KR102593963B1

KR102593963B1 - 면역학적 측정용 시약 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102593963B1
Application number: KR1020187005671A
Authority: KR
Inventors: 카즈노리 와타나베; 카즈히코 사토
Original assignee: 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2023-10-25
Also published as: HK1249582A1; JP2017211396A; CN107923907A; KR20180039654A; JPWO2017038711A1; JP6211233B2; WO2017038711A1; CN107923907B

Abstract

[과제] 시료로서 분변을 이용하는 면역학적 측정법에 있어서, 검출 대상물과의 반응성의 저하를 최소한으로 억제하면서, 비특이적 반응의 진행과 그에 따른 위양성의 발생을 억제할 수 있는 수단을 제공한다.
[해결 수단] 분변시료를 이용한 면역학적 측정법에 있어서, 산화제를 포함하는 시약 조성물을 이용한다.

Description

면역학적 측정용 시약 조성물 및 이의 용도

본 면역학적 측정용 시약 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.

최근, 진료소나 소규모 병원에 있어서, 「환자를 진찰하고 있는 사이에 검사 결과를 알고 싶다」라는 요구가 증가하고, 종래의 원외에의 외주 검사로부터, POCT(Point of Care Testing)로의 전환이 행해지고 있다. POCT의 보급에 따른 면역크로마토그래피법을 원리로 하는 테스트 스트립이 체외진단약으로서 사용되고 있다. 면역크로마토그래피법은, 검사 시에 시약의 조제를 필요로 하지 않고, 혈액이나 소변, 분변의 현탁액 등의 피험시료(이하, 단지 「시료」라고도 칭함)를 해당 테스트 스트립 위에 (필요에 따라서 여과 필터를 통과시킨 후에) 직접 적하하는 등의 간단한 조작만으로, 시료 중의 대상물을 검출하는 것이 가능하여, 검출 대상물을 간편하면서도 신속하게 분석하는데 매우 유용하다.

면역크로마토그래피법을 원리로 하는 테스트 스트립(이하, 단지 「테스트 스트립」이라고도 칭함)은, 일반적으로, 시료 공급부, 표지시약 유지부, 크로마토그래프 매체 및 검출부를 구비한 다공성의 멤브레인으로서, 검출 대상물에 대한 표지항체 등의 표지시약이, 시료와 접촉 후에 크로마토그래프 매체를 통과해서 검출부에 도달할 수 있도록, 크로마토그래프 매체의 전개 개시 부위에 용출, 전개 가능하게 유지되고, 또한 크로마토그래프 매체의 일부에 항체 등이 고정화되어 검출부를 구성하는 구조로 되어 있다. 여기에서, 시료가 시료 공급부에 적하되어, 표지시약 유지부에 도달하면, 시료 중의 검출 대상물이 표지항체와 특이적으로 결합해서 복합체를 형성한다. 해당 복합체는, 크로마토그래프 매체를 하류방향을 향해서 전개되어가서, 더욱 고정화된 항체에 결합한다. 이 때문에, 검출부에 있어서, 표지항체, 검출 대상물 및 고정화 항체에 의한 샌드위치형 복합체를 검출함으로써, 검출 대상물을 정성 또는 정량 분석하는 것이 가능하다. 표지시약을 구성하는 표지물의 일례는 금 콜로이드 입자이며, 금 콜로이드 입자에 의한 적색의 라인에 의해서 정성적인 검출이 가능해진다. 또한, 그 적색의 라인의 정도에 의거해서, 시료 중에 있어서의 검출 대상물을 정량적으로 검출하는 것도 가능하다.

그런데, 감염증의 조기발견이나 그 원인의 특정을 목적으로 해서, 피험시료 중의 노로바이러스나 로타바이러스 등의 바이러스나 세균의 존재를 조사하는 검사 등이 알려져 있다. 감염증의 원인이 되는 균이나 바이러스는 분변 중에 배출되는 일도 많으므로, 분변시료로부터의 병원체의 검출은 매우 유용하다. 감염증의 병원체 중, 세균은 배양이나 유전자 검사에 의한 방법 등으로 검출되고, 바이러스는 유전자검사나 전자현미경에 의한 방법 등으로 검출되지만, 이들 검사 방법에서는, 시료의 처리나 검사에 숙련된 기술과 시간, 특별한 장치를 필요로 하고, 게다가 검출에 시간이 걸리는, 대량인 시료를 처리할 수 없는 등의 결점이 있다. 또한, 노로바이러스나 로타바이러스는, 어린이나 고령자에서는 중증화되는 일도 있어, 바이러스 검출에 있어서는, 감염 확대를 막고, 조기에 치료 방침이나 격리 조치의 결정을 가능하게 하기 위하여, 단시간에서의 측정이 요구되고 있다. 한편, 면역크로마토그래피법 등의 면역학적 측정법을 이용해서 분변시료로부터의 병원체의 검출을 행함으로써, 간편하고 단시간에 그리고 고감도로 검사를 행하는 것이 가능해진다는 이점이 있다.

그렇지만, 면역크로마토그래피법 등의 면역학적 측정법에서는, 환자로부터 채취된 시료의 분석에 있어서, 분석 대상물이 시료 중에 존재하지 않는데도 불구하고, 비특이적인 반응에 의해서 양성으로 판정해버리는 일이 있다(위양성(false positive)). 면역학적 측정법에 있어서의 이러한 위양성의 발생을 방지하는 것을 목적으로 해서, 비특이반응의 진행을 억제하기 위한 여러 가지 기술이 제안되어 있다. 예를 들면, 시료나 표지항체를 고체상 위에서 전개시킬 때에 특정 성분을 용액 중에 함유시키는 방법(예를 들면, 특허문헌 1)이나, 항체를 고정화할 때의 고체상 제작용 시약(예를 들면, 특허문헌 2), 이호성(異好性) 항체에 의한 비특이적 반응의 억제 방법(예를 들면, 특허문헌 3) 등이 제안되어 있다.

또한, 특히 분변시료를 사용한 경우의 비특이반응을 억제하는 방법으로서, 고형의 협잡물이 비특이물질인 것으로 해서 강한 강성 필터를 포함하는 필터에 의해 시료를 여과하는 방법(예를 들면, 특허문헌 4), pH를 조정한 완충제에 의해 시료를 처리하는 방법(예를 들면, 특허문헌 5), 또한, 여과재를 사용한 여과 조작에 의해 발생하는 비특이반응을 억제하는 기술로서, 금속 이온의 마스킹제의 존재 하에서 면역반응을 행하는 방법(예를 들면, 특허문헌 6) 등이 있다.

JP(특표)2009-517632 A

JP

2009-162535

A

JP

2011-197014

A

JP

2008-122372

A

JP

2004-301684

A

JPH09-203735 A

본 발명자들의 검토에 따르면, 특허문헌 4 내지 6 등에 의해 종래 여러 가지 제안되어 있는 기술을 이용했다고 해도, 여전히, 분변시료를 이용했을 경우의 비특이반응의 진행과 그에 따른 위양성의 발생을 충분히 억제할 수 없는 경우가 있는 것이 밝혀졌다.

