CN101871939A - 检测试剂盒及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测试剂盒，包括样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、反应支持物，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次连接并均设置在所述反应支持物上，所述结合物垫含有示踪物标记的生物活性原料A，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带设置于靠近所述结合物垫的一侧并含有生物活性原料B，所述质控条带设置于远离结合物垫的一侧并含有生物活性原料C，所述检测试剂盒还包括设置在所述样品垫上并与所述样品垫连通的样品处理单元，所述样品处理单元包括能够过滤样品的样品处理垫和吸附有生物活性原料D的渗透滤膜，所述生物活性原料D能够吸附所述样品中的待测物。本发明使得样品的待测物浓度通过样品处理单元的处理后降低一个水平，通过控制该水平的具体值，可以通过判断是否显色达到更敏感地待测物浓度是否在某个水平之上。

Description

检测试剂盒及其应用方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域的一种快速检测试剂盒及其应用方法，尤其涉及一种通过显色来判断检测结果的检测试剂盒及其应用方法。

背景技术

快速检测试剂盒主要应用免疫层析技术，免疫层析技术是二十世纪九十年代出现的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术。其原理是将特异的蛋白(抗原或者抗体)先固定于硝酸纤维膜的某一区域，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至该区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合。若用免疫胶体金标记技术可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

部分检测项目(比如促黄体生成激素、铁蛋白等)应用目前的检测试剂盒进行检测时，需要将检测线的显色强度与标准显色强度对比，或者对比检测线和质控线的显色强度。由于人为地比较显色强度(尤其是在显色强度比较接近时)存在误差，因此使得试验结果的可靠性也较小。

目前需要一种通过是否显色来比较样品中的待测物的浓度与检测限度的试剂盒，从而减少结果判断的主观依赖性。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种通过显色来判断检测结果的检测试剂盒及其应用方法。

本发明的所采用的具体技术方案如下。

本发明的检测试剂盒包括样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、反应支持物，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次连接并均设置在所述反应支持物上，所述结合物垫含有示踪物标记的生物活性原料A，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带设置于靠近所述结合物垫的一侧并含有生物活性原料B，所述质控条带设置于远离结合物垫的一侧并含有生物活性原料C，所述检测试剂盒还包括设置在所述样品垫上并与所述样品垫连通的样品处理单元，所述样品处理单元包括能够过滤样品的样品处理垫和吸附有生物活性原料D的渗透滤膜，所述生物活性原料D能够吸附所述样品中的待测物。

优选地，所述生物活性原料A、B、C、D是抗原或抗体，其中，所述生物活性原料A、B、D相似或不同，所述生物活性原料C不同于所述生物活性原料A、B、D。

优选地，所述检测试剂盒还包括固定卡，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、反应支持物、样品处理单元通过所述固定卡固定连接在一起。

优选地，所述检测试剂盒还包括固定在所述固定卡中的稀释液孔，所述稀释液孔与所述样品垫连通、设置在所述样品处理单元的远离所述结合物垫的一侧并且与所述样品处理单元连接。

优选地，所述样品处理垫由纤维素制成，所述渗透滤膜由硝酸纤维素或醋酸纤维素制成。

本发明还提供一种应用上述权利要求的检测试剂盒的生物制品检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品通过所述样品处理单元，样品中的部分待测物与所述生物活性原料D反应并停留在所述渗透滤膜上；

(2)样品经过所述样品垫后移动至所述结合物垫，未与生物活性原料D反应的待测物与所述示踪物标记的生物活性原料A结合，形成复合物；

(3)所述复合物在经过所述硝酸纤维素膜的过程中依次与相对于所述复合物不足量的生物活性原料B和生物活性原料C特异性结合；

(4)如果所述检测条带出现红色或粉红色，则表明所述待测物含量在检测限度以上，为阳性，如果所述检测条带未出现红色或粉红色，则表明所述待测物含量在检测限度以下，为阴性；

