CN108265070B - 一种特异性的检测弓形虫的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性的检测弓形虫的方法。所述方法包括以下步骤：1、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列；2、连接转化目的基因和载体；3、重组质粒的表达纯化；4、表达重组蛋白；5、Western blot检测重组蛋白的免疫原性；6、ELISA法分析重组蛋白的免疫原性。所述方法灵敏度高，操作简单且无二次污染。

Description

一种特异性的检测弓形虫的方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫检测方法，具体涉及一种特异性的检测弓形虫的方法。
背景技术：
弓形虫属真球虫目，弓形虫科，是一种分布广泛的专性细胞内寄生虫，最早发现于1908年。该病呈世界性分布，广泛存在于温血动物中，其中猫科动物为其终宿主和重要的传染源。弓形虫感染人体后可使患者出现急性弓形虫脑炎而死亡。感染家畜后主要表现出流产、产死胎和弱畜，给人类和养殖业造成严重威胁。弓形虫速殖子是机体免疫系统识别的主要部位，其表膜蛋白抗原(SAG)由SAG基因家族编码。SAG1位于弓形虫速殖子表面，可以诱导宿主的免疫应答；SAG2是速殖子表膜的另一主要抗原，可介导弓形虫速殖子的入侵，这两种抗原均具有较强的免疫原性。目前，对血清特异性抗体进行检测时常用的是虫源性粗抗原，因其成分复杂，导致特异性较差，并容易产生交叉感染，最终影响检测效果。
目前国内外学者多用从感染动物中收集或经组织、细胞培养的弓形虫速殖体作为抗原，该方法虽然操作方便，特异性较好，但抗原纯度较低，成分复杂，容易出现交叉反应。而在原核表达系统中表达出的特异性目的蛋白，因蛋白产量高、操作简单、费用低廉等优势，成为众多学者研究的对象。因此，建立一种重组抗原作为诊断抗原检测弓形虫病的方法势在必行。
SAG1和SAG2抗原都是弓形虫速殖子期特异性表膜抗原，以糖磷脂酰化形式锚定在细胞膜上，以阻止吞噬细胞对侵袭的弓形虫进行吞噬消化。SAG1主要与弓形虫毒力相关，并己证实该基因编码的重组抗原可作为诊断抗原，用于弓形虫速殖子感染的免疫学检测；SAG2与弓形虫入侵宿主细胞有密切的关系，SAG2抗原可以使弓形虫固定于有核细胞的表面，并辅助弓形虫进入有核细胞，介导弓形虫速殖子的入侵过程。有研究表明，弓形虫感染后的血清抗体能够识别SAG1和SAG2表面抗原，抗SAG2蛋白抗体也可以阻断弓形虫的再定位，还有可能在弓形虫速殖子向缓殖子转化的过程中起作用，因此重组蛋白的表达对于蛋白疫苗的制备意义重大。
发明内容：
本发明的目的在于，提供一种特异性的检测弓形虫的方法。本发明方法对弓形虫抗原基因进行生物学分析，设计并合成弓形虫膜表面抗原SAG1和SAG2重构基因，将目的基因与PET-28a(+)表达质粒连接，并成功转化至大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)中表达，得到带有His标签的融合蛋白，通过His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，获得高浓度、高纯度的目的蛋白，之后用1×PBS溶液对纯化后的蛋白进行透析。Western blot检测结果显示，表达后融合蛋白可以与小鼠弓形虫阳性血清发生特异性结合；ELISA检测结果显示，不同稀释倍数的融合蛋白与不同浓度的小鼠阳性血清均可发生反应，并能很好的区分阴性阳性血清，说明该融合蛋白具有较好的免疫原性，为弓形虫诊断方法的建立及相应核酸疫苗的研发奠定基础。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
一种特异性的检测弓形虫的方法，包括以下步骤：
1、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列
重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2、连接转化目的基因和载体
将目的基因与PET-28a(+)载体连接后，转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取完整单个菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。之后进行菌液PCR，双酶切、测序鉴定。
3、重组质粒的表达纯化
菌液振荡培养至OD值为0.6～0.8时，加入IPTG诱导，于诱导前和诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h分别收集菌液，离心，加入1×PBS，进行SDS-PAGE电泳，确定最佳的表达时相。
4、表达重组蛋白
将诱导后的菌液离心，收集沉淀，用1×PBS重悬，反复冻融3次后，冰浴超声破碎后离心，收集上清，沉淀用尿素重悬，之后进行SDS-PAGE电泳，对蛋白可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化，收集各段洗脱液样品。
5、Western blot检测重组蛋白的免疫原性
将纯化后的带有His标签的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转移至NC膜上，用脱脂奶粉封闭2h，PBST洗涤，加入1：100稀释的小鼠弓形虫阳性血清，4℃孵育过夜，同样方法洗涤，加入1：2000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，室温孵育1h，洗涤后，HRP-DAB底物显色液显色。
6、ELISA法分析重组蛋白的免疫原性
