CN101408548A - 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡 - Google Patents
猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101408548A CN101408548A CN 200810162445 CN200810162445A CN101408548A CN 101408548 A CN101408548 A CN 101408548A CN 200810162445 CN200810162445 CN 200810162445 CN 200810162445 A CN200810162445 A CN 200810162445A CN 101408548 A CN101408548 A CN 101408548A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcv2
- pcv1
- trace
- detection
- identification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 title claims abstract description 171
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 title description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 47
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- 238000007639 printing Methods 0.000 claims description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 8
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 8
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 8
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 7
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 7
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 6
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 27
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 101000984477 Porcine circovirus 2 Capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 101100075830 Caenorhabditis elegans mab-5 gene Proteins 0.000 description 7
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 6
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 2
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102100033195 DNA ligase 4 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101000927810 Homo sapiens DNA ligase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001001429 Homo sapiens Inositol monophosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 206010020741 Hyperpyrexia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100035679 Inositol monophosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 241001432873 Porcine circovirus 3 Species 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011999 immunoperoxidase monolayer assay Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- NIQQIJXGUZVEBB-UHFFFAOYSA-N methanol;propan-2-one Chemical compound OC.CC(C)=O NIQQIJXGUZVEBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHZKGHQGPXBWSN-UHFFFAOYSA-N methyl(propan-2-yloxy)phosphinic acid Chemical compound CC(C)OP(C)(O)=O GHZKGHQGPXBWSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 208000028489 postweaning multisystemic wasting syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 propylene glucosan Chemical compound 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡适用于猪PCV2感染快速鉴别检测。其反应试剂载体吸附层包括纤维层，金标纤维层，纤维素膜层和吸水材料层；金标纤维层为吸附胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体的金标玻璃棉，纤维素膜层为依次印制检测印迹T1、T2和对照印迹C的硝酸纤维素膜；检测印迹T1为识别PCV1型特异性抗原表位的单克隆抗体溶液印制的条状PCV1检测印迹；T2为识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的条状PCV检测印迹，对照印迹C为抗小鼠IgG多克隆抗体溶液印制的条状对照印迹。试纸卡特异性强，敏感性高，简便快速，检测结果形象直观，在生产实践中易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是目前发现的最小的动物病毒，病毒粒子直径约17nm，为共价闭合，环状，单股DNA病毒，具有两种基因型：猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1无致病性，但广泛存在于猪体内和猪源传代细胞系，其基因组全长1759nt或1758nt，PCV2对猪有致病性，是引发一系列猪圆环病毒病(porcine circovirusdiseases，PCVD)，特别是断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)的主要病原，导致猪群免疫抑制，给养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2基因组全长1768nt或1767nt，目前已知PCV2 ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2编码PCV2免疫相关的衣壳蛋白，ORF3编码与PCV2复制无关、与致病性有关的蛋白。最近，我们从疑似猪“高热症”患猪中分离鉴定一种基因组全长1766nt的新的PCV2毒株(1766PCV2)。1766PCV2在1059位缺失一个核苷酸G，引起ORF2 C末端密码子移位，使得1766PCV2缺失1767PCV2的特异性抗原表位。该特征性抗原表位可作为血清学标志，用于1766PCV2、1767PCV2和1768PCV2的抗原分型鉴定。