(5)如果所述质控条带出现红色或粉红色，则表明步骤(4)的实验结果有效，如果所述质控条带未出现红色或粉红色，则表明所述示踪物失效或者实验操作有误，步骤(4)的实验结果无效。

优选地，在所述步骤(1)中，如果所述待测物在所述样品中的浓度或阈值偏高，则在样品进入所述样品处理单元后，通过所述稀释液孔加入稀释液。

优选地，根据所述样品中待测物的性质相应地选择渗透滤膜的厚度、层数以及处理所述渗透滤膜的参数，所述参数包括生物活性原料的种类及浓度、封闭方法。

优选地，所述选择的方法为正交试验设计。

本发明的有益效果如下。

样品的待测物浓度通过样品处理单元的处理后可以降低一个水平，通过控制该水平的具体值，可以达到更敏感地待测物浓度是否在某个水平之上。

通过本发明的方法以及试剂盒，能够改进目前很多检测，尤其是促卵泡生成激素、铁蛋白等需要比色确定其浓度的检测项目以及目标浓度和正常浓度相差不大的检测项目。本发明使这些检测项目改进成为只需要判断是否出现有色检测条带即可判断。

通过本发明的方法以及试剂盒，避免了比色本身引起的结果判断和稳定性的不一致性；同时可以通过调整样品处理单元的处理程度，对一个目标检测物进行梯度检测；这种方法的实现使得临床更多的检测项目采用胶体金快速检测法，从而大幅度改善这些检测项目的效率和操作。

附图说明

图1是本发明的一个具体实施方案的试剂盒的剖面图；

图2是本发明的另一个具体实施方案的试剂盒的剖面图；

图3是本发明的一个具体实施方案的试剂盒的正视图；

图4是样品处理单元的结构示意图；

图5是本发明的一个具体实施方案的阳性结果示意图；

图6是本发明的一个具体实施方案的阴性结果示意图；

图7是本发明的一个具体实施方案检测结果无效示意图；

图8是本发明的一个具体制作方案检测结果无效示意图。

其中：1.吸水滤纸；2.反应支持物；3.硝酸纤维素膜；4.结合物垫；5.样品垫；6.样品处理单元；7.稀释液孔；8.固定卡；9.样品处理垫；10.渗透滤膜；C.质控条带；T.检测条带。

具体实施方式

本发明的基本思路是，在试剂盒中增加一个样品处理单元，通过该样品处理单元对于样品进行预处理，使得样品中的待测物的浓度降低，将处理后的样品再通过试剂盒的其他部分进行检测。

样品处理单元包括样品处理垫和渗透滤膜。样品处理垫的主要作用为支撑所述渗透滤膜以及将样品中大颗粒过滤。渗透滤膜的主要作用为结合样品中待测物和层析处理。

一般情况下，渗透滤膜选用渗透型硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，样品处理垫选用玻璃纤维膜。

样品处理垫一般有纤维素制成，其一般不需要处理。在比较特殊的样品情况下，可以为了平衡样品中的离子或者pH值等，用一定的缓冲体系(比如PBS、TRIS-HCl等)处理。

渗透滤膜的处理方式主要为生物活性原料吸附处理以及封闭处理。

首先采用检测条带所含有的生物活性原料对渗透滤膜进行处理，使得渗透滤膜吸附，使得渗透滤膜能够对样品中的待测物具有吸附作用。再将渗透滤膜进行封闭处理，以避免发生非特异性吸附；封闭处理渗透滤膜使用的处理液一般的主要成分为缓冲体系结合牛血清白蛋白、酪蛋白或者动物血清等。

处理样品处理垫或者渗透滤膜的缓冲体系选择0.02M、pH8.0的TRIS-HCl缓冲液与0.02％TX-100的混合物。

封闭渗透滤膜的处理液选择0.02M、pH8.0的TRIS-HCl与0.5％牛血清白蛋白的混合物。

以下是采用正交试验设计对渗透滤膜的处理方法和使用层数进行选择，结果如表1所示(以LH检测数据为例，目标阈值为40到50mIU/ml，其他条件的选择过程与此类似)：

