CN110903356B

CN110903356B - 一种猪圆环病毒ii型抗原以及检测猪圆环病毒ii型抗体的胶体金免疫层析试纸条

Info

Publication number: CN110903356B
Application number: CN201911294319.9A
Authority: CN
Inventors: 孟赓; 朱文壮; 顾贵波
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110903356A

Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种猪圆环病毒II型抗原以及检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条。本发明所述抗原序列如SEQ ID NO:1‑3任意一项所示。本发明提供了一种新型的猪圆环病毒II型抗原，以其自组装的病毒样颗粒作为猪圆环病毒II型抗体的检测抗原时，具备极高的特异性、重复性和准确性，能够应用在相关的免疫层析检测产品中，结果直观可肉眼判断，可快速、特异地检出血清中猪圆环病毒II型抗体，具有较高的实用价值，便于基层推广使用。

Description

一种猪圆环病毒II型抗原以及检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒II型抗原以及检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条。

背景技术

猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，是一类单链环状DNA病毒，无囊膜、二十面体球形结构。目前圆环病毒有两个血清型，圆环病毒I型和圆环病毒II型。圆环病毒I型感染猪不表现临床症状，而圆环病毒II型则与猪的多种疾病有关，尤其是断奶仔猪多系统衰竭综合征相关，对养猪业造成重大损失。

猪圆环病毒II型有三个主要的开放阅读框，分别为ORF1、ORF2、ORF3，其中ORF1编码病毒复制相关蛋白Rep蛋白。ORF2编码主要的结构蛋白Cap 蛋白，Cap蛋白含有特异性抗原表位，具有很强的免疫原性，并产生中和抗体，可以体外中和病毒，是首选的诊断抗原和候选疫苗位点。ORF3编码病毒复制非必需基因。目前圆环病毒II型诊断的血清学检测方法主要以ELISA应用最为广泛，ELISA检测主要应用重组表达的Cap蛋白包板，ELISA具有特异性高、灵敏性好，可以大批量检测等优点，但是也存在技术要求高，操作方法繁琐，需要昂贵的仪器等缺点，不适于基层扩大推广。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒II型抗原，使其自组装的病毒样颗粒应用于猪圆环病毒II型抗体检测时具备较高的特异性、重复性和准确性；

本发明的另外一个目的在于提供上述猪圆环病毒II型抗原在制备免疫层析检测产品中的相关应用或在制备猪圆环病毒样颗粒中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种猪圆环病毒II型抗原，序列如SEQ ID NO:1-3任意一项所示。

本发明采用生物信息学技术对猪圆环病毒II型不同谱系毒株结构蛋白 Cap蛋白进行抗原性和保守性分析，并根据猪圆环病毒II型已知病毒样颗粒进行位点突变，设计合成猪圆环病毒II型特异性Cap蛋白基因(SEQ ID NO:4-6 所示，分别对应于SEQ ID NO:1-3所示序列抗原)，使重组表达形成的病毒样颗粒更加稳定，然后通过重组表达的方式获得抗原。

所述抗原及其重组表达以及病毒样颗粒的方法如下：

将猪圆环病毒II型特异性Cap蛋白基因插入载体pGAPZα的HindⅢ和 NotI酶切位点之间，保持pGAPZα的其它序列不变，得到的pGAPZα-Cap基因重组表达载体，然后将其转化毕赤酵母表达工程菌SMD1168，使其插入到毕赤酵母基因组中，稳定表达目的蛋白，并自组装成病毒样颗粒。

在本发明具体实施方式，利用所述抗原制备成胶体金免疫层析试纸条，特异性试验结果显示，对己知的猪口蹄疫O型阳性血清，猪细小病毒阳性血清，猪轮状病毒阳性血清及猪瘟病毒阳性血清和猪圆环病毒II型阳性血清进行交叉试验。只有猪圆环病毒II型阳性血清样品，检测线显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显色，呈阴性反应，表明所述抗原用于检测猪圆环病毒II型抗体时具有高度的特异性。

同时，分别检测5份已验证的猪圆环病毒II型抗体阳性血清和5份已验证的猪圆环病毒II型抗体阴性血清，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致，表明所述抗原用于检测猪圆环病毒II型抗体时具有较好的重复性和准确性。