目前，国内外采用的PCV2抗原和抗体检测技术主要有：病毒分离培养，间接免疫荧光(IFA)，免疫酶单层试验(IMPA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，原位杂交(ISH)，聚合酶链式反应(PCR)等等。上述技术和方法虽然可以检测PCV2病毒，在实践中也取得一定的效果，但均无法实现以PCV2抗原亚型的鉴别诊断，并且存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，常限于实验室内进行，很难在基层普及和推广。因此，在分析鉴定PCV2亚型抗原表位特征的基础上，研制开发适用于养殖基层的快捷、简便的PCV1和PCV2鉴别诊断和抗原分型检测器具，对诊断、监控猪群PCV2感染，有效控制PCVD的发生和危害有重要意义。
发明内容
本发明的目的是：提供一种适用于猪PCV1和PCV2感染快速鉴别检测和PCV2抗原亚型鉴定的试纸卡，在生产实践中易于推广应用。
本发明的PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡，包括用不吸水薄片条制成的支撑层1，反应试剂载体吸附层固定在支撑层1上，从样品端11到手柄端12的反应试剂载体吸附层依次为：纤维层2，金标纤维层3，纤维素膜层4和吸水材料层5；金标纤维层3为吸附胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体的金标玻璃棉，纤维素膜层4为从样品端11至手柄端12依次印制检测印迹T1 6、检测印迹T2 7和对照印迹C 8的硝酸纤维素膜，试纸卡固定在塑料卡10内，在样品端11设有加样孔9；检测印迹T1 6为以识别PCV1型特异性抗原表位的单克隆抗体溶液在纤维素膜上印制的条状PCV1检测印迹；检测印迹T2 7为以识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的条状PCV检测印迹，对照印迹C 8为以抗小鼠IgG多克隆抗体溶液印制的条状对照印迹，上述3条印迹按序平行排列。
本发明的PCV2亚型鉴定检测试纸卡，包括用不吸水薄片条制成的支撑层1，反应试剂载体吸附层固定在支撑层1上，从样品端11到手柄端12的反应试剂载体吸附层依次为：纤维层2，金标纤维层3，纤维素膜层4和吸水材料层5，金标纤维层3为吸附胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体的金标玻璃棉，纤维素膜层4为从样品端11至手柄端12依次印制检测印迹T1 6、检测印迹T2 7和对照印迹C 8的硝酸纤维素膜，试纸卡固定在塑料卡10内，在样品端11设有加样孔9；检测印迹T1 6为以识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液在纤维素膜上印制的1767亚型条状检测印迹，检测印迹T2 7为以识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的1766和1767亚型条状检测印迹，对照印迹C 8为以抗小鼠IgG多克隆抗体溶液印制的条状对照印迹，上述3条印迹按序平行排列。
以上方案详述如下：
PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡含有支撑层和反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片条，反应试剂载体吸附层粘贴于支撑层上，由样品端到手柄端依次为纤维层、金标纤维层、纤维素膜层和吸水材料层，纤维素膜层为从样品端至手柄端依次印制检测印迹T1，检测印迹T2和对照印迹C的硝酸纤维素膜，试纸卡固定在塑料卡内，在样品端设有加样孔。
支撑层的不吸水薄片条可用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸条，纤维层可用玻璃棉，吸水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，金标纤维层可用吸附金标蛋白玻璃棉，简称金标玻璃棉，金标蛋白为胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb1，PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的检测印迹T1为以识别PCV1型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2溶液在纤维素膜上印制的PCV1检测印迹“|”，检测印迹T2为以识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3溶液印制的PCV检测印迹“|”，对照印迹C为以抗小鼠IgG多克隆抗体pAb溶液印制的对照印迹C“|”，其组合排列为“|||”；PCV2亚型鉴定检测试纸卡的检测印迹T1为以识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4溶液在纤维素膜上印制的1767亚型检测印迹“|”，检测印迹T2为以识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb5溶液印制的1766和1767亚型检测印迹“|”，对照印迹C为以抗小鼠IgG多克隆抗体pAb溶液印制的对照印迹“|”，其组合排列为“|||”。
试纸卡具有下列各项优点：
(1)特异性强，敏感性高。PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡以高亲和力单克隆抗体为基础制备而成，抗衣壳蛋白单克隆抗体分别特异性识别PCV1和PCV2共同抗原表位，PCV1型特异性抗原表位，以及PCV2亚型特异性抗原表位，有效区分PCV不同抗原型和抗原亚型，有高度的特异性。
(2)操作简便快速。使用PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡检测PCV，能有效鉴别检测PCV1和PCV2感染，并进行PCV2抗原亚型鉴定，在5-10分钟内即可判定检测结果。
(3)显示检测结果形象、直观准确。PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡以红棕色“|”，“||”或“|||”作为阴性，抗原型和抗原亚型检测标记，通过PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡可鉴别检测PCV1和PCV2感染，即在PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡上显示一条棕红色“|”印迹表示在被检测样品中未检出PCV病毒，两条棕红色“||”印迹表示被检样品PCV2病毒阳性，三条棕红色“|||”印迹表示被检样品PCV1病毒阳性；与PCV2亚型鉴定试纸卡的组合检测，可进一步鉴定PCV2的抗原亚型，即在PCV2亚型鉴定试纸卡上显示一条棕红色“|”印迹表示被检测样品中的PCV2病毒为1768抗原亚型，两条棕红色“||”印迹表示被检样品中的PCV2病毒为1766抗原亚型，三条棕红色“|||”印迹表示被检样品中的PCV2病毒为1767抗原亚型，试纸卡无显色印迹则表示检测失败或试纸卡失效，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(4)成本低，投资少。PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡可在检测现场完成操作，检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