表1

在阈值合适的四个条件中，7号成本偏高，12号流速偏慢，不满足总体要求，2号和3号条件对比，2号条件在组装过程中相对简单，故选择2号的条件作为渗透滤膜的处理条件。

样品处理垫的处理方式如下。首先由用水浸泡玻璃纤维膜30分钟，晾干至少4小时，再用处理液浸泡30分钟，取出纤维膜淋干水分，室温干燥条件下晾干至少8小时。

渗透滤膜的处理方式如下。将渗透型硝酸纤维素膜用与待测物相关的处理液按照固定的浓度比例加到硝酸纤维素膜上，并于干燥间内晾干至少8小时，再将封闭液按照固定的比例加入到与处理完成的硝酸纤维素膜上，并在室温干燥条件下晾干至少8小时，干燥条件下保存备用。

渗透滤膜的处理液或封闭液与硝酸纤维素膜的比例一般为1.0mL处理液或封闭液对应15cm²硝酸纤维素膜。

样品处理单元所使用纤维膜和渗透滤膜的大小为1.0cm×1.0cm，样品处理垫和渗透滤膜的叠加复合体的上下缘需要固定卡支撑固定，使得样品经过该处理单元的处理后能够流到样品垫上。

将经过处理的样品处理垫和渗透滤膜组装成样品处理单元。

根据待检物的种类、浓度或者其需要被吸附的程度，选择处理渗透滤膜的生物活性原料的种类、处理程度，或者选择样品处理单元中的样品处理垫和渗透滤膜的层数。一般条件下样品处理单元内的最上层和最下层都需要使用样品处理垫作为支撑，如果中间需要加入多层渗透滤膜，则需要在每两层渗透膜之间加入一层样品处理垫作为支撑物。

以下结合附图对本发明的一个检测促卵泡生成激素(LH)的实施例进行进一步的说明。

参见图1、2和3，检测试剂盒由吸水滤纸1、反应支持物2、硝酸纤维素膜3、结合物垫4、样品垫5、样品处理单元6、稀释液孔7和固定卡8组成。

包被有检测条带T和质控条带C的硝酸纤维素膜3粘贴在反应支持物2上，在检测线T的方向上硝酸纤维素膜3的边缘距离反应支持物2边缘23.0mm，在质控线C的方向上硝酸纤维素膜3的边缘距离反应支持物2的边缘17.0mm。在质控条带C的方向上反应支持物2上粘贴有吸水滤纸1，长度为18.0mm，压住硝酸纤维素膜3的边缘1.0mm。在检测线区T的方向上反应支持物5上首先粘贴6.0mm长的结合物垫4，压住硝酸纤维素膜检测条带T方向的边缘1.0mm；在此方向上继续粘贴样品垫5，长度为19.0mm，压住结合物垫4的边缘1.0mm。

吸水滤纸可以防止样品在硝酸纤维素膜3的一端堆积，从而导致后续的样本无法继续前行，进而能够使反应充分。

检测线T含有抗LH单克隆抗体，质控线C含有羊抗鼠IgG多克隆抗体。所述结合物垫4含有胶体金标记的抗LH单克隆抗体。

参见图4，样品处理单元固定在固定卡上，结构依次为玻璃纤维素制成的样品处理垫、用LH单抗处理过的一层渗透滤膜(硝酸纤维素制成)、另一层样品处理垫。

样品处理垫9用0.02M pH8.0的TRIS-HCl与0.02％TX-100处理，渗透滤膜10用含LH多抗为0.5mg/ml的0.02M pH7.6磷酸盐缓冲液按照每ml液体处理15cm²渗透滤膜的比例处理并晾干8小时，并用0.02M、pH8.0的TRIS-HCl中与0.5％的牛血清白蛋白封闭液封闭处理，再晾干。将处理后的样品处理垫和渗透滤膜装配成样品处理单元。

