CN111363016A - 一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用。本发明所述免疫抗原为偶联金纳米颗粒的非洲猪瘟结构蛋白复合物，所述非洲猪瘟结构蛋白复合物为非洲猪瘟P72蛋白和B602L蛋白。本发明通过毕赤酵母表达系统成功表达非洲猪瘟病毒正确折叠P72三聚体和B602L复合物，同时联合金纳米颗粒的特性，获得了具有较高免疫效果的非洲猪瘟免疫抗原。此外，毕赤酵母表达系统易于发酵放大，且表达蛋白成本低，易于工业化应用；金纳米颗粒偶联结构蛋白复合物方法简单，方便，易于规模化放大。本发明免疫抗原偶联物动物实验免疫效果显著增强，能够解决亚单位疫苗的缺陷，在疫苗应用价值潜力巨大。

Description

一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性及高度致死性传染病，死亡率接近100％，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病，在我国被列为一类动物疫病。目前针对非洲猪瘟，尚没有有效的预防疫苗和特效药物，疫情爆发后进行隔离扑杀是主要的防控手段。2018年8月在我国首次爆发非洲猪瘟，导致上千万头猪被扑杀，给我国养猪业造成巨大经济损失。根据以往经验，要想根除非洲猪瘟，需要花费漫长的时间和巨大的人力物力，因此，针对非洲猪瘟疫情，目前急需有效的预防疫苗和治疗药物。
非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种有囊膜的双链DNA病毒。在电镜下呈正六边形，正20面体结构，直径约200nm，由5层同心圆结构组成，由内到外依次为类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。非洲猪瘟病毒可编码200多种蛋白质，其中P72蛋白是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白，也是组成病毒20面体衣壳的主要成分，P72蛋白占病毒颗粒总重33％左右；P72蛋白具有保守的抗原性和稳定的免疫原性，常用于血清学诊断和免疫制剂开发。
由于非洲猪瘟病毒非常大，包含的蛋白非常多，无法形成病毒样颗粒，因此非洲猪瘟疫苗研究的方向集中在基因缺失减毒活疫苗和亚单位疫苗两个方向。目前研究表明，正确折叠的非洲猪瘟全长P72蛋白只能在HEK293F细胞中表达，且表达成本太高，不适于作为动物疫苗使用。此外，现有技术主要通过重组表达获得蛋白，然后与佐剂混合作为亚单位疫苗。但亚单位疫苗与传统疫苗相比存在免疫水平较低，容易降解，免疫持续期不理想等，因此需要寻求一种方法提高亚单位疫苗的免疫优势，促进其应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法，使得所述免疫抗原能够显著提高免疫效果；
本发明的另外一个目的在于提供上述免疫抗原在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种非洲猪瘟免疫抗原，其为偶联金纳米颗粒的非洲猪瘟结构蛋白复合物，所述非洲猪瘟结构蛋白复合物为非洲猪瘟P72蛋白和B602L蛋白。
作为优选，所述非洲猪瘟P72蛋白和B602L蛋白的质量比为5:1-10:1。
金纳米颗粒具有较好的生物相容性和独特的理化性质，本发明发现将金纳米颗粒与非洲猪瘟结构蛋白复合物偶联，可增强免疫抗原的稳定性及在血液中的半衰期，延长其免疫效果的持续性。金纳米颗粒大小与微生物大小相当，将金纳米颗粒与非洲猪瘟免疫抗原偶联后，能更好的被抗原提呈细胞吞噬，诱导其有效的特异性免疫应答，增强其免疫响应。
此外，通过P72和B602L在蛋白表达系统中共表达可得到正确折叠的P72三聚体，协同两个蛋白及金纳米颗粒的作用，达到了提高免疫效果的目的。
作为优选，所述非洲猪瘟结构蛋白复合物通过蛋白表达系统共表达获得；在本发明具体实施方式中，所述蛋白表达系统选用毕赤酵母表达系统，所述毕赤酵母为SMD1168毕赤酵母。
作为优选，所述金纳米颗粒为超均匀球形金纳米颗粒，直径为1-100nm；在本发明具体实施方式中，本发明选用直径为40nm的超均匀球形金纳米颗粒。
