KR102351882B1 - 개의 암을 검출하기 위한 장치 및 방법 - Google Patents

개의 암을 검출하기 위한 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

암에 걸린 개에서 개 ECPKA 단백질이 높은 수준에서 분비되고 개 ECPKA 단백질에 대한 자가항체가 형성된다는 것이 밝혀졌다. 인간 ECPKA가 개 ECPKA 자가항체에 선택적으로 결합하지 않고 바이오마커로서 작용할 수 없다는 것도 밝혀졌다. 또한, 개 ECPKA 자가항체 검출은 이러한 항체의 정량적 측정이 채택되는 경우에만 개의 암에 대한 의미있는 진단 도구로서 사용될 수 있다. 개 ECPKA 자가항체의 측정이 확실하지 않은 경우, CRP를 측정하는 것은 이하에 추가 설명하는 개 ECPKA 자가항체 측정의 예측 가능성을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 보충 데이터를 제공할 수 있다.

Description

개의 암을 검출하기 위한 장치 및 방법{APPARATUS AND METHOD FOR DETECTING CANINE CANCER}
본 발명은 개(cannine) PKC Cα 단백질을 항원으로서 사용하여 개의 암을 검출하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 검출 방법 및 장치는 치료적으로 의미있는 선택성과 특이성으로 개 PKC Cα 단백질 또는 그의 서브유닛에 결합할 수 있는 항체의 정량적 검출을 이용한다.
인간과 개는 유전적으로 및 면역학적으로 많은 유사점을 공유하고 있지만, 동시에 많은 상이한 면역반응 및 생물학적 반응도 나타낸다. 예를 들어, 인간은 에이즈 바이러스에 감염되기 쉽지만, 개는 상기 바이러스에 내성이 있다. 또한 개는 개 디스템퍼에 감염되기 쉽지만 인간은 그렇지 않다.
잠재적인 바이오마커가 인간에게는 유용하지만 개에게는 유용하지 않은 다른 많은 예가 있다. 예를 들어, S기-특이적 단백질 티미딘 키나제 1(TK1)은 문헌[H. von Euler and S. Eriksson, Vet Comp Oncol. 2011 Mar, 9(1): 1-15. doi: 10.1111/j . l476-5829.2010.00238.x. Epub 2010 Aug 19]에 기재된 바와 같은 인간 암에 유용한 바이오마커인 것으로 공지되었다. TK1의 발현은 S기 세포의 비율 및 증식 수준과 밀접한 관련이 있다. 정상 세포에서, TK1 활성은 후기 G1기 및 초기 S기 동안에만 존재하지만, 많은 종양 세포에서 TK1 활성은 더 높고 S기 및 G2기 내내 유지된다. 과도한 제어되지 않은 세포 증식은 암의 특징 중 하나이다. 따라서, TK1 활성의 수준은 암과 그의 상관관계를 판정하기 위해 조사되었고 유방암을 포함한 고형 종양과 같은 종양의 진단 및 모니터링에 유용한 것으로 입증되었다. 또한, TK1의 주요 장점은 몇몇 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체가 TK1에 결합될 수 있다는 것이다. 가장 특이적이고 민감성인 TK1 항체는 TK1의 C-말단을 나타내는 31-아미노산 펩타이드에 대해 생산된다. TK1의 단백질 서열 상동성은 인간과 개 간에 높다[H. von Euler and S. Eriksson]. 개 TK1와 인간 TK1의 1차 아미노산 서열은 N-말단부터 약 200개 아미노산에서 매우 상동성이지만, C-말단 영역은 상이하다.
인간과 개 간의 단백질 서열의 높은 상동성에도 불구하고, 유방암을 포함하는 4종의 상이한 고형 종양을 갖는 개에서 TK1 값은 정상 범위 내인 것으로 밝혀졌다[Nakamura N, Momoi Y, Watari T, Yoshino T, Tsujimoto H and Hasegawa A., Plasma thymidinekinase activity in dogs with lymphoma and leukemia, the Journal of Veterinary Medical Science 1997; 59: 957-960]. 또한, 고형암을 갖는 검사된 50마리의 개 중 3마리만이 TK1 활성의 증가를 보였다[Monitoring therapy in canine malignant lymphoma and leukemia with serum thymidine kinase 1 activity - evaluation of a new, fully automated non-radiometric assay. International Journal of Oncology 2008; 34: 505-510]. 개 TK1은 인간 TK1과는 달리 개의 암을 검출하기에 유용한 바이오마커가 아니다. 또한, 인간 TK1에 대해 유도된 가장 민감하고 선택적인 항체는 개 TK1을 인식하지 못한다[H. von Euler and S. Eriksson]. 마찬가지로, 유사한 영역의 개 TK1에 대해 유도된 항체는 인간 TK1 단백질에 의해 인식될 수 없을 가능성이 높다.
포유동물 세포에서 cAMP 작용을 매개하는 세린/트레오닌 단백질 키나제인 사이클릭 AMP(cAMP) 의존성 단백질 키나제 A(PKA)는 세포 증식, 분화, 대사작용 및 아폽토시스(apoptosis)와 같은 다양한 생물학적 과정의 제어에 관여한다. PKA의 조절 해제는 암의 발생 및 진행과 연관되었으며, 실제로 그의 과발현은 종종 상이한 종류의 인간 암에서 관찰된다.
따라서, PKA는 인간 암의 진단 바이오마커에 대한 잠재적인 분자 표적으로서 제안되었다. 불활성 PKA 전효소(holoenzyme)는 2개의 촉매 서브유닛과 2개의 조절 서브유닛으로 구성된 4량체이다. 조절 서브유닛상의 cAMP와 결합하면, 불활성 PKA 4량체는 조절 서브유닛의 1개의 2량체와 활성적 촉매 서브유닛의 2개의 단량체로 해리되고, 이어서 핵과 세포질 둘 다에서 다양한 표적 단백질을 인산화한다. 생화학적 연구를 통해 조절 서브유닛의 4가지 이소형(isoform)인 RIα, RIβ, RIIα 및 RIIβ가 동정되었으며, PKA 신호전달 활성화의 결과는 세포내 조절 서브유닛 이소형의 종류에 의존하는 것으로 나타났다. RII 이소형의 발현은 정상 조직에서 우선적으로 관찰되고 세포의 성장을 억제하는 반면, RI 이소형(RIα/PKA-1)의 발현은 세포 증식을 자극한다.