此外，取同一批号免疫层析胶体金试纸对96份已知临床血清样本分别进行检测，观察结果并与韩国JBT ELISA检测试剂盒检测数据比较。韩国JBT ELISA检测数据显示96份血清样品74份阳性，22份阴性，假阳性数1份，假阴性数6份，阳性符合率92.4％(73/79)，阴性符合率94％(16/17)，总符合率92.7％(89/96)；而本研究制备的猪圆环病毒II型抗体检测试纸条检测阳性样品78份，阴性样品18份，假阴性数1份，阳性符合率98.7％(78/79)，阴性符合率100％，总符合率98.9％(95/96)，表明所述抗原用于检测猪圆环病毒II型抗体时具有良好的准确性。

基于上述试验结果，本发明提出了所述抗原在制备检测猪圆环病毒II型抗体的免疫层析产品中的应用或在制备猪圆环病毒样颗粒中的应用。作为优选，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸条。

依据所提出的应用，本发明提供了一种检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条，其以SEQ ID NO:1-3任意一项所示序列的蛋白自组装的病毒样颗粒为检测抗原。

作为优选，所述试纸条包括背衬以及在背衬上依次粘贴的样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上划有包被以SEQ ID NO:1-3任意一项所示序列的蛋白自组装的病毒样颗粒的检测线。其中，所述猪圆环病毒II型病毒样颗粒在检测线上的喷涂量为1ul/cm，所述猪圆环病毒 II型病毒样颗粒的工作浓度为2mg/ml。

作为优选，所述硝酸纤维素膜上划有包被兔抗猪IgG 抗体的质控线，所述兔抗猪IgG抗体在质控线上的喷涂量为1ul/cm；所述兔抗牛抗体的工作浓度为2mg/ml。

作为优选，所述标记物垫喷涂有标记胶体金颗粒的金黄色葡萄球菌蛋白A (SPA)的复合物，所述标记胶体金颗粒的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的复合物在标记物垫上的喷涂量为8uL/cm。在本发明具体实施方式中，所述胶体金与所述SPA在胶体金标记过程中的标记比含量为：2ml胶体金∶10ug SPA。

作为优选，所述背衬为聚乙烯背衬。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种新型的猪圆环病毒II型抗原，以其自组装的病毒样颗粒作为猪圆环病毒II型抗体的检测抗原时，具备极高的特异性、重复性和准确性，能够应用在相关的免疫层析检测产品中，结果直观可肉眼判断，可快速、特异地检出血清中猪圆环病毒II型抗体，具有较高的实用价值，便于基层推广使用。

附图说明

图1所示为胶体金免疫层析试纸条示意图；

图2所示为胶体金免疫层析试纸条特异性分析；其中，1表示猪圆环II 型病毒阳性血清；2表示猪口蹄疫O型阳性血清；3表示猪细小病毒阳性血清； 4表示猪轮状病毒阳性血清；5表示猪瘟病毒阳性血清。

具体实施方式

本发明公开了一种猪圆环病毒II型抗原以及检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述猪圆环病毒II型抗原以及胶体金免疫层析试纸条已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述猪圆环病毒II型抗原以及胶体金免疫层析试纸条进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

利用本发明胶体金免疫层析试纸条检测，当被检样品中含有猪圆环病毒 II型抗体时,胶体金标记的SPA与样品中猪圆环病毒II型抗体形成复合物一起层析移动，被喷涂在硝酸纤维素膜上T线位置的猪圆环病毒II型病毒样颗粒捕获，T线形成金标SPA-猪圆环病毒II型抗体-猪圆环病毒II型病毒样颗粒复合物，未结合的金标SPA-猪IgG继续运动到C线上，被兔抗猪IgG 抗体捕获,形成金标SPA-猪IgG-兔抗猪IgG 抗体复合物，此时，T线和C线均显示出肉眼可见的红色。当被检样品中不含有猪圆环病毒II型抗体时，金标SPA- 猪IgG复合物与T线上猪圆环病毒II型病毒样颗粒不反应，金标SPA-抗体复合物继续运动到C线上，被兔抗猪IgG 捕获，形成金标SPA-抗体-兔抗猪IgG 复合物,T线不显色，而C线显示出肉眼可见的红色。结果判定：T线不显色， C线显红色，检测样品为阴性，T线和C线都显红色，检测样品为阳性，若C 线和T线均不显色,则说明试纸条失效。