그래서, 본 발명은, 시료로서 분변을 이용하는 면역학적 측정법에 있어서, 검출 대상물과의 반응성의 저하를 최소한으로 억제하면서, 비특이적 반응의 진행과 그에 따른 위양성의 발생을 억제할 수 있는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의검토를 행하였다. 그 결과, 시료로서 분변을 이용하는 면역학적 측정법에 있어서, 분변시료가 검출부에 도달하기 전에 산화제와 접촉시킴으로써, 상기 과제가 해결될 수 있는 것을 찾아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 일 형태에 따르면, 분변시료를 이용한 면역학적 측정법에 이용되는 시약 조성물로서, 산화제를 포함하는, 시약 조성물이 제공된다.

또, 본 발명의 다른 형태에 따르면, 시료 공급부와, 상기 시료 공급부의 하류측에 위치하는 크로마토그래프 매체와, 상기 크로마토그래프 매체의 일부에 위치하는, 금속 콜로이드 등으로 표지된 항검출 대상물 항체(표지시약)가 용출 가능하게 유지된 표지시약 유지부와, 상기 크로마토그래프 매체의 일부로서 상기 표지시약 유지부보다 하류측에 위치하는, 고정화 항체를 포함하는 검출부를 구비하는 테스트 스트립으로서, 전술한 형태에 따른 시약 조성물을 포함하는, 테스트 스트립이 제공된다.

또한, 본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 시료 공급부와, 상기 시료 공급부의 하류측에 위치하는 크로마토그래프 매체와, 상기 크로마토그래프 매체의 일부에 위치하는, 금속 콜로이드등으로 표지된 항검출 대상물 항체(표지시약)가 용출 가능하게 유지된 표지시약 유지부와, 상기 크로마토그래프 매체의 일부로서 상기 표지시약 유지부보다 하류측에 위치하는, 고정화 항체를 포함하는 검출부를 구비하는 테스트 스트립을 이용해서, 면역학적 측정법에 의해 분변시료 중의 검출 대상물을 검출 또는 정량하는 방법으로서, 전술한 형태에 따른 시약 조성물을 이용하는, 방법도 또 제공된다.

또, 본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 전술한 형태에 따른 시약 조성물과, 분변시료를 접촉시키는 공정을 포함하는, 면역학적 측정법에 있어서의 비특이반응의 억제 방법도 또한, 제공된다.

본 발명에 따르면, 시료로서 분변을 이용하는 면역학적 측정법에 있어서, 검출 대상물과의 반응성의 저하를 최소한으로 억제하면서, 비특이적 반응의 진행과 그에 따른 위양성의 발생을 억제하는 것이 가능해진다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 노로바이러스 검출을 위한 면역크로마토그래피용 키트의 모식단면도이다.

[시약 조성물]

본 발명의 일 형태는, 분변시료를 이용한 면역학적 측정법에 이용되는 시약 조성물로서, 산화제를 포함하는, 시약 조성물이다.

본 형태에 따른 시약 조성물은, 분변시료의 면역학적 측정법에 이용된다. 시약 조성물은, 분변시료를 추출하기 위한 추출용 용액 또는 전개액 등의 용액에 포함되어도 되고, 패드, 여과 필터 등, 시료가 접촉하는 부재에 건조한 상태로 포함되어도 된다.

「면역학적 측정법」이란, 측정 대상인 검출 대상물과 특이적으로 결합하는 물질(예를 들면, 항체 또는 항원)을 이용해서, 검출 대상물의 검출·정량을 행하는 방법이다. 본 발명에 있어서, 면역학적 측정법으로서 전형적으로는 면역크로마토그래피법(바람직하게는, 후술하는 샌드위치형 면역크로마토그래피법)을 들 수 있지만, 그 밖의 ELISA법, 라텍스 응집법, 면역비탁법 등을 이용할 수 있어도 된다.

여기에서, 검출 대상물이 항원성을 지니는 물질일 경우, 검출 대상물을 특이적으로 인식하는 항체를 이용해서 면역학적 측정법을 실시할 수 있다. 이 경우, 항체의 구체적인 형태에 대해서 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 그 검출 대상물에 의해 면역된 동물의 혈청으로부터 조제하는 항혈청, 항혈청으로부터 정제된 면역 글로불린 분획으로부터 얻어지는 다클론성 항체, 그 분석 대상물에 의해 면역 된 동물의 비장세포를 이용하는 세포융합에 의해서 얻어지는 단클론성 항체, 또는 이들의 단편[예를 들면, F (ab')₂, Fab, Fab', 또는 Fv]을 이용할 수 있다. 이들 항체의 조제는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 특히, 단클론성 항체-항원-단클론성 항체 복합체를 형성하는 샌드위치형 면역학적 측정법이 바람직하다. 또한, 검출 대상물이 항체(즉, 특정한 항원에 대한 면역 글로불린 분자)일 경우에는, 해당 항체가 특이적으로 인식하는 물질(항원) 또는 면역 글로불린 분자에 대한 항체를 이용해서 면역학적 측정법을 실시할 수 있다. 또, 검출 대상물이 당일 경우에는, 당에 대한 항체 이외에, 레시틴 단백질 등을 이용해서 면역학적 측정법을 실시할 수 있다.

「분변시료」에 대해서는, 분변 유래의 시료인 한 그 구체적인 형태는 특별히 제한되지 않고, 그 유래로 하는 분변은, 경변, 보통변, 연변, 설사변, 물찌똥 등의 어느 것이어도 된다. 또, 분변시료는, 통상, 수분을 약 60질량%, 음식물 찌꺼기나 장점막세포, 장내 세균 등을 약 40질량% 포함하지만, 분변시료는 생체시료 중에서도, 체내에 흡수되지 않고 배설되는 성분을 많이 포함하는 것이나, 고체의 협잡물이 많은 것, 또한, 배출 상태에 따라서, 성분이나 형상, pH 등이 다양하다고 하는 특유한 성질을 지닌다. 이 때문에, 위양성이 발생하는 상황이나 원인도 다양하며, 분변시료에 있어서 비특이적 반응의 진행과 그에 따른 위양성의 발생을 억제할 수 있는 수단은 매우 유용하다. 본 발명에 따르면, 분변시료에 있어서의 비특이적 반응의 진행과 그에 따른 위양성의 발생을 억제할 수 있다.

면역크로마토그래피법 등의 면역학적 측정법에서는, 검출 대상물의 존재의 유무의 판정(검출)이나, 검출 대상물이 존재할 경우에는 그 존재량의 측정(정량)이 행해진다. 본 발명에 있어서, 「검출 대상물」에 특별히 제한은 없고, 분변시료 중에 포함될 수 있는 물질이면 된다. 검출 대상물의 일례로서는, 바이러스(예를 들면, 노로바이러스, 사포바이러스, 로타바이러스, 아데노바이러스 등), 세균(예를 들면, 이질균(赤痢菌), 살모넬라속균, 장관출혈성 대장균, 캄필로박터 등) 또는 대장암 스크리닝의 대상이 되는 변잠혈 등을 들 수 있다. 특히, 바이러스나 세균을 검출 대상물로서 이용함으로써, 위양성의 발생을 억제하면서 신속한 판정을 가능하게 할 수 있는 본 발명의 우위성이 현저한 것으로 된다. 또, 항검출 대상물 항체가 특이적으로 인식하는 물질(항원)에 대해서도, 전술한 검출 대상물의 각각에 특이적으로 존재하는 물질이면 특별히 제한은 없고, 단백질, 펩타이드, 항원, 항체의 이외에, 핵산, 당(특히 당 단백질의 당 부분, 당지질의 당 부분 등), 복합 당질 등이어도 된다.

