직경의 금-플레이팅된 트로카 니들의 어레이로 이루어진 전극 어레이를 사용하고, 25V의 100 ms 펄스; 포터블 펄스 발생기(일본, 이치카와 시 소재 CUY21 EDIT; Nepa Gene) 및 트위저 전극(아웃풋 전류 300 내지 600 mA로 10 msec의 6회 펄스); 핸들 위에 장착된 니들 프리 마이크로패치 라운드 전극을 갖는 BTX ECM 830 펄스 발생기(Model MP 35)(캘리포니아, 샌디에고 시 소재, Genetronics)를 적용하고, 60 ms의 펄스 지속기간, 200 ms의 펄스 간격, 및 3회 펄스 후 극성도의 전환으로, 각각 60, 70, 또는 80V에서 6 방형파 펄스를 적용함으로써 수행될 수 있다.
추가의 바람직한 방법은 주사 부위당 0.25 mL의 부피로 약 3 cm 떨어진 두 부위의 오른쪽 허벅지에 근육내 투여를 이용한다. 주사 직후, Cliniporator(IGEA)를 사용하는 인 비보 전기천공 절차는 주사 부위에서 선형/육각형 니들 전극으로 적용될 수 있다. 니들 사이의 공간은 바람직하게는 약 2 cm이고, 전기천공기는 바람직하게는 100V로 설정된다. 50 V/cm의 전류를 사용하여 0.6A의 평균 전류를 유지한다. 약 5 내지 50 밀리초, 바람직하게는 약 20 밀리초의 2 내지 20회 펄스, 바람직하게는 5 내지 10회 펄스, 바람직하게는 약 8회 펄스는 50 내지 500 밀리초, 바람직하게는 약 200 밀리초의 간격으로 적용된다.
바람직하게는 상기 투여는 바람직하게는 1 내지 3회 반복되어, 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자는 총 2 내지 4회 투여된다. 반복된 투여는 바람직하게는 약 2주의 간격으로 수행된다.
방어 면역 반응은 세포 및 혈청 면역을 모두 필요로 할 수 있다. 따라서, 돼지에서 면역 반응의 바람직한 자극 방법에서, 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 적어도 한 번의 투여는, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 합성 펩티드, 바람직하게는 2 내지 50개의 펩티드, 보다 바람직하게는 약 10 내지 30개의 펩티드, 예컨대 약 20개의 펩티드, 예컨대 18개의 펩티드, 19개의 펩티드, 20개의 펩티드, 및 21개의 펩티드의 투여와 조합된다.
T-세포 항원을 포함하는 상기 펩티드는 바람직하게는 6 내지 15개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 11개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 9개의 아미노산 잔기의 펩티드이다. 바람직한 펩티드는 표 1에 제시된 펩티드로부터 선택된다.
상기 펩티드는 바람직하게는 비경구적으로, 예컨대 주사에 의해, 보다 바람직하게는 근육내 주사에 의해 투여된다.
돼지에서 면역 반응의 바람직한 자극 방법에서, 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 적어도 한 번의 투여는 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 투여와 함께 조합된다.
돼지에게 투여되는 본 발명의 바이러스 입자의 양은, 일반적으로, 동물당 1,000 내지 1,000,000,000개 범위의 감염성 바이러스 입자이다. 감염성 입자의 양은 예를 들어 투여량 반응 곡선과 같은 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 바이러스 입자, 및 수의학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물, 바람직하게는 수의학적으로 허용가능한 조성물을 추가로 제공한다.
상기 조성물은 바람직하게는 수성 또는 유성 현탁액이다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들어 Tween 80) 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 만니톨, 물, 링거 용액, 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균의, 고정 오일은 일반적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 이용된다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 순한 고정 오일이 이용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 이의 글리세리드 유도체가 적합한 조성물의 제조에서 유용한데, 이는 이것이 특히 이들의 폴리옥시에틸화 버전에서 올리브 오일 또는 카스터 오일과 같은 천연의 약학적으로 허용가능한 오일이기 때문이다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 또는 헬베티카 약전에 기재된 유사 알코올을 함유할 수 있다.