本发明有益的积极效果是：操作简单，普通技术人员可以操作，能满足各种需要，如疫病诊断、疫病监测、口岸检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1是PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡结构示意图。图中，1.支撑层，2.样品端的纤维层，3.金标纤维层(金标玻璃棉)，4.纤维素膜层，5.手柄端的吸水材料层，6.检测印迹T1，7.检测印迹T2，8.对照印迹C，9.加样孔，10.塑料卡，11.样品端，12.手柄端。
图2是PCV1和PCV2鉴别检测结果图。图中，1为PCV阴性，2为PCV2阳性，3为PCV1阳性，4为检测失败或试纸卡失效。
图3是PCV2抗原亚型鉴定检测结果图。图中，1为1768亚型PCV2，2为1766亚型PCV2，3为1767亚型PCV2，4为检测失败或试纸卡失效。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进一步描述。
PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡可应用于猪PCV1和PCV2的鉴别检测以及PCV2抗原亚型鉴定。制备PCV2鉴别检测和抗原亚型鉴定检测试纸卡，首先需制备衣壳蛋白重组蛋白，进而制备抗衣壳蛋白单克隆抗体，筛选获得识别PCV1和PCV2共同抗原表位，PCV1型特异性抗原表位，1767亚型特异性抗原表位，以及1766和1767共同抗原表位的单克隆抗体，其次需制备羊抗小鼠IgG多克隆抗体，分别用于制备PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡的金标玻璃棉，PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的PCV检测印迹T2，PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的PCV1检测印迹T1，PCV2亚型鉴定检测试纸卡的1767亚型检测印迹T1，PCV2亚型鉴定检测试纸卡的1766和1767亚型检测印迹T2，以及两个试纸卡的对照印迹C。
实施例1衣壳蛋白重组蛋白的制备
用基因工程技术高效表达PCV1和PCV2衣壳蛋白，制备衣壳蛋白重组蛋白。根据PCV1分离株(GenBank No.AY193712)和1767PCV2分离株HZ0201(GenBank No.AY188355)全基因序列，分别设计PCV1和PCV2衣壳蛋白特异性引物，PCV1上游引物为PV1up：5’-GCGGATCCACGGGTATCTTCAATTC-3’，含BamHI酶切位点，PCV1下游引物为PV1down：5’-CCGCTCGAGTTATTTATTTAGAGGGTC-3’，含XhoI酶切位点，PCV2上游引物为pG1：5’-GCGGATCCAATGGCATCTTCAACAC-3’，含BamHI酶切位点；PCV2下游引物pG2：5’-CCGCTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGG-3’，含XhoI酶切位点。分别以PCV1和PCV2病毒DNA为模板，扩增573bp和579bp的去核定位信号衣壳蛋白基因，反应条件为：95℃预变性5min后，按95℃ 30s，58或61℃30s，72℃ 45s进行30个循环，最后72℃再延伸10min。PCR产物经BamHI和XhoI双酶切，分别连接到原核表达载体pET-28a和pGEX-4T-1的谷胱甘肽-S-转移酶基因(GST)下游BamHI和XhoI位点间，转化E.coli Top10感受态细胞，涂布于含100g/mL卡那霉素(Kan)或氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37℃培养16h，挑取单克隆菌落，碱裂解法抽提重组质粒，以PCR和双酶切鉴定阳性克隆，经序列测定验证鉴定。经PCR和酶切鉴定，构建重组表达质粒pET-PCV1-dCap和pGEX-PCV2-dCap，其中PCV2衣壳蛋白在N端与GST融合。分别将重组表达质粒pET-PCV1-dCap和pGEX-PCV2-dCap转化表达菌E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21，挑选单克隆接入5mL含100g/mL Kan或Amp)的LB培养基中，37℃、250r/min振荡培养10h，然后按1∶100转接500mL LB(100g/mL Kan)或2×YTA(100g/mL Amp)的培养基，37℃、250r/min振荡培养3h至A600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG在37℃诱导表达4h，4℃4000r/min离心10min收集诱导表达菌体。
利用QIAGEN公司的Ni-NTA亲和纯化柱，在变性条件下采用pH值梯度洗脱法纯化PCV1重组His-dCap蛋白，主要步骤如下：将收集的菌体沉淀称量，按8mL/g菌体沉淀的比例重悬于缓冲液B(100mM NaH2PO4，10mM Tris·Cl，8 M urea，pH8.0)中，在室温下轻微振荡45～60min(避免气泡产生)，400 W超声波击打30次，12000rpm，4℃离心30min，取上清加入到含2 mLNi-NTA填料的经缓冲液B平衡的纯化柱中，封闭纯化柱，200r/min，37℃振荡30min，使重组蛋白和Ni2+-NTA固相充分结合后，之后让纯化柱垂直放置，待Ni-NTA填料沉积后，将纯化柱用10mL缓冲液C(100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8 M urea，20mMimidazol，pH6.3)洗脱2次后，再用10mL buffer D(100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8 M urea，pH5.9)洗脱2次，最后用10mL缓冲液E(100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8 M urea，pH 4.5)洗脱目的蛋白，收集洗脱液进行SDS-PAGE鉴定。采用BCA法测定纯化His-dCap蛋白含量，计算表达量。结果显示，含pET-PCV1-dCap重组质粒的表达菌成功表达分子量为28kDa的PCV1 His-dCap蛋白，其表达量为36mg/L培养物，可用于制备抗衣壳蛋白单克隆抗体。
采用GSTrap FF亲和层析柱(Amersham公司)在天然条件下纯化PCV2 GST-dCap蛋白，主要步骤为：按每毫升培养菌液加入50μL 4℃预冷的Binding buffer(140mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，pH 7.3)将收集的细菌沉淀重新悬浮，超声波裂解破碎(0.2-0.3kw，120次)直至菌液呈均一、半透明状或云雾状消失；加入终浓度为1％的Triton X-100，冰上振荡混匀30min，4℃、12000rpm离心30min，取上清液进一步用0.45μm滤器过滤。取上清过用Binding buffer预平衡的GSTrap FF纯化柱，流速为0.5mL/min(中间不能引入气泡)。用20-30倍柱床体积Binding buffer洗涤柱子(流速为1mL/min)，用10倍柱床体积的Elution buffer(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L reducedglutathione，pH 8.0)洗脱(流速为1mL/min)，或者用80U凝血酶(Thrombin)柱上酶解PCV2GST-dCap融合蛋白，纯化重组的dCap蛋白，用eppendorf管收集洗脱液，每管1.0mL，取样作SDS-PAGE分析，并用Bradford法测蛋白含量，计算表达量。结果显示，含pGEX-PCV2-dCap重组质粒的表达菌成功表达分子量为48kDa的GST-dCap融合蛋白，其表达量为6.14mg/L培养物，可用于制备抗衣壳蛋白单克隆抗体。