(산화제)

본 형태에 따른 시약 조성물에 포함되는 산화제의 구체적인 형태에 대해서, 본 발명의 효과를 발휘할 수 있는 산화제이면 특별히 제한은 없고, 종래 공지의 산화제가 이용된다. 본 형태에 따른 시약 조성물에 포함되는 산화제는, 분변시료에 포함되고, 그리고 비특이반응의 원인이 되는 어떠한 성분을 산화시킨다. 산화제의 일례로서는, 예를 들면, 할로겐옥소산염, 전이금속 착체의 염, 과산화물, 유기 수은화합물, 과망간산염, 크롬산염, 옥시다제, 아질산염 및 초산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 들 수 있다.

할로겐옥소산염으로서, 예를 들면, 차아염소산, 아염소산, 염소산, 과염소산, 차아브로민산, 아브로민산, 브로민산, 과브로민산, 차아요오드산, 아요오드산, 요오드산, 및 과요오드산의 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염 및 암모늄염을 들 수 있고, 특히, 요오드산 및 과요오드산의 알칼리 금속염(예를 들면, 요오드산 칼륨, 요오드산 나트륨, 과요오드산 칼륨), 알칼리 토류 금속염(예를 들면, 요오드산 칼슘) 및 암모늄염(예를 들면, 요오드산 암모늄)이 바람직하다.

전이금속 착체의 염으로서, 예를 들면, 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염 및 암모늄염의 페리사이안화염을 들 수 있고, 특히 페리사이안화 칼륨이 바람직하다.

과산화물로서, 예를 들면 유기과산화물을 들 수 있고, 특히 과산화요소 및 과산화수소가 바람직하다.

유기 수은화합물로서, 티메로살이 바람직하다.

과망간산염으로서, 예를 들면 알칼리 금속 또는 알칼리 토류 금속의 과망간산염을 들 수 있고, 특히 과망간산 칼륨이 바람직하다.

옥시다제로서, 예를 들면 글루코스 옥시다제, 콜레스테롤 옥시다제, 콜린 옥시다제, 글루코스 옥시다제, 락타이드 옥시다제, 피루브산 옥시다제, 사르코신 옥시다제, 잔틴 옥시다제 및 유리카제(uricase) 등을 들 수 있고, 특히 글루코스 옥시다제가 바람직하다. 옥시다제는 분변 중에 존재하는 기질에 대하여 산화 환원 효소로서 기능하고, 생성된 과산화수소를 산화제로서 이용한다. 그 중에서도, 비특이반응의 억제와 이에 따른 위양성의 발생을 억제하는 효과가 특히 우수하다는 관점에서는, 요오드산 칼륨, 과요오드산 칼륨 및 페리사이안화 칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 산화제로서 이용되는 것이 특히 바람직하고, 측정 결과의 시인성 및 농도에 대한 비특이반응의 억제 효과의 관점에서, 요오드산 칼륨이 가장 바람직하다.

또, 본 형태에 따른 시약 조성물에 포함되는 산화제에 대해서, 산화 환원 전위의 관점에서 규정하면, 100mV 이상의 산화 환원 전위를 지니는 것이 바람직하다. 이러한 산화 환원 전위를 지님으로써, 비특이반응의 억제와 이에 따른 위양성의 발생을 억제한다는 효과가 확실하게 발휘될 수 있다. 또한, 산화제의 산화 환원 전위의 측정은, 이하의 방법으로 행하는 것으로 한다. 또, 산화 환원 전위의 값은, 보다 바람직하게는 200mV 이상이고, 더욱 바람직하게는 300mV 이상이며, 특히 바람직하게는 400mV 이상이다. 한편, 산화제의 산화 환원 전위의 상한치에 특별히 제한은 없지만, 통상은 900mV 이하, 바람직하게는 500mV 이하이다.

산화 환원 전위의 측정 방법: 산화제를 정제수에 용해시키고, 10mM의 용액을 10mL 조제한다. 얻어진 용액에 대해서, 3.33 ㏖/L KCl-Ag/AgCl 전극을 이용해서 산화 환원 전위를 측정한다.

[면역학적 측정용 키트(면역크로마토그래피용 키트)]

전술한 형태에 따른 시약 조성물에 있어서, 산화제는 각종 형태로 함유될 수 있다. 이하에서는, 산화제의 함유 형태의 설명에 앞서서, 전술한 형태에 따른 시약 조성물이 이용되는 면역학적 측정용 키트의 상세에 대해서, 면역학적 측정법이 면역크로마토그래피법일 경우를 예로 들어서, 도면을 참조하면서 설명한다.

도 1은, 본 발명의 일 실시형태에 따른 노로바이러스 검출을 위한 면역크로마토그래피용 키트의 모식 단면도이다.

도 1에 나타낸 면역크로마토그래피용 키트(10)는, 키트의 본체로서 테스트 스트립(100)을 구비하고 있다. 테스트 스트립(100)은, 최하층으로서 플라스틱제 점착 시트(110)를 구비하고 있고, 해당 점착 시트(110) 상에는, 크로마토그래프 매체(불용성 담체; 고정상)로서의 항체 고정화 멤브레인(120)이 적층되어 있다. 이하, 항체 고정화 멤브레인(120)의 시료 공급부측을 상류, 시료가 흘러가는 방향(흡수부측)을 하류로 해서 설명한다.

항체 고정화 멤브레인(120)의 상류측에는 표지시약 유지 패드(130)(표지시약 유지부)가 더 적층되어 있다. 표지시약 유지 패드(130) 위에는 샘플 패드(140)(시료 공급부)가 더 적층되어 있다. 해당 표지시약 유지 패드(130)에는, 금 콜로이드 입자의 표면에 항검출 대상물 항체인 항노로바이러스 항체(예를 들면, 항노로바이러스 GI 마우스 단클론성 항체 및 항노로바이러스 GII 마우스 단클론성 항체)가 고정화되어서 이루어진 표지항체(표지시약)가 용출 가능하게 유지되어 있다. 항체 고정화 멤브레인(120)에 있어서, 표지시약 유지 패드(130)보다 하류측에는, 항검출 대상물 항체인 항노로바이러스 항체(예를 들면, 항노로바이러스 GI 마우스 단클론성 항체 및 항노로바이러스 GII 마우스 단클론성 항체)이 고정화된 테스트 라인(122)(검출부)가 배치되고, 또한 테스트 라인(122)보다 하류측에는, 항면역 글로불린 항체가 고정화된 컨트롤 라인(124)(컨트롤부)이 배치되어 있다. 또한, 항체 고정화 멤브레인(120)에 있어서, 컨트롤 라인(124)보다 하류측에는 흡수 패드(150)가 적층되어 있다.

