WO2013008930A1 - 皮膚筋炎の検査方法 - Google Patents

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WO2013008930A1
WO2013008930A1 PCT/JP2012/067994 JP2012067994W WO2013008930A1 WO 2013008930 A1 WO2013008930 A1 WO 2013008930A1 JP 2012067994 W JP2012067994 W JP 2012067994W WO 2013008930 A1 WO2013008930 A1 WO 2013008930A1
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WO
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tif1
protein
antibody
dermatomyositis
patients
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/067994
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English (en)
French (fr)
Inventor
藤本　学
和彦 竹原
Original Assignee
国立大学法人 金沢大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders

Definitions

  • the present invention relates to an examination method for diagnosing dermatomyositis using TIF1- ⁇ protein and TIF1- ⁇ protein, particularly pediatric dermatomyositis or malignant dermatomyositis.
  • Non-patent Document 1 the first discovery of an anti-155 / 140 antibody that is an autoantibody associated with malignant dermatomyositis.
  • Non-patent Document 2 a research group of Targoff in the US reported an anti-p155 antibody related to dermatomyositis, which seems to be the same antibody as the anti-155 antibody among anti-155 / 140 antibodies. Furthermore, it has been reported that the antigen that is the target of the antibody is TIF1- ⁇ (transcriptional intermediate factor 1- ⁇ ) protein (TRIM33 protein) (Non-patent Document 3).
  • TIF1- ⁇ transcriptional intermediate factor 1- ⁇ protein
  • the object of the present invention is to identify a protein having a molecular weight of 140 kDa, which is an antigen of the anti-140 antibody among the anti-155 / 140 antibodies previously reported by the inventors, and further to anti-155 protein antibody and anti-140 protein antibody dermatomyositis, In particular, it is intended to clarify an association with pediatric dermatomyositis or dermatomyositis with malignant tumor, and to provide a test method or test kit for determining whether or not the patient is suffering from the disease.
  • a further object of the present invention is to provide a method for evaluating the treatment of the disease.
  • the present inventors have found that among the anti-155 / 140 antibodies, a protein having a molecular weight of 140 kDa, which is an antigen of the anti-140 antibody, is a TIF1- ⁇ (TRIM24) protein belonging to the TIF1 protein family. Furthermore, the present inventors have at least anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ more than adult dermatomyositis patients who are positive for anti-TIF1- ⁇ protein antibody and negative for anti-TIF1- ⁇ protein antibody. It was found that in adult dermatomyositis patients positive for both antibodies of protein antibody, the rate of complication of malignant tumor was high. We also found that the proportion of both antibodies positive was high in pediatric dermatomyositis patients. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • a test method for diagnosing dermatomyositis characterized by using an anti-TIF1- ⁇ antibody in a sample obtained from a subject as an index
  • a test method for diagnosis of dermatomyositis comprising the following steps: (1) a step of contacting a sample obtained from a subject and a healthy person with TIF1- ⁇ protein; (2) measuring the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody, (3)
  • the test method and test kit of the present invention can quickly and easily diagnose whether or not a subject suffers from dermatomyositis, particularly pediatric dermatomyositis or malignant dermatomyositis. Further, according to the present invention, it is possible to easily evaluate the treatment of a patient suffering from the above-mentioned disease and being treated.
  • A Autoradiographic image of immunoprecipitation assay for K562 cell extract using DM patient serum.
  • B Western blot image of TIF1- ⁇ protein using DM patient serum.
  • A Autoradiographic image of immunoprecipitation assay for K562 cell extract using DM patient serum, anti-MDA5 antibody, anti-NXP-2 antibody or anti-TIF1- ⁇ polyclonal antibody.
  • B Western blot image using anti-TIF1- ⁇ polyclonal antibody after immunoprecipitation assay for K562 cell extract using DM patient serum or control serum.
  • C Western blot image of TIF1- ⁇ protein using DM patient serum.
  • A Autoradiographic image of immunoprecipitation assay for K562 cell extract using DM patient serum and anti-TIF1- ⁇ protein antibody.
  • B Western blot image using anti-TIF1- ⁇ polyclonal antibody after immunoprecipitation assay for K562 cell extract using DM patient serum or control serum.
  • C Western blot image of TIF1- ⁇ protein using anti-TIF1- ⁇ protein antibody in sera of DM patients. It is a figure which shows distribution about the DM onset age of 78 DM patients who are positive for anti- TIF1- ⁇ protein antibody, anti-TIF1- ⁇ protein antibody or anti-TIF1- ⁇ protein antibody, and the presence or absence of malignant tumor.
  • the subject to which the test method of the present invention can be applied is not particularly limited, and examples thereof include a subject suspected of developing dermatomyositis.
  • Characteristics of “suspected of developing dermatomyositis” include heliotrophic eruption, Gottron sign, whiplash-like erythema, nail circumference erythema, nail epithelial bleeding point, joint pain, creatine kinase elevation, etc. It is done.
  • dermatomyositis can be classified into a plurality of subsets based on age of onset, muscle symptoms, skin symptoms and other comorbid diseases.
  • Such subsets include, for example, pediatric dermatomyositis from age, adult dermatomyositis, non-myopathy dermatomyositis from myositis degree, hypomyopathy dermatomyositis, and other complications from interstitial pneumonia (rapid progressive, chronic ) Combined dermatomyositis, malignant dermatomyositis, and the like.
  • malignant tumors to be combined include colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer.
  • Pancreatic cancer brain tumor, blood tumor and the like.
  • the sample used in the test method of the present invention is not particularly limited as long as it is collected from a subject and contains an antibody to be detected.
  • whole blood, blood cell components, plasma, serum, lymph, cerebrospinal fluid, semen, urine, sweat, saliva, joint fluid such as joint fluid or fractions thereof, mucous membrane, cell or tissue specimen obtained by biopsy, etc. Blood (eg, peripheral blood), serum, lymph, and the like are particularly preferred from the standpoint that they can be collected quickly and easily and less invasive to the subject, but are not limited thereto.
  • the test method of the present invention is characterized by measuring the amount of antibody that increases in correlation with dermatomyositis, particularly pediatric dermatomyositis or malignant tumor dermatomyositis, in a sample collected from the subject described above.
  • Dermatatomyositis especially pediatric dermatomyositis or increased dermatomyositis with malignant tumors
  • Dermatis especially pediatric dermatomyositis or increased dermatomyositis with malignant tumors” refers to a substantial amount of a specific antibody in a patient who has developed dermatomyositis (especially pediatric dermatomyositis or malignant dermatomyositis). That there is a statistically significant tendency to increase.
  • specific antibodies whose antibody amount increases in correlation with dermatomyositis include anti-TIF1- ⁇ protein antibodies, preferably anti-TIF1- ⁇ protein antibodies.
  • anti-aminoacyl-tRNA synthetase (ARS) antibody, anti-Mi-2 antibody, anti-MDA5 (melanoma-differentiated-associated gene 5) antibody or anti-NXP-2 antibody is also correlated with dermatomyositis.
  • ARS anti-aminoacyl-tRNA synthetase
  • anti-Mi-2 antibody anti-MDA5 (melanoma-differentiated-associated gene 5) antibody or anti-NXP-2 antibody
  • anti-NXP-2 antibody anti-NXP-2 antibody
  • anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ protein antibody are antibodies whose antibody amount increases particularly in correlation with pediatric dermatomyositis or malignant tumor dermatomyositis.
  • anti-Mi-2 antibody and anti-NXP-2 antibody are also listed as antibodies whose antibody amount increases.
  • anti-aminoacyl-tRNA synthetase antibody, anti-Mi-2 antibody, and anti-MDA5 antibody are examples of antibodies in which an increase in antibody amount is observed. Therefore, for pediatric dermatomyositis, in addition to anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ protein antibody, anti-Mi-2 antibody and anti-NXP-2 antibody may be included in the test.
  • the test method of the present invention is preferably characterized by using TIF1- ⁇ protein, more preferably TIF1- ⁇ protein.
  • TIF1- ⁇ protein as an antigen for each antibody, TIF1- ⁇ protein, TIF1- ⁇ protein or a partial peptide thereof (hereinafter referred to as “TIF1- ⁇ unless otherwise specified” in the description of the antibody).
  • TIF1- ⁇ protein or TIF1- ⁇ protein
  • a (synthetic) peptide having one or more antigen determinants identical thereto hereinafter referred to simply as“ this ”).
  • aminoacyl-tRNA synthetase protein Mi-2 protein, MDA5 protein, NXP-2 protein, etc. may be used in combination as an antigen.
  • TIF1- ⁇ protein a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1 as isoform a or an isoform b as SEQ ID NO: 2
  • TIF1- ⁇ protein include proteins containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence.
  • Specific examples of the TIF1- ⁇ protein include a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) of the present invention may be a protein comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3).
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3) is SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3).
  • homology refers to an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably the algorithm uses a sequence of sequences for optimal alignment). The percentage of identical and similar amino acid residues relative to all overlapping amino acid residues in which one or both of the gaps can be considered).
  • similar amino acids mean amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids (Gln, Asn).
  • Other algorithms for determining amino acid sequence homology include, for example, Karlin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) [the algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 ( 1997))], Needleman et al. , J .; Mol. Biol.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO:
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3) include, for example, the aforementioned SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 ( Equivalent to the protein having the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3) and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3)
  • a protein having activity is preferred.
  • substantially the same quality of activity acts on nuclear receptors such as estrogen receptor, retinoic acid receptor, vitamin D receptor via activation function 2 (AF2).
  • the transcriptional regulation activity of the target gene of the receptor or the ubiquitination promoting activity of p53 via E3 protein-ubiquitin ligase can be mentioned in addition to the transcriptional regulatory activity of the above gene and p53 ubiquitination promoting activity.