实施例2抗衣壳蛋白单克隆抗体的制备与筛选
分别将重组PCV1和PCV2衣壳蛋白与弗氏佐剂等量混合，充分乳化，以50g-100g/只免疫BALB/c系小鼠3次，每次间隔15-30天；第3次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5-10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与2-5×107的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清，在37℃的水浴中将0.7-1ml的40％-50％PEG 4000(pH8.5-9.0)缓缓加入细胞，温育1min后，缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100 1-200 l/孔)，置37℃ 5％CO2培养箱中培养。培养7-10天后，分别用5g-10g/ml的PCV1和PCV2衣壳蛋白重组蛋白包被96孔酶标板，以ELISA检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(OD492＝0.8以上)，经连续3次的有限稀释法克隆化，建立杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞腹腔注射经降植烷致敏一周的BALB/c系小鼠，每只小鼠注射5×105个细胞，诱生小鼠腹水，制备抗衣壳蛋白单克隆抗体。所建立的25株杂交瘤细胞株染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体特异识别PCV1和/或PCV2衣壳蛋白，与GST及其它菌体蛋白不发生交叉反应，亲和力常数达10-9，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1，IgG2a，IgG2b或IgG3。
实施例3 抗衣壳蛋白单克隆抗体的筛选
以间接免疫荧光(IFA)对所制备的25株抗衣壳蛋白单克隆抗体进行筛选和鉴定。分别将PCV1分离株，1768PCV2分离株，1767PCV2分离株和1766PCV2分离株按1∶10接种胰酶消化的无PCV污染的PK-15细胞，将病毒细胞混合液加入96孔细胞培养板，每孔100μL，37℃ 5％CO2培养96h，加入1∶1混合的甲醇丙酮固定液100μL，-20℃固定20min。将固定液弃去，自然干燥。用5％的脱脂奶粉封闭1h，每孔加入待检杂交瘤细胞上清100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤5次，加入1∶400稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG 50μL，37℃孵育40min，PBST洗涤5次。加入50μL PBS，用倒置荧光显微镜观察阳性细胞，筛选识别不同PCV基因型和抗原亚型的单克隆抗体。经IFA检测和筛选，单克隆抗体3F6和4C3均能识别感染PK-15细胞的PCV1，1768PCV2，1767PCV2和1766PCV2病毒粒子，为识别PCV1和PCV2共同抗原表位的单克隆抗体mAb1和mAb3，单克隆抗体3F11特异性识别感染PK-15细胞的PCV1病毒粒子，而不与1768PCV2，1767PCV2和1766PCV2感染细胞反应，为识别PCV1型特异性抗原表位的单克隆抗体mAb2，单克隆抗体8A12仅特异性识别感染PK-15细胞的1767PCV2病毒粒子，而不与其他三株病毒感染细胞反应，为特异识别1767PCV2亚型单克隆抗体mAb4，单克隆抗体6H9识别感染PK-15细胞的1767PCV2和1766PCV2病毒粒子，但不与1768PCV2和PCV1感染细胞反应，为识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的单克隆抗体mAb5，上述识别PCV1和PCV2共同抗原表位，PCV1型特异性，1767PCV2亚型特异性，以及1766PCV2和1767PCV2共同抗衣壳蛋白单克隆抗体分别用于制备PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测的金标玻璃棉，PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的检测印迹T2，PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的检测印迹T1，以及PCV2亚型鉴定检测试纸卡的1767亚型检测印迹T1，PCV2亚型鉴定检测试纸卡的1767亚型和1766亚型检测印迹T2的印制。
实施例4抗衣壳蛋白单克隆抗体识别抗原表位的鉴定
以合成多肽分析鉴定抗衣壳蛋白单克隆抗体识别的抗原表位。根据PCV2 HZ0201衣壳蛋白的氨基酸序列，设计由18肽组成的氨基酸重叠多肽片段，每条肽之间重叠8个氨基酸，移位10个氨基酸(aa)，跨越PCV2衣壳蛋白氨基酸位25-233(未包含核定位信号NLS中的前24个氨基酸)，共计20条肽，于每条肽N端加一半胱氨酸Cys，用于载体蛋白偶联，所设计多肽由上海波泰生物技术有限公司合成，每条合成多肽10mg，纯度大于90％，冻干保存。
用无菌的蒸馏水或去离子水、无氧水溶解冻干多肽，浓度为1mg/ml，应用异型双功能试剂Sulfo-SMCC(分子量436.37，美国Pierce公司产品)通过多肽N端Cys上的-SH基团与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，步骤为：1)称量4mg BSA，溶于500μl偶联缓冲液(0.1 Mphosphate，0.15M NaCl，1mM EDTA，pH 7.2)；2)加入1mg Sulfo-SMCC于载体蛋白溶液；3)RT孵育60min或37℃孵育30min，并不时混匀；4)对偶联缓冲液充分透析，以除去多余的偶联剂，用偶联缓冲液调整蛋白浓度为5mg/ml；5)取20μl(100μg)Sulfo-SMCC活化的载体蛋白，加入N末端含Cys的溶解多肽100μg，充分混匀，于4℃孵育4h或过夜，完成偶联反应，4℃保存备用。
采用Peptide-ELISA分析抗衣壳蛋白单克隆抗体识别的抗原表位。以50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.6)作包被液稀释BSA偶联多肽至1μg/ml，包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次；用5％的脱脂奶PBS封闭酶标板，200μl/孔，37℃封闭3h，PBST洗涤3次；加入用5％的脱脂奶1∶500-1000稀释的抗衣壳蛋白单克隆抗体，100μl/孔，重复3个孔，37℃孵育1.5h，PBST洗涤6次；加入1∶10000稀释的HRP羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤6次；加入TMB显色溶液100μl，室温孵育10min，观察显色结果，每孔加入50μl 2M硫酸溶液终止反应，在酶标仪上读取450nm吸收值。对于Peptide-ELISA阳性多肽，进一步设计合成系列截短多肽，偶联于载体蛋白BSA，同上以Peptide-ELISA分析截短多肽与相应单克隆抗体的反应性，精确定位所获得抗衣壳蛋白单克隆抗体识别的抗原表位。合成多肽的抗原表位分析结果表明，单克隆抗体mAb1识别的PCV1和PCV2共同抗原表位为PCV1和PCV2衣壳蛋白的156YHSRYFT162，单克隆抗体mAb2识别的PCV1型特异性抗原表位为PCV1衣壳蛋白的92LPFQYYRIRKVK103，单克隆抗体mAb3识别的PCV1和PCV2共同抗原表位为PCV1和PCV2衣壳蛋白的175QPNNKRNQLWLRLQTAGN192，单克隆抗体mAb4识别的1767PCV2亚型特异性抗原表位为PCV2衣壳蛋白C末端226LKDPPLNP233，是1767PCV2新的血清学标志，单克隆抗体mAb5不能识别PCV2衣壳蛋白的任何一条合成多肽，表明该单克隆抗体识别的1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位为构象型抗原表位。
