CN110894215B

CN110894215B - 一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡

Info

Publication number: CN110894215B
Application number: CN201911293190.XA
Authority: CN
Inventors: 孟赓; 朱文壮; 孟凯闻
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110894215A

Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡。本发明所述抗原序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了一种新型的小反刍兽疫病毒抗原，作为小反刍兽疫病毒抗体的检测抗原时，具备极高的特异性、重复性和准确性，能够应用在相关的免疫层析检测产品中，结果直观可肉眼判断，可快速、特异地检出血清中小反刍兽疫病毒抗体，具有较高的实用价值，便于基层推广使用。

Description

一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡。

背景技术

小反刍兽疫是国际动物卫生组织(OIE)规定的通报性疫病和国内法定的 I类动物疫病。该病由副黏病毒科、麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Peste des Petits RuminantsVirus，PPRV)引起，经接触传播，死亡率高达90％以上，严重威胁养羊业。自2007年我国首次报道西藏地区发生小反刍兽疫疫情至今，我国由西向东陆续有省市出现小反刍兽疫疫情，截至2015年，共有22个省 (市、自治区)受到影响。

为保证我国养羊业健康发展，农业部发布了《全国小反刍兽疫消灭计划 (2016-2020年)》。目前防控小反刍兽疫最有效的方法是疫苗免疫结合血清学监测，因此积极研发快速诊断检测试剂，推动相关产品上市，可为我国小反刍兽疫消灭计划的实施提供有力支持，有助于早日达到小反刍兽疫的控制和消灭。

在血清学检测领域，目前国内外最常见的报道是以纯化小反刍兽疫病毒 N、H、F蛋白或者以全病毒作为包被抗原建立竞争ELISA方法，市面上也使用检测小反刍兽疫病毒抗体的标准竞争ELISA试剂盒，但是ELISA实验对酶标仪精度，技术人员水平要求高，操作繁琐，耗时较长，不易现场大规模应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小反刍兽疫病毒抗原，使其应用于小反刍兽疫病毒抗体检测时具备较高的特异性、重复性和准确性；

本发明的另外一个目的在于提供上述小反刍兽疫病毒抗原在制备免疫层析检测产品中的相关应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种小反刍兽疫病毒抗原，序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明采用生物信息学技术对小反刍兽疫病毒不同谱系毒株M蛋白基因进行比对分析，设计合成小反刍兽疫病毒特异性M蛋白基因(SEQ ID NO:2 所示)，然后通过重组表达的方式获得抗原。

所述抗原重组表达的方法如下：

将小反刍兽疫病毒特异性M蛋白基因插入载体pGAPZα的HindⅢ和NotI 酶切位点之间，保持pGAPZα的其它序列不变，得到的pGAPZα-M基因重组表达载体，然后将其转化毕赤酵母表达工程菌SMD1168，使其插入到毕赤酵母基因组中，稳定表达目的蛋白。

在本发明具体实施方式，利用所述抗原制备成胶体金免疫层析试纸卡，特异性试验结果显示，对己知的羊口蹄疫O型阳性血清，羊布鲁氏菌阳性血清，羊衣原体阳性血清及羊痘病毒阳性血清和小反刍兽疫病毒阳性血清进行交叉试验。只有小反刍兽疫病毒阳性血清样品，检测线显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显色，呈阴性反应，表明所述抗原用于检测小反刍兽疫病毒抗体时具有高度的特异性。

同时，分别检测5份已验证的小反刍兽疫病毒抗体阳性血清和5份已验证的小反刍兽疫病毒抗体阴性血清，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致，表明所述抗原用于检测小反刍兽疫病毒抗体时具有较好的重复性和准确性。

此外，取同一批号胶体金免疫层析试纸卡对189份临床待测血清样本分别进行检测，观察结果并与国际通用试剂盒ID VET PPRV C-ELISA试剂盒检测数据比较。ID VETPPRV C-ELISA试剂盒检测数据显示189份血清样品145 份阳性，44份阴性；而本发明的阳性符合数140份，阴性符合数36份，假阳性数8份，假阴性数5份，阳性符合率96.60％(140/145)，阴性符合率81.81％ (36/44)，总符合率93.12％(176/189)。表明所述抗原用于检测小反刍兽疫病毒抗体时具有良好的准确性。