在检测过程中，需要在样品处理单元内用滴管缓慢加入大约三滴(80微升)尿液，保证样品能够缓慢地渗透进样品处理单元中，待硝酸纤维素膜区出现红色液流，并且流动至质控线区的时候开始计时，5分钟内查看结果。

如果待检样本为排卵高峰期样本，则在本检测中检测条带T显色，为阳性，参见图5(如果采用常规检测方法，则需要判断检测条带T显色强度是否超过质控条带C的强度)。

如果待检样本不是排卵高峰期样本，则在本检测中检测条带T不显色，为阴性，参见图6(而采用常规检测方法，则判断检测条带T线显色强度是否弱于质控条带C或者不显色的两种情况)。

依照免疫层析法检测的原理，本产品依然设置质控条带C作为判断检测结果有效性的依据。无论检测结果为阳性还是阴性，质控条带C都应该显色，如果质控条带不显色，则无论检测条带是否显色，均应判为使用结果无效。这表明可能是试剂盒本身失效或者操作有误，需要重新检测，参见图7或图8。

以上所述之具体实施例，意在具体说明本发明的思路，并不限于以上具体实施例所公开的方式。凡基于本发明之设计思路，进行简单推演与替换，都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种检测试剂盒，包括样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、反应支持物，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次连接并均设置在所述反应支持物上，所述结合物垫含有示踪物标记的生物活性原料A，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带设置于靠近所述结合物垫的一侧并含有生物活性原料B，所述质控条带设置于远离结合物垫的一侧并含有生物活性原料C，其特征在于，所述检测试剂盒还包括设置在所述样品垫上并与所述样品垫连通的样品处理单元，所述样品处理单元包括能够过滤样品的样品处理垫和吸附有生物活性原料D的渗透滤膜，所述生物活性原料D能够吸附所述样品中的待测物。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物活性原料A、B、C、D是抗原或抗体，其中，所述生物活性原料A、B、D相似或不同，所述生物活性原料C不同于所述生物活性原料A、B、D。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括固定卡，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、反应支持物、样品处理单元通过所述固定卡固定连接在一起。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括固定在所述固定卡中的稀释液孔，所述稀释液孔与所述样品垫连通、设置在所述样品处理单元的远离所述结合物垫的一侧并且与所述样品处理单元连接。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理垫由纤维素制成，所述渗透滤膜由硝酸纤维素或醋酸纤维素制成。

6.一种应用权利要求1-5所述检测试剂盒的生物制品检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品通过所述样品处理单元，样品中的部分待测物与所述生物活性原料D反应并停留在所述渗透滤膜上；

(2)样品经过所述样品垫后移动至所述结合物垫，未与生物活性原料D反应的待测物与所述示踪物标记的生物活性原料A结合，形成复合物；

(3)所述复合物在经过所述硝酸纤维素膜的过程中依次与相对于所述复合物不足量的生物活性原料B和生物活性原料C特异性结合；

(4)如果所述检测条带出现红色或粉红色，则表明所述待测物含量在检测限度以上，为阳性，如果所述检测条带未出现红色或粉红色，则表明所述待测物含量在检测限度以下，为阴性；

(5)如果所述质控条带出现红色或粉红色，则表明步骤(4)的实验结果有效，如果所述质控条带未出现红色或粉红色，则表明所述示踪物失效或者实验操作有误，步骤(4)的实验结果无效。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，如果所述待测物在所述样品中的浓度或阈值偏高，则在样品进入所述样品处理单元后，通过所述稀释液孔加入稀释液。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，根据所述样品中待测物的性质相应地选择渗透滤膜的厚度、层数以及处理所述渗透滤膜的参数，所述参数包括生物活性原料的种类及浓度、封闭方法。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述选择的方法为正交试验设计。

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