특히, RIα/PKA-I의 과발현은 암의 진행, 다제내성 및 예후가 불량한 다양한 종류의 암 환자와 높은 상관관계가 있다. 흥미롭게도, 최근의 연구는 PKA가 정상 세포에서는 대부분 세포내에서 발현되는 반면에, PKA의 세포외 형태(ECPKA)는 전립선, 방광, 유방, 대장 암종 및 폐 선암을 포함하는 수많은 종류의 암 세포주로부터 분비된다는 것을 보여준다. 또한, ECPKA은 다양한 종류의 암에 걸린 인간 환자 유래의 혈청에서 고도로 검출되었지만, 건강한 지원자 유래의 혈청에서는 검출되지 않았다. 또한, 인간 흑색종 환자에서 종양을 외과적 절제한 후 ECPKA의 혈청 수준이 감소하는 것으로도 나타났다. 인간 ECPKA를 항원으로서 사용하여 항-ECPKA 자가항체를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 보고하는 미국 특허 제7,838,305B2호를 참조한다. 이러한 관찰결과는 혈청 중의 인간 ECPKA 및 자가항체가 인간 암에 대한 가치있는 진단제가 될 수 있다는 가능성을 제기한다.
개 ECPKA는 인간 ECPKA와 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 아미노산 서열은 도 1에 나타낸다. 상이한 서열은 C-말단을 포함하는 쇄 전체에 퍼져있다. 개 ECPKA가 암에 걸린 개에 존재하는지 여부 및 특히 개에 존재하는 개 ECPKA의 수준이 암의 존재와 상관관계가 있을 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 게다가, 개가 자가항체를 생산하는 개 ECPKA에 대한 면역반응을 갖는지 여부 또는 그렇다 할지라도, 이러한 면역반응이 개 암을 검출하기 위한 바이오마커에 유용할 정도로 충분히 강력한지 여부는 알려져 있지 않다. 개 암을 검출하기 위한 진단 목적상 항원으로서 인간 ECPKA을 사용할 수 있는지 여부도 알려져 있지 않다. 전형적으로, 혈장 중 ECPKA와 같은 항원의 수준은 시간 경과에 따라 감쇠할 수 있고 진단 측정을 위해 항원의 정량 분석을 채택하는 것은 어려울 수 있다. 항원 수준의 검출은, 샘플을 검사하기 전의 샘플의 보유 시간이 결과에 영향을 미칠수 있기 때문에 특정의 확율로 진단 또는 검출하기에 유용한 도구가 아닐 수 있다. 그러나, 자가항체의 수준은 이러한 감쇠가 훨씬 더 없고, 특히 정량적 제어가 필요한 경우 바이오마커로서 유용할 수 있다.
다양한 종류의 암을 갖는 개의 상이한 품종 및 연령에 대한 광범위한 조사와 연구를 통해, 개가 개에서 암의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 독특한 개 ECPKA 및 자가항체 활성을 나타내고 인간 ECPKA와 개 암의 검출 사이에는 상관관계가 전혀 없거나 거의 없다는 것이 밝혀졌다. 고유한 특수성으로 인해, 단순한 정성적 검출보다는 개 ECPKA 대한 항체의 정량적 검출이 바람직하고, 이러한 정량적 검출을 가능하게 하는 장치가 개발되어 있다. 특히, 디지털화 데이터 처리에서 사용되는 정량적 검출이 개발되어 있으며 이러한 디지털화 처리를 지원하는 장치도 개발되어 있다. 정량적 검출 장치는 본원에 기재된 다른 단백질 또는 바이러스제를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
발명의 요지
한 실시형태는, 개 유래의 혈청 샘플을 제조하고 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질을 항원으로서 사용하여 혈청 샘플 중의 항체의 양을 검출함으로써 개에서 암의 존재를 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 개에서 암의 존재는 개 PKC Cα 항체의 양이 소정의 수준을 초과할 때 결정된다. 개 PKC Cα 항체의 검출된 양에 따라, 암이 존재할 가능성을 판정할 수 있다. 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질은 서열번호 1(AAT CCA TGG GCA ACG CCG CCG CCA AGA AGG GCA G) 및 서열번호 2(GCC GTC GAC GAA CTC ACA AAA CTC CTT GCC ACA CTT C)의 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 합성된다. 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질은 개 PKC Cα의 증폭된 cDNA 단편, 및 각각 서열번호 3(AAT ACG ACT CAC TAT AGG) 및 서열번호 4(GCT AGT TAT TGC TCA GCG G)의 서열을 갖는 T7 프로모터 및 터미네이터 프라이머와 함께 세균 발현 벡터를 사용하여 제조된다. 생성된 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질은 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열 및 서열번호 6을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
소정의 수준은 간 질환 또는 염증성 상태와 같은 다른 의학적 상태의 존재와 같은 다양한 요인들을 고려하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 간 질환을 갖는 개는 더 높은 수준의 개 ECPKA 자가항체를 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 방법은 간 질환이 없는 개에 대해 사전설정된 지시를 가질 수 있다. 소정의 수준은 3.5㎍/ml, 바람직하게는 4㎍/ml, 보다 바람직하게는 4.5㎍/ml, 보다 더욱 바람직하게는 5㎍/ml일 수 있다.
암에 걸린 개에서 높은 수준의 CRP 양이 측정되는 것으로도 밝혀졌다. 따라서, CRP 양을 결정하는 것은 개에서 암의 존재를 결정하기 위해 ECKPA 또는 ECPCKA자가항체 검출과 함께 사용할 수 있다. CRP는 ECPKA 또는 ECPKA 자가항체보다 훨씬 더 우세하게 혈청 중에 존재할 수 있기 때문에, 높은 수준의 CRP 양을 임계 수준이 되도록 설정할 수 있다. 또한, 완충액을 이용하여 혈청 샘플을 추가 희석시킨 후 CRP 양을 측정할 수 있다. 희석 비율은 100배일 수 있다. 소정의 CRP 수준은 약 80㎍, 바람직하게는 100㎍ 또는 더욱 바람직하게는 120㎍일 수 있다.
다른 실시형태는, 개 유래의 혈청 샘플을 제조하고 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질을 항원으로서 사용하여 혈청 샘플 중의 항체의 양을 검출하고 혈청 샘플 중의 CRP 양을 결정함으로써 개에서 암의 존재를 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 개에서의 암의 존재는 개 PKC Cα 항체 및 CRP의 양이 각각 소정의 항체 수준 및 소정의 CRP 수준을 초과할 때 결정되고 CRP 양은 희석 완충액의 도움으로 측정된다. 희석 완충액은 혈청 샘플을 약 50배 내지 150배만큼 희석시킨다.