면역크로마토그래피용 키트(10)는, 키트의 본체인 테스트 스트립(100)에 부가해서, 샘플 패드(140)(시료 공급부)에 공급되기 전의 시료를 여과하기 위한 여과 필터(200), 및 해당 시료의 추출용 용액 또는 전개액(300)을 구비하고 있다. 면역크로마토그래피용 키트(10)는, 필요에 따라서 그 밖의 구성 요소(예를 들면, 사용 설명서, 검체 채취용 기구, 검체 추출용 용기 등)를 더 구비하고 있어도 된다. 또한, 테스트 스트립(100)은, 도시하지 않은 플라스틱제의 전용 하우징(시료공급 창문부 및 검출 창문부를 구비함)에 격납·탑재하고, 면역크로마토 테스트 디바이스의 형태로 되는 것이 바람직하다.

면역크로마토그래피용 키트(10)가 사용될 때, 예를 들면 추출용 용액(300)을 이용할 경우에는, 채변 용기나 마이크로튜브 등의 용기 중에서 분변시료를 추출용 용액과 혼합하고, 얻어진 현탁액을 여과 필터(200)에 통과시킴으로써 여과 처리물의 형태의 시료를 얻는다. 이때, 여과 필터(200)는 상기 용기와는 다른 부재로서 이용해도 되고, 상기 용기 뚜껑 등과 일체화시킨 부재로서 이용해도 된다. 여과 필터(200)를 상기 용기 뚜껑과 일체화시킨 부재로서 구성함으로써, 용기로부터 현탁액을 배출시킴과 동시에 여과 처리가 행해져서 여과 처리물의 형태의 시료가 얻어지므로, 추출 후의 여과 조작이 간편하게 행해질 수 있다.

계속해서, 상기에서 얻어진 여과 처리물의 형태의 시료를 샘플 패드(140)에 적하하면, 여과 처리물의 형태의 시료는 전개액으로서 기능하고, 샘플 패드(140)를 통과한 후에 표지시약 유지 패드(130)로 이동한다. 그리고, 시료 중에 검출 대상물(예를 들면, 노로바이러스)이 존재할 경우에는, 시료가 모세관현상에 의해 표지시약 유지 패드(130) 속을 이동할 때에, 표지시약을 구성하는 항노로바이러스 항체와 시료 중의 노로바이러스(항원)의 항원-항체반응에 의해 복합체(금 콜로이드 입자-항노로바이러스 항체-노로바이러스(항원)복합체)가 형성된다. 이 복합체는 시료와 함께 더욱 모세관현상에 의해서 항체 고정화 멤브레인(120) 속을 하류로 이동한다. 복합체가 항체 고정화 멤브레인(120)의 도중에 설치된 테스트 라인(122)(검출부)에 도달하면, 테스트 라인(122)에 고정화되어 있는 항검출 대상물 항체인 항노로바이러스 항체가 상기 복합체에 포함되는 노로바이러스(항원)와의 사이에서 항원-항체반응을 일으켜, 노로바이러스(항원)가 2개의 항노로바이러스 항체(표지시약을 구성하는(금 콜로이드 입자에 고정화된) 항체 및 테스트 라인에 고정화된 항체) 사이에 삽입되도록 포착된 샌드위치 복합체가 형성된다. 여기에서, 샌드위치 복합체를 구성하는 한쪽의 항체는 테스트 라인(122)에 고정화되어 있으므로, 해당 샌드위치 복합체는 테스트 라인(122) 상에 머무르게 되어, 금 콜로이드 입자의 집적에 의해 적색의 라인을 나타낸다. 이 라인에 의해, 시료 중에 있어서의 검출 대상물(노로바이러스)의 존재를 육안으로 확인하는 것이 가능해지는 것이다. 또, 시료 중에 검출 대상물(노로바이러스)이 존재하지 않으면, 항원과, 표지시약을 구성하는 항체에 의한 항원-항체 복합체가 형성되지 않고, 테스트 라인에 있어서의 샌드위치 복합체는 형성되지 않으므로, 테스트 라인에 적색의 라인은 생기지 않는다. 즉, 테스트 라인(122)(검출부)이 금 콜로이드의 색(예를 들면, 적색 내지 적갈색)으로 착색되어 있으면, 시료 중에 검출 대상물(노로바이러스)이 존재하고 있다고 판정된다. 한편, 테스트 라인에 색조의 변화가 없이 막 부재의 색인 채이면, 시료 중에 검출 대상물(노로바이러스)은 존재하지 않고 있다고 판정된다.

또, 반응에 관여하지 않았던 항노로바이러스 항체 결합 금 콜로이드(표지시약)는, 컨트롤 라인(124)(컨트롤부)에 고정화된 항면역 글로불린 항체에 포착된다. 이것에 의해, 컨트롤 라인(124)은 적색의 라인을 나타내므로, 테스트 스트립(100) 상에서의 반응이 정상으로 진행된 것이 확인된다.

이상, 키트의 사용 시에 추출용 용액(300)을 이용할 경우를 예로 들어, 키트의 사용 형태를 상세히 설명했지만, 추출용 용액이 아니라 전개액(300)을 이용할 경우에는, 예를 들면, 샘플 패드(140) 위에 포갠 여과 필터(200) 상에 분변시료를 배치한 상태에서, 시료에 전개액(300)을 적하시킴으로써, 전술한 것과 마찬가지의 여과 처리물이 샘플 패드(140)에 공급된다. 그 후의 거동에 대해서는, 상기와 마찬가지이므로, 여기에서는 상세한 설명을 생략한다.

(산화제(시약 조성물)의 함유 형태)

전술한 형태에 따른 산화제를 포함하는 시약 조성물은, 면역학적 측정용 키트(면역크로마토그래피용 키트)에 있어서, 이하와 같은 각종 형태로 함유될 수 있다.

(1) 추출용 용액 또는 전개액(300)에 첨가되는 형태;

(2) 여과 필터(200)에 첨가되는 형태;

(3) 샘플 패드(140)에 첨가되는 형태;

(4) 표지시약 유지 패드(130)에 첨가되는 형태;

(5) 항체 고정화 멤브레인의 테스트 라인(122)의 상류에 첨가되는 형태.