病毒样颗粒是一种多聚蛋白复合物，与天然病毒有相似的结构，但不包含核酸，因此即是一种非常安全的候选疫苗，也是完美的候选诊断抗原。病毒样颗粒可重复性及高密度抗原位点能有效检测血清中抗体，检测准确率更高，结果更准确，有效避免漏检结果。且本发明采用毕赤酵母重组表达圆环病毒样颗粒，与目前市面上常用的昆虫细胞表达系统相比，具有更低的成本；与大肠杆菌系统相比，成本相当，表达后直接体内自组装，不需要复杂的体外自组装过程，且产量更高。病毒样颗粒作为诊断抗原特异性更高，敏感性更强。利用圆环病毒样颗粒作为诊断抗原制备胶体金快速检测试纸卡，对于猪圆环病毒II型的抗体诊断，不但特异性高、敏感性强，而且操作简便、结果简单清晰，易于基层防疫单位和农场、农户使用。本发明的胶体金免疫层析试纸条操作简便，不需要仪器设备，只需要将血清滴加到试纸条上，10分钟后即可判断结果，结果清晰可变，易于大规模基层推广使用。

以下就本发明所提供的一种猪圆环病毒II型抗原以及检测猪圆环病毒II 型抗体的胶体金免疫层析试纸条做进一步说明。

实施例1：猪圆环病毒II型病毒样颗粒的表达与纯化

1、猪圆环病毒II型病毒样颗粒基因重组表达质粒pGAPZα-Cap的构建

根据NCBI网站猪圆环病毒II型Cap蛋白序列进行保守性和抗原性分析，并根据猪圆环病毒II型已知病毒样颗粒进行位点突变，设计合成猪圆环病毒 II型特异性Cap蛋白基因(SEQ ID NO:4-6任意一项)，使重组表达形成的病毒样颗粒更加稳定。将pGAPZα载体用HindⅢ和NotI双酶切，酶切体系为 50uL：HindⅢ和NotI各1uL,载体片段20uL，10X酶切buffer 5uL，ddH2O 23uL，酶切产物经过1％的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与Cap基因序列进行连接，构建10μL的连接体系：NG基因片段5.5μL， pGAPZα载体2.5μL，T4DNA连接酶0.5μL，T4 DNA连接缓冲液1μL。轻敲管壁混匀，室温连接1h，连接产物常规的化学法转化DH5α感受态细胞，用 PCR方法对阳性克隆进行鉴定。将PCR鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pGAPZα-Cap。

2、猪圆环病毒II型病毒样颗粒的重组表达

用化学法将提取筛选到的阳性克隆质粒转化到SMD1168中。用菌落PCR 方法验证Cap基因插入。通过提高Zeocin抗生素浓度，筛选出高拷贝的转化子。挑选阳性单克隆毕赤酵母菌落接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养。取过夜培养的菌液于MGY液体培养基中100倍扩大培养，30℃培养60h即得到所需病毒样颗粒。

3、病毒样颗粒的纯化

取1L毕赤酵母培养物，6000rpm，离心10min，收集上清。上清中加入硫酸铵4℃过夜沉淀，然后15000rpm4℃离心30min，沉淀用0.01MPBS 重悬，然后过夜透析出去残留的硫酸铵。

应用离子交换柱进行病毒样颗粒亲和纯化，主要操作步骤如下：

a.用20mL 0.01MPBS平衡离子交换柱，取离心过滤后上清用注射器缓慢加到离子交换层析柱中。

b.用20mL 0.01MPBS洗涤，流速控制在1mL/min左右。

c.用不同盐浓度梯度洗脱，盐浓度从150mMNaCl到1MNaCl，流速控制在1mL/min左右；收集洗脱峰部分。

d.将收集的样品进行SDS-PAGE分析。

实施例2：制备猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析检测试纸条

1、制备标记有金颗粒的SPA的金标结合物

取40nm胶体金颗粒2ml用0.1mol/L碳酸钾调节溶液调节pH至6.8，加入10ug金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，快速混匀并在3D旋转仪上室温混匀30min，然后加入终浓度1％BSA并在3D旋转混合仪上混匀30min，将金标液于4℃12000r/min离心10min，小心弃去上清液，沉淀物用0.01MPBS 缓冲液洗涤2次，再离心所得沉淀即为纯化的SPA金标复合物，制备的胶体金标记SPA用0.01MPBS重悬，4℃保存备用。