  • “Substantially homogeneous” indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same. Accordingly, the above activities are preferably equivalent (for example, about 0.5 to about 2 times), but quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different. The activity can be measured using a known method.
  • the TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) of the present invention includes, for example, (i) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3) An amino acid sequence in which the above (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids have been deleted, (ii) SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 1 or 2 (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence represented by 2 (SEQ ID NO: 3) (Iii) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3) (preferably about 1 to 30, preferably 1 to About 10 and more preferred Or (iv) one or more amino acid sequences in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3).
  • TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) of the present invention is preferably a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3).
  • TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) is prepared, for example, using (a) a known method from a human (eg, subject) cell or tissue or a method equivalent thereto, (b) using a peptide synthesizer, etc. Chemically synthesized by a known peptide synthesis method, (c) culturing a transformant containing DNA encoding TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein), or (d) TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) ) And a biochemical synthesis using a cell-free transcription / translation system as a template.
  • TIF1- ⁇ protein When preparing TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) from human (eg, subject) cells or tissues, the cells (eg, hepatocytes, splenocytes, neurons, glial cells, pancreatic ⁇ cells, Bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells) Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes Or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells exist, such as the brain, each
  • TIF1- ⁇ protein TIF1- ⁇ protein
  • chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. It can also be separated.
  • the obtained TIF1- ⁇ protein TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) can be used as an antigen as it is, or a partial peptide can be prepared by limited degradation using a peptidase or the like and used as an antigen.
  • the synthetic peptide is, for example, the same as TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) purified from natural materials using the method of (a) described above.
  • a peptide containing one kind or two or more kinds is used.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the synthetic peptide thus obtained can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the synthetic peptide obtained by the above method is a free form
  • the free form can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the synthetic peptide is obtained as a salt
  • the salt can be converted to a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA can be obtained by a known cloning method [for example, Molecular Cloning 2nd ed. (Methods described in J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)].
  • the cloning method includes (1) using a DNA probe designed on the basis of a gene sequence encoding TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein), and DNA encoding the antigen from a human cDNA library by hybridization.
  • a desired antigen can be obtained by culturing a transformant obtained by transforming a host with the expression vector in an appropriate medium.
  • a complete TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) molecule or a peptide having a partial amino acid sequence can be used.
  • the partial amino acid sequence include those consisting of 3 or more consecutive amino acid residues, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 6 or more consecutive amino acid residues. It is done.
  • the amino acid sequence includes, for example, 20 or less consecutive amino acid residues, preferably 18 or less, more preferably 15 or less, and even more preferably 12 or less consecutive amino acid residues. Is mentioned. Some of these amino acid residues (eg, 1 to several) may be substituted with a substitutable group (eg, Cys, hydroxyl group, etc.).
  • a peptide used as an antigen has an amino acid sequence containing 1 to several such partial amino acid sequences.
  • an immunological measurement method using the above-described protein or the like as an antigen various immunoassays such as a fluorescent antibody indirect method, Western blot or ELISA using the protein can be used.
  • a fluorescent antibody indirect method a cultured cell (eg, HEp-2 cell) as an antigen is fixed on a solid phase (eg, slide glass) with acetone, and a sample derived from a subject is contacted to give a labeled anti-antibody. It can be detected by a human immunoglobulin antibody.
  • a sample is diluted in series (for example, 40-fold dilution, 80-fold dilution, 160-fold dilution, etc.), and the presence or absence of the subject's antibody is determined from the dilution factor that is a positive limit.
  • this method is largely based on the subjectivity of the inspector because the person performing the test visually determines the dilution factor at which the positive limit is reached.
  • the standard of the dilution rate at which the subject is determined to have an antibody is often set to around 40 times, even a healthy person is determined to have a positive antibody at the dilution rate. Cases often occur.
  • ELISA is also excellent in quantitative properties, it can compensate for the drawbacks of the indirect fluorescent antibody method.
  • the sample may be reacted simultaneously or sequentially with the separated or immobilized antigen on the solid phase and the labeled anti-immunoglobulin antibody.
  • Western blotting or ELISA it is preferable to use Western blotting or ELISA, and it is more preferable to use ELISA.
  • the inspection method of the present invention may include the following steps. (1) contacting a sample obtained from a subject and a healthy person with TIF1- ⁇ protein; (2) measuring the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody, (3) A step of comparing the amount of antibody measured between the subject and the healthy subject
  • the inspection method of the present invention may include the following steps. (1) contacting a sample obtained from a subject and a healthy person with TIF1- ⁇ protein and TIF1- ⁇ protein, respectively; (2) measuring the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody and the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody, (3) A step of comparing the amount of antibody measured between the subject and the healthy subject
  • the TIF1- ⁇ protein and TIF1- ⁇ protein to be contacted with the sample are used after being separated by a support in advance and then transferred to a transfer membrane such as a nitrocellulose membrane. obtain.
  • a transfer membrane such as a nitrocellulose membrane.
  • polyacrylamide gel is preferably used.
  • polyacrylamide gel, starch gel, urea-containing starch gel, agarose slab gel and the like having a concentration gradient may be used.
  • the separation method include urea gel electrophoresis, SDS electrophoresis, gradient gel electrophoresis, isoelectric focusing, and two-dimensional electrophoresis. The separation can also be performed according to other known methods.
  • the protein is transferred to the transfer film by being adsorbed by a diffusion method or an electric method.
  • the TIF1- ⁇ protein and the TIF1- ⁇ protein may be separated by the same support and transferred to the transfer membrane, or may be separated by a separate support and transferred to the transfer membrane.
  • the TIF1- ⁇ protein and TIF1- ⁇ protein of the present invention can be used in a state of being directly immobilized on a solid phase without being separated.
  • the solid phase include various carriers used in normal antigen-antibody reaction and affinity chromatography, for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass and metals. And microplates, tubes, membranes, columns, beads, and the like, and surface plasmon resonance (SPR) sensor chips.
  • SPR surface plasmon resonance
  • TIF1- ⁇ protein and TIF1- ⁇ protein may be immobilized on the same solid phase, or may be immobilized on separate solid phases.
  • a secondary antibody against an antibody specifically bound to an antigen on a transfer membrane or a solid phase can be used, and the secondary antibody is preferably labeled.
  • a natural antibody such as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (mAb), a chimeric antibody that can be produced using a gene recombination technique, a humanized antibody or a single antibody, as long as it recognizes human immunoglobulin.
  • Chain antibodies, and binding fragments thereof include, but are not limited to.
  • the antibody is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or a binding fragment thereof.
  • the binding fragment means a partial region of the aforementioned antibody having specific binding activity, and specifically includes, for example, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv, sFv, dsFv, sdAb and the like. (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, p. 441-456, 1996).
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
  • a radioisotope for example, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used.
  • the radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • the enzyme is preferably stable and has a high specific activity.
  • enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, and the like are used. When the test compound emits autofluorescence, it is necessary to select substances having different excitation wavelengths and fluorescence wavelengths.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin- (strept) avidin system can be used for the binding between the antibody and the labeling agent. Further, as described above, the anti-immunoglobulin antibody that is a secondary antibody may be reacted with the sample immobilized on the transfer membrane or solid phase simultaneously or successively.
  • An antibody amount measurement system may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method.
  • An antibody amount measurement system may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method.
  • reviews, books and the like it is possible to refer to reviews, books and the like.
  • Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” Kelsha, published in 1974
  • Hiroshi Irie “Continue Radioimmunoassay” published in Kodansha, 1974
  • Enzyme Immunoassay edited by Eiji Ishikawa et al. 53)
  • the test method of the present invention can be used as a material for determining whether or not a subject suffers from dermatomyositis by measuring anti-TIF1- ⁇ antibody and / or anti-TIF1- ⁇ antibody by the above-described method. .
  • both anti-TIF1- ⁇ antibody and anti-TIF1- ⁇ antibody are often positive in dermatomyositis patients, and in particular, anti-TIF1- ⁇ antibody alone is used.
  • the percentage of patients who are both positive is higher than that of patients who are positive.
  • a sample is obtained from an individual who has been confirmed not to have dermatomyositis (negative control) and an individual who is clinically determined to have dermatomyositis (positive control).
  • the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody and / or anti-TIF1- ⁇ antibody in a sample obtained from a subject subject to the test method of the invention is compared with that of a positive control and a negative control.
  • a correlation diagram between the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody and / or anti-TIF1- ⁇ antibody in patients with dermatomyositis and the rate clinically determined to be dermatomyositis is prepared in advance, and the test of the present invention is performed.
  • the antibody amount of anti-TIF1- ⁇ antibody and / or anti-TIF1- ⁇ antibody in a sample obtained from a subject to be subjected to the method may be compared with the correlation diagram.
  • the comparison of antibody amounts is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the antibody amount of the anti-TIF1- ⁇ antibody and / or the anti-TIF1- ⁇ antibody in the subject is relative to that of the healthy subject. If it is high, it can be determined that the probability of dermatomyositis is relatively high.
  • the dermatomyositis that can be diagnosed in the test method of the present invention is preferably pediatric dermatomyositis or malignant dermatomyositis.
  • pediatric dermatomyositis out of 11 patients clinically diagnosed with pediatric dermatomyositis, 36% (4/11) were antibodies against the TIF1 protein family (one was positive only for anti-TIF1- ⁇ antibody, 3 had positive anti-TIF1- ⁇ antibody and anti-TIF1- ⁇ antibody). Therefore, by examining both anti-TIF1- ⁇ antibody and anti-TIF1- ⁇ antibody, pediatric dermatomyositis can be diagnosed with high accuracy. Further, as described above, the anti-Mi-2 antibody and anti-NXP-2 antibody may be further combined and examined.
