JP5474784B2 - 結合アッセイ用多孔性固相及びこれを用いた結合アッセイ法 - Google Patents
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Description
また、特許文献3の実施例に記載されるようなフロースルー式では洗浄工程を具備する場合もあるが、例えば、多数の測定試料を一度に測定しようとする場合、実用的時間内に再現性良く測定するためには、加圧や吸引(メンブレン下の吸水パッドの容量を増やすなど)などの補助手段が必要となり、簡便性やコストの面で不利益なものとなる。
なお、白色のメンブレンを用い光学的に検出する通常のイムノクロマト法において、該測定波形の乱れは、メンブレンにおける該当部位の色がその周辺の色よりも白く、色が抜けているように見える現象として目視でもとらえることができる。
このような測定波形の乱れを問題としてとらえた従来技術はなく、該問題を解消する方法は今までに知られていない。
[1](A)下記一般式(I)
R1−(G)x (I)
(式中、R1は置換基を有していてもよい直鎖又は分岐鎖の炭素数5〜10のアルキル基を表し、Gは炭素数5又は6の還元糖に由来する残基であり、xは還元糖の縮合度を示す値であって1〜3の数を示す。R1とGとは、酸素原子又はイオウ原子を介するエーテル結合により連結されている)で表される化合物からなる糖含有界面活性剤、
(B)構成脂肪酸の炭素数が5〜14であるショ糖脂肪酸エステルからなる糖含有界面活性剤、
(C)ステロイド系界面活性剤
上記(A)〜(C)からなる群から選ばれる一種以上の界面活性剤を、測定試料の添加前に含むことを特徴とする、結合アッセイ用多孔性固相。
[2](A)からなる群が、n−オクチル−β−D−グルコシド及び/又はn−ヘプチル−β−D−チオグルコシドである、[1]に記載の結合アッセイ用多孔性固相。
[3](B)からなる群が、モノカプロン酸スクロース及び/又はモノラウリン酸スクロースである、[1]に記載の結合アッセイ用多孔性固相。
[4](C)からなる群が、コール酸ナトリウム及び/又は3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CHAPS)である、[1]に記載の結合アッセイ用多孔性固相。
[5]結合アッセイが、免疫測定法である、[1]〜[4]のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相。
[6]結合アッセイが、ラテラルフロー式、ディップスティック式又はフロースルー式メンブレンアッセイ法である[1]〜[5]のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相。
[7]捕捉試薬が固定化されている、[1]〜[6]のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相。
[8]捕捉試薬が、抗体、特異的捕捉物質又は抗原である、[7]に記載の結合アッセイ用多孔性固相。
[9][1]〜[8]のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相を含むことを特徴とする結合アッセイ用ストリップ。
[10]検出試薬を含有するコンジュゲートリリースパッドをさらに含む、[9]に記載の結合アッセイ用ストリップ。
[11]検出試薬が、標識された抗体、標識された特異的捕捉物質又は標識された抗原である、[10]に記載の結合アッセイ用ストリップ。
[12]標識が、粒径の異なる2種類の金コロイドによる標識である、[11]に記載の結合アッセイ用ストリップ。
[13]コンジュゲートリリースパッドがアミノ酸類を含む、[10]〜[12]のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップ。
[14]サンプルパッド及び/又は血球分離パッドをさらに含む、[9]に記載の結合アッセイ用ストリップ。
[15]サンプルパッドが抗凝固剤を含む、[14]に記載の結合アッセイ用ストリップ。
[16]以下の(1)〜(4)
(1)サンプルパッド
(2)サンプルパッドの下にサンプルパッドに接して配置された、検出試薬を含有するコンジュゲートリリースパッド
(3)コンジュゲートリリースパッドと下記(4)の多孔性固相の間に配置された血球分離パッド
(4)捕捉試薬が固定化された多孔性固相、
からなるラテラルフロー式結合アッセイ法を行うためのストリップにおいて、多孔性固相が[1]〜[8]のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相であることを特徴とする結合アッセイ用ストリップ。
[17][9]〜[16]のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップを搭載したデバイス。
[18][1]〜[8]のいずれかに記載の多孔性固相を使用することを特徴とする結合アッセイ法。
[19][9]〜[16]のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップを使用することを特徴とする結合アッセイ法。