2、硝酸纤维素膜检测线和质控线喷洒及胶体金结合垫制备

将重组表达的猪圆环病毒II型病毒样颗粒用0.01MPBS稀释成2mg/ml，以1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的T线位置。将兔抗猪IgG抗体用0.01MPBS 稀释成2mg/ml，以1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的C线位置，然后放于37℃过夜烘干备用。将SPA-胶体金复合物以8uL/cm均匀喷涂在标记物垫上，37℃过夜烘干备用。

3、试纸条的组装

将样品垫、喷涂有SPA金标结合物的标记垫、喷涂有猪圆环病毒II型病毒样颗粒作为检测线和喷涂有兔抗猪IgG 作为质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬上。其组装结构为硝酸纤维素膜置于聚乙烯背衬的上面,样品垫平贴于硝酸纤维素膜左侧，吸收垫平贴于硝酸纤维素膜右侧,胶体金结合垫平贴于样品垫与硝酸纤维素膜之间，使其一端压于样品垫之下，另一端覆于硝酸纤维素膜之上。组装成的试纸条真空封装，常温保存；示意图见图1。

4、检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条的应用

取150ul待测样品液滴在本发明试纸样品垫上，10min后观察结果，同时分别取已知阳性血清样品和已知阴性血清分别作为阳性和阴性对照。结果判定：在样品垫上加入检测样品时，若检测线和质控线均显红色，为猪圆环病毒II型抗体阳性；若检测线不显色而质控线显红色，为猪圆环病毒II型抗体阴性；若质控线不显色，则试纸无效。

实施例3：胶体金免疫层析试纸条特异性试验

对己知的猪口蹄疫O型阳性血清，猪细小病毒阳性血清，猪轮状病毒阳性血清及猪瘟病毒阳性血清和猪圆环病毒II型阳性血清进行交叉试验，结果见图2。

图2结果显示，只有猪圆环病毒II型阳性血清样品，检测线显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显色，呈阴性反应，表明所述抗原用于检测猪圆环病毒II型抗体时具有高度的特异性。

实施例4：胶体金免疫层析试纸条重复性和准确性试验

将不同批次的所述免疫层析胶体金试纸分别检测5份已验证的猪圆环病毒II型抗体阳性血清和5份已验证的猪圆环病毒II型抗体阴性血清，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致且与病毒中和试验结果保持一致，表明所述胶体金免疫层析试纸条条具有良好的重复性和准确性。

实施例5：胶体金免疫层析试纸条的符合性试验

取同一批号免疫层析胶体金试纸对96份已知临床血清样本分别进行检测，观察结果并与韩国JBT ELISA检测试剂盒检测数据比较。韩国JBT ELISA 检测数据显示96份血清样品74份阳性，22份阴性，假阳性数1份，假阴性数6份，阳性符合率92.4％(73/79)，阴性符合率94％(16/17)，总符合率 92.7％(89/96)；而本研究制备的猪圆环病毒II型抗体检测试纸条检测阳性样品78份，阴性样品18份，假阴性数1份，阳性符合率98.7％(78/79)，阴性符合率100％，总符合率98.9％(95/96)，表明所述抗原用于检测猪圆环病毒II型抗体时具有良好的准确性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种猪圆环病毒II型抗原以及检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条

<130> MP1932302

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly

1 5 10 15

Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp

20 25 30

Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Phe Gly Trp Ser

35 40 45

Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys

50 55 60

Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr

85 90 95

Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile

100 105 110

Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val

115 120 125

Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln

130 135 140

Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu

145 150 155 160

Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg

165 170 175

Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro

180 185 190

Leu Asn Pro

195

<210> 2

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly

1 5 10 15

Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp

20 25 30

Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Tyr Gly Trp Ser

35 40 45

Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys

50 55 60

Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr

85 90 95

Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile

100 105 110

Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val

115 120 125

Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln

130 135 140

Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu

145 150 155 160

Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg

165 170 175

Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro

180 185 190

Leu Asn Pro

195

<210> 3

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly

1 5 10 15

Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp

20 25 30

Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Phe Tyr Trp Ser

35 40 45

Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys

50 55 60

Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr

85 90 95

Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile

100 105 110

Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val

115 120 125

Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln

130 135 140

Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu

145 150 155 160

Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg

165 170 175

Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro

180 185 190

Leu Asn Pro

195

<210> 4

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaagaaaaa atggaatatt caatacaaga ttgtcaagaa ccttcggtta tactattaag 60