여기에서, 상기 (3) 내지 (5)의 형태에서는, 테스트 스트립(100)에 산화제가 함유되지만, 어느 것이라도 샘플 패드(시료 공급부)로부터 항체 고정화 멤브레인(120)(크로마토그래프 매체)에 있어서의 테스트 라인(122)(검출부)의 상류까지의 어느 쪽인가의 부위에 산화제가 포함되게 된다. 이 때문에, (1) 내지 (5)의 모든 형태에 있어서, 시료 또는 이의 여과 처리물과 추출용 용액 또는 전개액의 혼합물은, 테스트 라인(122)(검출부)의 상류에 있어서 산화제와 접촉하게 된다. 이것에 의해, 분변시료에 포함되는 어떠한 성분에 기인하는 비특이반응이 산화제의 존재에 의해 억제된다. 그 결과, 위양성의 발생이 억제될 수 있다. 또, 상기 (1) 내지 (5)의 형태 중, 상기 혼합물과 산화제의 접촉이 항체 고정화 멤브레인(120)의 상류에서 행해지는 (1) 내지 (4)의 형태가 바람직하고, 상기 혼합물과 산화제의 접촉이 표지시약 유지 패드(130)의 상류에서 행해지는 (1) 내지 (3)의 형태가 보다 바람직하다. 또한, 보다 낮은 산화제 농도로 위양성의 발생을 억제할 수 있다는 관점에서는, 상기 (1) 또는 (4)의 형태가 더욱 바람직하고, 산화제와 시료의 반응을 균일하게 진행시킬 수 있다는 관점에서는, 상기 (1)의 형태가 가장 바람직하다.

이하, 면역학적 측정용 키트(면역크로마토그래피용 키트)의 각 구성 요소에 대해서, 상세히 설명한다.

(추출용 용액/전개액)

추출용 용액 및 전개액은, 전술한 바와 같이 그 사용 형태가 다르지만, 동일한 조성의 용액이 추출용 용액 및 전개액의 쌍방으로서 기능할 수 있다. 추출용 용액 및 전개액은, 완충제 및 용매(통상적으로는, 물)로 이루어진 완충액을 포함한다. 완충제로서는, 목적으로 하는 면역반응에 적합한 pH로 조절 가능한 완충제가 이용된다. 일반적으로, 완충액의 pH는 5 내지 10이 바람직하고, 이 경우에는 인산완충액, Tris 완충액, 굿(good) 완충액 등의 통상 사용되는 완충액이 이용될 수 있다. 특히 면역반응에 적합한 pH 6 내지 8을 부여하는 완충제로서는, HEPES나 PIPES 등의 굿 완충액이 바람직하다. 또한, 추출용 용액 및 전개액에는, 완충제 이외에 염화나트륨 등을 첨가해도 되고, 공지의 첨가제를 더 첨가해도 된다. 첨가제로서는, 예를 들면, 항원-항체반응의 촉진 또는 비특이반응의 억제를 목적으로 한 단백질(예를 들면, 소 혈청 알부민, 카제인, 젤라틴 등), 고분자화합물(예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜, 덱스트란, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등), 비이온성 계면활성제(예를 들면, 트윈(Tween)(등록상표) 20, 트리톤(Triton)(등록상표)X-100등), 이온성 계면활성제 또는 폴리아니온(예를 들면, 덱스트란황산, 헤파린, 폴리스타이렌설폰산, 하이알루론산, 콘드로이틴 황산 등) 또는 그의 염 등; 항균제로서의 아지화 나트륨, 장쇄 알킬4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

여기에서, 추출용 용액 또는 전개액에 산화제가 포함될 경우, 이들 용액 중의 산화제 농도의 하한은, 바람직하게는 0.05mM 이상이고, 보다 바람직하게는 0.1mM 이상이며, 더욱 바람직하게는 1mM 이상이고, 가장 바람직하게는 2.5mM 이상이다. 단, 산화제로서 과산화요소를 이용할 경우에는, 산화제 농도의 하한은 1mM 이상인 것이 바람직하고, 산화제로서의 과산화수소를 생성하는 글루코스 옥시다제를 이용할 경우에는, 산화제 농도의 하한은 바람직하게는 5 units/mL 이상이고, 보다 바람직하게는 10 units/mL 이상이며, 더욱 바람직하게는 100 units/mL 이상이다. 한편, 산화제 농도의 상한은, 용액의 보존 안정성이나 면역반응의 저해성의 관점에서, 바람직하게는 100mM 이하이고, 보다 바람직하게는 10mM 이하이며, 더욱 바람직하게는 4mM 이하이고, 가장 바람직하게는 3mM 이하이다. 또한, 글루코스 옥시다제의 상한은, 바람직하게는 2000 units/mL 이하, 보다 바람직하게는 1000 units/mL 이하이다. 단, 산화제로서 티메로살 또는 과망간산 칼륨을 이용할 경우에는, 면역반응의 저해성의 관점에서, 산화제 농도의 상한은 10mM 이하인 것이 바람직하고, 1mM 이하인 것이 보다 바람직하다.

(항체 고정화 멤브레인)

항체 고정화 멤브레인(120)의 주상(主相)은, 면역크로마토그래피의 크로마토그래프 매체(고정 상)로서 기능하는 다공질체로 이루어진 불용성 담체이다. 해당 항체 고정화 멤브레인(120)의 구성 재료인 다공질체로서는, 예를 들면, 나이트로셀룰로스막, 셀룰로스막, 아세틸셀룰로스막, 폴리설폰막, 폴리에터설폰막, 나일론막, 유리섬유, 부직포, 천 등의 다공질 시트를 들 수 있고, 특히 나이트로셀룰로스막이 바람직하게 이용된다. 또, 적하된 시료의 멤브레인(120) 상에서의 이동 속도는, 멤브레인의 재질, 크기 등에 따라서 변화될 수 있고, 검출 대상물의 측정에 맞는 속도를 설정할 수 있다.

(샘플 패드)

샘플 패드(140)는, 시료 공급부로서 기능하지만, 여과 필터(200)를 통과한 후에 적하된 시료를 받을 뿐만 아니라, 시료 중의 불용물 입자 등을 여과하는 기능도 겸할 수 있다. 샘플 패드(140)의 구성 재료로서는, 예를 들면, 셀룰로스 여과지, 유리섬유, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산 셀룰로스, 나일론 및 면포 등의 균일한 특성을 지니는 재료를 들 수 있다.

(표지시약 유지 패드)

표지시약 유지 패드(130)는, 전술한 바와 같이 표지시약을 유지하는 표지시약 유지부로서 기능한다. 표지시약 유지 패드(130)의 구성 재료로서는, 예를 들면, 셀룰로스 여과지, 유리섬유 및 부직포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 유리섬유가 이용된다.

표지시약 유지 패드(130)에 의해서 유지되는 표지시약은, 검출 대상물과 특이적으로 결합하는 물질과, 적당한 표지체와의 복합체이다. 「검출 대상물과 특이적으로 결합하는 물질」로서는, 전술한 바와 같이, 검출 대상물이 항체일 경우에는, 해당 항체가 특이적으로 인식하는 물질(항원) 또는 면역 글로불린 분자에 대한 항체가 이용되고, 검출 대상물이 항원성을 지니는 물질일 경우에는, 검출 대상물을 특이적으로 인식하는 항검출 대상물 항체(바람직하게는, 단클론성 항체)가 이용된다. 한편, 「표지체」로서는, 착색 입자가 바람직하고, 예를 들면, 금, 은, 백금 또는 구리 등의 금속입자 또는 금속 콜로이드; 산화철 등의 금속산화물 입자 또는 금속산화물 콜로이드; 셀렌, 텔루륨, 황 등의 비금속 입자; 혹은 염료 등으로 착색한 것을 포함하는 유색 라텍스 입자 등을 들 수 있고, 특히 금 콜로이드가 바람직하다.