[20]測定試料が[1]に記載の結合アッセイ用多孔性固相を移動及び/又は通過する際に形成される、該多孔性固相上に固定化された捕捉試薬によって捕捉された測定試料中の測定対象物と検出試薬との複合体、を測定する結合アッセイ法。
[21]測定試料が、全血である[18]〜[20]のいずれかに記載の結合アッセイ法。
[22]
(A)下記一般式(I)
R1−(G)x (I)
(式中、R1は置換基を有していてもよい直鎖又は分岐鎖の炭素数5〜10のアルキル基を表し、Gは炭素数5又は6の還元糖に由来する残基であり、xは還元糖の縮合度を示す値であって1〜3の数を示す。R1とGとは、酸素原子又はイオウ原子を介するエーテル結合により連結されている)で表される化合物からなる糖含有界面活性剤、
(B)構成脂肪酸の炭素数が5〜14であるショ糖脂肪酸エステルからなる糖含有界面活性剤、
(C)ステロイド系界面活性剤
上記(A)〜(C)からなる群から選ばれる一種以上の界面活性剤を、測定試料の添加前に含む結合アッセイ用多孔性固相を用いることを特徴とする、ラテラルフロー式あるいはディップスティック式結合アッセイ方法における測定試料の展開不良を改善する方法。
[23]測定試料が、Ht値が50%以上の試料である[22]に記載の方法。
[24]
(A)下記一般式(I)
R1−(G)x (I)
(式中、R1は置換基を有していてもよい直鎖又は分岐鎖の炭素数5〜10のアルキル基を表し、Gは炭素数5又は6の還元糖に由来する残基であり、xは還元糖の縮合度を示す値であって1〜3の数を示す。R1とGとは、酸素原子又はイオウ原子を介するエーテル結合により連結されている)で表される化合物からなる糖含有界面活性剤、
(B)構成脂肪酸の炭素数が5〜14であるショ糖脂肪酸エステルからなる糖含有界面活性剤、
(C)ステロイド系界面活性剤
上記(A)〜(C)からなる群から選ばれる一種以上の界面活性剤を、測定試料の添加前に含む結合アッセイ用多孔性固相を用いることを特徴とする、ラテラルフロー式あるいはディップスティック式結合アッセイ方法における測定試料の測定波形の乱れを改善する方法。
以下、測定試料が全血である場合を中心に本発明を実施するための最良の形態について説明する。
が用いられる。
(A)下記一般式(I)
R1−(G)x (I)
(式中、R1は置換基を有していてもよい直鎖又は分岐鎖の炭素数5〜10のアルキル基を表し、Gは炭素数5又は6の還元糖に由来する残基であり、xは還元糖の縮合度を示す値であって1〜3の数を示す。R1とGとは、酸素原子又はイオウ原子を介するエーテル結合により連結されている)で表される化合物からなる糖含有界面活性剤である。
(B)構成脂肪酸の炭素数が5〜14であるショ糖脂肪酸エステルからなる糖含有界面活性剤である。
(C)ステロイド系界面活性剤である。
(1)金コロイド標識抗Dダイマー抗体(抗DD抗体コンジュゲート)の作製1OD/mLの金コロイド(粒径40nm)を含む炭酸カリウム緩衝液(pH8.0)200mLに対し、92.4μg/mLの抗Dダイマーモノクローナル抗体(抗DD抗体)を含む2mmol/Lホウ酸緩衝液(pH8.0)10mLを加え、室温で10分間撹拌した。該金コロイド−抗DD抗体混合液に対し、10%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を20mL添加し、さらに5分間撹拌の後、10℃にて、10,000rpmで45分間遠心し、沈渣(コンジュゲート)を得た。得られたコンジュゲートに対し、Conjugate Dilution Buffer(Scripps社製)を添加し、17OD/mLとなるように希釈し、コンジュゲートを懸濁させた。吸光度は、524nm(使用した金コロイドの最大吸収波長)で測定した。
(2)コンジュゲートリリースパッドの作製
上記(1)で調製したコンジュゲートを、4OD/mLとなるように、1.33%カゼイン、4%スクロース溶液(pH7.5)と混合してコンジュゲート溶液を作製し、13.0mm×254mm×0.56mm(幅×長さ×厚さ)のグラスファイバー製パッド(日本ポール社、No.8964)に該パッド体積の1.2倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、30分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートリリースパッドとした。
(3)抗DD抗体固定化メンブレン(結合アッセイ用多孔性固相)の作製
25mm×254mm×0.235mm(短辺×長辺×厚さ)のニトロセルロースメンブレン(ミリポア社、HF240)の長辺の一端から11mm内側の位置に、長辺と並行して1mg/mL抗DD抗体及び2.5%スクロースを含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)を、イムノクロマト用ディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社)を用いて1μL/cm幅でライン状に塗布した。ドライオーブン内で70℃、45分乾燥し、抗DD抗体固定化メンブレンとした。
(4)サンプルパッドの作製