本发明通过实验验证，证实了通过毕赤酵母共表达P72和B602L蛋白，得到了正确折叠的P72三聚体和B602L的复合物，将此复合物与金纳米颗粒偶联后免疫动物，可以显著增强其免疫响应。基于此，本发明提供了所述免疫抗原在制备非洲猪瘟疫苗中的应用，所述疫苗优选为亚单位疫苗。
依据上述应用，本发明提供了一种非洲猪瘟疫苗，包括本发明所述免疫抗原和疫苗佐剂；所述疫苗佐剂可选用常规的物质，例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。
此外，本发明还提供了所述免疫抗原的制备方法，将合成的非洲猪瘟病毒的p72基因序列以及B602L基因序列，分别与载体连接构建重组表达质粒，然后将两个表达质粒转化到毕赤酵母中共表达，获得非洲猪瘟结构蛋白复合物；将制备好的金纳米颗粒与非洲猪瘟结构蛋白复合物偶联，获得所述免疫抗原。
其中，所述p72基因序列以及B602L基因序列通过生物信息学方法分析，使用化学合成的方法合成并连接至pUC57载体上保存。
作为优选，所述载体选自pPICH载体和pPICZ载体；在本发明具体实施方式中，p72基因序列采用pPICZ载体构建重组表达质粒，B602L基因序列采用pPICH载体构建重组表达质粒。
作为优选，所述毕赤酵母为SMD1168毕赤酵母，所述金纳米颗粒为超均匀球形金纳米颗粒，直径为1-100nm；在本发明具体实施方式中，本发明选用直径为40nm的超均匀球形金纳米颗粒。
作为优选，所述金纳米颗粒与非洲猪瘟结构蛋白复合物的摩尔比为1:1-10；在本发明具体实施方式中，金纳米颗粒与非洲猪瘟结构蛋白复合物的摩尔比为1:5。
进一步地，本发明提供了较为具体的制备过程：
(1)P72和B602L复合物的表达和纯化
将合成的非洲猪瘟病毒的p72(strep-tag)基因序列与pPICZ载体连接构建pPICZ-p72重组表达质粒。然后将质粒pPICZ-p72转化到SMD1168中，通过提高Zeocin抗生素浓度，筛选出高拷贝的转化子SMD1168(pPICZ-p72)。
将合成的非洲猪瘟病毒的B602L(myc-tag)基因序列与pPICH载体连接构建pPICH-B602L重组表达质粒。然后将质粒pPICH-B602L转化到SMD1168(pPICZ-p72)中，通过提高Hygromycin B抗生素浓度，筛选出高拷贝的转化子SMD1168(pPICZ-p72/pPICH-B602L)。
上述对于p72和B602L转化的先后顺序不做限定，也可先转化pPICH-B602L，获得SMD1168(pPICH-B602L)，然后再转化pPICZ-p72，获得SMD1168(pPICZ-p72/pPICH-B602L)。
挑选阳性单克隆毕赤酵母菌落接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养。取过夜培养的菌液于MGY液体培养基中100倍扩大培养，30℃培养60h至OD600达3.0，得到所需结构蛋白复合物。通过IBA的Strep-Tactin XT gravity-flow柱和GE Superdex S-200分子筛对重组蛋白进行纯化，每升培养基可得到约50mg蛋白。
(2)金纳米颗粒与非洲猪瘟免疫抗原的偶联
将金纳米颗粒与非洲猪瘟免疫抗原按比例快速混匀，在4℃条件下反应12h，然后将混合物进行离心，弃上清，沉淀用0.01M PBS重悬即为所得偶联好的免疫抗原。
由以上技术方案可知，本发明通过毕赤酵母表达系统成功表达非洲猪瘟病毒正确折叠P72三聚体和B602L复合物，同时联合金纳米颗粒的特性，获得了具有较高免疫效果的非洲猪瘟免疫抗原。此外，毕赤酵母表达系统易于发酵放大，且表达蛋白成本低，易于工业化应用；金纳米颗粒偶联结构蛋白复合物方法简单，方便，易于规模化放大。本发明免疫抗原偶联物动物实验免疫效果显著增强，能够解决亚单位疫苗的缺陷，在疫苗应用价值潜力巨大。
附图说明
图1所示为P72和B602L纯化superdex S-200图；
图2所示为P72和B602L纯化SDS-PAGE胶图；
图3所示为金纳米颗粒偶联的非洲猪瘟免疫抗原的透射电子显微镜(TEM)图；
图4所示为小鼠血清抗体效价的ELISA检测结果；其中，1-4依次代表A-D组结果。
具体实施方式