(테스트 라인)

테스트 라인(122)은, 항체 고정화 멤브레인(120)에 있어서의 표지시약 유지 패드(130)보다 하류측에 위치하고 있고, 검출 대상물과 특이적으로 결합하는 물질이 고정화 시약으로서 배치되어 있음으로써, 검출부로서 기능한다. 도 1에 있어서, 검출부는 테스트 라인(122)으로서 라인 형상으로 형성되어 있지만, 검출부의 형상은 이것으로 한정되지 않고, 고정화 시약이 국소적으로 배치된 형상에 대응해서, 원 형상, 띠 형상 등의 임의의 형상일 수 있다. 단, 검출부의 형상은 라인 형상인 것이 바람직하고, 폭 0.5 내지 1.5㎜의 라인 형상인 것이 보다 바람직하다. 또, 표지시약 유지 패드(130)에의 표지시약의 고정화나, 테스트 라인(122)에의 고정화 시약(항체 등)의 고정화 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있다. 이들 고정화 방법으로서는, 고정화시켜야 할 시약을 크로마토그래프 매체에 물리적 수단 또는 화학적 수단에 의해 직접 고정화하는 방법이 있다. 직접 고정화하는 방법으로서는 물리흡착이나 공유결합이 있다. 일반적으로, 크로마토그래프 매체가 나이트로셀룰로스막 또는 혼합 나이트로셀룰로스 에스터 막인 경우, 물리흡착을 행할 수 있다. 또, 고정화한 후, 비특이적인 흡착에 의해 분석의 정밀도가 저하되는 것을 방지하기 위하여, 필요에 따라서, 공지의 방법으로 블로킹 처리를 행해도 된다.

(컨트롤 라인)

컨트롤 라인(124)은, 항체 고정화 멤브레인(120)에 있어서의 테스트 라인(122)보다 하류측에 위치하고 있고, 표지시약과 특이적으로 결합하는 물질이 고정화 시약으로서 배치되어 있다. 예를 들면 표지시약으로서 금 콜로이드 표지 마우스 단클론성 항체를 이용했을 경우에는, 예를 들면 항마우스 IgG 항체를 고정화시켜 두면 컨트롤부로서 기능한다. 표지시약이 컨트롤 라인(124)까지 이동하면, 컨트롤 라인(124)에 배치된 고정화 시약과 반응해서 표지시약이 집적된다. 그 결과, 컨트롤 라인(124)은 표지시약의 집적에 기인해서 발색 등을 나타내므로, 테스트 스트립(100) 상에서의 반응이 정상으로 진행된 것이 확인된다. 도 1에 있어서, 컨트롤부도 컨트롤 라인(124)으로서 라인 형상으로 형성되어 있지만, 컨트롤부의 형상은 이것으로 한정되지 않고, 고정화 시약이 국소적으로 배치된 형상에 대응해서, 원 형상, 띠 형상 등의 임의의 형상일 수 있다. 단, 컨트롤부의 형상은 라인 형상인 것이 바람직하고, 폭 0.5 내지 1.5mm의 라인 형상인 것이 보다 바람직하다.

(흡수 패드)

흡수 패드(150)는, 적하된 시료나 전개액이 크로마토그래프 매체를 이동함으로써 흡수되는 동시에, 검출부에 불용화되지 않은 미반응 표지물질 등을 흡수 제거하는 기능을 지니는 부재이다. 흡수 패드(150)의 구성 재료에 대해서 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 셀룰로스 여과지, 부직포, 천, 또는 셀룰로스 아세테이트 등의 흡수성 재료가 이용된다.

또, 이들 부재는, 모세관현상에 의해 시료가 이동될 수 있으면 되고, 샘플 패드, 표지시약 유지 패드, 테스트 라인, 컨트롤 라인, 및 흡수 패드 등을 기재에 붙여도, 단일의 다공성 부재 시트로 해도 된다.

(여과 필터)

여과 필터(200)는, 채변 용기나 마이크로튜브 등에 설치되어, 시료를 포함하는 추출액을 여과하고, 미소화된 고형물(협잡물)을 제거하기 위하여 이용된다. 여과 필터를 이용함으로써, 검사의 방해가 되는 고형분(협잡물)을 여과에 의해 제거할 수 있다. 또, 여과 필터의 구성 재료는, 검출 대상물에 대하여 불활성인 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 몰트 필터(モルトフィルタ-), 여과지, 수지소결 필터 등의 다공성 물질, 유리섬유, 탈지면 등의 섬유성 물질 등을 들 수 있고, 소정의 세공 직경을 지니는 몰트 필터, 수지소결 필터를 이용하는 것이 바람직하다.

시료와 접촉하는 부위, 예를 들면, 여과 필터나 시료 공급부, 표지시약 유지부 등의 각 부재에 산화제를 유지시키는 방법으로서는, 공지의 방법이면 되고, 예를 들면, 여과 필터나 시료 공급부, 표지시약 유지부 등의 제작 시에 이용되는 용액이나 완충액, 세정액 등에 산화제를 포함시켜서 각 부재에 도포, 적하, 함침 또는 분무 등 한 후, 이것을 동결 건조나 바람 건조 등에 의해 건조시켜서 유지시키는 방법 등을 들 수 있다.

각 부재가 산화제를 유지할 경우, 1시험당 시료가 접촉하는 산화제의 양(함침량)의 하한은, 바람직하게는 0.1n㏖/test 이상이고, 보다 바람직하게는 0.5n㏖/test 이상이다. 특히 샘플 패드 또는 여과 필터가 산화제를 유지할 경우, 함침량의 하한은, 바람직하게는 0.5n㏖/test 이상이고, 보다 바람직하게는 1.0n㏖/test 이상이며, 특히 바람직하게는 2.0n㏖/test 이상이다. 산화제를 패드류에 함침시킴으로써, 패드류의 산화제량을, 측정에 필요로 되는 양의 시료와 반응할 수 있는 양으로 하면 되고, 산화제의 사용량을 효율적으로 억제할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 이용해서 본 발명의 바람직한 실시형태를 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 각종 산화제의 첨가에 의한 비특이반응의 억제]

도 1에 나타낸 구조를 구비하는 노로바이러스 검출용의 면역크로마토그래피용 키트인 이뮤노캐치(イムノキャッチ)(등록상표)-노로(에이켄카가쿠 주식회사(EIKEN CHEMICAL CO., LTD) 제품)을 이용해서, 산화제의 사용에 의한 본 발명의 효과(비특이반응의 억제)을 확인했다. 또, 이뮤노캐치(등록상표)-노로의 테스트 스트립은, 나이트로셀룰로스막으로 이루어진 항체 고정화 멤브레인(120) 상에 표지시약 유지 패드(130)가 배치된 구성을 구비하고 있고, 표지시약 유지 패드(130)에는, 항노로바이러스 GI 마우스 단클론성 항체 결합 금 콜로이드액 및 항노로바이러스 GII 마우스 단클론성 항체 결합 금 콜로이드액이 함침되어 있다. 또한, 검출부인 테스트 라인(122)에는, 고정화 항체로서 항노로바이러스 GI 마우스 단클론성 항체 및 항노로바이러스 GII 마우스 단클론성 항체가 고정화되어 있다. 또, 컨트롤부인 컨트롤 라인(124)에는, 항마우스 IgG 토끼 항체가 고정화되어 있다. 또한, 이뮤노캐치(등록상표)-노로의 추출용 용액은, HEPES(N-2-하이드록시에틸피페라진-N'－2-에탄설폰산) 완충액(pH 7.0)으로 이루어져 있고, 아지화 나트륨을 함유하고 있다. 이것에 의해, 이뮤노캐치(등록상표)-노로의 최소 검출 감도는, 노로바이러스 GI에 대하여 2.5ng/mL, 노로바이러스 GII에 대하여 0.25ng/mL로 되어 있다.