본 발명은 유효 면역화량의 본 발명의 재조합 분자, 및/또는 바이러스 입자, 및 수의학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 포함하는 백신을 추가로 제공한다. 상기 백신은 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자를 추가로 포함한다.
본 발명의 바이러스 입자를 포함하는 조성물은 바람직하게는 시토킨, 예컨대 인터페론-감마, 면역자극 생성 핵산 서열, 예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드, 리포좀, 바이러스 유사 입자, 계면활성제, 예컨대 헥사데실아민, 폴리음이온, 예컨대 피란 및 덱스트란 술페이트를 포함하는 아쥬반트를 추가로 포함한다.
바람직한 아쥬반트는, 국제출원 WO2002026255A1호에 기재된 ISCOM이다. ISCOM 기술은 다른 아쥬반트에 비해 여러 이점을 갖는다. ISCOM은 체액성 및 세포 매개 면역 반응 모두를 자극한다. ISCOM은 매우 효율적인 아쥬반트로, 본 발명에 따라 비활성화된 것 또는 이의 일부의 양을 추가로 감소시킨다. 바람직한 ISCOM은 ISCOM 매트릭스-M이다.
또 다른 바람직한 아쥬반트는 BLP이다. BLP는 불활성화된 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 박테리아로부터 유래된 자가 아쥬반트 백신 전달 비히클이다. L. 락티스는 치즈 및 프로바이오틱 음료의 생산과 같은 식품 산업에서 일반적으로 사용된 안전한 박테리아이다. BLP는 간단한 고온 산 처리에 의해 생성되어, 펩티도글리칸 표면으로 대부분 이루어진 견고한 셀 형태의 매트릭스를 유도한다. 상기 펩티도글리칸은 바람직하게는 국제공개 WO 2010/033031호에 기재된 락토코쿠스 락티스 세포벽 히드롤라아제 AcmA의 C-말단 펩티도글리칸 결합 도메인 LysM을 포함한다. 이러한 표면은 질환을 야기하는 병원균에 대한 보호에 필요한 장기간 면역을 유도한다. BLP 입자의 비생물 성질은 전파의 위험 없이 정확한 투여를 허용한다.
또한 BLP는 선택된 특정 항원, 예를 들어 아프리카 돼지 열병 바이러스의 T-세포 항원 및/또는 B-세포 항원을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 바이러스 입자로 효율적으로 로딩될 수 있는 안전하고 다양한 백본을 제공한다. 항원으로의 BLP의 완전한 로딩은 국제공개 WO2010/033031호에서 기재된 비공유 커플링 기술을 사용하여 달성된다. 이러한 기술은 항원 융합물과 BLP의 간단한 혼합을 허용하여 항원이 입자 표면에 강하고 즉각적으로 결합되도록 한다. 수득한 항원으로 커버된 BLP는 바람직하게는 주사를 필요로 하지 않으면서, 비강(스프레이) 또는 구강(캡슐)의 점막층을 통해 돼지에게 전달된다.
또한, 본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 분자, 및/또는 상기 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자를 적어도 하나의 돼지에 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 아프리카 돼지 열병 바이러스의 감염 및/또는 전파를 예방 또는 완화시키는 방법을 제공한다. 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 상기 투여는 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 투여와 함께 바람직하게는 조합된다.
상기 방법은 야생형, 악성 아프리카 돼지 열병 바이러스에 의한 차후 감염에 대한 보호를 제공한다. 보호는 질환의 생존 및 임상 증상의 부재, 및 수평 및 수직 확산을 포함한 임의의 전파 경로에 의한 야생형 바이러스의 향후 전파의 감소로 정의된다. 보호 개시 시간 및 장기간 보호는 백신 효능의 일부이다. 추가로, 상이한 바이러스 종 또는 혈청형에 대한 광범위한 보호는 또한 본 발명에 따른 백신의 효능의 일부이다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스로 차후 감염되는 돼지를 보호하기 위한 방법에서 사용하기 위한, T-세포 항원을 포함하는, 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 입자, 또는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원 및 T-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 세트를 제공한다.