다른 실시형태는 고정된 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질을 갖는 고체상에서 개 PKC Cα 단백질에 대한 항체를 정량적으로 검출하기 위한 장치를 제공하며, 여기서 상기 재조합 개 PKC Cα 단백질은 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 상기 장치는 상기 재조합 개 PKC Cα 단백질을 이용하여 개 PKC Cα 단백질에 대한 항체의 양을 검출할 수 있다. 검출된 양이 소정의 수준을 초과할 경우, 암은 높은 확율로 존재할 수 있다. 개 PKC Cα 단백질에 대한 항체를 정량적으로 검출하기 위한 장치는 개 IgG에 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있고, 여기서 상기 리간드는 UV 또는 가시 광선에 대해 활성인 일부분을 포함한다. 장치는 샘플 수용부를 갖는 하우징 및 검출 창을 포함하고, 고체상은 하우징 내에 배치되고 검출 창에 의해 노출된 고체상의 일부분을 통해 샘플 수용부로부터 수용된 샘플을 이동시킬 수 있다.
개 PKC Cα 단백질에 대한 항체를 정량적으로 검출하기 위한 장치는 검출된 항체 양의 적어도 2가지 수준을 결정할 수 있다. 장치는 기준 정량 선으로서 사용될 수 있는 기준선을 가질 수 있다. 기준선은 샘플에 관계없이 유사한 색상 결과를 보여주며 검출된 항체의 양을 정량적으로 결정할 수 있게 한다. 장치는 바람직하게는 검출된 항체의 양의 다수의 수준을 결정할 수 있고 다수의 수준 중 인접한 2가지 수준 간의 간격은 약 5㎍/ml 이하, 바람직하게는 3㎍/ml 이하 또는 보다 바람직하게는 1㎍/ml 이하이다.
개 ECPKA 자가항체를 정량적으로 검출하기 위한 장치는 장치의 결과가 취해지는 동안 환자 데이터의 동시 수집을 가능하게 하는 하나 이상의 데이터 입력 슬롯을 포함할 수 있다. 예를 들어, 장치의 사진을 촬영함으로써 리더를 사용하여 장치의 결과를 읽을 수 있고 검사 결과를 읽고 디지털 데이터로 변환시킬 수 있다. 변환 과정은 검색 창에 나타난 고체상의 이미지를 변환시킬 수 있고, 또한 동시에 데이터 입력 슬롯에 나타난 데이터를 처리용 디지털 데이터로 변환시킬 수 있다. 이러한 변환된 데이터는 검사 리더에 내장될 수 있는 통신 장치 또는 모듈을 통해 원격 서버에 전송될 수 있다. 전송된 데이터는 분석을 위해 편집 및 정리될 수 있다. 분석된 데이터는 검사 리더 또는 이메일, 메시지 등과 같은 다른 전자적 수단을 통해 검사 수행자에게 다시 전송될 수 있다. 검사 리더는 스마트 폰을 사용하여 사진을 촬영하고 그 사진을 원격 서버로 전송할 수 있다.
다른 실시형태는 외표면 및 내부 공간을 갖는 하우징, 외표면상의 제어 패널, 내부 공간에서 단백질 또는 바이러스 검출 샘플의 사진을 촬영할 수 있는 방식으로 위치된 카메라, 내부 공간에 형성된 샘플 홀더(여기서 샘플은 샘플 홀더에 배치될 수 있다), 내부 공간을 조명할 수 있는 광원; 상기 광원으로부터의 빛을 발산하여 샘플에 간접 조명하는 것을 허용하도록 구성된 광 발산 장치, 통신 모듈을 가질 수 있는, 포유동물에서 단백질 또는 바이러스제를 검출하기 위한 장치를 제공하며, 여기서 상기 광원 및 광 발산 장치는 광원으로부터의 광을 샘플 홀더에 간접 조명하도록 구성되고 통신 모듈은 카메라에 의해 촬영된 사진을 원격 서버로 전송하도록 구성된다.
샘플 홀더는 측방 유동 키트 또는 다른 바이오 분석 키트를 보유하도록 구성된다. 샘플 홀더는 카메라가 샘플의 사진을 촬영할 수 있도록 카메라의 범위 내에 샘플이 위치할 수 있게 한다. 카메라 및 통신 모듈은 하우징 내로 통합될 수 있다. 대안적으로, 카메라 및 통신 모듈은 스마트 폰의 일부분이며, 스마트 폰은 하우징에 배치되어 샘플의 사진을 촬영하고 그 사진을 원격 서버로 전송한다. 스마트 폰의 섬광(flash light)을 광원으로서 사용할 수 있다. 광 발산 장치는 반투명 판일 수 있고 스마트 폰의 광원의 바로 아래에 위치하도록 이동될 수 있다.
포유동물에서 단백질 또는 바이러스제를 검출하는 장치는 카메라 개구부를 갖는 분리형 스마트 폰 어댑터를 포함할 수 있고, 여기서 광 발산 장치는 스마트 폰의 광원을 덮도록 스마트 폰 어댑터에 통합되어 있고, 카메라 개구부는 스마트 폰의 카메라에 정렬되어 있고, 분리형 스마트 폰 어댑터를 위한 수용 영역을 추가로 포함하는 하우징이 배치되어 있고 상기 수용 영역은 카메라와 광원을 위한 하나 이상의 개구부를 갖는다. 스마트 폰 어댑터는 하우징에 통합될 수 있다.
광원은 UV 광 또는 단파장 광과 같은 소정의 파장을 갖는 광을 조사할 수 있다. 통신 모듈은 와이파이(WiFi), 와이맥스(WiMx), 블루투스(Bluetooth), 지그비(ZigBee), 지-웨이브(Z-Wave)과 같은 근거리 통신 프로토콜 또는 기타 근거리 통신 프로토콜을 사용할 수 있다.
다른 실시형태는, 바이러스 검출제를 갖는 키트를 사용하여 포유동물에서 감염성 질환을 검사하는 단계, 카메라 및 통신 기능을 갖는 키트 리더를 사용하여 검사 결과를 판정하는 단계, 키트 리더에 의해 수득된 검사 결과를 원격 서버로 전송하는 단계 및 전기적 통신 방법에 의해 소정의 실체를 알리는 단계를 포함하는, 포유동물에서 감염성 질환을 검출 및 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 UV 활성 결과를 제공하는 키트를 이용할 수 있으며, 카메라는 US 활성 결과를 검출할 수 있다.