25mmol/L NaCl、0.5%スクロース及び0.25mg/mL HETERO BLOCK(オメガバイオロジカルス社、500−11−001)を含む20mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.2)よりなるサンプルパッド含浸液を、16mm×254mm×0.55mm(短辺×長辺×厚さ)に切断したグラスファイバー製パッド(Lydall社)に対し該パッド体積の1.15倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、45分乾燥し、サンプルパッドとした。
(5)結合アッセイ用ストリップ(テストストリップ)の作製
プラスチック製粘着シート(g)に上記抗DD抗体固定化メンブレン(d)を貼り、該メンブレンの抗DD抗体(e)を塗布した側と反対の端に血球分離パッド(c)(日本ポール社、BTS−SP300)を配置装着し、抗DD抗体を塗布した側の端には吸収体(f)(ワットマン社、740−E)を配置装着した。また該血球分離パッドに重なるように上記(2)で作製したコンジュゲートリリースパッド(b)を配置装着し、さらにこのコンジュゲートリリースパッドに重なるように上記(4)で作製したサンプルパッド(a)を配置装着して、最後に多孔性固相および吸収体を被覆するように上面にポリエステルフィルム(h)を配置装着しラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を6mm幅に切断してテストストリップを作製した。該テストストリップの外寸は、6mm×70mm(幅×長さ)であり、アッセイの際、プラスチック性の専用のハウジング(サンプル添加窓部及び検出窓部を有する、図1中図示せず)に格納・搭載し、イムノクロマトデバイスの形態にした。図1にテストストリップの模式構成図を示した。
(1)本発明の抗DD抗体固定化メンブレン(結合アッセイ用多孔性固相)の作製
先ずニトロセルロースメンブレン(ミリポア社、HF240)を、表1に示した本発明の界面活性剤をそれぞれ0.05%(w/v)の濃度で含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)に浸漬し、室温で30分間振盪した。余分な液を取り除いた後、37℃ドライオーブンで1時間乾燥した。得られた界面活性剤を含むメンブレンについて、比較例1(3)に記載の操作を行い、本発明の抗DD抗体固定化メンブレンを作製した。
(2)本発明のイムノクロマトデバイスの組み立て
比較例1(2)のコンジュゲートリリースパッド、同(4)のサンプルパッド、上記本発明の抗DD抗体固定化メンブレンを用い、比較例1(5)に記載の操作により、本発明のテストデバイスを作製した。
(1)高Ht値模擬全血の作製
全血を遠心分離して得た血球層に対し同一全血から得た血漿を添加し、再構成後のHt値が70%を示す高Ht値模擬全血を作製した。
(2)試験方法
高Ht値模擬全血100μLを、実施例1で作製した本発明のデバイスのテストストリップのサンプルパッド部に添加し、添加15分後に展開された液体の先端を示すコンジュゲートに由来する赤紫色ラインが、テストストリップ終端の吸収紙まで到達するか否かを目視により確認した。テストストリップ終端の吸収紙まで赤紫色ラインが到達した場合には、展開不良の改善効果ありと判定した。結果を表1に示した。なお、比較例1の抗DD抗体固定化メンブレンに、コンジュゲート溶液を直接添加し、展開を確認した試験において、プラスチック製粘着シートの有無による展開時間の変動は観察されなかった。
比較例1のテストストリップでは、抗DD抗体の塗布ラインより手前までしか赤紫色ラインは移動しなかった。一方、n−オクチル−β−D−グルコシド、n−ヘプチル−β−D−チオグルコシド及びモノカプロン酸スクロースを含有する本発明のテストストリップでは、テストストリップ終端の吸収紙まで赤紫色ラインの移動が確認された。
以上より、n−オクチル−β−D−グルコシド、n−ヘプチル−β−D−チオグルコシド及びモノカプロン酸スクロースは、結合アッセイ用多孔性固相における測定試料の展開不良の改善効果ありと判定した(表1効果の欄に○印で表示)。
(1)精製Dダイマー(DD)添加高Ht値模擬全血(DD模擬全血)の作製全血を遠心分離して得た血球層に対し、精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)および同一全血から得た血漿を添加し、DDの終濃度が1.0μg/mLかつ再構成後のHt値が70%を示すようにDD模擬全血を作製した。
(2)試験方法
DD模擬全血100μLを、実施例1で作製した本発明の結合アッセイ用多孔性固相(n−オクチル−β−D−グルコシド含有)含むイムノクロマトデバイスのサンプルパッド部に添加し、イムノクロマトリーダーICA−1000(浜松ホトニクス社)を用いてテストデバイスの検出窓部の反射吸光度(以下、各実施例において単に吸光度という)の変化を、添加1分後から添加15分後まで1分間隔で経時的に測定した。なお、各実施例における吸光度の測定は、前記と同じ測定装置を用いて行った。
(3)試験結果