基于上述试验结果，本发明提出了所述抗原在制备检测小反刍兽疫病毒抗体的免疫层析产品中的应用。作为优选，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸卡。

依据所提出的应用，本发明提供了一种检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，其以SEQ ID NO:1所示序列的蛋白为检测抗原。

作为优选，所述试纸卡包括背衬以及在背衬上依次粘贴的样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上划有包被SEQ ID NO:1 所示序列的小反刍兽疫病毒抗原的检测线。其中，所述小反刍兽疫病毒抗原在检测线上的喷涂量为1ul/cm，所述小反刍兽疫病毒抗原的工作浓度为 4mg/ml。

作为优选，所述硝酸纤维素膜上划有包被兔抗羊IgG 抗体的质控线，所述兔抗羊IgG抗体在质控线上的喷涂量为1ul/cm；所述兔抗牛抗体的工作浓度为2mg/ml。

作为优选，所述标记物垫喷涂有标记胶体金颗粒的金黄色葡萄球菌蛋白A (SPA)的复合物，所述标记胶体金颗粒的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的复合物在标记物垫上的喷涂量为8uL/cm。在本发明具体实施方式中，所述胶体金与所述SPA在胶体金标记过程中的标记比含量为：2ml胶体金∶10ug SPA。

作为优选，所述背衬为聚乙烯背衬。

作为优选，所述试纸卡还包括装载卡壳。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种新型的小反刍兽疫病毒抗原，作为小反刍兽疫病毒抗体的检测抗原时，具备极高的特异性、重复性和准确性，能够应用在相关的免疫层析检测产品中，结果直观可肉眼判断，可快速、特异地检出血清中小反刍兽疫病毒抗体，具有较高的实用价值，便于基层推广使用。

附图说明

图1所示为胶体金免疫层析试纸卡示意图；

图2所示为胶体金免疫层析试纸卡特异性分析；其中，1表示小反刍兽疫病毒抗体阳性血清；2表示羊口蹄疫O型阳性血清；3表示羊布鲁氏菌阳性血清；4表示羊衣原体阳性血清；5表示羊痘病毒阳性血清。

具体实施方式

本发明公开了一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述小反刍兽疫病毒抗原以及胶体金免疫层析试纸卡已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述小反刍兽疫病毒抗原以及胶体金免疫层析试纸卡进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

利用本发明胶体金免疫层析试纸卡检测，当被检样品中含有小反刍兽疫病毒抗体时，胶体金标记的SPA与样品中小反刍兽疫病毒抗体形成复合物一起层析移动，被喷涂在硝酸纤维素膜上T线位置的小反刍兽疫病毒M蛋白捕获，T线形成金标SPA-小反刍兽疫病毒M蛋白抗体-小反刍兽疫病毒M蛋白复合物，未结合的金标SPA-羊IgG继续运动到C线上，被兔抗羊IgG 抗体捕获，形成金标SPA-羊IgG-兔抗羊IgG 抗体复合物，此时，T线和C线均显示出肉眼可见的红色。当被检样品中不含有小反刍兽疫病毒抗体时，金标SPA- 羊IgG复合物与T线上小反刍兽疫病毒M蛋白不反应，金标SPA-抗体复合物继续运动到C线上，被兔抗羊IgG 捕获，形成金标SPA-抗体-兔抗羊IgG 复合物，T线不显色，而C线显示出肉眼可见的红色。结果判定：T线不显色， C线显红色，检测样品为阴性，T线和C线都显红色，检测样品为阳性，若C线和T线均不显色，则说明试纸卡失效。