키트 리더는 외표면 및 내부 공간을 갖는 하우징, 외표면상의 제어 패널, 샘플이 배치될 수 있는, 내부 공간에 형성된 샘플 홀더, 내부 공간을 조명할 수 있는 광원; 및 상기 광원으로부터의 빛을 발산하도록 구성된 광 발산 장치를 포함할 수 있으며, 여기서 카메라는 내부 공간에서 단백질 또는 바이러스 검출 샘플의 사진을 촬영할 수 있는 방식으로 위치되고, 상기 광원 및 광 발산 장치는 광원으로부터의 광을 샘플 홀더에 간접 조명하도록 구성되고 통신 모듈은 카메라에 의해 촬영된 사진을 원격 서버로 전송하도록 구성된다.
검사 리더 또는 키트 리더는 GPS 기능을 가질 수 있고 검사 장소를 식별할 수 있다.
다른 실시형태는 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체를 정량적으로 검출하기 위한 측방 유동 키트로서, 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 고정된 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질을 갖는 제1 고체상, 제1 결합 단백질과 접합되어 있는 광학 밀도를 갖는 접합된 착색제를 포함하는 접합체 패드, 및 제2 결합 단백질을 포함하는 제2 고체상을 갖고, 상기 접합된 착색제가 제1 고체상에서는 제1 색상 강도를 제공하고 제2 고체상에서는 제2 색상 강도를 제공하도록 구성되어 있고, 제1 색상 강도가 개의 혈중 항체 농도에 정량적으로 의존하고 제2 색상 강도는 항체 농도와 무관한, 측방 유동 키트를 제공한다.
항체의 농도는 간단한 측방 유동 키트를 이용하여 정량적으로 측정되기 때문에, 착색제는 가압 장치를 이용하여 적용될 수 있고, 착색제의 광학 밀도는 바람직하게는 높은 수준에서 사용될 수 있다. 접합된 착색제의 광학 밀도는 5 내지 30, 바람직하게는 8 내지 25, 보다 바람직하게는 10 내지 20일 수 있다.
제1 색상 강도는 제1 색상 강도를 제1 색상 강도와 항체의 농도 간의 상관 데이터 세트와 비교함으로써 항체의 농도를 제공한다. 이러한 농도는 데이터 세트를 이용하여 추정할 수 있고 그것은 상관 방정식, 바람직하게는 선형 방정식으로 표현될 수 있다.
제1 결합 단백질은 스트렙타비딘, 바이오틴, 단백질 A, 항-개 IgG 래트, 항-개 IgG 토끼, 항-개 IgG 염소, 항-개 IgG 양 및 항체에 결합할 수 있는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 제2 결합 단백질은 스트렙타비딘, 바이오틴, 단백질 A, 항-래트 IgG, 항-토끼 IgG, 항-염소 IgG, 항-양 IgG 및 IgG에 결합할 수 있는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제1 결합 단백질과 제2 결합 단백질의 선택은 상호 보완적일 필요가 있다.
착색제는 금, 라텍스, gfp, fitc 및 UV 활성 접합제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상이한 크기의 금 나노입자를 사용할 수 있다.
측방 유동 키트는 혈구를 여과하는 필터 위상(filter phase)을 추가로 가질 수 있고, 그것은 혈청이 아니라 혈액 샘플을 직접 적용할 수 있게 한다.
또 다른 실시형태는 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 검사선을 포함하는 측방 유동 키트를 위해 개의 혈액으로부터 검사 샘플을 제조하는 단계; (b) 검사 샘플을 측방 유동 키트에 적용하는 단계; (c) 측방 유동 키트가 발색되게 하는 단계; (d) 검사선을 포함하는 발색된 측방 유동 키트의 디지털 사진을 촬영하여 디지털 정보를 얻는 단계; 및 (e) 항체의 농도를 얻는 단계로서, 상기 농도가 디지털 사진에서 얻은 디지털 값을 항체의 농도와 상관시키는 데이터 세트와 검사선의 디지털 정보를 비교함으로써 결정되는 단계를 포함한다.
이러한 실시형태에서 사용되는 측방 유동 키트는 본원에 설명된 측방 유동 키트일 수 있다. 상기 방법은 또한 추정 데이터 세트를 사용하여 개가 암을 갖고 있을 가능성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 추정 데이터는 0.9보다 큰 R2 값을 갖는 선형 방정식을 사용하여 표현할 수 있다
상기 방법은 디지털 정보를 무선 통신을 통해 외부 서버로 전송하는 것을 포함할 수 있다. 디지털 정보는 무선 통신 모듈, 카메라 모듈, 광원 및 측방 유동 키트를 수용하도록 설계된 슬롯을 포함하는 리더 박스를 사용하여 얻을 수 있다. 무선 통신 모듈은 모바일 네트워크 대신에 단거리 무선 통신 프로토콜에 기반하여 작동하여, 상기 방법이 어떠한 휴대전화도 없이 실행될 수 있지만 와이파이와 같은 단거리 통신만으로 실행될 수 있게 한다.
항체의 농도는 약 5㎍ 이하보다 적은 수준에서 상기 방법에 의해 측정될 수 있다.
다른 실시형태는 포유동물의 혈중에서 ECPKA 항체의 농도를 결정하는 방법으로서, (a) 검사선을 포함하는 측방 유동 키트를 위해 포유동물의 혈액으로부터 검사 샘플을 제조하는 단계; (b) 검사 샘플을 측방 유동 키트에 적용하는 단계; (c) 측방 유동 키트가 발색되게 하는 단계; (d) 검사선을 포함하는 발색된 측방 유동 키트의 디지털 사진을 촬영하여 디지털 정보를 얻는 단계; 및 (e) 항체의 농도를 얻는 단계로서, 상기 농도가 디지털 사진에서 얻은 디지털 값을 항체의 농도와 상관시키는 데이터 세트와 검사선의 디지털 정보를 비교함으로써 결정되는 단계를 포함하고, 상기 측방 유동 키트가 아미노산 서열을 갖는 고정된 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질을 갖는 제1 고체상, 제1 결합 단백질과 접합되어 있는 5 이상의 광학 밀도를 갖는 접합된 착색제를 포함하는 접합체 패드, 및 제2 결합 단백질을 포함하는 제2 고체상을 포함하는, 방법을 제공한다. 상기 접합된 착색제는 제1 고체상에서는 제1 색상 강도를 제공하고 제2 고체상에서는 제2 색상 강도를 제공하도록 구성된다. 제1 색상 강도는 개의 혈중 항체 농도에 정량적으로 의존하고 제2 색상 강도는 항체 농도와 무관하다.
본원에서 개시되는 다양한 실시형태는 전체적으로 또는 선택적으로 조합될 수 있다.