본 실시예에서는, 우선, 이뮤노캐치(등록상표)-노로에 부속하는 추출용 용액에, 하기 표 1에 나타낸 종류·농도의 산화제를 첨가하거나(실시예), 또는 첨가하지 않고(비교예), 추출용 용액을 준비했다.

상기에서 준비한 추출용 용액(1mL)의 각각에, 인간으로부터 채취한 분변시료(20 내지 50mg)를 첨가하여, 교반하고, 현탁시켰다. 여기에서, 분변시료로서는, 검출 대상물인 노로바이러스의 존재를 RT-PCR법에 의해 확인 완료한 양성 검체, 노로바이러스의 부재를 확인 완료한 위양성 검체 및 음성 검체의 3종을 이용하였다.

다음에, 이 현탁시킨 시료를 이뮤노캐치(등록상표)-노로에 부속하는 여과 필터로 여과한 후, 샘플 웰(시료 공급부)에 3점적(90 내지 135μL) 적하하였다. 적하 후, 실온에서 15분간 정치시킨 후, 검출부의 라인을 확인했다. 구체적으로는, 면역크로마토 리더 C10066-10(하마마츠 포토닉스 주식회사(Hamamatsu Photonics K.K.) 제품)를 이용해서, 테스트 라인의 반사광 강도를 측정했다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 한편, 표 1에 기재된 수치[%]는 발색률(하기 수식에 의해 산출됨)을 나타내고 있고, 산화제를 첨가하고 있지 않은 시료(위양성 검체 또는 양성 검체)의 반사광 강도를 100이라고 했을 경우의 상대값이다. 또, 표 1에 기재된 「-」는, 음성(테스트 라인이 착색되지 않은 것)을 나타낸다. 또한, 산화제를 첨가하고 있지 않은 위양성 검체의 반사광 강도는 48.0mAbs이며, 양성 검체의 반사광 강도는 335.7mAbs였다. 또한, 산화제를 첨가한(또는 하고 있지 않은) 추출용 용액에 대해서도 마찬가지로 측정을 행했지만, 어느 쪽의 추출용 용액에 대해서도 반사광은 검출되지 않았다.

발색률［%］＝（각 시료의 검출부에 있어서의 반사광 강도(mAbs)/산화제 무첨가에서의 검출부에 있어서의 반사광 강도(mAbs))×100

또한, 본 실시예에서 이용한 산화제의 몇몇에 대해서, 산화 환원 전위의 값을 하기 표 1에 나타낸다. 여기에서, 산화제의 산화 환원 전위의 측정은 이하의 방법에 의해 행하였다.

산화 환원 전위의 측정 방법: 산화제를 정제수에 용해시키고, 10mM의 용액을 10mL 조제한다. 얻어진 용액에 대해서, 3.33㏖/L KCl-Ag/AgCl 전극을 이용해서 산화 환원 전위를 측정했다.

표 1에 나타낸 결과로부터, 각종 산화제를 추출용 용액에 첨가하고, 검출부의 상류에 있어서 분변시료를 산화제와 접촉시킴으로써, 위양성의 발생을 유의하게 억제할 수 있었던 것을 알 수 있다. 이것은, 분변시료에 포함되는 어떠한 성분에 기인하는 비특이반응이 억제된 것에 의한 것으로 생각된다. 한편, 양성 검체에 대한 발색률은, 산화제의 첨가에 의해서도 크게 저하되는 일은 없었던 것으로부터, 신속한 검사 및 진단에 도움이 된다는 면역학적 측정법의 이점을 훼손시키는 일은 없는 것도 확인되었다.

또한, 비특이반응의 진행과 이것에 따른 위양성의 발생을 산화제의 첨가에 의해 억제하는 효과는, 산화제의 농도 의존적으로 발현되는 것도 밝혀졌다. 많은 산화제에서는 0.1mM 정도의 지극히 저농도의 첨가에서도 전술한 효과를 발현하는 것이 가능하다. 한편, 산화제의 종류에 따라서는(예를 들면, 티메로살, 과망간산 칼륨), 첨가 농도가 커짐에 따라서 양성 검체의 발색률이 저하되어 버려, 소위 「위음성」이 생기기 쉬워지므로, 산화제의 첨가 농도는 많아도 수 mM 정도로 한정시킴으로써, 위양성 및 위음성의 발생을 모두 방지할 수 있는 것도 밝혀졌다.

[실시예 2: 산화제로서의 각종 요오드산염의 첨가에 의한 비특이반응의 억제]

산화제로서, 각종 요오드산염을 이용한 것 이외에는, 전술한 실시예 1과 마찬가지 수법에 의해, 산화제의 첨가에 의한 위양성의 발생의 억제 효과를 확인했다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 또, 본 실시예에서 이용한 산화제의 몇 가지에 대해서, 산화 환원 전위의 값을 하기 표 2에 나타낸다(산화 환원 전위의 측정 방법은 상기와 마찬가지이다).

표 2에 나타낸 바와 같이, 각종 요오드산염을 산화제로서 첨가했을 경우에 대해서도, 표 1에 나타낸 것과 마찬가지의 결과가 얻어졌다. 이것으로부터, 비특이반응의 발생과 이것에 따른 위양성의 발생을 억제한다는 본 발명의 효과는, 각종 요오드산염을 산화제로서 이용했을 경우에도 마찬가지로 발휘되는 것이 확인되었다.

[실시예 3: 테스트 스트립의 각 부위 또는 여과 필터에의 산화제의 첨가에 의한 비특이반응의 억제]

전술한 실시예 1 및 실시예 2에서는, 시료의 추출용 용액에 산화제를 첨가했지만, 본 실시예에서는, 추출용 용액이 아니라 테스트 스트립의 구성 요소의 일부 또는 여과 필터에 산화제(요오드산 칼륨)를 포함시킴으로써, 상기와 마찬가지의 효과(비특이반응의 억제)가 발휘되는지의 여부를 확인하였다.