将纯化后的rSAG蛋白稀释至10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，PBST洗涤，5min/3次，之后用5％脱脂奶粉封闭2h，洗涤后，将阳性血清及阴性血清按浓度比为1:50、1:100、1:200、1:400和1:800进行倍比稀释，100μL/孔，每个稀释度做两个重复，37℃孵育1.5h，之后洗涤。加入1：2500稀释的羊抗鼠HRP-IgG，75μL/孔，37℃孵育1h。洗涤后加入TMB进行显色10min，之后每孔加入30μL 2M硫酸终止反应，测A450值。
本发明的优点在于：1、本发明成功地构建了原核表达质粒pET28a(+)-rSAG，并表达纯化出具有活性的融合蛋白。Western blot结果显示纯化后的融合蛋白能够与被感染弓形虫的小鼠血清结合，表现出较好的免疫活性；ELISA法检测结果显示，不同浓度的融合蛋白与不同稀释度的阳性血清均可发生反应，但不与阴性血清发生反应。反应结果随浓度的降低而减弱，其中融合蛋白浓度为10μg/mL，血清稀释度为1:100为反应的最佳稀释度。该方法的建立进一步证明纯化后的融合蛋白可以作为抗原对相应血清抗体进行检测，为弓形虫诊断方法的建立及相应核酸疫苗的研究提供指导依据。2、本发明方法检测灵敏度高，操作简单，且无二次污染。
附图说明：
图1是SAG菌液PCR及双酶切鉴定结果图；其中A：M：DL2000标准分子量；1：SAG基因的PCR扩增产物(鉴定引物为载体的通用引物序列，上游：T7promoter；下游T7terminator；产物序列含部分载体序列，合计大小约1200bp)
B：M：DL5000标准分子量；1：PET28a(+)-rSAG重组质粒双酶切鉴定结果。
图2是PET28a(+)-rSAG表达时相图；其中，M：蛋白标志物；1：无IPTG诱导。
图3是PET28a(+)-rSAG可溶性分析及纯化结果图；其中，A：M：蛋白标志物：1、2：超声破碎上清液；3、4：超声破碎沉淀物；
B：M：蛋白标志物；1：纯化前的超声破碎后的上清液；2：加样后的流穿液；3：纯化的重组蛋白。
图4是重组蛋白Western blot分析图；其中M：蛋白标志物：1：重组蛋白与小鼠弓形虫阳性血清反应条带。
具体实施方式：
本实施例中：E.coli BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；质粒PET-28a(+)为实验室保存。限制性内切酶BamHI、HindIII、T4DNA连接酶、2×PCR mix购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司；ProteinRuler II(12-120kDa)购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生物科技(北京)有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自Whatman公司；弓形虫小鼠阳性血清为实验室分离保存；羊抗鼠IgG-HRP购自北京康为世纪生物科技有限公司。
实施例1：
1、构建弓形虫SAG基因序列，同SEQ ID NO:1所示，送至苏州金唯智生物科技有限公司合成，目的基因片段大小为909bp。
2、连接转化目的基因和载体
将目的基因与PET-28a(+)载体连接后，转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取完整单个菌落于50μg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。之后进行菌液PCR，双酶切、测序鉴定。
3、重组质粒的表达纯化
菌液振荡培养至OD值为0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，于诱导前和诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h分别收集菌液，12000×g离心10min，加入50μL的1×PBS，进行SDS-PAGE电泳，确定最佳的表达时相。
4、表达重组蛋白
将诱导后的菌液12000×g离心30min，收集沉淀，用1×PBS重悬，反复冻融3次后，冰浴超声破碎20min后离心，收集上清，沉淀用8mol/L尿素重悬，之后进行SDS-PAGE电泳，对蛋白可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化，收集各段洗脱液样品。
5、Western blot检测重组蛋白的免疫原性
将纯化后的带有His标签的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转移至NC膜上，用5％的脱脂奶粉封闭2h，PBST洗涤，10min/3次，加入1：100稀释的小鼠弓形虫阳性血清，4℃孵育过夜，同样方法洗涤，加入1：2000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，室温孵育1h，洗涤后，HRP-DAB底物显色液显色。
6、ELISA法分析重组蛋白的免疫原性
将纯化后的rSAG蛋白稀释至10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，PBST洗涤，5min/3次，之后用5％脱脂奶粉封闭2h，洗涤后，将阳性血清及阴性血清按浓度比为1:50、1:100、1:200、1:400和1:800进行倍比稀释，100μL/孔，每个稀释度做两个重复，37℃孵育1.5h，之后洗涤。加入1：2500稀释的羊抗鼠HRP-IgG，75μL/孔，37℃孵育1h。洗涤后加入TMB进行显色10min，之后每孔加入30μL 2M硫酸终止反应，测A450值。
2、实验结果
2.1菌液PCR、双酶切和测序鉴定结果
构建PET-28a(+)-rSAG重组质粒，进行菌液PCR和双酶切鉴定(图1)，与预期结果相符，测序结果显示与所设计序列一致。目的基因片段大小为909bp。
2.2重组蛋白表达时相