도 1은 인간 ECPKA의 서브유닛과 개 ECPKA 서브유닛의 아미노산 서열 간의 비교를 도시한다.
도 2는 인간 ECPKA의 서브유닛과 개 ECPKA 서브유닛의 mRNA 서열 간의 비교를 도시한다.
도 3은 정상적인 개, 양성 종양을 갖는 개, 종양을 갖는 개 및 암에 대해 외과적으로 치료된 개의 개 ECPKA 자가항체 측정을 예시한다.
도 4는 예시적인 수신자 조작 특성 그래프를 도시하며, 상기 도면에서 A는 ROC 곡선하 면적이다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따른 암 검출 방법의 ROC 곡선을 예시한다.
도 6은 혈장 중 CRP 수준과 다양한 검사 대상체들 간의 관계를 나타낸다.
도 7은 혈장 중 CRP 수준과 다양한 검사 대상체들 간의 관계를 도시한다.
도 8은 CRP 측정치와 개 ECPKA 자가항체 수준 간의 상관관계를 예시한다.
도 9는 개 암의 검출에 있어서 인간 ECPKA와 개 ECPKA 간의 상관관계를 예시한다.
도 10은 일 실시형태의 측방 유동 키트를 사용하여 얻은 색상 강도와 샘플 중의 항체 농도 간의 상관관계를 예시하며, 여기서 상관관계는 0.9보다 높은 R2 값과 거의 선형이다.
도 11은 일 실시형태에 따른 리더의 평면도를 예시한다.
도 12는 일 실시형태에 따른 리더의 내부 바닥 판을 나타내는 도면이다.
도 13은 일 실시형태에 따른 리더의 측면도를 예시한다.
도 14는 일 실시형태에 따른 리더의 측면도를 예시한다.
도 15는 일 실시형태에 따른 리더의 투시도를 예시한다.
도 16은 일 실시형태에 따른 리더의 투시도를 예시한다.
도 17은 일 실시형태에 따른 키트의 검사 결과를 예시한다.
도 18은 일 실시형태에 따른 키트의 검사 결과의 ROC 곡선을 예시한다.
도 19는 일 실시형태에 따른 키트의 검사 결과를 요약한 것이다.
광범위한 연구를 통해, 암을 가진 개에서 개 ECPKA 단백질이 높은 수준에서 분비되고 개 ECPKA 단백질에 대한 자가항체가 형성된다는 것이 밝혀졌다. 인간 ECPKA는 개 ECPKA 자가항체에 선택적으로 결합하지 않고 바이오마커로서 작용할 수 없다는 것도 밝혀졌다. 또한, 개 ECPKA 자가항체 검출은 이러한 항체의 정량적 측정이 채택되는 경우에만 개의 암에 대한 의미있는 진단 도구로서 사용될 수 있다. 개 ECPKA 자가항체의 측정이 확실하지 않은 경우, CRP를 측정하는 것은 이하에 추가 설명하는 바와 같이 개 ECPKA 자가항체 측정의 예측 가능성을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 보충 데이터를 제공할 수 있다.
도 1은 인간(NP_002721.1), 개(NP_001003032.1) 및 고양이(XP_006928552.1) 유래의 PKC Cα의 아미노산 서열의 정렬이다. 도트 상자는 인간과 개 간의 차이를 나타내는 아미노산 잔기를 나타낸다. 인간과 개 아미노산 서열은 높은 유사성을 공유하지만, 4가지 상이한 서열이 C-말단을 포함한 전체 서열에 걸쳐 퍼져 있다.
도 2는 인간(NP_002721.1), 개(NP_001003032.1) 및 고양이(XP_006928552.1) 유래의 PKC Cα를 코딩하는 mRNA 서열을 비교한다. 인간과 개의 mRNA 서열 사이에는 많은 차이가 있다.
도 3은 다양한 검사 대상체들에서의 ECPKA 자가항체 측정의 검사 결과를 나타낸다: 암에 걸린 것으로 진단된 개("암들" 또는 "암"), 양성 종양에 걸린는 개("양성 종양"), 종양 질환이 없는 개("대조군" 또는 "종양 질환 없음") 및 개("Tx "또는 "치료"). 도 3에 도시된 바와 같이, 암에 걸린 검사 대상체는 다른 검사 대상체에 비해서 훨씬 높은 수준의 ECPKA 자가항체 측정치를 나타낸다. 종양 질환을 앓고 있지만 수술을 통해 치료된 개는 낮은 수준의 ECPKA 자가항체 측정치를 나타낸다. 표 1은 검사 대상체의 총 수와 검사 결과를 요약한 것이다. 검사 결과를 분류하기 위해, ECPKA 자가항체가 41 단위 이상 검출된 경우에 양성 결과로 계산하고, ECPKA 자가항체 검출 수준이 41 단위 미만인 경우에는 음성 결과로 결정하였다.
양성 대조군 양성 종양 치료
양성 81 25 2 0
음성 1 160 23 19
합계 93 185 25 19
표 2는 암 진단 방법으로서 개 ECPKA 자가항체 검출에 대한 감도, 특이성, 양성 예측도 및 음성 예측도를 요약한 것이다.
선택성 87% 양성 예측도 75%
특이성 88.4% 음성 예측도 94.4%
특정 검사 방법의 정확도를 검증 또는 평가하기 위한 많은 방법이 있다. 그 중에서 감도와 특이성이 일반적으로 사용되고 있다. 일반적으로, 감도와 특이성은 방법이 표적으로 하는 결과와 표적으로 하지 않는 결과를 구별하는데 있어 얼마나 우수한지를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 경우, 감도는 개 ECPKA의 자가항체의 검출을 사용하여 개의 암을 얼마나 잘 발견할 수 있는가를 의미한다. 한편, 특이성은 본 방법이 암에 걸린 개와 암에 걸리지 않은 개를 얼마나 잘 구별할 수 있는가와 관련된다. 감도와 특이성 외에도, 방법의 유용성 및 컷오프 값을 결정하기 위해 수신자 조작 특성(ROC) 곡선이 종종 사용된다. ROC 곡선은 x축 값의 위양성율 및 y축 값의 진양성율을 사용하여 작도된다. 특정 검사 방법의 정확한지 아닌지의 여부는 ROC 곡선을 이용하여 측정될 수 있다. 판정 기준의 다양한 가능한 설정에 대해 양성 비율이 위양성율에 대해 플롯팅되어 있는 하기 예시적인 ROC 곡선에서, 1의ROC 곡선하 면적(AUC)은 검사 방법이 완벽하고 정확하다는 것을 의미하지만, AUC가 0.5라면 검사 방법이 도움이 되지 않고 부정확다는 것을 의미한다. 곡선이 좌측 상단 모서리에 가까울수록 검사 방법은 더 정확하고 더 유용하다. 전형적으로, 검사 방법은, AUC가 0.5인 경우에는 유익하지 않고, AUC가 0.5 내지 0.7인 경우에는 별로 정확하지 않고, AUC가 0.7 내지 0.9인 경우에는 정확하고, AUC가 0.9 및 1일 경우에는 매우 정확한 것으로 여겨진다. 따라서, ROC 곡선 및 그의 AUC 값은 새로운 검사 방법을 결정하고 평가하기 위한 훌륭한 도구이다. 문헌[Using the Receive Operating Characteristic (ROC) Curve to Measure Sensitivity and Specificity, Korean J. Fam. Med. Vol. 30, No. 11, Nov 2009, 30:841-842]을 참조한다.도 5는 개의 암을 검출하기 위한 개 ECKPA 자가항체 측정의 ROC 곡선을 도시한다. AUC 값은 0.9061이며, 이는 본 발명의 일 실시형태의 개 ECKPA 자가항체 측정이 매우 효과적이고 정확한 진단 도구임을 나타낸다.