(표지시약 유지 패드에의 산화제의 첨가 효과의 확인)

항NV-GI 마우스 항체 결합 금 콜로이드액 및 항NV-GII마우스 항체 결합 금 콜로이드액에, 요오드산 칼륨을 첨가하고, 얻어진 용액을 표지시약 유지 패드(유리섬유 여과지)에 함침시켜, 건조시켜서, 하기 표 3에 나타낸 각 함침량의 산화제를 포함하는 본 실시예의 표지시약 유지 패드를 얻었다. 또, 얻어진 표지시약 유지 패드에 있어서의 표지시약의 담지농도는 이뮤노캐치(등록상표)-노로에 있어서의 것과 마찬가지였다. 이와 같이 해서 얻어진 표지시약 유지 패드를 이용하여, 추출용 용액에 산화제를 첨가하지 않은 것 이외에는, 전술한 실시예 1 및 실시예 2와 마찬가지 수법에 의해, 각 검체에 있어서의 반사광 강도를 측정하고, 발색률을 산출했다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

(샘플 패드에의 산화제의 첨가 효과의 확인)

정제수에, 요오드산 칼륨을 첨가하고, 얻어진 용액을 샘플 패드(셀룰로스막)에 함침시켜, 건조시켜서, 하기 표 3에 나타낸 각 함침량의 산화제를 포함하는 본 실시예의 샘플 패드를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 샘플 패드를 이용하여, 추출용 용액에 산화제를 첨가하지 않은 것 이외에는, 전술한 실시예 1 및 실시예 2와 마찬가지 수법에 의해, 각 검체에 있어서의 반사광 강도를 측정하고, 발색률을 산출했다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

(여과 필터에의 산화제의 첨가 효과의 확인)

정제수에, 요오드산 칼륨을 첨가하고, 얻어진 용액을 셀룰로스막에 함침시키고, 건조시켜, 하기 표 3에 나타낸 각 함침량의 산화제를 포함하는 산화제 함유 셀룰로스막을 얻었다. 얻어진 산화제 함유 셀룰로스막을, 이뮤노캐치(등록상표)-노로의 검체 추출 용기에 부속된 여과 필터에 포개서 추출액의 여과를 행하고, 추출용 용액에 산화제를 첨가하지 않은 것 이외에는, 전술한 실시예 1 및 실시예 2와 마찬가지 수법에 의해, 각 검체에 있어서의 반사광 강도를 측정하고, 발색률을 산출했다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다. 또, 하기 표 3에 나타낸 함침량은, 각각의 부재가 함유하는 요오드산 칼륨량이며, 1테스트당 시료와 반응하는 양이다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 산화제의 첨가에 의한 비특이반응의 억제와 이것에 따른 위양성의 발생의 억제 효과는, 산화제를 추출용 용액이 아니라 테스트 스트립의 각 구성 요소 또는 여과 필터에 포함시켰을 경우이어도 마찬가지로 발휘되는 것이 확인되었다.

본 출원은, 2015년 8월 28일자로 출원된 일본 특허출원 번호 2015-169742호에 의거하고 있으며, 그 개시 내용은, 참조에 의해 전체로서 편입되어 있다.

10: 면역크로마토그래피용 키트 100: 테스트 스트립
110: 플라스틱제 점착 시트
120: 항체 고정화 멤브레인(크로마토그래프 매체)
122: 테스트 라인(검출부) 124: 컨트롤 라인(컨트롤부)
130: 표지시약 유지 패드(표지시약 유지부)
140: 샘플 패드(시료 공급부) 150: 흡수 패드
200: 여과 필터 300: 추출용 용액 또는 전개액

Claims

분변시료를 이용한 면역학적 측정법에 이용되는 시약 조성물로서, 1~100 mM의 과산화요소, 0.1~100 mM의 과산화수소, 0.1~100 mM의 요오드산염, 0.1~100 mM의 알칼리 금속의 페리사이안화물, 10~1000 units/mL의 글루코스 옥시다제, 0.1 내지 10 mM의 티메로살, 0.1 mM 내지 10 mM의 과망간산염 및 0.1 내지 100 mM의 과요오드산염으로 구성되는 군으로부터 선택된 산화제로 이루어진 비특이적 반응 억제제를 포함하는, 시약 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 면역학적 측정법이 면역크로마토그래피법인, 시약 조성물.
제1항에 기재된 시약 조성물을 포함하는, 분변시료의 추출용 용액.
제1항에 기재된 시약 조성물을 포함하는, 분변시료의 전개액.
시료 공급부와,
상기 시료 공급부의 하류측에 위치하는 크로마토그래프 매체와,
상기 크로마토그래프 매체의 일부에 위치하는, 표지시약이 용출 가능하게 유지된 표지시약 유지부와,
상기 크로마토그래프 매체의 일부로서 상기 표지시약 유지부보다 하류측에 위치하는, 고정화 항체를 포함하는 검출부
를 포함하는 테스트 스트립으로서,
제1항에 기재된 시약 조성물을 포함하는, 테스트 스트립.
제8항에 있어서, 상기 시약 조성물이, 상기 시료 공급부로부터 상기 크로마토그래프 매체에 있어서의 상기 검출부의 상류까지의 어느 하나의 부위에 포함되어 있는, 테스트 스트립.
제1항에 기재된 시약 조성물을 포함하는, 분변시료를 여과하기 위한 여과 필터.
제6항에 기재된 추출용 용액 또는 제7항에 기재된 전개액, 제8항 또는 제9항에 기재된 테스트 스트립, 및 제10항에 기재된 여과 필터 중 적어도 하나를 포함하는, 분변시료 중의 검출 대상물을 검출 또는 정량하기 위한 면역학적 측정법에 이용되는 면역학적 측정용 키트.
시료 공급부와,
상기 시료 공급부의 하류측에 위치하는 크로마토그래프 매체와,
상기 크로마토그래프 매체의 일부에 위치하는, 표지시약이 용출 가능하게 유지된 표지시약 유지부와,
상기 크로마토그래프 매체의 일부로서 상기 표지시약 유지부보다 하류측에 위치하는, 고정화 항체를 포함하는 검출부
를 포함하는 테스트 스트립을 이용해서, 면역학적 측정법에 의해 분변시료 중의 검출 대상물을 검출 또는 정량하는 방법으로서,
제1항에 기재된 시약 조성물을 이용하는, 방법.
제12항에 있어서,
상기 시료 또는 그 여과 처리물과 추출용 용액 또는 전개액의 혼합물을 상기 시료 공급부에 공급하는 공정과,
상기 검출 대상물과 상기 표지시약의 복합체를 상기 검출부에 있어서 검출하는 공정을 포함하되,
상기 검출부의 상류에 있어서, 상기 혼합물을 상기 산화제와 접촉시키는 공정을 더 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 혼합물을 상기 산화제와 접촉시키는 공정은, 상기 표지시약 유지부의 상류에 있어서 행해지는, 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 추출용 용액 또는 상기 전개액이 상기 산화제를 포함하고, 상기 혼합물을 상기 산화제와 접촉시키는 공정은 상기 시료와 상기 추출용 용액 또는 상기 전개액의 혼합 시에 행해지는, 방법.
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제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 대상물이 바이러스, 세균 또는 변잠혈인, 방법.
제1항 또는 제5항에 기재된 시약 조성물과 분변시료를 접촉시키는 공정을 포함하는, 면역학적 측정법에 있어서의 비특이반응의 억제 방법.