以下就本发明所提供的一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡做进一步说明。

实施例1：本发明所述抗原的重组表达

1、小反刍兽疫病毒抗原基因重组表达质粒pGAPZα-M的构建

本发明采用生物信息学技术对小反刍兽疫病毒不同谱系毒株M蛋白基因进行比对分析，设计合成小反刍兽疫病毒特异性M蛋白基因，将M蛋白基因的目的序列优化，并使用化学合成的方法合成小反刍兽疫病毒的M基因序列(SEQ ID NO:2所示)。将pGAPZα载体用HindⅢ和NotI双酶切，酶切体系为50uL：HindⅢ和NotI各1uL，载体片段20uL，10X酶切buffer5uL，ddH₂O 23uL，酶切产物经过1％的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与M基因序列进行连接，构建10μL的连接体系：M基因片段5.5μL， pGAPZα载体2.5μL，T4DNA连接酶0.5μL，T4 DNA连接缓冲液1μL。轻敲管壁混匀，室温连接1h，连接产物常规的化学法转化DH5α感受态细胞，用 PCR方法对阳性克隆进行鉴定。将PCR鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pGAPZα-M。

2、抗原蛋白的重组表达

用化学法将提取筛选到的阳性克隆质粒转化到SMD1168中。用菌落PCR 方法验证M基因插入。通过提高Zeocin抗生素浓度，筛选出高拷贝的转化子。挑选阳性单克隆毕赤酵母菌落接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养。取过夜培养的菌液于MGY液体培养基中100倍扩大培养，30℃培养60h即得到所需蛋白。

3、抗原蛋白的纯化

取1L毕赤酵母培养物，6000rpm，离心10min，收集上清。取上清用 0.45μm滤器过滤，浓缩进行纯化。应用镍柱进行融合蛋白亲和纯化，主要操作步骤如下：

a.用20mL NTA-0buffer平衡层析柱，取离心过滤后上清用注射器缓慢加到Ni层析柱中。

b.用20mL NTA-0buffer洗涤，流速控制在1mL/min左右。

c.依次用20mL的NTA-50、NTA-100、NTA-500buffer洗脱，流速控制在1mL/min左右；收集洗脱峰部分。

d.将收集的样品进行SDS-PAGE分析。

实施例2：制备小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸卡

1、制备标记有金颗粒的SPA的金标结合物

取40nm胶体金颗粒2ml用0.1mol/L碳酸钾调节溶液调节pH至6.8，加入10ug金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，快速混匀并在3D旋转仪上室温混匀30min，然后加入终浓度1％BSA并在3D旋转混合仪上混匀30min，将金标液于4℃12000r/min离心10min，小心弃去上清液，沉淀物用0.01M PBS 缓冲液洗涤2次，再离心所得沉淀即为纯化的SPA金标复合物，制备的胶体金标记SPA用0.01M PBS重悬，4℃保存备用。

2、硝酸纤维素膜检测线和质控线喷洒及胶体金结合垫制备

将重组表达的小反刍兽疫病毒抗原用0.01M PBS稀释成4mg/ml，以 1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的T线位置。将兔抗羊IgG抗体用0.01M PBS 稀释成2mg/ml，以1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的C线位置，然后放于37℃过夜烘干备用。将SPA-胶体金复合物以8uL/cm均匀喷涂在标记物垫上，37℃过夜烘干备用。

3、试纸卡的组装

将样品垫、喷涂有SPA金标结合物的标记垫、喷涂有小反刍兽疫病毒抗原作为检测线和喷涂有兔抗羊IgG 作为质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬上。其组装结构为硝酸纤维素膜置于聚乙烯背衬的上面，样品垫平贴于硝酸纤维素膜左侧，吸收垫平贴于硝酸纤维素膜右侧，胶体金结合垫平贴于样品垫与硝酸纤维素膜之间，使其一端压于样品垫之下，另一端覆于硝酸纤维素膜之上。将组装好的大板用切条机切成5mm胶体金试纸条，然后将试纸条与卡壳组装，真空封装，常温保存；示意图见图1。

