JP2012224594A - 環状シトルリン化グルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチドおよび関節リウマチ症診断方法 - Google Patents

Abstract

【課題】関節リウマチ症（ＲＡ）の診断のための新規技術の提供。
【解決手段】グルコース−６−リン酸イソメラーゼの部分ペプチドを環状シトルリン化したペプチドを作製し、ＲＡ患者血清においてこのペプチドに対する自己抗体をスクリーニングした結果、自己抗体が顕著に検出された。生体から採取した血清等の試料中の環状シトルリン化ＧＰＩペプチドに対する抗体を検出することにより、関節リウマチ症の診断を行うことが可能となった。
【選択図】なし

Description

本発明は、関節リウマチ症特異的抗原ペプチドおよび該抗原ペプチドを利用した関節リウマチ症の診断方法等に関する。より詳しくは、グルコース−６−リン酸イソメラーゼの部分ペプチドを環状シトルリン化して得た関節リウマチ症特異的抗原ペプチド等に関する。

関節リウマチ症（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）は、関節内腔を覆う滑膜の炎症と増殖による関節痛や関節腫脹を主な特徴とする自己免疫疾患である。日本における罹患率は、５０歳以上の中年期において約１％とされている。ＲＡの発症機序は、未だ十分に解明されていない。

ＲＡの診断は、米国リウマチ学会や日本リウマチ学会の診断基準に基づいて行われる。具体的には、関節の炎症などの臨床所見や、手の関節のＸ線所見、血液検査によるリウマトイド因子やＣ反応性タンパク質の陽性等の指標から判断される。

ＲＡに対する血液中のバイオマーカーとしては、前述のリウマトイド因子やＣ反応性タンパク質の他に、自己抗体が利用されている。その中でも、近年、環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）やシトルリン化α−エノラーゼペプチド−１（ＣＥＰ−１）等のシトルリン化ペプチドに対する自己抗体が報告されている（非特許文献１参照）。シトルリン化は、アミノ酸のアルギニンがシトルリンに置換される反応である。ＲＡ患者において、シトルリン化の基質となるタンパク質は、フィブリノゲン、ビメンチン、コラーゲン、α−エノラーゼなど複数存在する（非特許文献２−５参照）。特許文献１および特許文献２では、複数あるいは単一のタンパク質に由来するシトルリン化ペプチドに対する自己抗体を利用したＲＡの診断方法が開示されている。

グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＧＰＩ）は、５５８アミノ酸からなる、分子量６３ｋＤａの、解糖系の酵素である。自己抗体誘導性の関節炎の動物モデルとして知られるＫ／ＢｘＮマウスでは、ＧＰＩの一部のペプチドが自己抗原として同定されている（非特許文献６参照）。また、特許文献３では、関節炎誘発原性ペプチドとして、ＧＰＩの一部のアミノ酸配列が開示されている。

特許第４５５７４２１号明細書 特許第４４１１４１６号明細書 特開２００９−１７９６２１号公報

van Venrooij WJ et. al., Clin Rev Allergy Immunol (2008) 34:36-39 Wegner N et. al., Immunol Rev (2010) 233:34-54 Vander Cruyssen B et. al., Arthritis Res Ther(2006) 8:R122 Snir O et. al., Ann Rheum Dis (2009) 68:736-743 Lundberg K et. al., Arthritis Rheum (2008) 58:3009-3019 Matsumoto I et. al., Science (1999) 286:1732-1735

本発明は、ＲＡの診断のための新規技術を提供することを主な目的とする。

本発明者は、ＧＰＩの部分ペプチドを環状シトルリン化したペプチドを作製し、ＲＡ患者血清おける自己抗体をスクリーニングした。その結果、ＲＡ患者において環状シトルリン化ＧＰＩペプチドに対する自己抗体が顕著に検出されることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、まず、環状シトルリン化ＧＰＩペプチドを提供する。
この環状シトルリン化ＧＰＩペプチドは、ＲＡ患者に特異的に見出された環状シトルリン化ＧＰＩペプチドに対する自己抗体を検出するための抗原として利用できる。
この環状シトルリン化ＧＰＩペプチドは、配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列を有するＧＰＩペプチドを環状シトルリン化して得たものとでき、より具体的には配列番号１７〜１９で示されるアミノ酸配列において配列に含まれるアルギニンのうち少なくとも１つ以上がシトルリンに置換されたアミノ酸配列を有するものとされることが好ましい。このうち、特に配列番号１８で示されるアミノ酸配列において配列に含まれアルギニンが全てシトルリンに置換されたアミノ酸配列を有するものとされることが特に好ましい。

また、本発明は、環状シトルリン化ＧＰＩペプチドを含む関節リウマチ症診断試薬を提供する。

さらに、本発明は、生体から採取した試料中の環状シトルリン化ＧＰＩペプチドに対する抗体を検出する手順を含む、関節リウマチ症診断方法も提供する。
この関節リウマチ症診断方法では、前記手順において、経時的に生体から採取した試料や関節リウマチ症に対する治療前後に生体から採取した試料を用いることにより、関節リウマチ症の活動性や治療効果を評価することが可能である。

本発明において、生体から採取される試料には、血清、血漿、滑液などが含まれる。

本発明により、ＲＡの診断のための新規技術が提供される。

（Ａ）−（Ｅ）は、各種、抗シトルリン化ペプチド抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図面代用グラフである。＊および＊＊は、マンホイットニーのＵ検定によるＰ値を、＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＝Ｐ＜０．００１として示す。（Ｆ）、（Ｇ）は、抗原（ＣＣＧ−２、ＣＥＰ−１）で予め処理したＲＡ患者血清のＥＬＩＳＡの結果を示す図面代用グラフである。 （Ａ）、（Ｂ）は、抗ＧＰＩタンパク質抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図面代用グラフである。（Ｃ）は、抗ＣＣＧ抗体が陽性であるＲＡ患者血清について、抗ＧＰＩタンパク質抗体の検出の有無を示した図面代用グラフである。（Ｄ）は、抗ＣＣＧ−２抗体および抗ＣＣＧ−３抗体に陽性であるＲＡ患者の血清における抗ｒｈＧＰＩ抗体および抗ｒａｂＧＰＩ抗体の濃度を示す図面代用グラフである。 抗ＣＥＰ−１抗体および抗ＣＣＰ抗体の濃度と、抗ＣＣＧ−１、２、３および抗ｒｈＧＰＩ抗体、抗ｒａｂＧＰＩ抗体の濃度との相関解析の結果を示す図面代用グラフである。 ＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープのアリル数と抗シトルリン化抗体の検出について解析した結果を示す図面代用グラフである。ＳＥ０は、アリルを持たない検体、ＳＥ１または２は、それぞれアリルを１個（ヘテロ）、または２個（ホモ）持つ検体を示す。（Ａ）は、各自己抗体について、抗体の濃度（ＯＤ値）の分布を示す。（Ｂ）は、各自己抗体の陽性の頻度を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープのアリルの有無で比較した結果を示す。＊および＊＊は、フィッシャー直接検定およびカイ二乗検定によるＰ値を、＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＝Ｐ＜０．００１として示す。（Ｃ）は、各自己抗体陽性の検体におけるアリル数の内訳を示す。 ＲＡ患者において、ＴＮＦαのアンタゴニストによる治療の前後における、各自己抗体の濃度（ＯＤ）の変化を示す、図面代用グラフである。＊＊は、対応のあるｔ検定によるＰ値を、＊＊＝Ｐ＜０．００１として示す。

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。

１．試料中の抗環状シトルリン化ＧＰＩペプチド抗体の検出方法
２．環状シトルリン化ＧＰＩペプチド
３．環状シトルリン化ＧＰＩペプチドの作成方法
４．抗環状シトルリン化ＧＰＩペプチド抗体を利用したＲＡ活動性の診断評価
５．抗環状シトルリン化ＧＰＩペプチド抗体を利用したＲＡ治療効果の診断評価
６．ＨＬＡ−ＤＲＢ１共有エピトープのアリル数

本発明者らは、ＧＰＩの部分ペプチドを環状シトルリン化したペプチドを作製し、ＲＡ患者および健常者（ＨＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者、シェーグレン症候群（ＳＳ）患者の血清中の自己抗体をスクリーニングした。その結果、ＲＡ患者において環状シトルリン化ＧＰＩペプチド（以下、「ＣＣＧ」と称する）に対する自己抗体が顕著に検出されることを見出した。抗ＣＣＧ抗体のＲＡ患者に対する特異性は、公知の環状シトルリン化ペプチドに対する抗体である抗ＣＥＰ−１抗体や抗ＣＣＰ抗体に比べて同等以上であった。また、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープのアリルを持つ検体で、抗ＣＣＧ抗体の陽性率が高い傾向にあった。さらに、抗ＣＣＧ抗体の濃度は、ＲＡの活動性の変化を反映して変化した。以上の知見から、血清等の試料中の抗ＣＣＧ抗体を検出することにより、ＲＡを高感度かつ高精度に診断できることが明らかとなった。

１．試料中の抗環状シトルリン化ＧＰＩペプチド抗体の検出方法
抗ＣＣＧ抗体は、ＣＣＧを用いた免疫学的方法によって検出できる。具体的には、酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））やウエスタンブロット法、ドットブロット法などが使用可能である。抗体の検出は、アルカリフォスファターゼを利用した呈色反応による検出や西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素、フレオロレセインやローダミン等の蛍光団、ヨウ素、硫黄等の放射性同位体による検出によって行うことができる。なお、ＣＣＧは、抗ＣＣＧ抗体検出のための抗原として、ＥＬＩＳＡ等のための試薬とともにＲＡの診断試薬を構成する。

２．環状シトルリン化ＧＰＩペプチド
ＣＣＧを構成するアミノ酸配列は、ヒトＧＰＩタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３３）において少なくとも１以上のアルギニンを含む部分配列であればよい。ＣＣＧのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数も特に限定されない。アミノ酸残基数は多いほど、ＣＣＧの抗原性を高めることができるが、一方で合成のための手間やコストが増大する。このため、ＣＣＧのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数は、１０〜３０程度が好ましく、２０前後が特に好ましい。「表１」には、アミノ酸残基数を１９とした場合のＣＣＧを構成し得るアミノ酸配列を例示する。

表中、「N末端からのアミノ酸数」は、各ＣＣＧのアミノ酸配列が対応するヒトＧＰＩタンパク質のアミノ酸配列中の領域を、タンパク質のＮ末端からのアミノ酸数により示す。

表１に示すＣＣＧのうち、特にＣＣＧ−１およびＣＣＧ−２は、これらに対する抗体がＲＡ患者において高い特異性をもって検出されたことから特に有用である。また、ＣＣＧ−２およびＣＣＧ−３は、これらに対する抗体がＲＡ患者において高い頻度で検出されるため有用である。

３．環状シトルリン化ＧＰＩペプチドの作成方法
環状シトルリン化ペプチドの作成は、化学合成法や遺伝子組換え等の定法によって作製することができる。化学合成法は、固相合成法および液相合成法のいずれによっても良い。作製後、ペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端に付加したシステインを用いて、ジスルフィド結合によって環状化ペプチドとする。

遺伝子組換え技術を用いた抗原ペプチドの作成は、抗原ペプチドに対応する部分のＤＮＡ配列の両端にシステインに対応するコドンの配列を加えたオリゴを挿入したベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトすることにより行う。宿主細胞は、原核細胞であれば大腸菌や枯草菌、真核細胞であれば、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。ベクターは、宿主細胞に応じた各種のものが利用できる。

産生されたペプチドは、その物理的性質や化学的性質を利用した公知の分離操作法によって分離・精製することが可能である。例えば、透析や限外膜ろ過や、分子サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等の各種クロマトグラフィーを単独あるいは組み合わせることで、高収率で精製度の高いペプチドを得ることができる。また、ペプチドの精製を容易にするために、標識をＮ末端かＣ末端に結合させても良い。代表的な標識ペプチドには、本実施例に示したＧＳＴの他、ヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃペプチド、ＧＦＰポリペプチドなどが挙げられる。

精製されたペプチドは、アルギニンをシトルリンに置換する酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いて、シトルリン化を行う。この場合においても、最終的に、ペプチドの両末端にあるシステインを結合して、環状化ペプチドとする。

４．抗環状シトルリン化ＧＰＩペプチド抗体を利用したＲＡ活動性の診断評価
抗ＣＣＧ抗体はＲＡ患者において特異的に検出されたことから、抗ＣＣＧ抗体の検出によればＲＡの診断を行うことが可能となる。さらに、血清等の試料中の抗ＣＣＧ抗体の濃度とＲＡの活動性に相関が認められたことから、経時的に血清等の試料を採取し、ＥＬＩＳＡなどの定量的検出方法を使用することで、ＲＡの活動性の評価を行うことが可能である。

５．抗環状シトルリン化ＧＰＩペプチド抗体を利用したＲＡ治療効果の診断評価
また、血清等の試料中の抗ＣＣＧ抗体の濃度は、ＲＡに対する治療前に対し治療後で有意に低下し、治療前後のＲＡの活動性に相関したことから、治療前後で血清等の試料を採取し、ＥＬＩＳＡなどの定量的検出方法を使用することで、ＲＡに対する治療の効果を評価することも可能である。

ここで、ＲＡの治療としては、ステロイド性、非ステロイド性の治療の他、ＴＮＦαの阻害剤や他の免疫抑制薬を用いた治療などがある。ＲＡの活動性の評価は、「ＤＡＳ−２８ＣＲＰ」等の公知の指標や臨床所見と組み合わせることで、より精度を高められる。

６．ＨＬＡ−ＤＲＢ１共有エピトープのアリル数
実施例において後述するように、抗ＣＣＧ抗体の濃度と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１共有エピトープのアリル数との間に関連が認められたことから、抗ＣＣＧ抗体の検出とアリル数の検出とを組み合わせることで、より高い精度でＲＡの診断を行うことが可能である。

ゲノムＤＮＡは、末梢血の白血球からフェノール−クロロホルムを用いた抽出やカラムを用いた精製により得ることができる。ＨＬＡ−ＤＲＢ１のジェノタイピングは、例えば配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲ法により行うことができ、この他にシークエンサーによる方法を用いても良い。

＜１．対象および試料＞
関節リウマチ症（ＲＡ）患者から血清、血漿、全血のそれぞれの試料を採取した。診断は、米国リウマチ学会の診断基準に従ってリウマチ専門医が行った。２０８人の日本人ＲＡ患者から試料を得た。ＲＡ患者の平均年齢は５４歳（年齢範囲、１６−８４歳）で、７６％が女性であった。対照群として、健常者（ＨＳ）１７４人からも血清を得た。ＨＳの平均年齢は、２７歳（年齢範囲、１８−５５歳）で、４８％が女性であった。また、自己免疫疾患の対照群（疾患コントロール）として、１０１人の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者および１０１人のシェーグレン症候群（ＳＳ）患者からも試料を得た。ＳＬＥ患者は全て、１９９７年のアメリカリウマチ学会の分類基準を満たしていた。また、ＳＳ患者は全て、厚生労働省のＳＳに対する診断基準を満たしていた。ＳＳの診断基準は、４種類の臨床病理学的所見を包含し、１．抗ＳＳ−Ａ抗体または抗ＳＳ−Ｂ抗体の存在、２．乾性角結膜炎、３．唾液分泌の機能不全、４．唾液腺または涙腺におけるリンパ球浸潤、の４項目のうち２以上の項目に当てはまる臨床所見に基づいて診断された。本実施例で対象とした患者では、ＲＡとＳＬＥまたはＳＳの両方を併発する例は含まれていない。全ての研究用試料は、患者および健常者の同意を得た上で、採取された。

＜２．ＧＰＩタンパク質の作成＞
リコンビナントヒトＧＰＩ（ｒｈＧＰＩ）は，ヒトＧＰＩ遺伝子のｃＤＮＡをｐＧＥＸ−４Ｔ３プラスミド（ファルマシア）にクローニングし、大腸菌を用いて、glutathione S-transferase（ＧＳＴ）融合タンパクとして発現させた。発現させたＧＳＴ融合ｒｈＧＰＩは、gultathione-sepharoseカラム（ファルマシア）を用いて精製した。ｒｈＧＰＩのタンパク質量と精製度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって調べた。また、ウサギ由来の天然のＧＰＩ（ｒａｂＧＰＩ）は、ウサギの筋肉から精製された市販品（シグマ）を用意した。

＜３．ＧＰＩペプチドの環状シトルリン化＞
非特許文献５記載の方法に基づき、環状シトルリン化ＧＰＩペプチドを作製した。具体的には、配列表１〜３に示す、ヒトＧＰＩ由来の３種類の１９アミノ酸からなるペプチド（ヒトＧＰＩ：１２−３０、７０−８８、９１−１０９）を合成した。これらのペプチドは、シトルリン化残基によってアルギニンを置換し、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれシステインを加え環状化を行って、環状シトルリン化ＧＰＩペプチド−１、２、３（ＣＣＧ−１、２、３）とした。また、ＣＥＰ−１ペプチドについても合成を行った。

＜４．シトルリル化ペプチドに対する自己抗体の測定＞
ＲＡ患者およびＨＳ、疾患コントロールにおける血清中のシトルリン化タンパク質およびペプチドに対する自己抗体を、酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））を用いて行った。

前述の合成したペプチドＣＣＧ−１、２、３とＣＥＰ−１は１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６穴プレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）にコートし、４℃で一晩置いた。ＰＢＳで３回洗浄の後、非特異的結合を阻害するために、５％ウシ血清アルブミン溶液をプレートに加え、１時間室温に置き、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）によって３回洗浄した。ＲＡ患者（２０８人）およびＨＳ（１７４人）、疾患コントロールの血清を、１００倍希釈してプレートに加え、１時間室温に置いた。洗浄後、アルカリフォスファターゼを結合した、Ｆｃフラグメントに特異的なヒト免疫グロブリンＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）をプレートに、２０００倍希釈の濃度で加え、室温に１時間置いた。洗浄後、ＡＰ反応溶液（９．６％ ジエタノールアミン、０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）とＡＰの基質を含むタブレット（シグマ）を用いて発色させた。プレートは３０分間室温に置き、吸光度（ＯＤ）は、プレート用分光光度計で波長４０５ｎｍにおいて測定した。測定結果は、合成ペプチドをコートしていないウエル（５０ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．６）のＯＤを減算し、算出した。ＯＤのカットオフ値（平均値＋２標準偏差）は、ＨＳのＥＬＩＳＡ反応から算出した。抗環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）抗体の測定については、市販の抗ＣＣＰ２ＥＬＩＳＡキット（Ｃｏｓｍｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用した。当該抗ＣＣＰ２ＥＬＩＳＡキットに含まれる抗原には、複数のタンパク質由来のシトルリンを含むペプチドが使用されている。

抗ＣＣＧ−１、２、３抗体、抗ＣＥＰ−１抗体、抗ＣＣＰ抗体のＥＬＩＳＡの結果は、表２および図１にまとめた。抗ＣＣＧ−１、２、３の抗体は、ＲＡ患者において、それぞれ８．７％、２６．０％、１９．７％の検体から検出された（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、表２）。抗ＣＣＧ−２抗体と抗ＣＣＧ−３抗体の濃度は、ＨＳと比べ、ＲＡ患者で有意差が見られた（マンホイットニーのＵ検定による解析。それぞれＰ＜０．００１、Ｐ＜０．０１）。抗ＣＣＧ−１抗体の濃度については、ＲＡ患者とＨＳの間で有意な差は見られなかった（Ｐ＝０．１５３）。抗ＣＣＧ−１、２、３抗体のＲＡ患者での特異性は、ＨＳと比較して、９５．４％であった。一方、日本人ＲＡ患者における抗ＣＥＰ−１抗体については、ＲＡ患者の４７．１％について観察され、抗ＣＥＰ−１抗体の濃度は、ＲＡ患者とＨＳの間で有意な差が見られた（Ｐ＜０．００１、図１Ｄ）。抗ＣＣＰ抗体については、ＲＡ患者において、８６．１％の検体が、陽性であった。

抗ＣＣＧ抗体の疾患特異性を明らかにするために、ＳＬＥ患者（１０１人）やＳＳ患者（１０１人）の血清についても、スクリーニングを行った。抗ＣＣＧ−２抗体は、ＳＬＥ患者とＳＳ患者においては、陽性となった検体がなく、ＨＳでは、０．６％であった（表２）。抗ＣＣＧ−２抗体の特異性は、ＳＬＥ患者、ＳＳ患者、およびＨＳと比較し、９９．７％と算出された。さらに、抗ＣＣＧ−１抗体の特異性は１００％であったが、感度は８．７％であった。対照的に、抗ＣＣＧ−３抗体は、ＨＳで４．０％、ＳＬＥ患者で１０．９％、ＳＳ患者で２２．８％の検体において陽性であった。抗ＣＣＧ−３抗体の特異性は、ＨＳおよび疾患コントロールと比較して８９．１％であった。抗ＣＥＰ−１抗体は、ＨＳで１．２％、ＳＬＥ患者で２．０％、ＳＳ患者で０％に陽性であった。抗ＣＥＰ−1抗体の特異性は９８．９％であった。抗ＣＣＰ抗体は、ＨＳで、１．２％、ＳＬＥ患者で６．９％、ＳＳ患者で３．４％の検体が、それぞれ陽性であった。抗ＣＣＰ抗体の特異性は９７．３％であった。

本実施例において、ＲＡ患者では、合計４０．９％の検体では、少なくともいずれか１種類のＣＣＧに対して陽性であった。このことから、ＣＣＧはＲＡの診断に有用なペプチドであり、該ペプチドに対する自己抗体の検出によりＲＡの診断が可能であることが明らかとなった。また、ＣＣＧに対する抗体のうち、とりわけ抗ＣＣＧ−１抗体および抗ＣＣＧ−２抗体は、抗ＣＥＰ−１抗体と抗ＣＣＰ抗体に比べ、ＲＡ患者に対して、高い特異性を示した。

前述のＥＬＩＳＡの結果が抗原特異的検出であることを確認するために、予め抗原と反応させた患者血清を用いてＥＬＩＳＡを行った。

抗ＣＣＧ−２抗体と抗ＣＥＰ−１抗体が陽性であった血清を１００倍に希釈し、０．１から３００μｇ／ｍｌの濃度に調整したＣＣＧ−２、ＣＥＰ−１またはコントロールペプチド（ＣＣＧ−１）と混合し、２時間保温した。検体は、ＣＣＧ−１、ＣＣＧ−２、ＣＥＰ−１のそれぞれをコートしてあるプレートに加え、各ペプチドに対する抗体の結合は、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果、ＣＣＧ−２とＣＥＰ−１で、ＥＬＩＳＡ測定前に添加した抗原濃度に依存的な阻害が観察された（図１Ｆ、１Ｇ）。対照的に、コントロールペプチド（ＣＣＧ−１）を用いた場合、濃度依存的な阻害は検出されなかった。これは、抗ＣＣＧ−２抗体および抗ＣＥＰ−１抗体が、それぞれＣＣＧ−２とＣＥＰ−１のペプチドに対して特異的であることを示している。

＜５．ＧＰＩタンパク質に対する自己抗体の測定＞
ＲＡ患者血清における、ＧＰＩタンパク質に対する自己抗体と、抗ＣＣＧ−１、２、３の関連を明らかにするために、ＲＡ患者（１５８人）およびＨＳ（７１人）の血清を用いて、抗ｒｈＧＰＩ抗体および、抗ｒａｂＧＰＩ抗体に対するＥＬＩＳＡを行った。

抗ＧＰＩ抗体の定量のために、ｒｈＧＰＩとｒａｂＧＰＩをそれぞれ、５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６穴プレートにコートした後、４℃に一晩置いた。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で２回洗浄し、非特異的な結合を阻害するためにＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＰＢＳで４倍希釈したもの）を用いた。３回洗浄の後、ＲＡ患者（１５８人）およびＨＳ（７１人）の血清は、プレートに添加し、２時間室温に置いた。洗浄後、アルカリフォスファターゼを結合した、Ｆｃフラグメントに特異的なヒト免疫グロブリンＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）をプレートに、１０００倍希釈の濃度で加え、室温に１時間置いた。３回の洗浄の後、ＡＰ反応溶液（９．６％ ジエタノールアミン、０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）とＡＰの基質を含むタブレット（シグマ）で発色させた。プレートは３０分間室温に置き、ＯＤは、プレート用分光光度計で、４０５ｎｍにおいて測定した。測定結果は、ＧＰＩタンパク質をコートしていないコントロールのウエル（ＧＳＴとＰＢＳをコートしたウエル）のＯＤを減算し、算出した。ＯＤのカットオフ値（平均値＋２標準偏差）は、ＨＳのＥＬＩＳＡ反応から算出した。

抗ｒｈＧＰＩ抗体の濃度は、ＨＳの血清においても、弱い反応が確認されたが（図２Ａ）、ＲＡ患者（平均ＯＤ＝１．０３８）とＨＳ（平均ＯＤ＝０．７３６）で有意に差が見られた（マンホイットニーのＵ検定による解析。Ｐ＜０．０１）。抗ｒａｂＧＰＩ抗体の濃度もまた、ＲＡ患者（平均ＯＤ＝０．０４１）とＨＳ（平均ＯＤ＝０．０１５）の間で有意に差が見られた（Ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。ＲＡ患者の血清では、抗ｒｈＧＰＩ抗体については、２４．１％の検体で陽性であり、抗ｒａｂＧＰＩ抗体については、３７．１％の検体で陽性であった。抗ｒｈＧＰＩ抗体と抗ｒａｂＧＰＩの両方について陽性であったのは、ＲＡ患者で１３．９％であった。抗ＧＰＩタンパク質抗体陽性と陰性の個々の検体の中で、抗ＣＣＧ抗体陽性について比較を行った。抗ｒｈＧＰＩ抗体と抗ｒａｂＧＰＩ抗体に陽性である患者で、抗ＣＣＧ-１抗体および抗ＣＣＧ-２抗体、抗ＣＣＧ−３抗体のいずれか１種類かあるいは全ての抗ＣＣＧ抗体に陽性である検体数は、両方が陰性である検体数に対して高い割合の傾向にあった（図２Ｃ）。しかし、抗ＣＣＧ抗体と抗ＧＰＩタンパク質抗体の両方で陽性と、両方陰性である検体数の間で、有意な差は見られなかった。また、抗ＣＣＧ−２抗体および抗ＣＣＧ−３抗体に陽性であるＲＡ患者で、抗ｒｈＧＰＩ抗体および抗ｒａｂＧＰＩ抗体の両方に陰性である検体が存在した（図２Ｄ）。この結果は、公知であるＧＰＩタンパク質に対する自己抗体の測定に比べ、ＣＣＧを使用した場合、より高い精度のＲＡの診断が可能であることを示している。

＜６．各種自己抗体間における相関解析＞
抗ＣＣＧ−１、２、３抗体および、抗ＧＰＩタンパク質抗体と、抗ＣＥＰ−１抗体および抗ＣＣＰ抗体と、の関連を解析するために、前述のＥＬＩＳＡのＯＤ値を用いて、相関解析を行った（図３）。

抗ＣＣＧ−１抗体は、抗ＣＥＰ−１抗体（ｒ＝０．０９０、Ｐ＝０．７２３）と、抗ＣＣＰ抗体（ｒ＝０．１０１、Ｐ＜０．１４１）の両方に対して、相関は認められなかった（図３Ａ）。一方、抗ＣＣＧ−２抗体は、抗ＣＥＰ−1抗体に対して相関が認められた（ｒ＝０．３１３、Ｐ＜０．００１）。さらに、抗ＣＣＧ−２抗体は、抗ＣＣＰ抗体に対しても、相関が認められた（ｒ＝０．４４２、Ｐ＜０．００１）（図３Ｂ）。対照的に、抗ＣＣＧ−３抗体は、抗ＣＥＰ−１抗体と相関せず（ｒ＝０．０９０、Ｐ＝０．１８３）、これに対して、抗ＣＣＰ抗体とでは、相関していた（ｒ＝０．１８１、Ｐ＜０．０１）（図３Ｃ）。また、抗ＣＥＰ−１抗体は、抗ＣＣＰ抗体と相関していた（ｒ＝０．３９９、Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、抗ＣＣＰ−２抗体が抗ＣＥＰ−１抗体および抗ＣＣＰ抗体と関連していることを示唆している。

抗ＧＰＩタンパク質抗体と、抗ＣＥＰ−１抗体および、抗ＣＣＰ抗体との相関についても検証した。抗ｒｈＧＰＩ抗体は、抗ＣＥＰ−１抗体と相関していたが（ｒ＝０．２０６、Ｐ＜０．０１）、抗ＣＣＰ抗体との相関は認められなかった（ｒ＝０．００５、Ｐ＝０．９４３）（図３Ｄ）。抗ｒａｂＧＰＩ抗体は、抗ＣＥＰ−１抗体（ｒ＝０．０７２、Ｐ＝０．３６７）と、抗ＣＣＰ抗体（ｒ＝０．０５３、Ｐ＝０．５０４）の両方で、相関が認められなかった（図３Ｅ）。抗ＣＣＧ−２抗体と異なり、抗ＧＰＩタンパク質抗体は、抗ＣＥＰ−１抗体および抗ＣＣＰ抗体に対して明らかな相関は見られなかった。この結果は、前述のＧＰＩタンパク質に対する自己抗体の測定の結果と合わせ、ＲＡ患者の診断マーカーとして、ＧＰＩのシトルリン化による翻訳後修飾が重要であることを示唆している。そして、抗ＣＣＧ抗体の濃度は、他のシトルリン化ペプチドに対する自己抗体の濃度と組み合わせることで、確度の高いＲＡの診断方法を提供できることを示している。

＜７．ＨＬＡ−ＤＲＢ１アリルと抗シトルリン化ペプチド抗体の関連＞
ＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープのアリルと、抗シトルリン化ペプチド抗体との関連を検証するために、ＲＡ患者におけるＨＬＡ−ＤＲＢ１のジェノタイピングを行い、共有エピトープのアリルを同定した。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１アリルのジェノタイピングでは、ゲノムＤＮＡを、１４７人のＲＡ患者の末梢血の白血球から、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ（富士フィルム）を用いて抽出した。ＨＬＡ−ＤＲＢ１のジェノタイピングは、ＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（湧永）を使用して、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブＰＣＲ法にて行った。ＰＣＲ産物は、ハイブリダイズを行い、Ｌｕｍｉｎｅｘ−２００ ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｚｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ｘＭＡＰ；Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で測定した。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープのジェノタイピングの結果、６種類のＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープ（ＤＲＢ１^＊０１０１、^＊０４０１、^＊０４０５、^＊０４１０、^＊１００１、^＊１４０６）が日本人ＲＡ患者において同定された。２７．９％の検体は、共有エピトープのアリルを持っていなかった。５１．０％の検体は、アリルを１個持っており、２１．１％の検体では、アリルを２個持っていた。抗ＣＣＧ−２、３抗体、抗ＣＥＰ−１抗体および抗ＣＣＰ抗体の濃度は、共有エピトープのアリルを持たないＲＡ患者に比べ、アリルを持つＲＡ患者の方で、高い傾向にあった（図４Ａ）。抗ＣＣＰ−２抗体、抗ＣＥＰ−１抗体および抗ＣＣＰ抗体は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープのアリルの存在の有無で有意差が見られた（フィッシャー直接検定およびカイ二乗検定による解析。それぞれ、Ｐ＝０．００２６、Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．００１）。これに対して、抗ＣＣＧ−３抗体と抗ＧＰＩタンパク質抗体では、アリルの有無との間に有意差は認められなかった（図４Ｂ）。抗ＣＣＧ−２抗体と抗ＣＥＰ−１抗体が陽性である患者は、高い確率で、１個あるいは２個のＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープの対立遺伝子を持っていた（図４Ｃ）。これらの結果は、日本人のＲＡ患者集団において、抗ＣＣＧ−２抗体および抗ＣＥＰ−１抗体と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の共有エピトープのアリル数とが、強く関連していることを示唆している。ＣＣＧに対する自己抗体の検出に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のアリル数を組み合わせることで、より早期で精度の高いＲＡの診断方法を提供することができる。

＜８．ＴＮＦαアンタゴニストの治療の前後における、シトルリル化ペプチドに対する自己抗体の測定＞
ＲＡの疾患の活動性とシトルリン化ペプチドに対する抗体との関連について検証するために、３５人のＲＡ患者について、ＴＮＦαのアンタゴニストによる治療の前後６か月における抗ＣＣＧ−１、２、３抗体、抗ＣＥＰ−１抗体および抗ＧＰＩタンパク質抗体の濃度の変動を調べた。

ＴＮＦαアンタゴニストの治療を受けた３５人の関節リウマチ症患者の内訳は、インフリキシマブ投与２５人、エタネルセプト投与８人、アダリムマブ投与２人である。投与前と投与６か月後で、血清を採取した。３５人の患者は、治療前に少なくとも、抗ＣＣＧ−１、２、３と抗ＣＥＰのいずれか１種類の抗体に対して陽性であった。

３５人のＲＡ患者について、ＴＮＦαアンタゴニストによる治療前では、抗ＣＣＧ−１、２、３抗体、抗ＣＥＰ−１抗体、抗ｒｈＧＰＩ抗体、抗ｒａｂＧＰＩ抗体は、それぞれ7人、２３人、１４人、２９人、５人、８人の患者から検出された。

ＴＮＦαのアンタゴニストによる治療の後、図５に示すように、抗ＣＣＧ−２抗体のみが、ＯＤが１．２３７から０．９０６と、有意に低下していた（対応のあるｔ検定による解析。Ｐ＜０．００１）。抗ＣＣＧ−１抗体の濃度については、有意な低下は見られなかった（ＯＤ ０．２６７から０．１９７、Ｐ＝０．２１６）（図５Ａ）。抗ＣＣＧ−３抗体の濃度は、減少する傾向にあった（ＯＤ ０．５６５から０．３９６、Ｐ＝０．１３３）（図５Ｃ）。しかし、抗ＣＥＰ−１抗体は、治療の前後で変化が見られなかった（ＯＤ ０．８６６から０．８６１、Ｐ＝０．９５７）（図５Ｄ）。抗ＧＰＩタンパク質抗体については、抗ｒｈＧＰＩ抗体（図５Ｅ）と抗ｒａｂＧＰＩ抗体（図５Ｆ）で、治療の前後で、抗体の濃度に有意な低下は見られなかった（ＯＤ ２．２３６から２．２３５、Ｐ＝０．９８；ＯＤ ０．０６５から０．０７９、Ｐ＝０．２４）。なお、関節リウマチ症の活動性を評価する指標である「ＤＡＳ−２８ＣＲＰ」の平均は、ＴＮＦαのアンタゴニストによる治療後、有意に低下しており、治療効果があったことが確認されている。

これらの結果は、抗ＣＣＧ抗体、特に抗ＣＣＧ−２抗体、の濃度が、抗ＣＥＰ−１抗体とは異なり、ＴＮＦαのアンタゴニストによる治療によって減少することを示し、抗ＣＣＧ−抗体がＲＡの活動性を評価するマーカーとして有用であることを示唆している。

本発明に係る環状シトルリン化ＧＰＩペプチドおよび関節リウマチ症診断方法によれば、ＲＡを高感度かつ高精度に診断できる。従って、本発明は、ＲＡの診断、治療効果の評価などのために有用である。

Claims (8)

1. 環状シトルリン化グルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチド。
2. 配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチドを環状シトルリン化して得た請求項１記載の環状シトルリン化グルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチド。
3. 配列番号１７〜１９で示されるアミノ酸配列において配列に含まれるアルギニンのうち少なくとも１つ以上がシトルリンに置換されたアミノ酸配列を有する請求項２記載の環状シトルリン化グルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチド。
4. 配列番号１８で示されるアミノ酸配列において配列に含まれるアルギニンが全てシトルリンに置換されたアミノ酸配列有する請求項３記載の環状シトルリン化グルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチド。
5. 環状シトルリン化グルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチドを含む関節リウマチ症診断試薬。
6. 生体から採取した試料中の環状シトルリン化グルコース−６−リン酸イソメラーゼペプチドに対する抗体を検出する手順を含む、関節リウマチ症診断方法。
7. 前記手順において、経時的に生体から採取した試料を用いる請求項６記載の関節リウマチ症診断方法。
8. 前記手順において、関節リウマチ症に対する治療前後に生体から採取した試料を用いる、請求項７記載の関節リウマチ症診断方法。
   

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