CN110423270B - 一种弓形虫表面抗原gra1和gra7重组蛋白的制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白的制备。本发明提供的一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，将GRA1和GRA7中的信号肽和C端疏水序列排除，截取可溶性表达部位的B细胞抗原表位信息，对表达这两个基因抗原表位的重组基因进行重构。本发明的重组蛋白可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中弓形虫的检测。

Description

一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白的制备

技术领域

本发明涉及生物检疫技术领域，具体地说，涉及一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，同时涉及其制备方法。

背景技术

弓形虫病是世界范围内流行的一种人兽共患寄生虫病，在感染人或动物后可通过胎盘方式垂直传播，造成胎儿畸形，早产，神经系统发育障碍；也可经口传播，如饮用未经灭菌的奶制品，或使用未熟的肉类。弓形虫对宿主选择性不强，可寄生在多种动物的有核细胞中，并侵害多种组织器官，对人类及动物健/康造成严重的威胁。为了研制一种可快速检测弓形虫的诊断试剂，需要对抗原标志物进行筛选。以往国内外学者多用从感染动物中收集或经组织、细胞培养的弓形虫速殖体作为抗原，该方法虽然特异性好，但抗原纯度较低，成分复杂，价格昂贵。而在原核表达系统中表达出的特异性目的蛋白产量高、操作简单、费用低廉，成为众多学者研究的对象。

致密颗粒蛋白GRAs是弓形虫细胞器分泌产生的一类有免疫原性的蛋白质，该家族的蛋白质均含两种核苷酸水解酶，可以作为弓形虫的抗原标志物被检测。GRA蛋白的分泌持续弓形虫的整个感染过程，其中GRA1蛋白具有钙离子结合蛋白特点，能调节钙离子浓度，在分泌产物的包装过程中起重要作用，可以作为弓形虫急性或者慢性感染的诊断抗原。GRA7蛋白则主要定位于宿主细胞包浆内，在弓形虫缓殖子期间，GRA7蛋白释放后直接与宿主免疫系统接触，并且在感染早期晚期均能够诱导强烈免疫应答，因此GRA7也成为弓形虫感染抗体血清检测的较优抗原分子。

临床中对弓形虫的检测常采用PCR、ELISA等方法，但多因操作繁琐，耗时长，费用高等缺点，不适用与基层的推广，因此，寻找一种简便、快速、灵敏度高的诊断方法势在必行。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。

申请人分析GRA1、 GRA7的蛋白结构，在GRA1内选择7个B细胞抗原表位，在GRA7内选择抗原表位集中的4个片段，将这11个片段通过两个丙氨酸结构进行串联，使得抗原表位尽量不相互影响。将重新分析的氨基酸序列反推出碱基序列并进行密码子优化，使得新重构基因符合原核表达。然后构建相应的原核表达质粒，获得了展现弓形虫多表位的新型重组蛋白。该蛋白具有His标签，实现了亲和层析的纯化，表达量高，纯化方便，且检测相关的抗体灵敏性高。由于重组蛋白是GRA1和GRA7联合的，因此可以对弓形虫不同阶段产生的抗体均可检测。

为了实现上述技术方案，本发明提供一种融合蛋白，一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，将GRA1和GRA7中的信号肽和C端疏水序列排除，截取可溶性表达部位的B细胞抗原表位信息，对表达这两个基因抗原表位的重组基因进行重构。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，合并抗原表位集中区段，两个抗原表位间以GG、GS密码子相连，建立新的目的基因片段；

其中，所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

上述方法中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体和/或共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本发明对表达载体、共表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主，具体的，表达载体可为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11的等，共表达载体可为pCDFDuet-1等；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。

本发明中，克隆可通过例如链式酶聚合反应(PCR)完成。

本发明同时提供一种用于免疫分析的产品，所述产品包括本发明所述的融合蛋白。

其中，产品的形式可为探针(传感器)、试纸条、芯片、试剂盒等，在使用时，将本发明所述的融合蛋白与其它现有的商业试剂(如酶标抗体、荧光标记抗体、显色剂、底物等)混合，可用于各种形式的免疫分析，例如抗体检测、抗体筛选、抗原检测、病原检测、蛋白检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛选等。

有益效果

(1) 为了提高弓形虫血清学检测效果，在本研究中，我们对GRA1和GRA7基因的抗原表位进行分析，将信号肽和C端疏水序列排除，截取可溶性表达部位的B细胞抗原表位信息，对表达这两个基因抗原表位的重组基因进行重构，之后在大肠杆菌中表达该重组蛋白，并对其抗原性进行分析。结果显示，该重组蛋白在大肠杆菌表达系统中高效可溶性表达，且具有较好的抗原性。