본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스로 차후 감염되는 돼지를 보호하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원, 및 T-세포 항원을 포함하는, 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 입자를 포함하는 파트의 키트를 추가로 제공한다.
명확성과 간결한 설명을 위해, 특징은 동일하거나 별개의 실시형태의 일부로서 여기에서 설명되지만, 본 발명의 범위는 설명된 특징의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 실시형태를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
5 실시예
실시예 1: ASFV T-세포 에피토프의 발현을 기반으로 한 DNA 백신접종
방법:
공지된 ASF 단리물의 전체 게놈 서열과 돼지의 게놈 서열을 기반으로, 에피토프 예측 프로그램 NetMHCpan을 사용하여 바이러스 균주 또는 돼지 품종과 무관한 T-세포 에피토프 목록을 제공하였다(표 1 참조). 19개의 최상위 T-세포 에피토프를 사용하여 폴리에피토프 합성 DNA 백신을 생성하였다. DNA 서열은, 프로테아좀 절단 및 추가 가공을 위한 신호를 함유하는 3 내지 5개 아미노산의 스페이서에 의해 분리된 19개의 노나펩티드 에피토프를 코딩하였다(도 1a 참조). 에피토프 14는 정확한 가공을 방해할 수 있어 사용하지 않았다. 또한, 소위 PADRE 만능 T-세포 에피토프 서열을 이를 위해 포함시켰다(도 1b 참조). 프로테아좀 분해를 향상시키기 위해, 유비퀴틴에 대한 뉴클레오티드 서열을 합성 유전자의 5'-종료 말단에서 첨가하였다. 이는 프로테아좀에 의한 보다 효율적인 분해를 유도하고, 숙주 T-세포에 대한 에피토프의 개선된 제시를 유도한다. 마지막으로, CpG 아쥬반트 서열을 합성 유전자의 3'UTR에 첨가하였다. 합성 유전자의 코돈 최적화된 버전은 GenScript Corporation에 의해 화학적으로 합성되었고, NheI 및 NotI 제한 부위를 사용하여 플라스미드 pCVI(ClaI-제한 단편을 결실시킴으로써 수득된 pCI-neo [Promega]의 유도체)에서 CMV 프로모터 뒤에 클로닝되었다. 수득한 플라스미드를 pCVI-ASFDVAC2로 칭하였다.
각각 6마리의 돼지의 3개의 군을 백신접종 검사 연구에 사용하였다. 군 1로부터의 동물은 pCVI-ASFDVAC2로 3회 백신접종하였다. 군 2로부터의 동물도 또한 3회 백신접종되었지만, 세 번째 DNA 백신접종과 동시에 이루어졌고, 이들은 또한 합성 유전자의 T-세포 에피토프에 상응하는 합성 노나펩티드의 혼합물을 갖는 부스터를 수여받았다. 대조군(군 3)으로부터의 동물은 빈 플라스미드 pCVI로 3회 백신접종되었다. 돼지를 2주의 간격으로 백신접종하였다. cliniporator 디바이스(이탈리아 카프리 시 소재, IGEA Clinical Biophysics)를 사용하여 면역-전기천공에 의해 근육내/피부층 사이에 백신을 적용하였다. 전기천공 기기에 의해 발생된 전기 펄스는 주변 조직에 의한 DNA 흡수를 개선한다. 근육내 백신접종으로 펩티드를 적용하였다. 최종 백신접종 2주 후, 돼지에게 ASFV 네덜란드 '86 균주(네덜란드, Wageningen Bioveterinary Research, 문헌 [Terpstra and Wensvoort, 1986. Tijdschrift voor diergeneeskunde 111: 389-392] 참조)를 접종하였다. 균주를 돼지 폐포 대식세포에서 성장시켰다. 감염된 돼지를 임상 증상에 대해 2주 넘게 추적하였다. 혈중 바이러스 수준을 PCR로 결정하였다. 전체 바이러스를 항원으로 사용하여 ELISA에 의해 항체 반응을 조사하였다. IFN-y 분비 세포의 수준을 바이러스 또는 20개의 노나펩티드의 칵테일로 인 비트로 자극 후 ELISPOT에 의해 결정하였다.