도 6은 다양한 검사 대상체들에서 C-반응성 단백질(CRP)의 측정치를 도시한다: 암에 걸린 개, 양성 종양을 갖는 개, 종양 질환이 없는 개, 비-암 질환을 갖는 개. 도 7은 암에 걸린 개("개"), 개 ECKPA자가항체 측정에서 위음성 결과를 갖는 개("FN"), 양성 종양을 갖는 개("BT"), 암에 걸리지 않은 개("음성") 및 개 ECKPA자가항체 측정에서 위양성 결과를 갖는 개("FP")의 측정치를 도시한다.
도 8은 다양한 검사 대상체 그룹의 개 ECKPA 자가항체 측정 결과에 대해 CRP 측정 결과를 플롯팅한 것이다. 표 3은 CRP 및 ECKPA 자가항체 측정이 함께 사용된 경우의 음성 예측도 및 양성 예측도를 보여준다. 양성 예측도는 C 면적 및 E 면적에서 총 양성 예측도 73.6%로부터 91% 및 100%로 증가하며, 음성 예측도는 C 면적에서 총 음성 예측도 93.4%로부터 97.6%로 향상된다. 따라서, CRP의 측정은 개 ECKPA 자가항체 측정을 이용한 암 진단의 정확도를 향상시킬 수 있다.
면적 NPV(%) PPV(%) 암 양성 종양 비-종양
A
B
C
D
E
F		 62
97.6
9
50
0
11		 38
2.4
91
50
100
89		 8
4
20
25
13
16		 4
19
0
2
0
0		 9
138
2
23
0
2
도 9는 인간 ECPKA에 기반한 개의 검사 결과를 개 ECPKA에 기반한 개의 검사 결과에 대해 플롯팅한 차트이다. r2 값이 1인 경우, 검사 결과는 서로 밀접하게 상관관계가 있으며 인간 ECPKA 또는 그의 자가항체는 개에서 암을 검출하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 도 x에 도시된 바와 같이, r2 값은 0.15이고, 이는 인간 ECPKA와 개 ECPKA 사이에 많은 상관관계가 없고 인간 ECPKA 또는 그의 자가항체가 개의 암을 검출하는 우수한 바이오마커가 아니라는 것을 시사한다.표 4는 검사 대상체에서 검출된 다양한 암을 요약한 것이다. 본 발명의 일 실시형태의 암 검출 방법이 암 종류에 관계없이 사용될 수 있고 이로써 본 검출 방법이 고유하고 매우 유용하다는 것이 또한 밝혀졌다.
종양 종류(번호) 진단(번호)
암종(57) 유선 암종(14)
TCC (11)
간 암종(9)
선암종(5)
SCC(5)
기타 암종(13)
조혈암(2) 림프종(14)
비만세포종(5)
백혈병(1)
육종 (16) 혈관 육종 (5)
흑색종(4)
연조직 육종(4)
기타 육종(3)
양성(25) 선종(9)
림프종(5)
조직구종(2)
양성 혼합 종양(2)
기타 양성 종양(7)
측방 유동 키트 구조는 전형적인 측방 유동 키트 구조를 따를 수 있다. 그러나, 사용되는 착색제 및 단백질은 개 ECPKA 항체를 정량적으로 검출하도록 특수하게 설계된다. 키트는 검사 샘플이 적용되는 적절한 장소를 갖는다. 검사 샘플은 전형적으로 검사 대상체의 혈액으로부터 제조된다. 혈액으로부터 얻은 혈청은 적용 장소에 적용된다. 혈청 샘플은 검사 스트립을 따라 흘러서 접합된 착색제가 배치되어 있는 접합체 패드를 통과한다. 착색제를 가압하면서 적용하고 오븐에서 베이킹한다. 측방 유동 키트에서 사용되는 전형적인 광학 밀도는 약 2 내지 3이다. 그러나, 표현의 디지털화된 검사 결과와 농도 데이터 간에 더 우수한 상관관계를 얻기 위해 훨씬 더 높은 광학 농도가 사용된다. 다양한 착색제가 사용될 수 있다. 금 및 라텍스가 전형적인 착색제이다. UV 활성 착색제에는 gfp, fitc 및 UV 활성 접합제가 포함된다. 착색제는 상이한 색상 강도를 나타낸다. 고유 강도는 디지털화에 영향을 준다. 도 10은 일 실시형태에 따른 측방 유동 키트를 이용한 검사 후 수신된 색상 강도와 항체의 농도 간의 예시적인 상관관계를 도시한다.
샘플 중의 개 ECPKA 항체 및 다른 항체는 접합된 제1 결합 단백질에 결합하여 항체를 착색제로 효과적으로 코팅할 것이다. 제1 결합 단백질은 스트렙타비딘, 바이오틴, 단백질 A, 항-개 IgG 래트, 항-개 IgG 토끼, 항-개 IgG 염소, 항-개 IgG 양 및 항체에 결합할 수 있는 기타 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 샘플이, 고정된 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질을 함유하는 키트의 제1 고체상을 통과할 경우, 개 ECPKA 항체는 고정된 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질에 결합한다. 키트의 완전한 발색 후, 개 ECPKA 항체만이 제1 고체상에 머물러 색상 강도를 나타내며, 이것을 사용하여 해당 항체 농도를 찾아낼 수 있다. 표현된 검사 결과를 디지털 카메라를 촬영하여 디지털화하고, 디지털화된 정보를 상관 데이터와 비교하여 실제 농도를 결정한다. 디지털화된 정보는 디지털 표현 값을 얻기 위해 색상 농도를 사용한다. 도 10에 도시된 실시형태는 디지털화된 표현 값과 농도 간의 선형 관계를 제공한다. 따라서, 그것은 일치하는 데이터가 데이터 세트에 존재하지 않는 농도를 추정할 수 있게 한다. 더 용이한 추정을 위해, 선형 관계를 제공하는 다양한 농도의 항체에 대한 착색제의 색상 강도가 바람직하다.