实施例5抗小鼠IgG多克隆抗体的制备
采取小鼠血液，分离血清，以辛酸-硫酸铵法粗提小鼠血清IgG，并用Superdex 200凝胶层析进行纯化。首先用4倍血清体积的0.06M pH4.8醋酸缓冲液稀释血清，以1M NaOH调pH至4.5；在室温下边搅拌边逐滴加入辛酸，每毫升血清加入25μL辛酸，4℃静置2h，12000r/min离心30min，取上清；在溶液中加10倍体积磷酸盐缓冲液PBS，用5M NaOH调pH至7.4，冰浴至4℃；按每毫升混合液加0.277g硫酸铵并搅拌30min，4℃静置4h，12000r/min离心30min，弃上清；沉淀以0.05M PBS pH7.4重悬于，透析除盐，直至用BaCl2检测无白色沉淀为止，用PEG8000进行浓缩。利用GE公司AKAT purifier蛋白纯化系统以Hiload16/60 Superdex 200 prep pg凝胶过滤预装柱纯化粗提的小鼠IgG。用0.22μm滤器过滤粗提的小鼠血清IgG溶液，并经超声波除气；将Hiload 16/60 Superdex 200 prep pg凝胶过滤预装柱与AKAT purifier蛋白纯化系统相连接，先用ddH2O清洗柱子，接着用含0.15M NaCl的0.05M磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0)平衡柱子，流速为2mL/min，直至UV280的吸光值和电导值基线稳定，平衡柱子时要清洗各阀位。将过滤的猪血清IgG样品用注射器(上样前注意排空注射器里的气泡，以免损害柱子)注入样品环中，设置洗脱速度和报警压，进行上样和洗脱，流速为1mL/min。观察UV280值基线的变化，收集紫外吸收峰的洗脱峰，每管收集2mL，SDS-PAGE电泳检测脱蛋白，合并收集液，装入透析袋，放入PEG8000中浓缩，用Nanodrop 1000分光光度仪测OD280和OD260吸光值，并根据公式计算IgG含量：蛋白含量(mg/mL)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数，测得小鼠IgG的蛋白含量为12.0mg/mL，用于羊抗小鼠IgG多克隆抗体的制备。
以50～100μg/kg体重的小鼠IgG蛋白加弗氏佐剂充分乳化，经皮下和肌肉注射免疫健康山羊3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸铵法粗提免疫山羊血清IgG，并用Superdex 200凝胶层析进行纯化，不重述。所制备的抗小鼠IgG多克隆抗体用于PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡对照印迹的印制。
实施例6金标玻璃棉的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在沸腾的50-100ml 0.01-0.05％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L K2CO3调胶体金pH至8.5-9.5，以1∶1000-1∶1300的标记比将待标记的单克隆抗体mAb1加入pH8.5-9.5金溶胶中，标记10min后，加20％PEG 10000至终浓度0.05％，4℃ 1500-3000g离心20min，除去未结合的金颗粒，4℃ 15000g离心1h，弃上清，获初步纯化金标蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得胶体金标记的抗PCV2衣壳蛋白单克隆抗体。将1∶100-1∶1500稀释的胶体金标记蛋白吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡的金标玻璃棉。
实施例7 PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡的实施结构
PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡的实施结构参见图1，图中，1为支撑层用不吸水薄片条，实施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由2，3，4，5，组合而成，从样品端2开始，到手柄端5依次粘贴在支撑层1上面；其中2为样品端纤维层，实施中可使用玻璃纤维棉简称玻璃棉，3为吸附金标蛋白的纤维层，金标蛋白为胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb1，可采用精制玻璃纤维棉，简称为金标玻璃棉，4为纤维素膜层，实施中可采用硝酸纤维素膜，5为手柄端吸水材料层，采用吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，2，3，4，5各层彼此之间交界处纤维互相交叉渗透；PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的6为用识别PCV1型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2溶液在纤维素膜上印制的PCV1检测印迹T1“|”，7为用识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3溶液印制的PCV检测印迹T2“|”，PCV2亚型鉴定检测试纸卡的6为识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4溶液在纤维素膜上印制的1767亚型检测印迹T1“|”，7为用识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb5溶液印制的1766和1767亚型检测印迹T2“|”，8为用抗小鼠IgG多克隆抗体pAb溶液印制的对照印迹C“|”，在纤维素膜上的检测印迹T1，检测印迹T2和对照印迹C组合排列为“|||”，9为样品溶液的加样孔，10为塑料卡，11为样品端，12为手柄端。
实施例8 PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡实施检测的反应原理
PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的反应原理为：待检测样品溶液加入样品孔后，待检溶液通过虹吸带动待检抗原与金标蛋白一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在扩散过程中PCV1或PCV2病毒抗原与胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb1相结合，形成金标蛋白-抗原复合物，该复合物可与检测印迹T1中的识别PCV1型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2相结合，生成红棕色“|”标记，同时也可与检测印迹T2中的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3结合，生成另一条红棕色“|”标记，部分未与抗原结合的金标蛋白不能与检测印迹结合而继续扩散，在纤维膜上与对照印迹C中的抗小鼠IgG多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，三种标记组合叠加，形成三条红棕色阳性标记“|||”，代表样品为PCV1病毒阳性；同理，样品中的PCV2病毒抗原与胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb1相结合形成金标蛋白-抗原复合物，但该复合物不能与检测印迹T1中的识别PCV1型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2结合，不能形成红棕色标记，复合物继续扩散与检测印迹T2中的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3相结合，生成红棕色“|”标记，部分未与抗原结合的金标蛋白不能与检测印迹结合而继续扩散，在纤维膜上与对照印迹C中的抗小鼠IgG多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，从而形成两条红棕色阳性标记“||”，代表样品为PCV2病毒阳性，而PCV1病毒阴性；如果样品溶液中既不含PCV1病毒，又不含PCV2病毒，则没有金标蛋白-抗原复合物形成，不能与检测印迹T1或T2结合，只有金标蛋白与对照印迹C相结合，生成一条红棕色标记“|”，代表样品为PCV1和PCV2病毒阴性。