SDA-PAGE电泳结果显示(如图2所示)，重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，且IPTG诱导后1h蛋白表达量达到最高，之后到诱导后7h一直维持在较高水平。蛋白大小约为50kDa，与预期结果相符。
2.3重组蛋白可溶性分析及蛋白纯化
SDA-PAGE电泳结果显示(如图3所示)，PET-28a(+)-rSAG重组蛋白存在于超声后的上清中，为可溶性沉淀；重组蛋白经纯化后，在50kDa处获得背景清晰的目的蛋白条带。
2.4 Western blot鉴定结果
Western blot检测结果显示(如图4所示)，PET28a(+)-rSAG与1:100稀释的小鼠弓形虫阳性血清发生特异性反应，可以观察到在约50kDa处出现识别条带，证明该重组蛋白具有较好的免疫原性。
Figure BDA0001197959910000061
2.5 ELISA鉴定结果(如表1所示)
P＝重组蛋白与阳性血清反应OD值；N＝重组蛋白与阴性血清反应OD值，判定结果：P/N≥2.1为阳性；P/N＜2.1为阴性。根据棋盘法测定抗原结果显示，融合蛋白能够与弓形虫感染的小鼠阳性血清发生反应，但不与阴性血清反应，在临床上可作为抗原区分阴性、阳性血清。
Figure BDA0001197959910000062
表1。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 一种检测弓形虫的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 909
<212> DNA
<213> 弓形虫
<400> 1
ggatccgcca gcgatccgcc gctggttgcc aaccaggttg tgacctgccc tgacaaaaag 60
agcaccggtg gtaccgcact gaccgaaccg ccgaccctgg cctatagccc gaatcgtcag 120
atttgtccgg ccggcaccac cagcagctgt accagtggca gcccggaagc agaagatagc 180
tggtggaccg gtgatagtgc cagcctggat ggtggtaaag gcgatgatgc ccagggtagc 240
tatggcgccg atagcaccct gggccctgtt aaactgagtg ccgaaggccc taccacaggt 300
ggtgatggtg tgaaggtgcc gcaggataac aaccagtatt gcagcggcac caccctgacc 360
ggctgtaacg aaaaaggcag cctgaccgag aatccgtggc agggtaatgc cagcagcgat 420
aaaggcgcca cactgaccat caaaaaggaa gcctttccgg ccgaaagcaa gagcgttatc 480
attggctgca ccggtggtag tccggaaaaa catggtggtg cagcaggtag tgccaaaagc 540
gccgcaggta ccgccggtag tagcaccacc gaaaccccgg ccccgattga atgtaccgcc 600
ggtgcaacca aaaccgttga tgccccgagc agcggtagcg gtggtctgac cattagtccg 660
agtggtgagg gtgatgtgtt ctacggtaag gagtgcaccg atagccgcgg tagtgtgcag 720
cagccggcaa aaggtccggc cacctatacc ctgagctatg atggcacccc ggagaaaccg 780
ggtggtgaag caggtgcccc ggccggtcgt aataatgatg gtagcagtgc cccgaccccg 840
aaagacggta gcccgggtgc agatggtcgt gttaccagcg gctttgatcc ggttagcctg 900
taaaagctt 909

Claims (5)

1.重组弓形虫SAG1和SAG2融合蛋白在制备利用ELISA法检测弓形虫的制剂中的应用，所述融合蛋白的制备包括以下步骤：
1)、重组弓形虫SAG1和SAG2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示；
2)、将SEQ ID NO:1所示基因与PET-28a(+)载体连接后，转化至感受态细胞，挑取完整单个菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；之后进行菌液PCR、双酶切和测序鉴定；
3)、菌液振荡培养至OD值为0.6—0.8时，加入IPTG诱导，诱导后1h收集菌液，离心，加入1×PBS进行SDS-PAGE电泳；
4)、将诱导后的菌液离心，收集沉淀，用1×PBS重悬，反复冻融3次后，冰浴超声破碎后离心，收集上清，沉淀用尿素重悬，之后进行SDS-PAGE电泳，对蛋白可溶性进行分析；使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化，收集各段洗脱液样品；
所述检测方法为将纯化后的重组蛋白作为抗原，并通过ELISA法对相应血清中的抗体进行检测，其区分阴性或阳性血清。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述LB培养基含有50μg/mL Kana。
3.如权利要求1所述的应用，其中，所述IPTG终浓度为1mmol/L。
4.如权利要求1所述的应用，其中，所述离心转速为12000×g。
5.如权利要求1所述的应用，其中，所述尿素为8mol/L。
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