  • adult DM patients who were positive for at least anti-TIF1- ⁇ antibody and anti-TIF1- ⁇ antibody ie, anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1
  • anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ antibody -73% of adult DM patients positive for ⁇ protein antibody and adult DM patients positive for anti-TIF1- ⁇ protein antibody, anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ protein antibody
  • adult DM patients who are positive for at least anti-TIF1- ⁇ protein antibody and negative for anti-TIF1- ⁇ protein antibody that is, adult DM patients positive only for anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ protein
  • adult DM patients who were positive for antibody and anti-TIF1- ⁇ protein antibody occurred at a rate of 50%. Therefore, by examining both the anti-TIF1- ⁇ antibody and the anti-TIF1- ⁇ antibody, it is possible to diagnose malignant dermatomyositis with high accuracy. Since a marker that sufficiently correlates with malignant tumor-associated dermatomyositis has not been found so far, the test method for diagnosing malignant tumor-associated dermatomyositis that tests both antibodies of the present invention is extremely useful.
  • the therapeutic effect can be evaluated by applying the test method for diagnosis of dermatomyositis to a patient who has been treated for dermatomyositis or a subject who has been administered a candidate compound for treating dermatomyositis. That is, the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody, preferably anti-TIF1- ⁇ antibody, in a sample collected over time from a dermatomyositis patient during or after treatment is measured and compared, and compared with before treatment. Thus, if the anti-TIF1- ⁇ antibody and / or anti-TIF1- ⁇ antibody amount after treatment shows a tendency to decrease, it can be determined that a therapeutic effect is observed.
  • the present invention also provides a test kit for diagnosing dermatomyositis that can be preferably used in the test method of the present invention.
  • the diagnostic kit for diagnosis comprises TIF1- ⁇ protein, preferably further containing TIF1- ⁇ protein.
  • TIF1- ⁇ protein When the diagnostic kit for diagnosis contains two or more of the above TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein), each protein is a partial peptide of TIF1- ⁇ protein (TIF1- ⁇ protein) containing different epitopes. It's okay.
  • TIF1- ⁇ protein and TIF1- ⁇ protein of the test kit of the present invention include the antigens described above in the test method of the present invention.
  • the protein is preferably provided in an immobilized state on an appropriate solid phase.
  • the solid phase and the immobilization means the solid phase and immobilization means described above in the inspection method of the present invention are used.
  • the reagent constituting the agent of the present invention is a substance capable of detecting the anti-TIF1- ⁇ antibody amount and the anti-TIF1- ⁇ antibody amount, as well as other substances necessary in the reaction for detecting the antibody amount. Further, a substance that does not adversely influence the reaction by being stored in a coexisting state can be further contained. Alternatively, the reagent may be provided together with separate reagents containing other substances necessary in the reaction for detecting the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody and the amount of anti-TIF1- ⁇ antibody.
  • Examples of the other substance include a reaction buffer, a competent antibody, a labeled secondary antibody (for example, mouse anti-human IgG labeled with peroxidase, alkaline phosphatase, etc. to react with human immunoglobulin), blocking, and the like. Liquid and the like.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • cDNA complementary deoxyribonucleic acid
  • A adenine T: thymine
  • G guanine
  • C cytosine RNA: ribonucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • dATP deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP deoxythymidine triphosphate
  • dGTP deoxyguanosine tri
  • Phosphate dCTP deoxycytidine triphosphate ATP: adenosine triphosphate
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Gly glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine
  • Ile isoleucine
  • Ser threonine
  • CyrM threonine
  • Methionine Glu Glutamic acid
  • Asp Aspa Gin acid
  • CADM included amyopathic DM patients and hypopathic DM patients.
  • Hypopathic DM patients had frequent DM and had potential symptoms of myositis at electrophysiological, radiological and laboratory evaluation. Eleven patients were categorized as pediatric DM and the other 445 were categorized as adult DM.
  • As control diseases 62 patients with polymyositis (PM), 108 patients with systemic lupus erythematosus, and 443 patients with systemic scleroderma were evaluated.
  • Clinical information was collected retrospectively from all patients by reviewing the clinical chart. Visceral malignancies and hematological malignancies in DM patients are described in Medicine (Baltimore). 1991; 70 (6): 360-374.
  • malignant tumor refers to a case where a malignant tumor is diagnosed within 3 years from the diagnosis of DM.
  • the protocol was approved by Kanazawa University School of Medicine and Kanazawa University Hospital.
  • Reagents As antibodies used in this example, rabbit anti-human TIF1- ⁇ (TRIM24), sheep anti-human TIF1- ⁇ (KAP1, TRIM28) and rabbit anti-human TIF1- ⁇ (TRIM33) polyclonal antibodies are Abcam (Cambridge, UK). We purchased more and used.
  • Recombinant proteins used in this example include glutathione S-transferase (GST) -tagged human full-length TIF1- ⁇ protein (Abnova, Taipei City, Taiwan), GST-tagged human full-length TIF1- ⁇ protein (Abnova) and Human full length TIF1- ⁇ protein (Origene, Rockville, MD).
  • GST glutathione S-transferase
  • IP Immunoprecipitation Immunoprecipitation
  • IP buffer 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40
  • the antibody-coated sepharose beads were mixed with 35 S methionine labeled K562 cell extract or unlabeled K562 cell extract derived from 10 6 cells and rotated at 4 ° C. for 2 hours.
  • the membrane was incubated with a serum sample or polyclonal antibody, followed by anti-rabbit IgG (Thermo Scientific, RockFord, IL) conjugated with horseradish peroxidase (HRP), anti-sheep IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Alternatively, it was incubated with an anti-human IgG (MP Biomedicals, Solon, OH) antibody.
  • HRP horseradish peroxidase
  • anti-sheep IgG Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA
  • HRP horseradish peroxidase
  • an anti-human IgG MP Biomedicals, Solon, OH
  • the membrane was processed using an enhanced chemiluminescence kit (Thermo Scientific). Statistical Processing In this example, Fisher's exact test was used for frequency comparison. P values ⁇ 0.05 were considered statistically significant.
  • Example 1 Molecular Weight 155 kDa Antigen Recognized by Anti-155 / 140 Antibody
  • an antigen having a molecular weight of 155 kDa recognized by anti-155 antibody is a different research group (Targoff IN et al. , Arthritis Rheum, 54 (11): 3682-3689, 2006), whether or not it is a TIF1- ⁇ protein was confirmed.
  • the band size that can be confirmed when immunoprecipitation was performed using a TIF1- ⁇ reactive polyclonal antibody was sera from DM patients positive for anti-155 / 140 antibody (in this example, expressed as anti-155 / 140 serum).
  • Example 2 Molecular Weight 140 kDa Antigen Recognized by Anti-155 / 140 Antibody
  • the protein having a molecular weight of 140 kDa immunoprecipitated using anti-155 / 140 serum is MXP5, which is an antigen of anti-CADM140 antibody that becomes positive in CADM, and NXP, which is an antigen of anti-MJ antibody.
  • -2 (MORC3) protein was confirmed to be different in size (FIG. 2A).
  • the band size of the protein immunoprecipitated with a polyclonal antibody of TIF1- ⁇ protein, another protein of the TIF1 protein family coincided with the band size immunoprecipitated with anti-155 / 140 serum at a molecular weight of 140 kDa.
  • FIGGS. 1A and 2A We further performed immunoprecipitation by incubating K562 cell extract with protein-A sepharose beads pre-incubated with anti-155 / 140 serum and Western blotting the immunoprecipitated protein with TIF1- ⁇ protein polyclonal antibody. went.
  • Example 3 Reactivity of anti-155 / 140 serum against TIF1- ⁇ protein
  • the inventors examined whether TIF1- ⁇ protein belonging to the TIF1 protein family is also recognized by anti-155 / 140 serum.
  • the TIF1- ⁇ protein was confirmed at a molecular weight of about 100 kDa (FIG. 3A). From this result, the inventors screened anti-155 / 140 serum that can immunoprecipitate a protein having a molecular weight of about 100 kDa.
  • TIF1- ⁇ protein immunoprecipitated by TIF1- ⁇ protein polyclonal antibody (FIG. 3A).
  • the protein-A was obtained by preincubating K562 cell extract with serum capable of immunoprecipitation of the above-mentioned protein having a molecular weight of 100 kDa. Incubated with Sepharose beads and Western blotted with TIF1- ⁇ protein polyclonal antibody.
  • the inventors have also determined whether 456 DM patients, 62 patients to determine whether anti-TIF1- ⁇ protein antibodies can exist independently of anti-TIF1- ⁇ protein antibodies or anti-TIF1- ⁇ protein antibodies.
  • PM patients, 108 systemic lupus erythematosus patients, and 443 systemic scleroderma patients were rescreened. Serum from a 36-year-old CADM female patient was reactive with a 100 kDa molecular weight protein but not with a 155/140 protein. On the other hand, the sera of patients with other diseases showed no reactivity to the molecular weight 100 kDa protein.
  • TIF1- ⁇ protein was the most targeted protein, followed by TIF1- ⁇ protein, and the least targeted protein was TIF1- ⁇ protein, and anti-155 / 140 sera have various reactivity patterns Suggested that TIF1- ⁇ protein, TIF1- ⁇ protein, and TIF1- ⁇ protein, which are TIF1 protein family, are targeted.
  • Example 4 Association of Response Patterns of Serum from DM Patients to TIF1 Protein Family and Diseases We have reported that 78 patients with the disease showing reactivity with the TIF1 protein family examined in Example 3 We investigated the relevance. Of all patients, 74 were over 15 years old and 4 were under 15 years old ( Figure 4). Therefore, 16% of adult DM patients (74/445), 36% of pediatric DM patients (4/11; one positive for anti-TIF1- ⁇ antibody only, 3 for anti-TIF1- ⁇ antibody and anti-TIF1- ⁇ antibody ) was reactive against the TIF1 protein family. This is consistent with reports in the US and Europe that anti-155 / 140 antibodies are a major serological subset in both pediatric DM and adult malignant DM.
  • Some DM patients have typical DM symptoms (ie, muscle related symptoms) and others with CADM symptoms, but 53 of 78 patients with anti-TIF1 protein family antibodies (68%) was typical DM and 25 were CADM. All pediatric DM patients could be classified as typical DM. In contrast, out of 8 young adult DM patients who were positive for anti-TIF1 protein family antibody, 6 had no muscle related symptoms throughout the course and were classified as CADM. Another young adult DM patient was initially diagnosed with CADM, but progressed to mild DM after 6 months. Regarding malignant tumors, the percentage of adult adult DM and CADM patients with malignant tumors was 69% (34/49) and 56% (14/25), respectively.
  • the typical DM patient had a slightly higher frequency of malignant tumors, but this was not a significant difference. Interstitial pneumonia was seen in only 3 patients (3.8%).
  • adult DM patients positive for at least anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ protein antibody ie, anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ protein
  • adult DM patients positive for antibodies and adult DM patients positive for anti-TIF1- ⁇ protein antibody, anti-TIF1- ⁇ protein antibody and anti-TIF1- ⁇ protein antibody have a malignant tumor ratio of 73% (36/49).
  • the test method and test kit of the present invention can quickly and easily diagnose whether or not a subject suffers from dermatomyositis, particularly pediatric dermatomyositis or malignant dermatomyositis. Further, according to the present invention, it is possible to easily evaluate the treatment of a patient suffering from the above-mentioned disease and being treated.

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Abstract

　本発明は、皮膚筋炎、特に小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎に罹患しているか否かを判断するための検査方法または検査キットを提供する。本発明はまた、該疾患の治療評価方法を提供する。

Description

皮膚筋炎の検査方法
　本発明は、ＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質を用いる皮膚筋炎、特に小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎の診断のための検査方法などに関する。
　現在、膠原病の診療では、自己抗体の検索が診断、病型分類、治療方針の決定に欠かせないツールである。例えば、関節リウマチにおけるリウマトイド因子や抗ＣＣＰ抗体、全身性エリテマトーデスにおける抗二本鎖ＤＮＡ抗体や抗Ｓｍ抗体、全身性強皮症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＳＳｃ）における抗Ｓｃｌ－７０抗体や抗セントロメア抗体などは陽性率が高く、疾患特異性が概ね高いため、これらの疾患の診断に極めて有用である。
　膠原病の一つである多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ：ＰＭ）・皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｓ：ＤＭ）は、骨格筋の炎症による筋力低下・筋痛を主症状とする自己免疫疾患であるが、発症年齢、筋症状や皮膚症状の病型、その他の症状の有無などを軸として幾つかのサブセットに分類される。皮膚筋炎においては、年齢からは小児例と成人例、筋炎の程度からは通常の皮膚筋炎以外に非ミオパチー性皮膚筋炎、低ミオパチー性皮膚筋炎などに分類できる。その他の症状としては、間質性肺炎または悪性腫瘍の合併が知られており、成人の皮膚筋炎では約３０％に悪性腫瘍が合併する悪性腫瘍合併皮膚筋炎という共通した臨床的特徴を持つサブセットを形成している。
　多発性筋炎・皮膚筋炎では、ルーチン検査（保険診療）で測定することが出来る筋炎特異的自己抗体として、抗細胞質抗体であるＪｏ－１抗体が見出されている。しかし、抗Ｊｏ－１抗体は、多発性筋炎では２０～３０％の患者で陽性となるが、皮膚筋炎患者での陽性率は５～１０％に留まり、陽性率は高くない。また、皮膚筋炎患者における抗核抗体全般の陽性率も低く、陽性であっても力価が低いことも多い。かかる状況から、これまでは皮膚筋炎においては自己抗体の検索はあまり有用なツールにはならないと考えられてきた。しかし近年になって、皮膚筋炎の新しい特異的抗体がいくつか見出され、いずれかの特異的抗体が陽性になる率がかなり高いこと、さらにその特異的抗体と臨床病型とが密接に相関することが明らかとなってきた。以前、発明者らは悪性腫瘍合併皮膚筋炎に関連する自己抗体である抗１５５／１４０抗体を初めて見出したことを報告した（非特許文献１）。また、ほぼ同時期に米国のＴａｒｇｏｆｆの研究グループは、抗１５５／１４０抗体のうち、抗１５５抗体と同一抗体と思われる、皮膚筋炎に関連する抗ｐ１５５抗体を報告し（非特許文献２）、さらに該抗体の標的となる抗原はＴＩＦ１－γ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　１－γ）タンパク質（ＴＲＩＭ３３タンパク質）であることを報告している（非特許文献３）。かかる現状から、皮膚筋炎、特に悪性腫瘍合併皮膚筋炎の検査として、ＴＩＦ１－γタンパク質に対する自己抗体を指標とした方法に期待がもたれるが、一方で分子量１４０ｋＤａの抗原の同定には至っておらず、検査の確度の向上を図るべく、その解析が待たれている状態であった。
Ｋａｊｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｒｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ），４６（１），２５－２８，２００７ Ｔａｒｇｏｆｆ　ＩＮ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｕｅｍ．，５４（１１），３６８２－３６８９，２００６ Ｔａｒｇｏｆｆ　ＩＮ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｕｅｍ．，５４，Ｓ５１８，２００６
　本発明の目的は、以前発明者らが報告した抗１５５／１４０抗体のうち、抗１４０抗体の抗原である分子量１４０ｋＤａのタンパク質を特定し、さらに抗１５５タンパク質抗体と抗１４０タンパク質抗体の皮膚筋炎、特に小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎との関連性を明らかにし、以って該疾患に罹患しているか否かを判断するための検査方法または検査キットを提供することである。本発明のさらなる目的は、該疾患の治療評価方法を提供することである。
　本発明者らは、抗１５５／１４０抗体のうち、抗１４０抗体の抗原である分子量１４０ｋＤａのタンパク質がＴＩＦ１タンパク質ファミリーに属する、ＴＩＦ１－α（ＴＲＩＭ２４）タンパク質であることを見出した。さらに、本発明者らは、少なくとも抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性であって、かつ抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体が陰性の成人皮膚筋炎患者よりも、少なくとも抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体の両抗体が陽性の成人皮膚筋炎患者において、悪性腫瘍を合併する割合が高いことを見出した。また、小児皮膚筋炎患者においても、両抗体が陽性である割合が高いことも見出した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］被験者から得られた試料中の抗ＴＩＦ１－α抗体を指標とすることを特徴とする、皮膚筋炎の診断のための検査方法；
［２］ＴＩＦ１－αタンパク質を用いることを特徴とする、上記［１］に記載の検査方法；
［３］さらに、前記試料中の抗ＴＩＦ１－γ抗体を指標とすることを特徴とする、上記［１］または［２］に記載の検査方法；
［４］ＴＩＦ１－γタンパク質を用いることを特徴とする、上記［３］に記載の検査方法；
［５］皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、上記［１］から［４］のいずれか１つに記載の検査方法；
［６］以下の工程を含むことを特徴とする、皮膚筋炎の診断のための検査方法
（１）被験者および健常者から得られた試料をＴＩＦ１－αタンパク質に接触させる工程、
（２）抗ＴＩＦ１－α抗体量を測定する工程、
（３）被験者および健常者間で測定した抗体量を比較する工程；
［７］ＴＩＦ１－αタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、上記［６］に記載の検査方法；
［８］以下の工程を含むことを特徴とする、皮膚筋炎の診断のための検査方法
（１）被験者および健常者から得られた試料をＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質にそれぞれ接触させる工程、
（２）抗ＴＩＦ１－α抗体量および抗ＴＩＦ１－γ抗体量をそれぞれ測定する工程、
（３）被験者および健常者間で測定した抗体量を比較する工程；
［９］ＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、上記［８］に記載の検査方法；
［１０］皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、上記［６］から［９］のいずれか１つに記載の検査方法；
［１１］ＴＩＦ１－αタンパク質を含む、皮膚筋炎の診断のための検査キット；
［１２］ＴＩＦ１－αタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、上記［１１］に記載の検査キット；
［１３］さらに、ＴＩＦ１－γタンパク質を含む、上記［１１］または［１２］に記載の検査キット；
［１４］ＴＩＦ１－γタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、上記［１３］に記載の検査キット；
［１５］皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、上記［１１］から［１４］のいずれか１つに記載の検査キット；
［１６］被験者から得られた試料中の抗ＴＩＦ１－α抗体を指標とすることを特徴とする、皮膚筋炎の治療効果の評価方法；
［１７］ＴＩＦ１－αタンパク質を用いることを特徴とする、上記［１６］に記載の評価方法；
［１８］さらに、前記試料中の抗ＴＩＦ１－γ抗体を指標とすることを特徴とする、上記［１６］または［１７］に記載の評価方法；
［１９］ＴＩＦ１－γタンパク質を用いることを特徴とする、上記［１８］に記載の評価方法；
［２０］皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、上記［１６］から［１９］のいずれか１つに記載の評価方法；
などを提供する。
　本発明の検査方法および検査キットは、被験者が皮膚筋炎、特に小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎に罹患しているか否かの診断を迅速かつ簡便ならしめることができる。また本発明によれば、前記疾患に罹患しており、治療中の患者の治療評価を容易に行うことができる。
Ａ：ＤＭ患者の血清を用いたＫ５６２細胞抽出物に対する免疫沈降アッセイのオートラジオグラフ像を示す図である。Ｂ：ＤＭ患者の血清を用いた、ＴＩＦ１－γタンパク質のウェスタンブロット像を示す図である。 Ａ：ＤＭ患者の血清、抗ＭＤＡ５抗体、抗ＮＸＰ－２抗体または抗ＴＩＦ１－αポリクローナル抗体を用いたＫ５６２細胞抽出物に対する免疫沈降アッセイのオートラジオグラフ像を示す図である。Ｂ：ＤＭ患者の血清または対照血清を用いたＫ５６２細胞抽出物に対する免疫沈降アッセイを行い、抗ＴＩＦ１－αポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット像を示す図である。Ｃ：ＤＭ患者の血清を用いた、ＴＩＦ１－αタンパク質のウェスタンブロット像を示す図である。 Ａ：ＤＭ患者の血清、抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体を用いたＫ５６２細胞抽出物に対する免疫沈降アッセイのオートラジオグラフ像を示す図である。Ｂ：ＤＭ患者の血清または対照血清を用いたＫ５６２細胞抽出物に対する免疫沈降アッセイを行い、抗ＴＩＦ１－γポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット像を示す図である。Ｃ：ＤＭ患者の血清中の抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体を用いた、ＴＩＦ１－βタンパク質のウェスタンブロット像を示す図である。 抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体、抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体または抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の７８名のＤＭ患者のＤＭ発症年齢、悪性腫瘍の有無について分布を示す図である。
　本発明の検査方法が適用できる被験者は特に制限されないが、例えば、皮膚筋炎を発症していることが疑われる被験者が挙げられる。「皮膚筋炎を発症していることが疑われる」特徴としては、ヘリオトロープ疹、ゴットロン徴候、むち打ち様紅斑、爪囲紅斑、爪上皮出血点、関節痛、クレアチンキナーゼ上昇などが認められる場合などが挙げられる。また、本発明において皮膚筋炎は、発症年齢、筋症状、皮膚症状およびその他の合併する疾患から複数のサブセットに分類することができる。そのようなサブセットとしては、例えば、年齢から小児皮膚筋炎、成人皮膚筋炎、筋炎の程度から非ミオパチー性皮膚筋炎、低ミオパチー性皮膚筋炎、その他の合併症から間質性肺炎（急速進行性、慢性）合併皮膚筋炎、悪性腫瘍合併皮膚筋炎などが挙げられる。また、合併する悪性腫瘍としては、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍などが挙げられる。
　本発明の検査方法に用いられる試料としては、被験者から採取されるものであって、検出対象である抗体を含有するものであれば特に制限されない。例えば、全血、血球成分、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、汗、唾液、関節液等の体液もしくはそのフラクション、粘膜、生検により得られる細胞もしくは組織標本などが挙げられる。迅速且つ簡便に採取することができ、被験者への侵襲が少ないなどの点から、血液（例：末梢血）、血清、リンパ液等が特に好ましいが、それらに限定されない。
　本発明の検査方法は、上記した被験者から採取した試料における、皮膚筋炎、特に小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎と相関して増加する抗体量を測定することを特徴とする。「皮膚筋炎、特に小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎と相関して増加する」とは、皮膚筋炎（その中でも小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎）を発症した患者において特定の抗体量の実質的な増加傾向が、統計学上有意に認められることをいう。
　具体的には、本発明において皮膚筋炎と相関して抗体量が増加する特定の抗体として、抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体、好ましくは、さらに抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が挙げられる。また、その他の抗体として抗アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）抗体、抗Ｍｉ－２抗体、抗ＭＤＡ５（ｍｅｌａｎｏｍａ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　５）抗体または抗ＮＸＰ－２抗体等も皮膚筋炎と相関して抗体量が増加する公知の抗体として挙げられる。また、これらの抗体は、それが増加する皮膚筋炎患者の臨床的特徴から、サブセットに分類される。例えば、抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体、抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体は、小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎と相関して特に抗体量が増加する抗体である。小児皮膚筋炎の場合、抗Ｍｉ－２抗体、抗ＮＸＰ－２抗体もまた抗体量が増加する抗体として挙げられる。また、成人皮膚筋炎であれば、抗アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素抗体、抗Ｍｉ－２抗体、抗ＭＤＡ５抗体が抗体量の増加が認められる抗体として挙げられる。従って、小児皮膚筋炎であれば、抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体、抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体に加えて、抗Ｍｉ－２抗体、抗ＮＸＰ－２抗体を検査の対象に挙げてもよい。
　被験者から採取した試料における抗体量の測定は、該試料から抗体画分を調製し、該画分中に含まれる対象となる抗体を検出することにより調べることができる。各抗体の検出は、各抗体に対する抗原を用いて、免疫学的測定法によって行うことができる。従って、本発明の検査方法は、好ましくはＴＩＦ１－αタンパク質、より好ましくは、さらにＴＩＦ１－γタンパク質を用いることを特徴とする。
　ここで、本発明において各抗体に対する抗原としては、ＴＩＦ１－αタンパク質、ＴＩＦ１－γタンパク質またはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、特にことわらない限り、これらを包括して単に「ＴＩＦ１－αタンパク質（またはＴＩＦ１－γタンパク質）」という）、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。これらの抗原に加えて、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素タンパク質、Ｍｉ－２タンパク質、ＭＤＡ５タンパク質またはＮＸＰ－２タンパク質なども抗原としてさらに組み合わせて用いてもよい。具体的には、ＴＩＦ１－αタンパク質としては、アイソフォームａとして配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはアイソフォームｂとして配列番号：２に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、ＴＩＦ１－γタンパク質としては、具体的には配列番号：３に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
　本発明のＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）は配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよいが、配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ）、水酸基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の抗原性に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）限り用いることができる。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６－１３１０（１９９０）を参照）。
　本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４－４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、Ｍｙｅｒｓ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
　より好ましくは、配列番号：１又は配列番号：２（または配列番号：３）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１又は配列番号：２（または配列番号：３）で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
　配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の活性を有するタンパク質などが好ましい。
　実質的に同質の活性としては、例えば、ＴＩＦ１－αタンパク質の場合、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　２（ＡＦ２）を介してエストロゲン受容体、レチノイン酸受容体、ビタミンＤ受容体などの核内受容体に作用することによる、前記受容体の標的遺伝子の転写調節活性、または、Ｅ３蛋白-ユビキチンリガーゼを介したｐ５３のユビキチン化促進活性が挙げられる。ＴＩＦ１－γタンパク質の場合、上記遺伝子の転写調節活性、ｐ５３ユビキチン化促進活性に加えて、ＳＭＡＤ４のユビキチン化促進活性が挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。従って、上記活性は同等（例えば、約０．５～約２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
　活性の測定は、公知の方法を用いて行うことができる。
　また、本発明のＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）としては、例えば、（ｉ）配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１～３０個程度、好ましくは１～１０個程度、さらに好ましくは数（１～５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１～３０個程度、好ましくは１～１０個程度、さらに好ましくは数（１～５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１～３０個程度、好ましくは１～１０個程度、さらに好ましくは数（１～５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１～３０個程度、好ましくは１～１０個程度、さらに好ましくは数（１～５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
　上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、タンパク質の活性が保持される限り特に限定されないが、エピトープに該当するアミノ酸配列以外の箇所であることが好ましい。
　本発明のＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）は、好ましくは、配列番号：１又は配列番号：２（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
　ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）は、例えば、（ａ）ヒト（例えば、被験者）の細胞または組織から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養、あるいは（ｄ）ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）をコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
　（ａ）ヒト（例えば、被験者）の細胞または組織からＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）を調製する場合、その細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られたＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）をそのまま抗原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを抗原とすることもできる。
　（ｂ）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製したＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）と同一の構造を有するもの、具体的には、ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）のアミノ酸配列において少なくとも３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする合成ペプチドを製造することができる。
　ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（ｉ）～（ｖ）に記載された方法に従って行われる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座　１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
　このようにして得られた合成ペプチドは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
　上記方法で得られる合成ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に合成ペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
　（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（１）ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブを用い、ヒトｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするＤＮＡを単離するか、（２）ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ヒト由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該抗原をコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
　（ｄ）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（ｃ）と同様の方法により調製した抗原をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼおよび基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
　抗原としては完全なＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）分子やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば３個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、いっそう好ましくは６個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば２０個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、いっそう好ましくは１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：１ないし数個）は置換可能な基（例：Ｃｙｓ、水酸基等）によって置換されていてもよい。抗原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を１ないし数個含むアミノ酸配列を有する。
　本発明において、前記したタンパク質等を抗原として用いた免疫学的測定法としては、該タンパク質を用いた蛍光抗体間接法、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等の各種イムノアッセイを用いることができる。例えば、蛍光抗体間接法であれば、固相上（例：スライドガラス）に抗原として培養細胞（例：ＨＥｐ－２細胞）をアセトンで固定し、被験者由来の試料を接触させて、標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体によって検出することができる。該方法では、試料を順次希釈（例えば、４０倍希釈、８０倍希釈、１６０倍希釈など）して用い、陽性限界となる希釈倍率から被験者の抗体の有無を判断する。しかし、該方法は検査を行う者が目視により陽性限界となる希釈倍率を判断するため、検査官の主観によるところが大きい。また、被験者が抗体を有すると判断される希釈倍率の基準が概ね４０倍近辺に設定されている場合が多いにもかかわらず、健常者であっても該希釈倍率において抗体が陽性と判断される場合がしばしば起こる。さらに、染色パターンから抗体を同定できる場合が不可能な場合も多く、該方法は１次検査としての利用に留まるにすぎない。一方、ウェスタンブロット法を用いれば、抗原の持つ分子量、等電点に基づいてタンパク質を分離することができるため、バンドサイズの位置から容易に抗体の有無を判定することができる。さらに、ＥＬＩＳＡを用いる場合、抗原を予め特定して用いる点で蛍光抗体間接法と異なる。具体的には、試料と、固相上に固定化した抗原および標識化された抗免疫グロブリン抗体とを反応させた後、固相上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料中の本発明の抗体を定量する方法等が挙げられる。ＥＬＩＳＡは定量性にも優れるため、前記蛍光抗体間接法の欠点を補いうる。ウェスタンブロット法またはＥＬＩＳＡにおいては、試料は同時あるいは連続的に、分離されたまたは固相上に固定化した抗原と標識化された抗免疫グロブリン抗体に反応させてよい。本発明における免疫学的測定法としては、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡを用いることが好ましく、ＥＬＩＳＡを用いることがより好ましい。
　具体的には、本発明の検査方法は以下の工程を含んでよい。
（１）被験者および健常者から得られた試料をＴＩＦ１－αタンパク質に接触させる工程、
（２）抗ＴＩＦ１－α抗体量を測定する工程、
（３）被験者および健常者間で測定した抗体量を比較する工程
　さらに別の実施態様では、本発明の検査方法は以下の工程を含んでよい。
（１）被験者および健常者から得られた試料をＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質にそれぞれ接触させる工程、
（２）抗ＴＩＦ１－α抗体量および抗ＴＩＦ１－γ抗体量をそれぞれ測定する工程、
（３）被験者および健常者間で測定した抗体量を比較する工程
　本発明の検査方法の一実施態様において、試料を接触させるＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質は、予め支持体によって分離された後、ニトロセルロース膜のような転写膜に移した状態で使用され得る。支持体としてはポリアクリルアミドゲルが好ましく用いられるが、分離方法によっては濃度勾配があるポリアクリルアミドゲル、デンプンゲル、尿素含有デンプンゲル、アガローススラブゲルなども用いられて良い。分離方法としては、尿素ゲル電気泳動、ＳＤＳ電気泳動、勾配ゲル電気泳動、等電点電気泳動、２次元電気泳動などがあげられ、その他の公知の方法に従っても行うことができる。転写膜へのタンパク質の移行は、拡散的手法、電気的手法によって吸着させて行われる。ＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質は同一の支持体によって分離され転写膜に移行されてもよいし、別々の支持体によって分離され転写膜に移行されてもよい。
　本発明の検査方法の別の実施態様において、本発明のＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質は分離せずに直接に固相に固定化された状態で使用され得る。固相としては、例えば、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーチップなどが挙げられる。固定化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えば、ビオチン－（ストレプト）アビジン系等が用いることができる。ＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質は同一の固相に固定化されてもよいし、別々の固相に固定化されてもよい。
　抗体量の測定には、転写膜や固相上の抗原に特異的に結合した抗体に対する二次抗体を用いることができ、該二次抗体は標識されていることが好ましい。二次抗体としては、ヒト免疫グロブリンを認識するものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ等が挙げられる（Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５，ｐ．４４１－４５６，１９９６）。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［１２５Ｉ］、［１３１Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ］などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などの酵素が用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが用いられるが、被検化合物が自家蛍光を発する場合、異なる励起波長および蛍光波長を有するものを選択する必要がある。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体と標識剤との結合にビオチン－（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
　また、前記したとおり、二次抗体である抗免疫グロブリン抗体は、同時あるいは連続的に試料と転写膜上または固相上に固定化した試料に反応させてよい。例えば、（１）第一に試料と転写膜上または固相上に固定化された抗原を接触させた後、第二に抗免疫グロブリン抗体を接触させる場合、（２）第一に試料と抗免疫グロブリン抗体を接触させた後、第二に転写膜上または固相上に固定化された抗原を接触させる場合、または（３）試料、転写膜上または固相上に固定化された抗原および抗免疫グロブリン抗体を同時に接触させる場合などが挙げられる。
　個々の免疫学的測定法を本発明の検査方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて抗体量の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
　本発明の検査方法は、上記手法により、抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体を測定することによって、被験者が皮膚筋炎に罹患しているか否かの判定の材料とすることができる。後述の実施例に示すように、皮膚筋炎患者では、抗ＴＩＦ１－α抗体および抗ＴＩＦ１－γ抗体の両者が陽性である場合が多いことが確認されており、特に抗ＴＩＦ１－γ抗体が単独で陽性である患者よりも、両者が陽性である患者の割合の方が高く、抗ＴＩＦ１－α抗体および抗ＴＩＦ１－γ抗体の両者を検査することで、より診断の確度を引き上げることができる。従って、抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量と被験者の皮膚筋炎罹患率との間には正の相関関係があり、抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量が高いほど、皮膚筋炎である確率が高いと判定することができる。さらに、前記した皮膚筋炎の公知抗体の抗体量をさらに検査対象とすることで、より皮膚筋炎の診断の確度を向上させることもできる。
　例えば、皮膚筋炎に罹患していないことが確認されている個体（ネガティブコントロール）及び、皮膚筋炎に罹患していると臨床医的に判断されている個体（ポジティブコントロール）から試料を得て、本発明の検査方法の対象となる被験者から得られた試料における抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量がポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。あるいは、皮膚筋炎患者における抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量と臨床的に皮膚筋炎であると判断される率との相関図をあらかじめ作成しておき、本発明の検査方法の対象となる被験者から得られた試料における抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量をその相関図と比較してもよい。抗体量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
　または、抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量の比較結果より、被験者の抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量が健常者に比して相対的に高い場合には、皮膚筋炎である確率が相対的に高いと判定することができる。
　本発明の検査方法において診断されうる皮膚筋炎は、好ましくは小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎である。後述する実施例において、小児皮膚筋炎であると臨床的に診断された患者１１名中のうち、３６％（４／１１）がＴＩＦ１タンパク質ファミリーに対する抗体（１名が抗ＴＩＦ１－γ抗体のみ陽性、３名が抗ＴＩＦ１－α抗体および抗ＴＩＦ１－γ抗体が陽性）を有した。従って、抗ＴＩＦ１－α抗体および抗ＴＩＦ１－γ抗体の両者を検査することで、小児皮膚筋炎の診断を高い確度で行うことができる。さらに、前述の通り、抗Ｍｉ－２抗体、抗ＮＸＰ－２抗体を更に組み合わせて検査してもよい。
　さらに皮膚筋炎であると臨床的に診断された患者４５６名中において、少なくとも抗ＴＩＦ１－α抗体および抗ＴＩＦ１－γ抗体が陽性であった成人ＤＭ患者（即ち、抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者ならびに抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体、抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者）のうち、７３％もの患者が悪性腫瘍を併発したことを確認した。一方、少なくとも抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性であって、かつ抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体が陰性の成人ＤＭ患者（即ち、抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体のみが陽性の成人ＤＭ患者ならびに抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者）は５０％の割合で併発した。従って、抗ＴＩＦ１－α抗体および抗ＴＩＦ１－γ抗体の両者を検査することで、悪性腫瘍合併皮膚筋炎の診断を高い確度で行うことができる。これまでに悪性腫瘍合併皮膚筋炎と充分に相関するマーカーを見出せなかったことから、本発明の両抗体を検査する悪性腫瘍合併皮膚筋炎の診断のための検査方法は、極めて有用である。
　上記皮膚筋炎の診断のための検査方法を、皮膚筋炎に対する治療を施された患者や皮膚筋炎治療薬候補化合物を投与された被験者に適用することにより、治療効果の評価を行うことができる。即ち、治療中または治療を受けた皮膚筋炎患者から経時的に採取された試料における抗ＴＩＦ１－α抗体、好ましくは、さらに抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量をそれぞれ測定・比較し、治療前と比較して治療後の抗ＴＩＦ１－α抗体および／または抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量が減少する傾向を示せば、治療効果が認められると判定することができる。
　本発明はまた、上記本発明の検査方法において好ましく使用され得る、皮膚筋炎を診断するための検査キットを提供する。該診断するための検査キットは、ＴＩＦ１－αタンパク質、好ましくは、さらにＴＩＦ１－γタンパク質を含有してなる。該診断するための検査キットが２以上の上記ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）を含む場合、各タンパク質は互いに異なるエピトープを含む、ＴＩＦ１－αタンパク質（ＴＩＦ１－γタンパク質）の部分ペプチドであってよい。
　本発明の検査キットのＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質としては、本発明の検査方法において前記した抗原が挙げられる。
　該タンパク質は、適当な固相に固定化された状態で提供されることが好ましい。固相および固定化手段としては、本発明の検査方法で前記した固相、固定化手段が用いられる。
　本発明の剤を構成する試薬は、抗ＴＩＦ１－α抗体量および抗ＴＩＦ１－γ抗体量を検出し得るタンパク質に加えて、該抗体量を検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、抗ＴＩＦ１－α抗体量および抗ＴＩＦ１－γ抗体の抗体量を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、ｃｏｍｐｅｐｔｉｔｏｒ抗体、標識された二次抗体（例えば、ヒト免疫グロブリンと反応させるため、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等で標識されたマウス抗ヒトＩｇＧなど）、ブロッキング液等が挙げられる。
　本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
　ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
　ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
　　Ａ　　　　　　：アデニン
　　Ｔ　　　　　　：チミン
　　Ｇ　　　　　　：グアニン
　　Ｃ　　　　　　：シトシン
　ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
　ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
　ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
　ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
　ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
　ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
　ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
　ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
　ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
　Ｇｌｙ　　　　　：グリシン
　Ａｌａ　　　　　：アラニン
　Ｖａｌ　　　　　：バリン
　Ｌｅｕ　　　　　：ロイシン
　Ｉｌｅ　　　　　：イソロイシン
　Ｓｅｒ　　　　　：セリン
　Ｔｈｒ　　　　　：スレオニン
　Ｃｙｓ　　　　　：システイン
　Ｍｅｔ　　　　　：メチオニン
　Ｇｌｕ　　　　　：グルタミン酸
　Ａｓｐ　　　　　：アスパラギン酸
　Ｌｙｓ　　　　　：リジン
　Ａｒｇ　　　　　：アルギニン
　Ｈｉｓ　　　　　：ヒスチジン
　Ｐｈｅ　　　　　：フェニルアラニン
　Ｔｙｒ　　　　　：チロシン
　Ｔｒｐ　　　　　：トリプトファン
　Ｐｒｏ　　　　　：プロリン
　Ａｓｎ　　　　　：アスパラギン
　Ｇｌｎ　　　　　：グルタミン
　ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
　Ｓｅｃ　　　　　：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
　以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
患者
　本実施例では、２００３年から２０１０年までの間に金沢大学病院　皮膚科学部門および協力医療センターで追跡調査した４５６名の日本人皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ；ＤＭ）患者から血清試料を取得して用いた。４５６名のＤＭ患者のうち、３７３名はＢｏｈａｎ’ｓ　ａｎｄ　Ｐｅｔｅｒ’ｓ基準（Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．１９７５；２９２（７）：３４４－３４７，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．１９７５；２９２（８）：４０３－４０７）を満たした。一方で、残りの８３名は臨床上の筋症状が見られず、固有のＤＭ皮膚症状が見られたため、該基準を満たさず、Ｓｏｔｈｅｉｍｅｒ’ｓ基準（Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９９；１１：４７５－４８２）を満たし、ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ　ａｍｙｏｐａｔｈｉｃ　ＤＭ（ＣＡＤＭ）であると診断した。ＣＡＤＭには、ａｍｙｏｐａｔｈｉｃ　ＤＭ患者とｈｙｐｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ　ＤＭ患者が含まれた。ｈｙｐｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ　ＤＭ患者は、ＤＭを頻発し、電気生理学的、放射線学的、実験室的評価で筋炎の潜在的症状を有した。患者１１名は小児ＤＭにカテゴリーし、その他の４４５名は成人性ＤＭにカテゴリーした。また、対照疾患として、６２名の多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ；ＰＭ）患者、１０８名の全身性エリテマトーデス患者、４４３名の全身性強皮症患者を評価した。
　臨床上の情報は、臨床チャートを再検討することで、全患者から遡及して回収した。ＤＭ患者の内臓性悪性腫瘍、血液性悪性腫瘍は、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）．１９９１；７０（６）：３６０－３７４に記載の基準に従い、評価した。ここで悪性腫瘍であるとは、ＤＭの診断から３年以内に悪性腫瘍と診断された場合をいう。プロトコルは金沢大学医学部および金沢大学病院に承認を受けた。
試薬
　本実施例に用いる抗体としては、ウサギ抗ヒトＴＩＦ１－α（ＴＲＩＭ２４）、ヒツジ抗ヒトＴＩＦ１－β（ＫＡＰ１，ＴＲＩＭ２８）およびウサギ抗ヒトＴＩＦ１－γ（ＴＲＩＭ３３）ポリクローナル抗体をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）より購入して使用した。また、本実施例で用いた組み換えタンパク質としては、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付きヒト全長ＴＩＦ１－αタンパク質（Ａｂｎｏｖａ，Ｔａｉｐｅｉ　Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）、ＧＳＴタグ付きヒト全長ＴＩＦ１－Βタンパク質（Ａｂｎｏｖａ）およびヒト全長ＴＩＦ１－γタンパク質（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）が挙げられる。
免疫沈降
　本実施例における免疫沈降（ＩＰ）は、白血病細胞株Ｋ５６２の抽出物を用いて行った。５００μｌのＩＰバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ－４０）中の２ｍｇプロテイン－Ａセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に全量１０μｌの患者血清を結合させ、４℃で２時間インキュベートし、その後ビーズをＩＰバッファーで５回洗浄した。抗体で被覆されたセファロースビーズを１０６個の細胞から由来する、３５Ｓメチオニン標識したＫ５６２細胞抽出物または未標識Ｋ５６２細胞抽出物と混合し、４℃で２時間回転させた。５回洗浄後、該ビーズをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーに再懸濁し、試料をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分画した。
ウェスタンブロット
　本実施例において免疫沈降されたＫ５６２細胞抽出物由来のタンパク質または１μｇの組み換えＴＩＦ１－α、ＴＩＦ１－βおよびＴＩＦ１－γタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供試し、ニトロセルロースメンブレン上に電気的に転写した。ブロッキング後、メンブレンを血清試料またはポリクローナル抗体でインキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＲｏｃｋＦｏｒｄ，ＩＬ）、抗ヒツジＩｇＧ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）または抗ヒトＩｇＧ（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）抗体でインキュベートした。メンブレンは強化化学発光キット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて処理した。
統計処理
　本実施例では、フィッシャーの正確確率検定を頻度比較のために用いた。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
実施例１　抗１５５／１４０抗体によって認識される分子量１５５ｋＤａ抗原
　発明者らは、抗１５５／１４０抗体のうち、抗１５５抗体によって認識される分子量１５５ｋＤａの抗原が、別の研究グループ（Ｔａｒｇｏｆｆ　ＩＮ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ，５４（１１）：３６８２－３６８９，２００６）から報告されている通り、ＴＩＦ１－γタンパク質であるか否かについて確認を行った。その結果、ＴＩＦ１－γ反応性のポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った場合に確認できるバンドサイズが、抗１５５／１４０抗体陽性のＤＭ患者の血清（本実施例では抗１５５／１４０血清と表記する）を用いて免疫沈降されたバンドサイズと分子量１５５ｋＤａで一致した（図１Ａ）。さらに、ウェスタンブロットから抗１５５／１４０血清は組み換えＴＩＦ１－γタンパク質と強く反応することが確認できた（図１Ｂ）。従って、抗１５５／１４０抗体のうち、抗１５５抗体は、分子量１５５ｋＤａの抗原としてＴＩＦ１－γタンパク質を認識することが確認できた。
実施例２　抗１５５／１４０抗体によって認識される分子量１４０ｋＤａ抗原
　発明者らは、抗１５５／１４０抗体のうち、抗１４０抗体によって認識される分子量１４０ｋＤａ抗原の同定を試みた。７％ポリアクリルアミドゲル上においては、抗１５５／１４０血清を用いて免疫沈降された分子量１４０ｋＤａのタンパク質は、ＣＡＤＭで陽性となる抗ＣＡＤＭ１４０抗体の抗原であるＭＤＡ５タンパク質や抗ＭＪ抗体の抗原であるＮＸＰ－２（ＭＯＲＣ３）タンパク質とは、サイズが異なることが確認できた（図２Ａ）。一方、ＴＩＦ１タンパク質ファミリーの別のタンパク質である、ＴＩＦ１－αタンパク質のポリクローナル抗体によって免疫沈降されたタンパク質のバンドサイズは、抗１５５／１４０血清を用いて免疫沈降されたバンドサイズと分子量１４０ｋＤａで一致した（図１Ａおよび図２Ａ）。発明者らはさらに、抗１５５／１４０血清とプレインキュベートしたプロテイン－ＡセファロースビーズでＫ５６２細胞抽出物をインキュベートして免疫沈降を行い、免疫沈降されたタンパク質をＴＩＦ１－αタンパク質ポリクローナル抗体でウェスタンブロットを行った。健常者由来の血清を用いたコントロールではバンドが確認できなかったが、抗１５５／１４０血清を用いた場合は、分子量１４０ｋＤａのサイズのバンドが確認できた（図２Ｂ）。さらに、発明者らは、ＧＳＴタグ付き組み換えＴＩＦ１－αタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、抗１５５／１４０血清でウェスタンブロットを行った。その結果、抗１５５／１４０血清はＴＩＦ１－αタンパク質に反応した（図２Ｃ）。一方、ＧＳＴタグのみについては、反応しなかった（データ未掲載）。従って、抗１５５／１４０抗体のうち、抗１４０抗体によって認識される分子量１４０ｋＤａの抗原は、ＴＩＦ１－αタンパク質であることが判明した。
実施例３　ＴＩＦ１－βタンパク質に対する抗１５５／１４０血清の反応性
　発明者らは、ＴＩＦ１タンパク質ファミリーに属するＴＩＦ１－βタンパク質についても、抗１５５／１４０血清によって認識されるか否かを検証した。ＴＩＦ１－βタンパク質ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行い、結合したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した場合、ＴＩＦ１－βタンパク質は分子量約１００ｋＤａの位置に確認できた（図３Ａ）。この結果から、発明者らは、約１００ｋＤａの分子量を持つタンパク質を免疫沈降できる抗１５５／１４０血清をスクリーニングした。７７サンプルの抗１５５／１４０血清のうち、６サンプルがＴＩＦ１－βタンパク質ポリクローナル抗体によって免疫沈降されるＴＩＦ１－βタンパク質と同じ分子量１００ｋＤａのタンパク質を免疫沈降した（図３Ａ）。発明者らは、この免疫沈降されたタンパク質がＴＩＦ１－βタンパク質であるか否かを検証するため、Ｋ５６２細胞抽出物を上述の分子量１００ｋＤａのタンパク質を免疫沈降できる血清とプレインキュベートさせたプロテイン－Ａセファロースビーズとインキュベートし、ＴＩＦ１－βタンパク質ポリクローナル抗体によるウェスタンブロットを行った。健常者由来の血清を用いたサンプルにはバンドが確認できなかったが、分子量１００ｋＤａのタンパク質を免疫沈降できる血清を用いたサンプルからは、ＴＩＦ１－βタンパク質ポリクローナル抗体によって分子量１００ｋＤａのバンドを確認できた（図３Ｂ）。また、上述の分子量１００ｋＤａのタンパク質を免疫沈降できる血清は、ＧＳＴタグ付き組み換えＴＩＦ１－βタンパク質に反応性を示したが、ＧＳＴタグのみについては反応しなかった（図３Ｃ）。従って、抗１５５／１４０抗体を有するＤＭ患者の一部は、ＴＩＦ１－βタンパク質に対する自己抗体をも有することが判明した。
　発明者らはまた、抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体が、抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体や抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体と独立して存在しうるか否かを確認するため、４５６名のＤＭ患者、６２名のＰＭ患者、１０８名の全身性エリテマトーデス患者、４４３名の全身性強皮症患者を再スクリーニングした。３６歳のＣＡＤＭ女性患者由来の血清では、分子量１００ｋＤａタンパク質には反応性を示すが、１５５／１４０タンパク質には示さなかった。一方、その他の疾患患者の血清は、分子量１００ｋＤａタンパク質には反応性を示さなかった。
　スクリーニングの結果、４血清はＴＩＦ１－αタンパク質、ＴＩＦ１－βタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質、４８血清はＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質、２血清はＴＩＦ１－βタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質、２３血清はＴＩＦ１－γタンパク質のみ、１血清はＴＩＦ１－βタンパク質のみとそれぞれ反応性を示した。ＴＩＦ１－αタンパク質のみと反応性を示す血清、またはＴＩＦ１－γタンパク質と反応せずにＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－βタンパク質と反応性を示す血清は確認できなかった。従って、ＴＩＦ１－γタンパク質が最も標的となるタンパク質であり、次いでＴＩＦ１－αタンパク質、最も標的とならないタンパク質がＴＩＦ１－βタンパク質であることが判明し、抗１５５／１４０血清は、種々の反応性パターンでＴＩＦ１タンパク質ファミリーであるＴＩＦ１－αタンパク質、ＴＩＦ１－βタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質を標的とすることが示唆された。
実施例４　ＤＭ患者由来の血清のＴＩＦ１タンパク質ファミリーに対する反応パターンと疾患との関連性
　発明者らは、実施例３で調べられたＴＩＦ１タンパク質ファミリーと反応性を示す、７８名の患者の疾患との関連性について調査を行った。全患者のうち、７４名が１５歳以上であり、４名が１５歳未満であった（図４）。従って、成人ＤＭ患者の１６％（７４／４４５）、小児ＤＭ患者の３６％（４／１１；１名が抗ＴＩＦ１－γ抗体のみ陽性、３名が抗ＴＩＦ１－α抗体および抗ＴＩＦ１－γ抗体が陽性）がＴＩＦ１タンパク質ファミリーに対して反応性を示した。これは抗１５５／１４０抗体は、小児ＤＭおよび成人悪性腫瘍合併ＤＭの両方において主要な血清学的サブセットであるとの米国や欧州における報告と一致する。成人ＤＭ患者では、２５－３９歳の若年成人において発症の小さなピークが見られるものの、大部分は４５歳以上で発症する。抗ＴＩＦ１タンパク質ファミリー抗体陽性の成人ＤＭ患者では６５％の割合（４８／７４）で悪性腫瘍を合併していたが、若年成人患者においては合併は見られなかった。従って、抗１５５／１４０抗体は、悪性腫瘍を合併しない若年成人ＤＭのサブセットを形成することが示唆された。対照的に、４０歳以上の６４名の患者のうち、４８名（７２％）の患者が悪性腫瘍を合併していた。特に、６０歳以上の患者は、８６％（３０／３５）もの頻度で悪性腫瘍を合併していた。４８名の患者の腫瘍部位は表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＤＭ患者には典型的なＤＭの症状（即ち、筋肉に関与する症状）を持つものとＣＡＤＭの症状をもつものが存在するが、抗ＴＩＦ１タンパク質ファミリー抗体を有する７８名の患者のうち、５３名（６８％）は典型的なＤＭであり、２５名はＣＡＤＭであった。全ての小児ＤＭ患者は典型的なＤＭに分類できた。対照的に、抗ＴＩＦ１タンパク質ファミリー抗体陽性の若年成人ＤＭ患者８名のうち、６名は全経過を通して筋肉に関わる症状がみられず、ＣＡＤＭに分類した。別の若年成人ＤＭ患者は、最初にＣＡＤＭであると診断されていたが、６ヵ月後に軽度のＤＭに進行した。悪性腫瘍に関して、成人の典型的なＤＭ患者およびＣＡＤＭ患者のうち悪性腫瘍を合併した患者の割合は、それぞれ６９％（３４／４９）および５６％（１４／２５）であった。従って、典型的なＤＭ患者の方が悪性腫瘍の合併頻度が僅かに高かったが、有意な差ではなかった。間質性肺炎は僅か３名（３．８％）の患者において見られた。
　抗体の反応性と疾患との関連性を検討した結果、少なくとも抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者（即ち、抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者ならびに抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体、抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者）は、７３％（３６／４９）の割合で悪性腫瘍を合併した一方、少なくとも抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性であって、かつ抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体が陰性の成人ＤＭ患者（即ち、抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体のみが陽性の成人ＤＭ患者ならびに抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者）は５０％（１２／２４）の割合で悪性腫瘍を合併した。従って、悪性腫瘍合併の頻度は、少なくとも抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性であって、かつ抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体が陰性の成人ＤＭ患者よりも、少なくとも抗ＴＩＦ１－αタンパク質抗体および抗ＴＩＦ１－γタンパク質抗体が陽性の成人ＤＭ患者の方が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質に対する反応性と癌種や癌の部位の間に関連性は認められなかった。また、抗ＴＩＦ１－βタンパク質抗体陽性の７名の患者のうち、２名が悪性腫瘍を合併していると診断され、その両者とも卵巣癌であった。
　本発明の検査方法および検査キットは、被験者が皮膚筋炎、特に小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎に罹患しているか否かの診断を迅速かつ簡便ならしめることができる。また本発明によれば、前記疾患に罹患しており、治療中の患者の治療評価を容易に行うことができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１１－１５５１４５（出願日：平成２３年７月１３日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (20)

  1. 　被験者から得られた試料中の抗ＴＩＦ１－α抗体を指標とすることを特徴とする、皮膚筋炎の診断のための検査方法。
  2. 　ＴＩＦ１－αタンパク質を用いることを特徴とする、請求項１に記載の検査方法。
  3. 　さらに、前記試料中の抗ＴＩＦ１－γ抗体を指標とすることを特徴とする、請求項１または２に記載の検査方法。
  4. 　ＴＩＦ１－γタンパク質を用いることを特徴とする、請求項３に記載の検査方法。
  5. 　皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の検査方法。
  6. 　以下の工程を含むことを特徴とする、皮膚筋炎の診断のための検査方法
    （１）被験者および健常者から得られた試料をＴＩＦ１－αタンパク質に接触させる工程、
    （２）抗ＴＩＦ１－α抗体量を測定する工程、
    （３）被験者および健常者間で測定した抗体量を比較する工程。
  7. 　ＴＩＦ１－αタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、請求項６に記載の検査方法。
  8. 　以下の工程を含むことを特徴とする、皮膚筋炎の診断のための検査方法
    （１）被験者および健常者から得られた試料をＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質にそれぞれ接触させる工程、
    （２）抗ＴＩＦ１－α抗体量および抗ＴＩＦ１－γ抗体量をそれぞれ測定する工程、
    （３）被験者および健常者間で測定した抗体量を比較する工程。
  9. 　ＴＩＦ１－αタンパク質およびＴＩＦ１－γタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、請求項８に記載の検査方法。
  10. 　皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、請求項６から９のいずれか１項に記載の検査方法。
  11. 　ＴＩＦ１－αタンパク質を含む、皮膚筋炎の診断のための検査キット。
  12. 　ＴＩＦ１－αタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、請求項１１に記載の検査キット。
  13. 　さらに、ＴＩＦ１－γタンパク質を含む、請求項１１または１２に記載の検査キット。
  14. 　ＴＩＦ１－γタンパク質が固相上に固定化されていることを特徴とする、請求項１３に記載の検査キット。
  15. 　皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の検査キット。
  16. 　被験者から得られた試料中の抗ＴＩＦ１－α抗体を指標とすることを特徴とする、皮膚筋炎の治療効果の評価方法。
  17. 　ＴＩＦ１－αタンパク質を用いることを特徴とする、請求項１６に記載の評価方法。
  18. 　さらに、前記試料中の抗ＴＩＦ１－γ抗体を指標とすることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の評価方法。
  19. 　ＴＩＦ１－γタンパク質を用いることを特徴とする、請求項１８に記載の評価方法。
  20. 　皮膚筋炎が小児皮膚筋炎または悪性腫瘍合併皮膚筋炎であることを特徴とする、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の評価方法。
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Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUJIMOTO MANABU ET AL.: "Myositis-specific anti- 155/140 autoantibodies target transcription intermediary factor 1 family proteins", ARTHRITIS AND RHEUMATISM, vol. 64, no. 2, February 2012 (2012-02-01), pages 513 - 522 *
IRA N. TARGOFF ET AL.: "A novel autoantibody to a 155-kd protein is associated with ermatomyositis", ARTHRITIS & RHEUMATISM, vol. 54, no. 11, 2006, pages 3682 - 3689 *
KAJI K ET AL.: "Identification of a novel autoantibody reactive with 155 and 140 kDa nuclear proteins in patients with dermatomyositis: an association with malignancy", RHEUMATOLOGY, vol. 46, no. 1, 2007, pages 25 - 28 *
SCHUPPAN D ET AL.: "Identification of the Autoantigen of Celiac Disease", ANN N Y ACAD SCI, vol. 859, 1998, pages 121 - 126 *
TARGOFF, IRA N ET AL.: "autoantibodies to transcriptional intermediary factor 1-gamma (tifl-g) in dermatomyositis", ARTHRITIS AND RHEUMATISM, vol. 54, no. 9, SUP, 2006, pages S518 *
WANG Y ET AL.: "Large Scale Identification of Human Hepatocellular Carcinoma-Associated Antigens by Autoantibodies", J IMMUNOL, vol. 169, no. 2, 2002, pages 1102 - 1109 *
YOSHINAO MURO: "Enshosei Kin Shikkan ni Kansuru Saikin no Chiken Hifukin'en no Seimei Yogo ni Kanren suru Jiko Kotai", GEKKAN RHEUMATISM-KA, vol. 45, no. 2, 28 February 2011 (2011-02-28), pages 153 - 157 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019111797A1 (ja) * 2017-12-05 2019-06-13 国立大学法人京都大学 筋疾患の診断のためのバイオマーカー

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