카메라의 종류, 색온도 설정, 샘플과 카메라 간의 거리, 광원 및 노출 설정은 색상 강도의 디지털화된 값에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 표현된 색상 강도의 디지털화가 바람직하게는 일정한 조건에서 이루어지는 것이 바람직하다. 도 11 내지 도 16은 하우징(200)을 갖는 리더 박스(100)을 나타낸다. 하우징의 상면에는 카메라 모듈(300), 모니터링 및 제어 유닛(400) 및 바코드 스캐너(500)가 제공되어 있다. 리더의 내부에는 키트가 개구부(900)을 통해서 배치되는 슬롯(600)이 있다. LED와 같은 내부 조명 시스템(1000)을 이용하여, 리더 내부의 조명을 디지털화를 위한 일정한 조건을 제공하는데 최적화되도록 제어한다. 디지털 카메라 모듈이 슬롯에서 키트의 사진을 촬영하면, 디지털 이미지는 무선 통신 모듈(100)을 통해 서버로 전송된다. 무선 통신 모듈은 근거리 통신 프로토콜을 사용하여 리더가 와이파이 핫스팟과 같은 지역 인터넷 포털에 연결될 수 있게 한다. 광원의 파장은 UV 활성 착색제와 같은 다양한 착색제에 따라 조정될 수 있다. 리더는 자체의 통신 모듈을 갖기 때문에 모바일 네트워크와 독립적으로 작동할 수 있다.
도 17 내지 19는 키트가 84.7%의 감도와 84.4%의 특이성을 나타내는 일 실시형태에 따른 키트의 검사 결과를 도시한다.
실시예
개 사이클릭 AMP-의존성 단백질 키나제 촉매 서브유닛 Cα(PKC Cα)의 클로닝
RNeasy 컬럼(Qiagen)을 사용하여, 전체 RNA를 트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen) 중에서 균질화된 개 지방 조직으로부터 단리하였다. 이어서, Improm-II™ 역전사 시스템(Promega)을 제조업체의 지시에 따라 사용하여 1㎍의 전체 RNA를 올리고(dT) 프라이머로 cDNA로 역전사하였다. 개 PKC Cα cDNA를 exTaq 폴리머라제(Takara) 및 제한 효소 인식 부위, NcoI 및 XhoI를 함유하는 개 PKC Cα 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 프라이머의 서열은 다음과 같다: 전방향, AAT CCA TGG GCA ACG CCG CCG CCA AGA AGG GCA G 및 역방향, GCC GTC GAC GAA CTC ACA AAA CTC CTT GCC ACA CTT C.
이어서, 개 PKC Cα의 증폭된 cDNA 단편을 제한 효소, NcoI 및 XhoI (Takara)를 이용하여 분해시키고 세균 발현 벡터인 pET-22b(+) 플라스미드(Novagen)에 삽입하고 T7 프로모터 및 터미네이터 프라이머(T7 프로모터 프라이머, AAT ACG ACT CAC TAT AGG 및 T7 터미네이터 프라이머, GCT AGT TAT TGC TCA GCG G)를 이용하여 시퀀싱하였다.
재조합 개 PKC Cα의 정제
C-말단에서 6개의 히스티딘 잔기(6x - His 에피토프)로 태그된 개 PKC Cα를 코딩하는 pET-22b(+) 플라스미드를 에스케리카 콜라이(Escherichia coli) 균주 BL21(DE3)에 도입시키고, 실온에서 하룻밤 동안 1mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 이용하여 개 PKC Cα의 발현을 유도하였다. 세포를 회수하고 0.2M NaCl을 함유하는 50mM Tris·HCl(pH 7.4)에 재현탁시키고 초음파 처리하였다. 이어서, 재조합 개 PKC Cα를 IDA 엑셀로즈(Excellose) 수지(Bioprogen)를 이용하여 2개의 연속 고정된 금속 친화성 크로마토그래피로 정제한 다음, SP 세파로오스 수지(GE healthcare)을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 용출된 재조합 단백질을 투석하고, 추가 사용할 때까지 0.15M NaCl 및 1% 슈크로오스가 보충된 50mM Tris·HCl(pH 7.4) 중에서 1mg/ml의 농도로 -80℃에서 저장하였다.
웨스턴 블롯팅
50ng의 정제된 재조합 개 PKC Cα 및 양성 대조군 단백질인 인간 PKC Cα를 10% SDS PAGE 젤에서 분리하고 PVDF 막으로 이전시키고 토끼 폴리클로날 항-PKC Cα 항체(Abeam) 및 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Bethyl Laboratories)와 접합된 염소 항-토끼 IgG 항체로 연속적으로 프로빙(probing)한 다음, 강화된 화학발광(Pierce)으로 면역검출하였다.