결과:
백신접종되지 않은 대조군(군 3)의 접종 감염은 40% 생존률을 초래하였다. 군 1 및 2에서 백신접종은 약 83% 생존률을 초래하였다(도 2a 참조). 군 2에서의 돼지는 다른 군에서의 돼지에 비해 유의하게 낮은 총 임상 점수를 가졌다(도 2b). 상기 군에서의 돼지는 또한 첫 백신 접종 42일 후(p.v.)(접종 0일차[p.c.])에서 실험 종료까지 노나펩티드의 칵테일에 대해 유의한 IFN-y 분비 세포 반응을 가졌다(도 2c 참조). 군 2에서의 돼지는 49일 p.v.(7일 p.c.)에서 노나펩티드의 칵테일에 대해 유의한 IFN-y 분비 세포 반응을 가졌다. 대조군에서는 노나펩티드의 칵테일에 대한 IFN-y 분비 세포 반응이 관찰되지 않았다. 모든 군은 56일 p.v.(14일 p.c.)에 바이러스에 대한 유의한 IFN-y 분비 세포 반응을 보였다. 군들 사이에 혈중 바이러스 DNA 수준의 유의한 차이는 없었다. ASF 항체 ELISA의 차단 백분율 수준에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 2: ASFV T- 및 B-세포 에피토프를 발현하는 MVA 벡터를 사용한 백신 접종
방법:
폴리에피토프 DNA 백신의 유망한 결과를 기반으로, 합성 ASFDVAC2 유전자에 MVA 13.5 프로모터 서열을 제공하고, 공개된 절차(문헌 [Cottingham, 2012. Methods Mol Biol 890: 37-57])에 따라 BAC-재조합을 통해 MVA(약독화된 천연두) 백신 벡터의 TK 유전자로 삽입하였다. 수득한 바이러스를 MVA-VAC2로 칭하였다. MVA-VAC2의 삽입은, 5' 말단으로부터, TK의 왼쪽면, MVA 13.5L 프로모터, 코작 서열, 합성 ASFDVAC2 유전자, mH5로부터의 종료 서열, 및 TK의 오른쪽면을 포함한다.
또한, BAC 재조합을 사용하여 6개의 익히 공지된 주요 ASFV B-세포 항원(p30, p54, p72, EP402R, A104R 및 B602L)을 코딩하는 유전자를, 탠덤(p30 + B602L; p72 + A104R) 또는 트리플(p54 + EP402R + K205R) 유전자 발현 카세트(MVA-p30/B602L, MVA-p72/A104R 및 MVA-p54/EP402R/K205R) 각각을 사용하여 MVA 벡터로 삽입하였다. 이를 위해, 합성 DNA 구조체를 생성하였고(GenScript), 단백질 코딩 영역에 이러한 유전자의 발현을 구동하기 위해 상이한 MVA 프로모터 및 전사-종료 서열을 제공하였다. 추가로, 단백질 발현의 검출을 허용하기 위해, 각각의 단백질 코딩 영역에 C-종료 FLAG-태그 서열을 제공하였다.
각각 10마리의 돼지의 3개의 군을 백신 접종 검사 실험에 사용하였다. 군 1로부터의 동물은 10^8 TCID50 MVA-VAC2를 사용하여 근육내로 2회 백신 접종되었다. 군 2로부터의 동물은 T-세포 에피토프 및 B-세포 에피토프(각각 10^8 TCID50)를 발현하는 모든 4개의 MVA-재조합물의 조합으로 2회 백신 접종되었다. 군 3으로부터의 백신 접종되지 않은 동물을 대조군으로 간주하였다. 두 번째 백신 접종 2주 후, 동물에게 ASFV 네덜란드 '86 균주를 접종하였다.