agaactactg taaaaactcc ttcttgggct gtggatatga tgcgattcaa cattaacgac 120

ttccttcctc cttttggttg gtcaaatccc cgatccgttc ctttcgagta ttacagaatt 180

agaaaggtta aggttgagtt ctggccttgc agtcctatca ctcaaggaga tagaggtgtc 240

ggctcttctg ctgtcatact agacgacaat tttgttacaa aggctactgc actgacttat 300

gatccttacg ttaactacag ttcaagacat acaattactc aaccattctc ttatcattca 360

agatacttca cccctaaacc tgttcttgat tctacaatcg attacttcca accaaacaac 420

aagagaaatc aactttggtt gagacttcaa actgctggaa acgtagacca tgtaggccta 480

ggaactgctt ttgaaaatag tatttacgat caagagtata atatccgagt tacaatgtac 540

gttcaattca gggaattcaa cttgaaagat ccaccactta accca 585

<210> 5

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaagaaaga atggtatctt caacactcgt cttagtagga cctttggtta cactattaaa 60

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tttttgcctc catatggatg gtctaatccc aggtcagtgc ccttcgaata ttatagaatc 180

aggaaggtga aggtggagtt ttggccttgt tccccaatta ctcaaggaga tcgtggtgtt 240

ggttcatctg cagttattct ggatgacaat ttcgttacta aagcaacagc actgacttat 300

gatccatacg ttaattactc ttctagacac acaattactc agccttttag ttaccattcc 360

cgttacttta cacctaagcc tgttctagat tcaacgattg attattttca acctaataat 420

aagagaaacc agttatggtt gagattgcag actgctggta atgtcgatca tgttggcttg 480

ggaactgcat tcgaaaatag tatctacgat caggagtaca acattcgtgt gaccatgtat 540

gtacaattca gagagtttaa tttaaaagat ccaccattga accca 585

<210> 6

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agacgtaaaa acggtatttt caacactaga ttatcacgta ctttcggtta caccattaag 60

agaactacag ttaagacgcc cagttgggcc gtggacatga tgcgattcaa tatcaacgac 120

ttcttgcctc ctttttattg gtctaatcct cgttcagttc cattcgaata ttatagaatt 180

cgaaaggtga aggtggaatt ttggccttgt tcacctatca cacaaggtga cagaggagtc 240

ggaagtagtg cagttatctt ggatgataat tttgttacta aagctaccgc tcttacttac 300

gacccatatg ttaactactc ttctaggcat accattactc aaccattctc ttatcattcc 360

agatacttca cccctaagcc agttttggat tccactatcg attatttcca gccaaacaac 420

aaaagaaatc agttatggct gagactgcaa accgcaggca acgttgatca tgtcggacta 480

ggaaccgcat tcgaaaactc tatctatgac caagagtata acatccgtgt tacaatgtac 540

gttcaatttc gtgaattcaa cttaaaagat cctcctctaa accca 585

Claims

1.一种猪圆环病毒II型抗原，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1-3任意一项所示，经由毕赤酵母重组表达获得。

2.权利要求1所述抗原在制备检测猪圆环病毒II型抗体的免疫层析产品中的应用或在制备猪圆环病毒样颗粒中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸条。

4.一种检测猪圆环病毒II型抗体的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，以经由毕赤酵母重组表达获得的SEQ ID NO:1-3任意一项所示序列的蛋白自组装的病毒样颗粒为检测抗原。

5.根据权利要求4所述试纸条，其特征在于，包括背衬以及在背衬上依次粘贴的样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上划有包被以SEQ ID NO:1-3任意一项所示序列的蛋白自组装的病毒样颗粒的检测线。

6.根据权利要求5所述试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上划有包被兔抗猪IgG抗体的质控线。

7.根据权利要求5所述试纸条，其特征在于，所述标记物垫喷涂有胶体金颗粒标记的金黄色葡萄球菌蛋白A的复合物。

8.根据权利要求5所述试纸条，其特征在于，所述背衬为聚乙烯背衬。