本発明の結合アッセイ用多孔性固相を使用したテストストリップでは、DD模擬全血添加10分後に吸光度の増加が観察されると共に、DD模擬全血添加15分後まで吸光度の直線的増加が認められた。この結果は二回の測定でほぼ同様であった(以上、図2中の実施例)。一方、従来の結合アッセイ用多孔性固相を使用したテストストリップでは、一回目の測定では、DD模擬全血添加14分後まで吸光度の増加が観察されず、吸光度増加が観察された添加15分後の吸光度も本発明のテストストリップの10分後の吸光度よりも低い吸光度であった。また、二回目の測定ではDD模擬全血添加11分後に吸光度の増加が確認されたが、DD模擬全血添加15分後まで測定しても本発明のテストストリップにおいて示された吸光度と同レベルの吸光度に達することはなかった(以上、図2中の比較施例)。
以上のように、本発明のテストストリップでは、極端に液体成分の少ない全血(例えばHt値70%)を測定試料とする場合であっても、良好な再現性で測定可能であり、本発明は結合アッセイ用多孔性固相における測定試料の展開不良の改善効果が顕著であることが確認された。
(1)DD模擬全血の作製
実施例3と同様の操作により、DD模擬全血を作製した。
(2)本発明のイムノクロマトデバイスの作製
界面活性剤としてn−オクチル−β−D−グルコシド、n−ヘプチル−β−D−チオグルコシド、モノラウリン酸スクロースを使用し、実施例1に記載の操作により作製した。
(3)試験方法
DD模擬全血100μLを上記(2)で作製した本発明のイムノクロマトデバイスのサンプルパッド部に添加し、添加15分後のテストデバイスの検出窓部の吸光度を測定した。測定はn=5で行い、測定値のCV(%)を算出し、従来の結合アッセイ用多孔性固相からなるテストストリップを搭載したイムノクロマトデバイスと比較した。
(4)試験結果
本発明のテストストリップは、従来のテストストリップと比較して顕著に小さいCV(%)を示した(図3)。このように、本発明の結合アッセイ用多孔性固相を使用すると、Ht値が極端に高い測定試料であっても良好な再現性での測定が可能であること、及び本発明は結合アッセイ用多孔性固相における測定試料の展開不良を改善し、正確な測定を可能にすることが確認された。
(1)精製Dダイマー(DD)添加高Ht値模擬全血(DD模擬全血)の作製全血を遠心分離して得た血球層に対し、精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)および同一全血から得た血漿を添加し、DDの終濃度が1.0μg/mLかつ再構成後のHt値が62%を示すようにDD模擬全血を作製した。
(2)抗DD抗体固定化メンブレン(結合アッセイ用多孔性固相)の作製
実施例1(1)に記載の本発明の抗DD抗体固定化メンブレン(結合アッセイ用多孔性固相)の作製方法において、10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)に添加した各界面活性剤の濃度を0、0.01、0.05、0.075、0.10%(w/v)とした以外は、実施例1と同じ方法を用いた。
(3)試験方法
実施例4(3)と同じ方法で測定を行った。測定値のCV(%)を算出して至適濃度範囲を決定した。
(4)試験結果
図4に示すように、今回試験した濃度においては、いずれの界面活性剤でも従来法と比較して良好な再現性を示した。ここでは、CV値が従来法の半分である15%以下を満たす場合を効果ありと判断した。本試験例の界面活性剤は0.01〜0.10%の範囲でいずれもCV値が15%未満であり、従来法に比べ十分な効果を発揮することが確認された。
(1)コントロールライン用金コロイド標識KLH(KLHコンジュゲート)の作製
1OD/mLの金コロイド(粒径40nm)を含む炭酸カリウム緩衝液(pH8.0)200mLに対し、620μg/mLとなるようKLH粉末を溶解した2mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.1)10mLを加え、室温で10分間撹拌した。該金コロイド−KLH混合液に対し、10%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を20mL添加し、さらに5分間撹拌の後、10℃にて、10,000rpmで45分間遠心し、沈渣(コンジュゲート)を得た。得られたコンジュゲートに対し、Conjugate Dilution Buffer(Scripps社製)を添加し、17OD/mLとなるように希釈し、コンジュゲートを懸濁させた。吸光度は、531nm(使用した金コロイドの最大吸収波長)で測定した。
(2)コンジュゲートリリースパッドの作製
比較例1(1)で調製した抗DD抗体コンジュゲートを4OD/mLとなるように、上記(1)で調製したKLHコンジュゲートを4.5OD/mLとなるように、1.33%カゼイン、4%スクロース溶液(pH7.5)と混合してコンジュゲート溶液を作製し、13.0mm×254mm×0.56mm(幅×長さ×厚さ)のグラスファイバー製パッド(日本ポール社、No.8964)に該パッド体積の1.2倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、30分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートリリースパッドとした。