4、检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡的应用

取100ul待测样品液滴在本发明试纸卡加样孔上，10min后观察结果，同时分别取已知阳性血清样品和缓冲液分别作为阳性和阴性对照。结果判定：在样品垫上加入检测样品时，若检测线和质控线均显红色，为小反刍兽疫病毒抗体阳性，即样品中含有小反刍兽疫病毒M蛋白抗体；若检测线不显色而质控线显红色，为小反刍兽疫病毒抗体阴性，即样品中不含小反刍兽疫病毒 M蛋白抗体；若质控线不显色，则试纸无效。

实施例3：胶体金免疫层析试纸卡特异性试验

对己知的羊口蹄疫O型阳性血清，羊布鲁氏菌阳性血清，羊衣原体阳性血清及羊痘病毒阳性血清和小反刍兽疫病毒阳性血清进行交叉试验，结果见图2。

图2结果显示，只有小反刍兽疫病毒阳性血清样品，检测线显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显色，呈阴性反应，表明所述抗原用于检测小反刍兽疫病毒抗体时具有高度的特异性。

实施例4：胶体金免疫层析试纸卡重复性和准确性试验

将不同批次的所述免疫层析胶体金试纸分别检测5份已验证的小反刍兽疫病毒抗体阳性血清和5份已验证的小反刍兽疫病毒抗体阴性血清，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致且与病毒中和试验结果保持一致，表明所述胶体金免疫层析试纸卡具有良好的重复性和准确性。

实施例5：胶体金免疫层析试纸卡的符合性试验

取同一批号免疫层析胶体金试纸卡对189份临床待测血清样本分别进行检测，观察结果并与国际通用试剂盒ID VET PPRV C-ELISA试剂盒检测数据比较。ID VET PPRV C-ELISA试剂盒检测数据显示189份血清样品145份阳性，44份阴性；而本发明制备的小反刍兽疫病毒抗体检测试纸卡阳性符合数 140份，阴性符合数36份，假阳性数8份，假阴性数5份，阳性符合率96.60％ (140/145)，阴性符合率81.81％(36/44)，总符合率93.12％(176/189)。证明，所述胶体金免疫层析试纸卡具有良好的准确性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡

<130> MP1925392

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Glu Ile Tyr Asp Phe Asp Lys Ser Ala Trp Asp Val Lys Gly

1 5 10 15

Ser Ile Ala Arg Ile Glu Pro Thr Thr Tyr His Asp Gly Arg Leu Ile

20 25 30

Pro His Val Arg Val Ile Asp Pro Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Glu