本发明公开了一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述免疫抗原及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述免疫抗原及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下就本发明所提供的一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：非洲猪瘟结构蛋白复合物在大肠杆菌中的制备
1.非洲猪瘟病毒结构蛋白重组表达质粒pET Duet-p72的构建
本发明通过生物信息学方法分析，使用化学合成的方法合成非洲猪瘟病毒的p72(strep-tag)基因序列。将pET Duet1载体和p72 PCR产物用NcoI和NotI双酶切，酶切体系为50uL：NcoI和NotI各1uL，载体片段20uL，10X酶切buffer 5uL，ddH2O 23uL，酶切产物经过1％的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与p72基因片段进行连接，构建10μL的连接体系：p72基因片段5.5μL，pET Duet载体2.5μL，T4DNA连接酶0.5μL，T4DNA连接缓冲液1μL。轻敲管壁混匀，室温连接1h，连接产物常规的化学法转化DH5α感受态细胞，用PCR方法对阳性克隆进行鉴定。将PCR鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pET Duet-p72。
2.非洲猪瘟病毒蛋白重组表达质粒pET Duet-p72-B602L的构建
本发明通过生物信息学方法分析，使用化学合成的方法合成非洲猪瘟病毒B602L(myc-tag)基因序列。将pET Duet-p72载体和B602L PCR产物用NdeI和XhoI双酶切，酶切体系为50uL：NdeI和XhoI各1uL，载体片段20uL，10X酶切buffer 5uL，ddH2O 23uL，酶切产物经过1％的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与B602L基因片段进行连接，构建10μL的连接体系：B602L基因片段5.5μL，pET Duet-p72载体2.5μL，T4 DNA连接酶0.5μL，T4 DNA连接缓冲液1μL。轻敲管壁混匀，室温连接1h，连接产物常规的化学法转化DH5α感受态细胞，用PCR方法对阳性克隆进行鉴定。将PCR鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pET Duet-p72-B602L。
3.重组蛋白共表达
将重组质粒pET Duet-p72-B602L转化至BL21(DE3)表达菌株中，涂板过夜倒置培养至单克隆长出，挑选阳性单克隆菌落接种于LB液体培养基中，37℃ 210rpm过夜培养。取过夜培养的菌液于LB液体培养基中37℃ 210rpm50倍扩大培养至OD600达0.6，加入终浓度为0.5mM IPTG 18℃ 200rpm过夜培养20h，即得到所需结构蛋白复合物。
4.重组蛋白纯化
取1L大肠杆菌培养物，6000rpm，离心10min，收集沉淀。沉淀用50ml bufferW(IBA)重悬，然后用高压匀浆机破碎酵母细胞，17000rpm 4℃离心90分钟，取上清用0.45μm滤器过滤，进行纯化。应用Strep-Tactin XT gravity-flow柱(IBA)进行融合蛋白亲和纯化，主要操作步骤如下：
a.用10ml bufferW(IBA)平衡层析柱，取过滤后上清加到层析柱中。然后通过重力流缓慢流出，重复操作两次。
b.用20mL buffer W(IBA)洗涤，洗除杂蛋白。
c.用洗脱buffer BXT(IBA)洗脱所需目的蛋白，收集洗脱液，1管/ml。
d.将收集的样品进行SDS-PAGE分析。
结果没有纯化出所需蛋白，说明大肠杆菌表达系统不适合非洲猪瘟结构蛋白复合物的表达。
实施例2：非洲猪瘟结构蛋白复合物在毕赤酵母中的制备
1、非洲猪瘟病毒结构蛋白重组表达质粒pPICZ-p72的构建