(2)本发明的融合蛋白rGRA可高效、高密度的捕获目标分子，达到快速、高灵敏的检测。

(3)本发明的融合蛋白rGRA制备过程简单、易行，可适用于不同的免疫检测模式，如可用于间接ELISA、夹心ELISA、免疫PCR等，仅仅是替换原有检测方法中的一种试剂，不改变原有操作步骤，不需要额外的设备和仪器。

附图说明

图1 重组蛋白rGRA合成示意图。

图2 pET-32a(+)-GRA重组质粒构建图。

图3 重组质粒的鉴定，其中，

A.菌液PCR鉴定结果，其中：M：核酸标志物；1：rGRA PCR产物；

B. 双酶切鉴定结果，其中：M：核酸标志物；1：rGRA ，酶切产物。

C：重组蛋白溶解性分析，其中： M：蛋白标志物；1：重组蛋白上清液；2：重组蛋白沉淀；3：纯化后重组蛋白；

D：Western-blot检测重组蛋白，其中： M：蛋白标志物；1重组蛋白与小鼠弓形虫阳性血清结合能力检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1重组蛋白GRA1和GRA7（简写为rGRA）的构建

BALB/c鼠标准弓形虫阴阳性血清为实验室保存；待检猪血清分别采自上海爱森肉食品有限公司，重庆腾驰食品有限公司，上海深蓝养殖场，各50份样品。

对弓形虫GRA1和GRA7蛋白抗原表位进行分析，合并抗原表位集中区段，两个抗原表位间以GG、GS密码子相连，建立新的目的基因片段。对大肠杆菌使用频率低的密码子进行优化，将其替换成能编码同一氨基酸的大肠杆菌偏爱的密码子，在5’端加上BamH

（GGATCC）酶切位点；3’端加入终止密码子TAA，最后在其前后端加入BamH

（GGATCC）和Hind

（AAGCTT）酶切位点，合成后的序列总长度为663bp，GC%为58.52%，如SEQ ID NO.1所示。将序列交由苏州金唯智生物科技有限公司合成，得到目的基因片段，构建过程如图1所示。

如图2所示，将pET-32a(+)质粒（上海华津生物科技有限公司）与rGRA重组序列连接后，将重组质粒pET-32a(+)-GRA转化至大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)（北京全式金生物技术有限公司）中，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养10 h后，挑取完整的单克隆菌落至LB液体培养基上37℃过夜培养，后进行菌液PCR、双酶切、测序鉴定。

对PCR产物进行电泳鉴定（图3A）和双酶切鉴定（图3B），菌液PCR鉴定结果显示，目的条带大小约为950bp（含目的基因及部分载体基因序列）；重组质粒经双酶切后扩增出大小为663bp的目的基因片段，与预期结果相符；测序结果显示与所设计序列一致。目的基因片段大小为909 bp。

将鉴定正确的菌液在IPTG（北京全式金生物技术有限公司）诱导下表达，并对重组蛋白的溶解性进行分析，Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）对融合蛋白进行纯化。具体为：

（1）将鉴定结果正确的重组质粒分别转入BL21（DE3），并接种于150ml含Kan+的LB液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养。

（2）当生长至对数期（OD600约为0.6时），加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。将诱导8h后的菌液12000rpm离心20min弃上清，沉淀用20ml 1×PBS重悬，反复冻融三次后，冰浴超声破碎20min（超2s隔9s）后12000rpm离心15min，收集沉淀和上清。

（3）将离心后的沉淀用5ml 8mol 尿素重悬，重复上述离心步骤，收集上清。

（4）将超声后上清、沉淀重悬后上清，分别加入等体积蛋白电泳缓冲液，用SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性。

SDS-PAGE电泳结果显示（图3C），表达产物经纯化后在50kDa处获得纯度较高的目的蛋白。Western blot结果显示(图3D)，重组蛋白能够与小鼠弓形虫阳性血清发生特异性结合。

实施例2 rGRA重组蛋白抗原活性鉴定

按照说明书的记载进行操作，纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转移到PDVF膜（美国Millipore）上。5%脱脂奶粉封闭2h后，加入1:100稀释的BLAB/c小鼠标准弓形虫阳性血清（实验室保存）孵育1.5h。之后加入山羊抗鼠IgG-HRP（北京康为世纪）孵育1h，HRP-DAB显色试剂盒（北京天根生物科技有限公司）显色，观察结果。