35 40 45

Cys Phe Met Tyr Leu Phe Leu Leu Gly Val Ile Glu Asp Asn Asp Pro

50 55 60

Leu Ser Pro Pro Val Gly Arg Thr Phe Gly Ser Leu Pro Leu Gly Val

65 70 75 80

Gly Arg Ser Thr Ala Arg Pro Glu Glu Leu Leu Arg Glu Ala Thr Glu

85 90 95

Leu Asp Ile Val Val Arg Arg Thr Ala Gly Leu Asn Glu Lys Leu Val

100 105 110

Phe Tyr Asn Asn Thr Pro Leu Ser Leu Leu Thr Pro Trp Arg Lys Val

115 120 125

Leu Thr Thr Gly Ser Val Phe Ser Ala Asn Gln Val Cys Asn Ala Val

130 135 140

Asn Leu Val Pro Leu Asp Thr Pro Gln Arg Phe Arg Val Val Tyr Met

145 150 155 160

Ser Ile Thr Arg Leu Ser Asp Asn Gly Tyr Tyr Ser Val Pro Arg Arg

165 170 175

Met Leu Glu Phe Arg Ser Ala Asn Ala Val Ala Phe Asn Ile Leu Val

180 185 190

Thr Leu Arg Ile Glu Asn Gly Thr Asn Pro Ser Arg Tyr Ile Val Gly

195 200 205

Ser Trp Glu Asn Pro Glu Val Thr Phe Met Val His Val Gly Asn Phe

210 215 220

Arg Arg Lys Lys Asn Lys Val Tyr Ser Ala Asp Tyr Cys Lys Met Lys

225 230 235 240

Ile Glu Lys Met Gly Leu Val Phe Ala Leu Gly Gly Ile Gly Gly Thr

245 250 255

Ser Leu His Ile Arg Ser Thr Gly Lys Met Ser Lys Thr Leu His Ala

260 265 270

Gln Leu Gly Phe Lys Lys Ile Leu Cys Tyr Pro Leu Met Asp Ile Asn

275 280 285

Glu Asp Leu Asn Arg Tyr Leu Trp Arg Ala Glu Cys Arg Ile Val Lys

290 295 300

Ile Gln Ala Val Leu Gln Pro Ser Val Pro Gln Glu Phe Arg Val Tyr

305 310 315 320

Asp Asp Val Ile Ile Asn Asp Asp Gln Gly Leu Phe Lys Ile Leu

325 330 335

<210> 2

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgactgaaa tttatgattt tgataaatct gcttgggatg ttaagggttc catagctagg 60

atcgaaccta caacatacca cgacggacga ctaataccac atgtaagagt tatcgaccct 120

ggattaggcg acagaaagga tgaatgtttt atgtaccttt tccttttagg tgtgatagag 180

gacaacgatc ctttgtctcc cccagttgga cgaacttttg gctccttgcc acttggtgtc 240

ggtagaagta ctgctaggcc agaagaattg cttcgtgaag caactgagct tgatatagtc 300

gttcgtagaa cggctggatt gaacgagaag ttagtatttt ataacaacac cccactgtct 360

ttgcttaccc catggagaaa ggttttaacc actggttccg tcttctctgc taatcaggtt 420

tgtaatgctg ttaatctagt ccctttggat accccacaaa gatttagagt agtttatatg 480

tctattacta gattgagtga caatggctac tattctgttc caagacgaat gttagaattt 540

agatcagcaa acgccgtcgc ttttaatatc ttggttacgt tgagaattga aaacggaaca 600

aatccctcaa gatatattgt tggatcttgg gaaaatcctg aagtcacttt catggtccat 660

gtgggcaatt tccgaagaaa aaagaacaag gtttattcag ctgattattg taagatgaag 720

atagagaaaa tgggtttggt ctttgcactt ggaggaattg gtggtacttc attgcatatt 780

cgttctactg gaaaaatgtc taagacttta cacgctcagc taggattcaa aaaaatctta 840

tgttacccat tgatggatat taatgaagat ttgaacaggt acctttggcg tgccgagtgt 900

aggatcgtca agattcaagc agttcttcaa ccttccgtcc ctcaagaatt tagagtttac 960

gatgatgtaa ttattaatga cgatcaagga ttatttaaaa tactg 1005

Claims

1.小反刍兽疫病毒抗原在制备检测小反刍兽疫病毒抗体的免疫层析产品中的应用；所述小反刍兽疫病毒抗原表达方法如下：

将SEQ ID NO:2所示小反刍兽疫病毒特异性M蛋白基因插入载体pGAPZα的HindⅢ和NotI酶切位点之间，保持pGAPZα的其它序列不变，得到的pGAPZα-M基因重组表达载体，然后将其转化毕赤酵母表达工程菌SMD1168，使其插入到毕赤酵母基因组中，稳定表达目的蛋白。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸卡。

3.一种检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于，以权利要求1中所述小反刍兽疫病毒抗原为检测抗原。

4.根据权利要求3所述试纸卡，其特征在于，包括背衬以及在背衬上依次粘贴的样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上划有包被权利要求1中所述小反刍兽疫病毒抗原的检测线。

5.根据权利要求4所述试纸卡，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上划有包被兔抗羊IgG抗体的质控线。

6.根据权利要求4所述试纸卡，其特征在于，所述标记物垫喷涂有胶体金颗粒标记的金黄色葡萄球菌蛋白A的复合物。

7.根据权利要求4所述试纸卡，其特征在于，所述背衬为聚乙烯背衬。

8.根据权利要求3-7任意一项所述试纸卡，其特征在于，还包括装载卡壳。