如果纤维素膜上没有红棕色标记显现，则表明检测失败或PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡失效。
PCV2亚型鉴定检测试纸卡检测的反应原理为：待检测样品溶液加入样品孔后，待检溶液通过虹吸带动待检抗原与金标蛋白一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在扩散过程中PCV2病毒抗原与胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb1相结合，形成金标蛋白-抗原复合物，1767PCV2形成的复合物与检测印迹T1中的识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4相结合，生成红棕色“|”标记，同时也与检测印迹T2中的识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb5结合，生成另一条红棕色“|”标记，部分未与抗原结合的金标蛋白不能与检测印迹结合而继续扩散，在纤维膜上与对照印迹C中的抗小鼠IgG多克隆抗体pAb相结合，生成红棕色标记“|”，三种标记组合叠加，形成三条红棕色阳性标记“|||”，代表样品中PCV2病毒的抗原亚型为1767亚型；同理，1766PCV2形成的金标蛋白-抗原复合物不能与检测印迹T1中的识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4识别，不能形成红棕色标记，复合物继续扩散与检测印迹T2中的识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb5相结合，生成红棕色“|”标记，部分未与抗原结合的金标蛋白不能与检测印迹结合而继续扩散，在纤维膜上与对照印迹C中的抗小鼠IgG多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，从而形成两条红棕色阳性标记“||”，代表样品中PCV2病毒的抗原亚型1766亚型；而1768PCV2形成的金标蛋白-抗原复合物既不能与检测印迹T1中的识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4结合，也不能与检测印迹T2中的识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb5识别，因此两条检测印迹均不能形成红棕色检测标记，只能形成一条对照印迹C标记“|”，代表样品中PCV2病毒的抗原亚型为1768亚型。如果纤维素膜上没有红棕色标记显现，则表明检测失败或PCV2分型试纸卡失效。
实施例9 PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡检测的实例操作方法
采集待检猪淋巴结或脾脏，以样品稀释液或生理盐水1∶5倍稀释，充分研磨，制备样品溶液。取50μl样品溶液分别加入PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡，水平放置约2-5分钟，检测结果见图2和图3。PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡的显现一条红棕色标记“|”为PCV阴性，显现两条红棕色标记“||”为PCV2阳性而PCV1阴性，显现三条红棕色标记“|||”为PCV1阳性，如果PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡没有标记显示，则表明检测失败或试纸卡失效(图2)；当PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡显现两条红棕色标记“||”时，PCV2亚型鉴定检测试纸卡显现一条红棕色标记“|”表示PCV2的抗原亚型为1768亚型，显现两条红棕色标记“||”表示PCV2的抗原亚型为1766亚型，显现三条红棕色标记“|||”表示PCV2的抗原亚型为1767亚型，如果PCV2分型试纸卡没有标记显示，则表明检测失败或试纸卡失效(图3)。
序列表：
<110>浙江大学
<120>猪圆环病毒PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡
<160>4
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PCV1上游引物PV1up
<400>1
GCGGATCCAC GGGTATCTT CAATTC
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PCV1下游引物PV1down
<400>2
CCGCTCGAGT TATTTATTTA GAGGGTC
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PCV2上游引物pG1
<400>3
GCGGATCCAA TGGCATCTTC AACAC
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PCV2下游引物pG2
<400>4
CCGCTCGAGT TAAGGGTTAA GTGGG
Claims (1)
1.PCV1和PCV2鉴别检测试纸卡，包括用不吸水薄片条制成的支撑层(1)，反应试剂载体吸附层固定在支撑层(1)上，从样品端(11)到手柄端(12)的反应试剂载体吸附层依次为：纤维层(2)，金标纤维层(3)，纤维素膜层(4)和吸水材料层(5)，其特征在于：金标纤维层(3)为吸附胶体金标记的识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体的金标玻璃棉，纤维素膜层(4)为从样品端(11)至手柄端(12)依次印制检测印迹T1(6)、检测印迹T2(7)和对照印迹C(8)的硝酸纤维素膜，试纸卡固定在塑料卡(10)内，在样品端(11)设有加样孔(9)；检测印迹T1(6)为以识别PCV1型特异性抗原表位的单克隆抗体溶液在纤维素膜上印制的条状PCV1检测印迹；检测印迹T2(7)为以识别PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的条状PCV检测印迹，对照印迹C(8)为以抗小鼠IgG多克隆抗体溶液印制的条状对照印迹，上述3条印迹按序平行排列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200810162445 CN101408548B (zh) | 2008-11-13 | 2008-11-13 | 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200810162445 CN101408548B (zh) | 2008-11-13 | 2008-11-13 | 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101408548A true CN101408548A (zh) | 2009-04-15 |