효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 분석
개 혈청 중 세포외 PKC Cα의 존재와 수준을 제조업체의 지시에 따라서 항-개 PKC Cα ELISA 키트(Genorise)를 이용하여 평가하였다. 간략하게 언급하면, 시약 희석액 중에 4배 희석된 개 혈청 샘플 100㎕를 항-개 PKC Cα 항체로 사전 코팅된 96웰 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 플레이트를 실온에서 추가로 1시간 동안 개 PKC Cα 검출 항체와 함께 항온배양한 다음, 실온에서 20분 동안 HRP 접합체와 함께 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 10분 동안 기질 용액을 이용하여 발색시키고, 50㎕의 정지 용액을 이용하여 반응을 정지시켰다. 스캐닝 다중웰 분광광도계(Molecular Device)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
개 혈청 중의 세포외 PKC Cα 대한 자가항체를 고체상 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 간략하게 언급하면, 96웰 폴리스티렌 ELISA 스트립 플레이트(Santa Cruz)를 실온에서 하룻밤 동안 탄산염 코팅 완충액(pH 9.6)(Sigma) 중에 1㎍/ml로 희석된 100㎕의 재조합 개 PKC Cα로 코팅하고 0.1% Tween 20(pH 7.4)을 함유하는 PBS로 1회 세척하고 실온에서 2시간 동안 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하고 세척 완충액(0.15M NaCl 및 0.1% Tween 20이 보충된 50mM 나트륨 시트레이트(pH 5.2))으로 2회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 샘플 희석 완충액(0.25% BSA 및 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS(pH 7.4))에 1:500으로 희석된 100㎕의 개 혈청 샘플과 함께 항온배양하고 세척 완충액으로 4회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 샘플 희석 완충액에 1:20,000으로 희석된 HRP와 접합된 100㎕의 염소 항-개 IgG 항체(Abeam)와 함께 추가 항온배양하고, 세척 완충액으로 5회 세척하고 실온에서 15분 동안 100㎕의 3',3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 액체 기질 용액(Thermo - Fisher)으로 발색시켰다. 이어서, 50㎕의 2N H2SO4 용액으로 반응을 정지시키고 스캐닝 다중웰 분광광도계를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
악성 종양에 걸린 개 유래의 혈청 중에서 세포외 PKC Cα 검출
암 세포에 의해 생성된 세포외 PKA는 암 환자의 혈청에서 현저하게 증가하고 그 환자에서 이에 대한 자가항체의 생성을 유발하는 것으로 나타났다. 또한, 혈청 중의 PKA에 대한 자가항체의 역가는 다양한 세포 유형의 암의 존재와 유의적으로 상관관계가 있는 것으로 보고되었다. 따라서 PKA에 대한 자가항체는 인간의 암 진단을 위한 새로운 잠재적인 바이오마커로서 간주된다. 그러나, PKA 자가항체의 존재 및 그의 암과의 상관관계는 인간 이외의 포유동물에서 밝혀진 적은 없었다.
악성 종양에 걸린 개 유래의 혈청 중에서 세포외 PKC Cα에 대한 자가항체의 검출
PKC Cα자가항체의 역가가 인간에서 나타난 개의 다양한 세포 유형의 암과 양의 상관관계가 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 먼저 개 지방 조직 유래의 개 PKC Cα 유전자를 클로닝하고 세균에서 발현시키고 6x-His 에피토프로 태그된 재조합 단백질을 정제하였다(도). 이어서, 정제된 개 PKC Cα 단백질을 항원으로서 사용하는 ELISA 분석으로 PKC Cα자가항체의 존재 및 역가를 평가하였다.
측방 유동 키트의 제조
ECPKA(0.5 내지 4mg/ml) 및 제어 단백질(1 내지 2mg/ml)을 단백질 완충액으로 희석시키고 Biodot 저용적 정밀 분배 장비에 의해 니트로셀룰로오스 막에 분배하였다. 니트로셀룰로오스 막을 10% 습도 하에 밤새 건조시킨다. 샘플 패드를 샘플 패드 버터에 침지시키고 15% 습도 하에 37℃에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 개 IgG를 검출하기 위한 단백질과 접합된 고밀도 금 입자의 현탁액을 실온에서 가압하면서 슬라이스된 접합체 패드에 분무하여 높은 광학 밀도를 얻는다. 이어서, 접합체 패드를 25℃에서 10% 습도 하에 하룻밤 동안 건조시켰다. 이면 패드(backing pad) 위에 니트로셀룰로오스 막을 놓고, 금 입자로 충전된 슬라이스된 접합체 패드를 전방면에서 니트로셀룰로오스 막과 중첩되도록 이면 패드 위에 놓고, 샘플 패드를 접합체 패드 위에 놓고, 흡착 패드를 미단부에서 니트로셀룰로오스 막과 중첩되게 놓고, 조립된 이면 패드를 4mm 폭으로 절단하고, 절단된 조립된 이면 패드를 하우징에 넣어서 키트를 조립하였다.
상기 실시형태들은 단지 예시로서 설명하였기 때문에, 본 발명은 상기 실시형태들로 한정되지 않으며, 따라서 다양한 변형 또는 변경이 본 발명의 범위에서 벗어남이 없이 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있다.
서열목록
서열번호 1
Figure 112019122452910-pat00001
서열번호 2
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서열번호 3
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서열번호 4
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서열번호 5
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서열번호 6
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Figure 112019122452910-pat00007

Claims (20)

  1. 개의 암을 진단하는 방법으로서,
    (a) 측방 유동 키트를 위해 개의 혈액으로부터 검사 샘플을 제조하는 단계;
    (b) 검사 샘플을 측방 유동 키트에 적용하는 단계;
    (c) 측방 유동 키트가 발색되게 하는 단계;
    (d) 검사선을 포함하는 발색된 측방 유동 키트의 디지털 사진을 촬영하여 디지털 정보를 얻는 단계; 및
    (e) 항체의 농도를 얻는 단계로서, 상기 농도가 디지털 값을 항체 농도와 상관시키는 데이터 세트와 디지털 정보를 비교함으로써 결정되는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 추가적으로 개의 혈액 중 C-반응성 단백질(CRP)의 양을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 측방 유동 키트는,
    서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 고정화(immobilized)되고 정제된 재조합 개 PKC Cα 단백질을 갖는 제1 고체상;
    광학 밀도를 갖는 접합된 착색제를 포함하는 접합체 패드- 상기 접합된 착색제는 제1 결합 단백질과 접합(conjugated)되고; 및
    제2 결합 단백질을 포함하는 제2 고체상을 포함하고,
    상기 접합된 착색제는 제1 고체상에서는 제1 색상 강도를 제공하고 제2 고체상에서는 제2 색상 강도를 제공하도록 구성되어 있고,
    제1 색상 강도는 개의 혈중 항체 농도에 정량적으로 의존하고 제2 색상 강도는 항체 농도와 무관한, 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체의 농도를 얻는 단계 이후 개가 암에 걸리는 가능성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 디지털 사진을 촬영하여 얻은 디지털 정보를 무선 통신을 통해 외부 서버로 전송하는 단계를 추가로 포함하는 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 디지털 정보를 얻는 단계가 무선 통신 모듈, 카메라 모듈, 광원 및 측방 유동 키트를 수용하도록 설계된 슬롯을 포함하는 리더 박스를 사용하여 실시되는, 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 무선 통신 모듈이 단거리 무선 통신 프로토콜에 기반하여 작동하는, 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 광학 밀도가 5보다 높은, 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 광학 밀도가 10보다 높은, 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 방법이 적어도 80%의 특이성과 적어도 80%의 감도로 개에서 암을 검출하는, 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 농도가 0.9보다 큰 R2 값을 갖는 선형 방정식을 사용하여 추정되는, 개의 혈중에서 개 ECPKA 항체의 농도 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도를 결정하는 방법.
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