本发明通过生物信息学方法分析，使用化学合成的方法合成非洲猪瘟病毒的p72(strep-tag)基因序列。将pPICZ载体和pUC57-p72用EcoRI和NotI双酶切，酶切体系为50uL：EcoRI和NotI各1uL，载体片段20uL，10X酶切buffer 5uL，ddH2O 23uL，酶切产物经过1％的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与p72基因片段进行连接，构建10μL的连接体系：p72基因片段5.5μL，pPICZ载体2.5μL，T4DNA连接酶0.5μL，T4 DNA连接缓冲液1μL。轻敲管壁混匀，室温连接1h，连接产物常规的化学法转化DH5α感受态细胞，用PCR方法对阳性克隆进行鉴定。将PCR鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pPICZ-p72。
2、非洲猪瘟病毒蛋白重组表达质粒pPICH-B602L的构建
本发明通过生物信息学方法分析，使用化学合成的方法合成非洲猪瘟病毒B602L(myc-tag)基因序列。将pPICH载体和pUC57-B602L用EcoRI和NotI双酶切，酶切体系为50uL：EcoRI和NotI各1uL，载体片段20uL，10X酶切buffer 5uL，ddH2O 23uL，酶切产物经过1％的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与B602L基因片段进行连接，构建10μL的连接体系：B602L基因片段5.5μL，pPICH载体2.5μL，T4DNA连接酶0.5μL，T4 DNA连接缓冲液1μL。轻敲管壁混匀，室温连接1h，连接产物常规的化学法转化DH5α感受态细胞，用PCR方法对阳性克隆进行鉴定。将PCR鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pPICH-B602L。
3、高表达菌株的筛选
用化学法将提取筛选到的阳性克隆质粒pPICZ-p72转化到SMD1168中。用菌落PCR方法验证p72基因插入。通过提高Zeocin抗生素浓度，筛选出高拷贝的转化子。用化学法将提取筛选到的阳性克隆质粒pPICH-B602L转化到SMD1168(pPICZ-p72)中。用菌落PCR方法验证B602L基因插入，通过提高Hygromycin B抗生素浓度，筛选出高拷贝的转化子SMD1168(pPICZ-p72/pPICH-B602L)。
4、重组蛋白共表达
挑选阳性单克隆毕赤酵母菌落接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养。取过夜培养的菌液于MGY液体培养基中100倍扩大培养，30℃培养60h至OD600达3.0，即得到所需结构蛋白复合物。
5、重组蛋白纯化
取1L毕赤酵母培养物，6000rpm，离心10min，收集沉淀。沉淀用50ml bufferW(IBA)重悬，然后用高压匀浆机破碎酵母细胞，17000rpm 4℃离心90分钟，取上清用0.45μm滤器过滤，进行纯化。应用Strep-Tactin XT gravity-flow柱(IBA)进行融合蛋白亲和纯化，主要操作步骤如下：
a.用10ml bufferW(IBA)平衡层析柱，取过滤后上清加到层析柱中。然后通过重力流缓慢流出，重复操作两次。
b.用20mL buffer W(IBA)洗涤，洗除杂蛋白。
c.用洗脱buffer BXT(IBA)洗脱所需目的蛋白，收集洗脱液，1管/ml。
d.将收集的样品进行SDS-PAGE分析。
e.将目的蛋白收集用Merck-Millipore 30KD浓缩管浓缩蛋白。
f.在4℃条件下用FPLC平衡分子筛(Superdex S-200，GE)，buffer为20mM Tris150mM NaCl pH 8.0，流速为1ml/min。将蛋白分批上样至上样环，用分子筛进一步纯化P72蛋白，结果如图1所示，表明P72是三聚体形式。
g.收集的样品进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，纯化后胶图中出现两条带，分别为73kD的P72蛋白和68KD的B602L蛋白。将目的蛋白用Merck-Millipore 30KD浓缩管浓缩，然后通过BCA方法测蛋白浓度，浓度为5mg/ml，共10ml。
实施例3：金纳米颗粒与结构蛋白复合物偶联
1.金纳米颗粒准备
实验室制备40nm金纳米颗粒，用NaOH调节金纳米颗粒溶液pH至8.0，备用。
2.金纳米颗粒与非洲猪瘟免疫抗原偶联
将调节好pH值的金纳米颗粒放置磁力搅拌器上快速搅拌，以摩尔比1:5加入非洲猪瘟病毒免疫抗原(P72+B602L复合物)，快速混匀然后在磁力搅拌器上调慢速度4℃缓慢过夜反应，然后加入终浓度0.1％PEG20000并在磁力搅拌器上混匀60min，将金标液于4℃12000r/min离心10min，小心弃去上清液，沉淀物用0.01M PBS缓冲液洗涤2次，再离心所得沉淀即为纯化的金偶联复合物，制备的金纳米颗粒与非洲猪瘟病毒免疫抗原偶联复合物用0.01M PBS重悬，4℃保存备用。
3.金纳米颗粒偶联的非洲猪瘟病毒免疫抗原表征
取适量上述复合物用透射电子显微镜(TEM)分析。结果如图3，通过TEM分析可得，偶联复合物呈现较好的分散性和均一性。
实施例4：本发明免疫抗原免疫效果和安全性评价
1、安全性评价
6-8周雌性Balb/c小鼠10只，分为A/B两组，每组5只。A组每只小鼠皮下注射0.5ml金纳米颗粒偶联的非洲猪瘟病毒免疫抗原，B组每只小鼠注射0.5ml 0.01M PBS。连续观察15天，两组小鼠状态均无明显差异，证实金纳米颗粒偶联的非洲猪瘟病毒免疫抗原对小鼠是安全无害的。
2、免疫效果评价
6-8周雌性Balb/c小鼠15只，随机分成A/B/C三组，每组5只。
A组每只小鼠注射0.01M PBS，两周后再注射一次；
B组每只小鼠背部皮下多点注射20ug弗氏佐剂乳化的大肠杆菌表达的非洲猪瘟结构蛋白P72组(因实施例1方法无法获得非洲猪瘟结构蛋白复合物，故这里对P72进行截短，选择第139-289位表达优势抗原表位的一段肽段重组表达获得目标蛋白)，2周后每只小鼠背部皮下多点注射20ug不完全弗氏佐剂乳化的大肠杆菌表达的非洲猪瘟结构蛋白P72；
C组每只小鼠背部皮下多点注射20ug弗氏佐剂乳化的非洲猪瘟结构蛋白复合物(同D组，区别是没有偶联金纳米颗粒)，2周后每只小鼠背部皮下多点注射20ug不完全弗氏佐剂乳化的非洲猪瘟结构蛋白复合物(同D组)；
D组每只小鼠背部皮下多点注射20ug弗氏佐剂乳化的本发明的非洲猪瘟病毒免疫抗原，2周后每只小鼠背部皮下多点注射20ug不完全弗氏佐剂乳化的本发明的非洲猪瘟病毒免疫抗原加强免疫一次；
加强免疫2周后，取血清稀释1000倍后，用非洲猪瘟结构蛋白P72包板做ELISA检测小鼠血清抗体效价，结果如图4所示，各组结果中以本发明免疫抗原D组的效果最佳，证明本发明免疫抗原免疫效果显著增强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟免疫抗原，其特征在于，其为偶联金纳米颗粒的非洲猪瘟结构蛋白复合物，所述非洲猪瘟结构蛋白复合物为非洲猪瘟P72蛋白和B602L蛋白。
2.根据权利要求1所述免疫抗原，其特征在于，所述非洲猪瘟结构蛋白复合物通过蛋白表达系统共表达获得。
3.根据权利要求2所述免疫抗原，其特征在于，所述蛋白表达系统为毕赤酵母表达系统。
4.根据权利要求1所述免疫抗原，其特征在于，所述金纳米颗粒为超均匀球形金纳米颗粒。
5.权利要求1-4任意一项所述免疫抗原在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。
6.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述免疫抗原和疫苗佐剂。
7.权利要求1所述免疫抗原的制备方法，其特征在于，将合成的非洲猪瘟病毒的p72基因序列以及B602L基因序列，分别与载体连接构建重组表达质粒，然后将两个表达质粒转化到毕赤酵母中共表达，获得非洲猪瘟结构蛋白复合物；将制备好的金纳米颗粒与非洲猪瘟结构蛋白复合物偶联，获得所述免疫抗原。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述载体选自pPICH载体和pPICZ载体。
9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母为SMD1168毕赤酵母。
10.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述金纳米颗粒与非洲猪瘟结构蛋白复合物的摩尔比为1∶1-10。
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