将纯化后的rGRA蛋白稀释至20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、 2.5 μg/mL、 1.25 μg/mL，每孔加入100 μL，4℃包被过夜，PBST洗涤，5 min/3次，之后用5 %脱脂奶粉封闭2 h，洗涤后，将小鼠弓形虫病阳性血清及阴性血清按浓度比为1：50、1：100、1：200、1：400和1：800进行倍比稀释，100 μL/孔，每个稀释度做两个重复，37℃孵育1.5 h，之后洗涤。加入1：2500稀释的羊抗鼠HRP-IgG，75 μL/孔，37℃孵育1 h。洗涤后加入TMB进行显色10 min，之后每孔加入2 M硫酸终止反应，测OD450值。结果判定：P=重组蛋白与阳性血清反应OD值；N=重组蛋白与阴性血清反应OD值，判定结果：P/N≥2.1为阳性；P/N＜2.1为阴性。

表1 ELISA鉴定结果

根据棋盘法测定抗原结果显示，融合蛋白在1.25μg/mL包被时依然能够与800倍稀释的弓形虫感染的小鼠阳性血清发生阳性反应，说明该重组蛋白具有较强的抗原性，在临床上可作为抗原区分阴性、阳性血清。

应当理解，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明内容作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）,上海杰一生物技术有限公司

<120>一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白的制备

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 663

<212> DNA

<213> rGRA全长序列

<400>GGATCCGAAGGCGGTGACAATCAGAGCAGCGCAGTGAGCGATGGTGGTGGTGGTACCGGTCAGGGTCTGGGCATTGGTGGTAGCTATCGTGTGGAACGCCCGACAGGTAATCCGGATGGCGGTGCAAGCGATGGCAGCTATAGCGAGGTGGGTAATGTGAACGGTAGTAGCATGCAGCGTGGCGGCGGTGAAACCGTGGAAGAAGCCATCGAAGATGTGGCCCAGGCAGAAGGTCTGAACAGCGAACAGACCCTGGGTAGCCAGCTGGAAAAAGACAAACAGCAGCTGAAAGGCGGCGCAACCGCCAGCGATGATGAAGGCGGCTTTTTCGATGGTCAGGCCCCGGTTGATAGTCTGCGCCCGACCAATGCCGGTGTGGATAGCAAAGGCACCGACGATCATCTGACCACCAGCATGGATAAAGCCAGCGTTGAAAGCCAGCTGCCGCGTCGCGAACCTCTGGAAACCGAACCGGACGAACAGGAAGAGGTGGGTAGCGTGCGCAGCGATGCCGAAGTGACCGATGACAACATCTACGAGGAGCACACCGATCGCAAAGTGGTGCCGCGCAAAAGCGAAGGCAAACGTAGCGGTGGCGAACTGACCGAAGAACAGCAGCGCGGTGATGAACCGCTGACCACCGGTCAGAACGTGTAAAAGCTT

Claims (3)

1.一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白是对弓形虫GRA1和GRA7蛋白抗原表位进行分析，合并抗原表位集中区段，两个抗原表位间以GG、GS密码子相连，建立新的目的基因片段，对大肠杆菌使用频率低的密码子进行优化，将其替换成能编码同一氨基酸的大肠杆菌偏爱的密码子，在5’端加上BamH I酶切位点；3’端加入终止密码子TAA，最后在其前后端加入BamHI和HindIII酶切位点，合成后的序列总长度为663bp，GC%为58.52%，如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白的表达和纯化方法，将鉴定正确的菌液在IPTG诱导下表达，并对重组蛋白的溶解性进行分析，具体步骤为：

（1）将鉴定结果正确的重组质粒分别转入BL21（DE3），并接种于150ml含Kan⁺的LB液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养；

（2）当生长至对数期时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达；将诱导8h后的菌液12000rpm离心20min弃上清，沉淀用20ml 1×PBS重悬，反复冻融三次后，冰浴超声破碎20min后12000rpm离心15min，收集沉淀和上清；

（4）将离心后的沉淀用5ml 8mol 尿素重悬，重复上述离心步骤，收集上清；

（5）将超声后上清、沉淀重悬后上清，分别加入等体积蛋白电泳缓冲液，用SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性。

3.一种用于免疫分析的产品，所述产品包括权利要求1所述的弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白。

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