| CN101408548B CN101408548B (zh) | 2013-07-03 |
Family
ID=40571646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200810162445 Expired - Fee Related CN101408548B (zh) | 2008-11-13 | 2008-11-13 | 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101408548B (zh) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101871939A (zh) * | 2010-07-09 | 2010-10-27 | 北京易斯威特生物医学科技有限公司 | 检测试剂盒及其应用方法 |
| CN104593526A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-05-06 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种用于猪圆环病毒检测的方法及引物组 |
| CN107478836A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-12-15 | 哈尔滨医科大学 | 一种同时检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒及其制备方法和用途 |
| CN108761098A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-11-06 | 河南中泽生物工程有限公司 | 致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法 |
| CN109142725A (zh) * | 2018-08-29 | 2019-01-04 | 陕西省人民医院 | 一种甲型通用及h7n9亚型流感病毒胶体金联合检测试纸的制备方法 |
| CN110903356A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-24 | 中国农业大学 | 一种猪圆环病毒ii型抗原以及检测猪圆环病毒ii型抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
| CN111693693A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-22 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法 |
| CN113092787A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-07-09 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种绵羊乳蛋白和山羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN113311155A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-08-27 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN113311156A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-08-27 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN116875621A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-10-13 | 浙江大学 | 一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109425738B (zh) * | 2017-09-01 | 2022-01-28 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1584599A (zh) * | 2004-06-15 | 2005-02-23 | 浙江大学 | 猪圆环病毒2型抗原或抗体检测试纸条 |
| CN2911690Y (zh) * | 2006-06-07 | 2007-06-13 | 浙江大学 | 猪圆环病毒2型抗原或抗体检测试纸条 |
-
2008
- 2008-11-13 CN CN 200810162445 patent/CN101408548B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101871939B (zh) * | 2010-07-09 | 2014-09-10 | 北京易斯威特生物医学科技有限公司 | 检测试剂盒及其应用方法 |
| CN101871939A (zh) * | 2010-07-09 | 2010-10-27 | 北京易斯威特生物医学科技有限公司 | 检测试剂盒及其应用方法 |
| CN104593526A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-05-06 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种用于猪圆环病毒检测的方法及引物组 |
| CN104593526B (zh) * | 2015-02-05 | 2017-10-27 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种用于猪圆环病毒检测的方法及引物组 |
| CN107478836A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-12-15 | 哈尔滨医科大学 | 一种同时检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒及其制备方法和用途 |
| CN108761098A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-11-06 | 河南中泽生物工程有限公司 | 致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法 |
| CN109142725A (zh) * | 2018-08-29 | 2019-01-04 | 陕西省人民医院 | 一种甲型通用及h7n9亚型流感病毒胶体金联合检测试纸的制备方法 |
| CN110903356B (zh) * | 2019-12-16 | 2021-07-13 | 中国农业大学 | 一种猪圆环病毒ii型抗原以及检测猪圆环病毒ii型抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
| CN110903356A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-24 | 中国农业大学 | 一种猪圆环病毒ii型抗原以及检测猪圆环病毒ii型抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
| CN111693693A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-22 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法 |