(3)抗DD抗体および抗KLHポリクローナル抗体固定化メンブレン(結合アッセイ用多孔性固相)の作製
実施例1(1)と同様に、ニトロセルロースメンブレンを、本発明の各界面活性剤を所定の濃度で含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)に浸漬し、室温で30分間振盪した。余分な液を取り除いた後、37℃ドライオーブンで1時間乾燥した。25mm×254mm×0.235mm(短辺×長辺×厚さ)のニトロセルロースメンブレン(ミリポア社、HF240)の長辺の一端から内側11mmの位置に、長辺と並行して、1mg/mL抗DD抗体及び2.5%スクロースを含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)を、同様に同一端から15mmの位置に、長辺と並行して、0.5mg/mL抗KLHポリクローナル抗体及び2.5%スクロースを含む10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)を、イムノクロマト用ディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社)を用いて1μL/cm幅でライン状に塗布した。ドライオーブン内で70℃、45分乾燥し、抗DD抗体固定化メンブレンとした。
(4)サンプルパッドの作製
比較例1(4)と同様にサンプルパッドを作製した。
(5)イムノクロマトデバイスの作製
上記(2)のコンジュゲートリリースパッド、同(3)のメンブレン、同(4)のサンプルパッドを用いて、比較例1(5)記載の操作により、コントロールラインを含むテストストリップおよび、イムノクロマトデバイスを作製した。図5にテストストリップの模式構成図を示した。
後述する実施例7及び実施例9において、テストラインとは、上記抗DD抗体固定化メンブレン(d)の抗DD抗体(e)が固定化されている位置に測定試料が到達して検出されるライン(図5(e)の位置に現れる)をいい、コントロールラインとは、同メンブレンにコントロール捕捉試薬(抗KLHポリクローナル抗体)が固定化されている位置に測定試料が到達して検出されるライン(図5(j)の位置に現れる)をいう。
(1)Dダイマー(DD)添加濃縮血漿(DD濃縮血漿)の作製
凍結乾燥した0.5mLの健常人血漿を、0.25mLの精製水で溶解することにより2倍濃縮した血漿を調製した。そこへ、精製DDを含む10mmol/Lトリス塩緩衝液(pH8.0)を添加し、終濃度DD1.0μg/mLとなるようにDD添加濃縮血漿を作製した。
(2)試験方法
DD濃縮血漿100μLを実施例6で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッド部に添加し、DD濃縮血漿添加15分後のテストデバイスの検出窓部の吸光度を測定した。測定はn=5で行い、測定値のCV(%)を算出し、従来法のイムノクロマトデバイス(本発明の界面活性剤を含まない以外は実施例6のイムノクロマトデバイスと同じ)と比較した。
(3)試験結果
テストラインの検出結果を図6に、コントロールラインの検出結果を図7に示す。本発明の界面活性剤のいずれを用いた場合においても、従来のイムノクロマトデバイスでの測定と比較してCV(%)が減少した。コントロールラインの検出においては、従来法では展開液の先端がテストラインに到達しないために再現性不良になっていたところ、本発明の結合アッセイ用多孔性固相を用いた場合には、測定試料の展開不良の改善によって再現性が大幅に向上した。以上より、本発明の結合アッセイ用多孔性固相は、血漿成分が2倍濃厚になった状態の測定試料であっても良好な再現性での測定が可能であること、および本発明は結合アッセイ用多孔性固相における測定試料の展開不良を改善し、正確な測定を可能にすることが確認された。
(1)材料及び試験方法
使用した界面活性剤がコール酸ナトリウムとCHAPSであること以外は実施例2に記載の材料及び試験方法を用いた。
コール酸ナトリウムを含有する本発明のテストストリップでも、実施例2に示した界面活性剤と同様にテストストリップ終端の吸収紙まで赤紫色ラインが移動した。
よって、コール酸ナトリウムおよびCHAPSは、結合アッセイ用多孔性固相における測定試料の展開不良の改善効果ありと判定した(表2効果の欄に○印で表示)。
(1)材料及び試験方法
界面活性剤の種類がコール酸ナトリウムあるいはCHAPSである以外は、実施例4と同じ方法を用いた。
(2)試験結果
テストラインの検出結果を図8に、コントロールラインの検出結果を図9に示す。テストライン及びコントロールラインの検出において、コール酸ナトリウムあるいはCHAPSで処理した本発明のテストストリップは、従来法のテストストリップと比較して顕著に低いCV(%)を示した(図8、図9)。特にコントロールラインの検出では、従来法のCV(%)が著しく高かったが、これは展開不良のため測定試料がコントロールラインまで到達していないことに起因する。このように、コール酸ナトリウムあるいはCHAPSを使用した場合も、Ht値が極端に高い測定試料を再現性良く測定できた。
(1)粒径60nm金コロイド標識抗Dダイマー抗体の添加
1OD/mLの金コロイド(粒径60nm)を含む炭酸カリウム緩衝液(pH8.0)200mLに対し、46.2μg/mLの抗Dダイマーモノクローナル抗体(抗DD抗体)を含む2mmol/Lホウ酸緩衝液(pH8.0)10mLを加え、室温で10分間撹拌した。該金コロイド−抗DD抗体混合液に対し、10%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を10mL添加し、さらに5分間撹拌の後、10℃にて、10,000rpmで45分間遠心し、沈渣(コンジュゲート)を得た。得られたコンジュゲートに対し、Conjugate Dilution Buffer(Scripps社製)を添加し、17OD/mLとなるように希釈し、コンジュゲートを懸濁させた。吸光度は、531nm(使用した金コロイドの最大吸収波長)で測定した。
(2)コンジュゲートリリースパッドの作製
40nm金コロイド標識抗Dダイマー抗体と60nm金コロイド標識Dダイマー抗体を、各々4OD/mLとなるように、1.33%カゼイン、4%スクロース溶液(pH7.5)と混合してコンジュゲート溶液を作製し、13.0mm×254mm×0.56mm(幅×長さ×厚さ)のグラスファイバー製パッド(日本ポール社、No.8964)に該パッド体積の1.2倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、30分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートリリースパッドとした。
(3)本発明のイムノクロマトデバイスの作製
コンジュゲートリリースパッドが上記(2)で作製したものであること以外、実施例1と同様に行った。使用した界面活性剤はn−ヘプチル−β−D−チオグルコシドである。
(3)精製Dダイマー(DD)添加高Ht値模擬全血(DD模擬全血)の作製全血を遠心分離して得た血球層に対し、精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)および同一全血から得た血漿を添加し、再構成後のHt値が60%を示すようにDD模擬全血を作製した。DD濃度は0、3.0、15μg/mLになるように調整した。
(4)試験結果
2種類の粒径の金コロイドを用いた測定系において、従来法(単一粒径の金コロイド使用)と比較して本発明の多孔性固相を用いた場合では、検出感度が向上し、測定対象物が高濃度の測定試料においてもより定量的な測定が可能になった(図10)。
(1)精製Dダイマー(DD)添加高Ht値模擬全血(DD模擬全血)の作製全血を遠心分離して得た血球層に対し、精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)および同一全血から得た血漿を添加し、DDの終濃度が1.0μg/mLかつ再構成後のHt値が60%を示すようにDD模擬全血を作製した。
(2)抗DD抗体固定化メンブレン(結合アッセイ用多孔性固相)の作製
実施例1(1)に記載の本発明の抗DD抗体固定化メンブレン(結合アッセイ用多孔性固相)の作製方法において、用いた界面活性剤がコール酸ナトリウムであり、10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)に添加した界面活性剤の濃度を0、0.01、0.05、0.075、0.1、0.5%(w/v)とした以外は、実施例1と同じ方法を用いた。
(3)試験方法
実施例4(3)と同じ方法で測定を行った。測定値のCV(%)を算出して至適濃度範囲を決定した。
(4)試験結果
図11に示すように、今回試験した濃度においては、いずれの界面活性剤濃度でも従来法と比較して顕著に良好な再現性を示した。ここでは、CV値が従来法の半分である10%以下を満たす場合を効果ありと判断した。本試験例の界面活性剤は0.01〜0.5%の範囲でいずれもCV値が10%未満であり、従来法に比べ十分な効果を発揮することが確認された。
(1)Dダイマー(DD)添加濃縮血漿(DD濃縮血漿)の作製
凍結乾燥した0.5mLの健常人血漿を、0.25mLの精製水で溶解することにより2倍濃縮した血漿を調製した。そこへ、精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を終濃度1.0μg/mLとなるように精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を添加し、DD添加濃縮血漿を作製した。
(2)イムノクロマトデバイスの作製方法
10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)中に含まれる界面活性剤として、0.05%n−ヘプチル−β−D−チオグルコシドあるいは0.05%Tween20、0.05%TritonX−100を用いた以外は、実施例6(3)と同様の方法で抗DD抗体および抗KLHポリクローナル抗体固定化メンブレンを作製した。上記メンブレンを用いて実施例6(5)と同様の方法でイムノクロマトデバイスを作製した。
(3)試験方法
DD濃縮血漿120μLを上記(2)で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッド部に添加し、DD濃縮血漿添加15分後のテストデバイスの検出窓部の吸光度を測定した。測定はn=5で行い、それぞれ測定波形の形状を確認した。
本発明のイムノクロマトデバイス(n−ヘプチル−β−D−チオグルコシド前処理)と、界面活性剤を含浸させないニトロセルロースメンブレンを用いたイムノクロマトデバイス(従来法)及び固相に含浸させる界面活性剤にTritonX−100、Tween20を用いたイムノクロマトデバイス(TritonX−100前処理、Tween20前処理)とを比較した。
(4)試験結果
図12に、各試験条件における測定波形の形状を示した。図左側が上流側、図右側が下流側であり、下向きに検出されるピークがシグナルである。最初に現れるピークがテストラインに由来するピークであり、後に現れるピークがコントロールラインに由来するピークである。先述したように反射吸光度は、ピークとその近傍の反射光強度を測定し、その比を用いて算出するのでピーク付近の反射光強度の変化は測定精度に影響を与える。従ってピーク前後の反射光強度は一定であることが理想である。
図12の(a)従来法、(c)TritonX−100前処理、(d)Tween20前処理のいずれにおいても、ピークの前後に上向きの反射光強度の変化が認められた。特にTween20で前処理した多孔性固相では、極端な反射光強度の変化(図12(d))が観察された。
これに対し、本発明の界面活性剤で前処理した多孔性固相(図12(b))は、ピーク前後で反射光強度の変化を認めなかった。
テストラインにおける反射吸光度の分布を図13に示した。本発明の界面活性剤で前処理した多孔性固相を用いた場合には、測定される反射吸光度の分散が少なく良好な再現性を示し、かつ高感度であったが、その他の条件では分散が大きく、Tween20では反射吸光度を算出できない(測定不可能になる)場合さえあった。
(1)Dダイマー(DD)添加濃縮血漿(DD濃縮血漿)の作製
実施例12と同様の操作により、DD濃縮血漿を作製した。
(2)固相洗浄液の調製
10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)に、n−ヘプチル−β−D−チオグルコシドあるいはTween20、TritonX−100を終濃度0.05%(w/v)になるよう添加し、固相洗浄液を調製した。
(3)試験方法
DD濃縮血漿120μLを、本発明のテストストリップ、および従来法で作製されたテストストリップの、サンプルパッド部に添加した。15分後、本発明のテストストリップのテストデバイスの検出窓部の吸光度を測定した。従来法で作成されたテストデバイスには、DD濃縮血漿添加から5分後に、50μLの固相洗浄液を添加し、DD濃縮血漿添加から15分後のテストデバイスの検出窓部の吸光度を測定した。
(4)試験結果
本発明の界面活性剤の多孔性固相への添加方法を固相洗浄液とした場合、測定波形の乱れは改善されなかった(図14(c)の矢印部分)。同様に、図14の(b)従来法、(d)TritonX−100を含む固相洗浄液、(e)Tween20を含む固相洗浄液のいずれでも測定波形の乱れは改善されなかった。
これに対し、本発明の界面活性剤で前処理した多孔性固相(図14(a))は、ピーク前後で反射光強度の変化を認めなかった。
テストラインにおける反射吸光度の分布を図15に示した。本発明の界面活性剤で前処理した多孔性固相を用いた場合には、測定される反射吸光度の分散が少なく良好な再現性を示し、かつ高感度であったが、その他の条件では分散が大きかった。
これより本発明の多孔性固相を用いることで、展開不良のみならず測定波形の乱れが改善されて、従来法や固相洗浄液を用いた場合よりも感度の良い測定を再現良く行えることが確認できた(図15)。
(1)精製Dダイマー(DD)添加全血(DD全血)の作製
DDの終濃度が1.0μg/mLとなるように精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を健常人全血に添加し、DD全血を作製した。
(2)抗凝固剤を含むサンプルパッドを用いたイムノクロマトデバイスの作製
サンプルパッド含浸液に抗凝固剤を添加してサンプルパッドを作製した以外は、比較例と同じ方法でイムノクロマトデバイスを作製した。抗凝固剤の種類と終濃度については次の通りである。
EDTA−2Na(以下、EDTA:1又は5mmol/L)、
Diethylenetriamine−N,N,N’,N”,N”−pentaacetic acid(以下DTPA:1mmol/L)、
trans−1,2−Diaminocyclohexane−N,N,N’,N’−tetraacetic acid(以下CyDTA:1mmol/L)
(3)試験方法
DD全血120μLを、各抗凝固剤を含むサンプルパッドを具備するイムノクロマトデバイスの、サンプルパッド部に添加し、15分後、各テストデバイスの検出窓部の吸光度を測定した。
(4)試験結果
抗凝固剤で処理されたサンプルパッドを用いたテストストリップは、いずれの抗凝固剤で処理されたものでも、未処理のサンプルパッドを用いたテストストリップと比較して再現性が向上した(図16)。
(1)Dダイマー(DD)添加血漿(DD血漿)の作製
DDの終濃度が1.0μg/mLとなるように精製DDを含む10mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を健常人血漿に添加し、DD添加血漿を作製した。
(2)各種アミノ酸のコンジュゲートリリースパッドへの添加コンジュゲート溶液に各種アミノ酸を添加してコンジュゲートリリースパッドを作製した以外は、比較例と同様にイムノクロマトデバイスを作製した。添加したアミノ酸の種類は、セリン、グリシン、グルタミン、アルギニン、アラニンで、添加終濃度はそれぞれ10mmol/Lとした。
(3)試験方法
DD血漿120μLを、各アミノ酸を含むコンジュゲートリリースパッドを具備するイムノクロマトデバイスの、サンプルパッド部に添加し、15分後、各テストデバイスの検出窓部の吸光度を測定した。
(4)試験結果
アミノ酸を添加したコンジュゲートリリースパッドを使用することにより再現性が向上し、特にセリン、グリシン添加によって著しく向上した(図17)。
(b)コンジュゲートリリースパッド
(c)血球分離パッド
(d)多孔性固相(メンブレン)
(e)捕捉試薬(抗体)
(f)吸収体
(g)プラスチック製粘着シート
(h)ポリエステルフィルム
(j)コントロール捕捉試薬
Claims (19)
- 結合アッセイ用の多孔性固相であって、
n−ヘプチル−β−D−チオグルコシドを前記多孔性固相のうち少なくとも測定試料の移動領域に乾燥状態で含み、
前記アッセイは、測定試料が、前記固相を移動及び/又は通過することにより、該多孔性固相上に固定化された捕捉試薬によって測定試料中の測定対象物と検出試薬とによって形成される複合体、を測定するアッセイである、
前記多孔性固相。 - 結合アッセイが、免疫測定法である、請求項1に記載の結合アッセイ用多孔性固相。
- 結合アッセイが、ラテラルフロー式、ディップスティック式又はフロースルー式メンブレ
ンアッセイ法である請求項1または2に記載の結合アッセイ用多孔性固相。 - 捕捉試薬が、抗体、特異的捕捉物質又は抗原である、請求項1〜3のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相を含むことを特徴とする結合アッセイ用ストリップ。
- 検出試薬を含有するコンジュゲートリリースパッドをさらに含む、請求項1〜5のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップ。
- 検出試薬が、標識された抗体、標識された特異的捕捉物質又は標識された抗原である、請
求項6に記載の結合アッセイ用ストリップ。 - 標識が、粒径の異なる2種類の金コロイドによる標識である、請求項7に記載の結合アッセイ用ストリップ。
- コンジュゲートリリースパッドがアミノ酸類を含む、請求項6〜8のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップ。
- サンプルパッド及び/又は血球分離パッドをさらに含む、請求項6〜9のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップ。
- サンプルパッドが抗凝固剤を含む、請求項10に記載の結合アッセイ用ストリップ。
- 以下の(1)〜(4)
(1)サンプルパッド
(2)サンプルパッドの下にサンプルパッドに接して配置された、検出試薬を含有するコ
ンジュゲートリリースパッド
(3)コンジュゲートリリースパッドと下記(4)の多孔性固相の間に配置された血球分
離パッド
(4)捕捉試薬が固定化された多孔性固相、
からなるラテラルフロー式結合アッセイ法を行うためのストリップにおいて、多孔性固相
が請求項1〜4のいずれかに記載の結合アッセイ用多孔性固相であることを特徴とする結合アッセイ用ストリップ。 - 請求項5〜12のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップを搭載したデバイス。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の多孔性固相を使用することを特徴とする結合アッセイ法。
- 請求項5〜12のいずれかに記載の結合アッセイ用ストリップを使用することを特徴とする結合アッセイ法。
- 測定試料が、全血である請求項14または15に記載の結合アッセイ法。
- 請求項1〜4のいずれかの結合アッセイ用多孔性固相を用いることを特徴とする、ラテラルフロー式あるいはディップスティック式結合アッセイ方法における測定試料の展開不良を改善する方法。
- 測定試料が、Ht値が50%以上の試料である請求項17に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれかの結合アッセイ用多孔性固相を用いることを特徴とする、ラテラルフロー式あるいはディップスティック式結合アッセイ方法における測定試料の測定波形の乱れを改善する方法。
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