결과:
백신 접종되지 않은 동물(군 3)의 접종 감염은 0% 생존률을 초래하였다(도 3a 참조). 모든 4개의 MVA 재조합물의 조합으로 백신 접종된(군 2) 10마리 돼지 중 9마리가 생존했으며, 단지 수 일 동안 경미한 이환율을 보였다. 단지 MVA-VAC2로만 백신 접종된 군 1 동물에서, 4마리의 돼지가 생존하였다. 상기 군으로부터의 동물은, 군 2로부터의 동물과 비교하는 경우, 더 긴 시간에 걸쳐 높은 이환율을 보였다(도 3b 참조). 이러한 결과는 전체 ASFV 항원 또는 T-세포 노나펩티드 에피토프의 칵테일에 대한 IFN-y 분비 세포 반응으로 측정된 세포-매개 면역(CMI: cell-mediated immunity)과 잘 일치하였다(도 3c).
결론:
본 연구에서, B-세포 에피토프뿐만 아니라 ASFV T-세포를 발현하는 MVA 벡터 바이러스로 이루어진 조합-백신을 사용하여 ASFV 백신의 개발에 대한 유망한 결과가 획득되었다. 조합-백신은 사망 및 접종 후 임상 질환에 대한 보호를 제공하였다.

Claims (16)

  1. 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 T-세포 항원을 포함하는 폴리에피토프를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산 분자, 바람직하게는 재조합 DNA 분자로서, 상기 T-세포 항원은 프로테아좀 절단에 대한 신호를 함유하는 스페이서, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 스페이서에 의해 분리되는 재조합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코딩된 폴리에피토프는 T-세포 항원으로서 2 내지 50개의 펩티드를 포함하는 재조합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 코딩된 폴리에피토프는 T-세포 항원으로서 2 내지 50개의 노나펩티드, 바람직하게는 표 1에 도시된 바와 같은 노나펩티드 1 내지 13 및 15 내지 20을 포함하고, 이는 약 1 내지 5개의 아미노산 잔기의 스페이서, 바람직하게는 표 2에 도시된 바와 같은 스페이서 서열 1 내지 11에 의해 분리되는 재조합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 만능(universal) T-세포 에피토프를 추가로 코딩하는 재조합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 폴리에피토프의 5'-말단 종료점에서 유비퀴틴에 대한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 재조합 분자는 바람직하게는 도 1b에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자.
  7. 제6항에 있어서, 마커 단백질을 추가로 포함하는 바이러스 입자.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자, 및/또는 제6항 또는 제7항의 바이러스 입자와, 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자를 함께, 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자는 비경구적으로 투여되는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자는 바람직하게는 약 2주의 간격으로 2 내지 4회 투여되고, 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 적어도 한 번의 투여는 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 투여와 함께 조합되는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 적어도 한 번의 투여는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질로부터의 합성 T-세포 항원의 투여와 조합되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자, 및/또는 제6항 또는 제7항의 바이러스 입자를 적어도 하나의 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 아프리카 돼지 열병 바이러스의 감염 및/또는 전파를 예방 또는 완화시키는 방법으로서, 상기 재조합 분자 및/또는 바이러스 입자의 투여는 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 바이러스 입자의 투여와 조합되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자, 및 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 하나 이상의 바이러스 입자를 포함하는 바이러스 입자의 세트.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 분자를 포함하는 바이러스 입자, 및 바람직하게는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 단백질 p30, p54, p72, EP402R, A104R 및/또는 B602L로부터 선택된, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 B-세포 항원을 포함하는 하나 이상의 바이러스 입자를 포함하는 파트의 키트.
  15. 제13항에 있어서, 아프리카 돼지 열병 바이러스로 차후 감염되는 것으로부터 돼지를 보호하는 방법에서 사용하기 위한 바이러스 입자의 세트.
  16. 제14항에 있어서, 아프리카 돼지 열병 바이러스로 차후 감염되는 것으로부터 돼지를 보호하는 방법에서 사용하기 위한 파트의 키트.
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