| CN111693693B (zh) * | 2020-06-29 | 2022-03-04 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法 |
| CN113092787A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-07-09 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种绵羊乳蛋白和山羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN113311155A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-08-27 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN113311156A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-08-27 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN113092787B (zh) * | 2021-04-09 | 2022-07-19 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种绵羊乳蛋白和山羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN113311155B (zh) * | 2021-04-09 | 2022-11-29 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN113311156B (zh) * | 2021-04-09 | 2022-11-29 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 |
| CN116875621A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-10-13 | 浙江大学 | 一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法 |
| CN116875621B (zh) * | 2023-07-18 | 2024-03-29 | 浙江大学 | 一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101408548B (zh) | 2013-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101408548B (zh) | 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡 | |
| CN104198703B (zh) | 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN104198710B (zh) | 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人肺炎衣原体IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 | |
| CN104181301B (zh) | 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 | |
| CN101339192A (zh) | 一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条 | |
| CN109187967B (zh) | 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法 | |
| CN104725490A (zh) | 猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒 | |
| CN103048459A (zh) | 检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 | |
| CN105203768A (zh) | 基于磁性分离和量子点标记的人肺炎支原体快速检测方法和试剂盒 | |
| CN105319359A (zh) | 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN106632691A (zh) | Hiv重组抗原、表达基因、表达载体以及hiv检测试剂盒 | |
| CN102426242B (zh) | J亚群禽白血病病毒快速检测试纸卡及应用 | |
| CN103472225A (zh) | 一种用于检测猪圆环病毒2型的荧光免疫试剂盒 | |
| CN101413950B (zh) | 猪圆环病毒2型抗原亚型鉴定试纸卡 | |
| CN104181302B (zh) | 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人肺炎链球菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 | |
| CN101413949A (zh) | 猪圆环病毒pcv2亚型鉴定试纸卡 | |
| CN104181306B (zh) | 基于磁性分离和多色量子点标记的抗卡他莫拉菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 | |
| CN103235127A (zh) | 马立克氏病病毒快速检测试纸条 | |
| CN105777900A (zh) | 果斑病菌单抗及其杂交瘤细胞株 | |
| CN101363865A (zh) | 一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用 | |
| CN105277713B (zh) | 基于磁性分离和量子点标记的人肺炎链球菌快速检测方法和试剂盒 | |
| CN103217527B (zh) | 马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒快速联检试纸条 | |
| CN103235128B (zh) | 禽网状内皮组织增生病病毒和j亚群禽白血病病毒快速联检试纸条 | |
| CN100535664C (zh) | 禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST-ELISA检测方法 | |
| CN102507946B (zh) | J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20090415 Assignee: ZHEJIANG EBVAC BIOTECH Co.,Ltd. Assignor: ZHEJIANG University|Zhejiang Tongdian Biotechnology Co.,Ltd. Contract record no.: 2015330000175 Denomination of invention: Porcine circovirus PCV1 and PCV2 identifying and detecting test paper card Granted publication date: 20130703 License type: Common License Record date: 20150624 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130703 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |