KR102424212B1 - 보르나바이러스 감염의 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 샘플에서 보르나바이러스, 바람직하게는 포유동물 2 보르나바이러스, 훨씬 더 바람직하게는 VSBV-1, 및 포유동물 1 보르나바이러스, 훨씬 더 바람직하게는 BoDV-1을 포함하는 그룹으로부터의 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 변연계 뇌염, 부종양 증후군(paraneoplastic syndrome, PNS), 뇌척수염, 백색질뇌증, 망막염 또는 시신경 위축의 진단 방법; BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N 및 VSBV-P를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 담체; 본 발명에 따른 담체, 또한 포획 항체의 검출을 위한 수단 및 샘플의 존재의 검출에 대한 대조군을 포함하는 키트; 및 뇌염의 진단, 이식후 합병증의 예후, 뇌염 또는 이식후 합병증의 치료법의 모니터링 또는 자가면역 뇌염과 감염에 의해 야기된 뇌염간의 구별을 위한 담체 또는 키트, 또는 보르나바이러스의 검출에 적합한 프라이머, 또는 상기와 같은 프로브(probe)의 용도에 관한 것이다.

Description

보르나바이러스 감염의 진단 방법{METHOD FOR DIAGNOSING A BORNAVIRUS INFECTION}

본 발명은 샘플에서 보르나바이러스, 바람직하게는 포유동물 2 보르나바이러스, 더욱바람직하게는 VSBV-1, 및 포유동물 1 보르나바이러스, 더욱바람직하게는 BoDV-1을 포함하는 그룹으로부터의 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 변연계 뇌염, 방종양증후군(paraneoplastic syndrome, PNS), 뇌척수염, 백색질뇌증, 망막염 또는 시신경 위축의 진단 방법; BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N 및 VSBV-P를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 담체; 본 발명에 따른 담체 및 또한 포획 항체의 검출을 위한 수단 및 샘플의 존재의 검출에 대한 대조군을 포함하는 키트; 및 뇌염의 진단, 이식후 합병증의 예후, 뇌염 또는 이식후 합병증의 치료법의 모니터링 또는 자가면역 뇌염과 감염에 의해 야기된 뇌염 간의 구별을 위한 담체 또는 키트, 또는 보르나바이러스의 검출에 적합한 프라이머, 또는 이러한 프로브(probe)의 용도에 관한 것이다.

뇌염은 감염, 방종양성 질병 또는 자가면역 질병에 의해 야기되는 뇌의 염증이다. 환자는 다수의 비특이적인 증상, 예를 들어 발열, 두통, 마비, 시각장애, 경련, 의식 및 지각의 상실, 및 지남력 장애를 앓는다.

시의 적절하게 확인되면 다수의 뇌염에 유효하지만, 상기 질병의 원인에 따라 상당히 상이한 치료 접근법들이 존재한다. 세균에 의해 야기된 뇌 염증은 항생제에 의해 치료될 수 있고 바이러스성 뇌염은 아시클로버와 같은 항바이러스제의 정맥내 투여에 의해 치료될 수 있는 반면, 자가면역에 의해 야기된 뇌염의 경우 지시되는 것은 면역억제제의 투여이다.

많은 경우에, 뇌염은 경증인 경우 전혀 알아채지 못한다. 상기 질병의 치료는 빠를수록 좋으며, 따라서 비특이적이고 가능한 가벼운 증상들임에도 불구하고, 상기 진단을 초기에 신뢰할만한 방식으로 진단을 내릴 수 있는 것이 특히 중요하다. 상기 질병은 부정확하게 치료되거나 치료되지 않으면, 마비, 언어장애 및 정신적 장애와 같은 지속적인 손상을 갖는 중증 질병에 이를 수 있다. 세균성 뇌염의 경우에, 사망률은 50%에 달하고; 단순 포진에 의해 야기된 뇌염의 경우에 사망률은 심지어 70%이다.

최근 몇년, 바이러스 또는 자가면역에 의해 야기된 뇌염, 예를 들어 NMDAR (EP2057466 B1), GABA(A) (EP2863231 A1), GABA(B) (EP2483417 B1), DPPX (US9719993 BB), LgI1 (US9250250 BB), IGLON5 (EP2905622 A1), SNARE (EP17001205), NBC1 (EP3026434 A1), 플로틸린 (EP3101424 A1) 및 ITPR (EP3018478 A1)에 대한 자가항체에 의해 야기된 뇌염의 다수의 발현들이 발견되었다.

그럼에도 불구하고, 다수의 환자가 뇌염의 전형적인 증상들을 갖는 질병을 앓고 있지만, 여전히 정확하게 진단할 수 없다(Bloch and Glaser (2007) Diagnostic approaches for patients with suspected encephalitis. Current Infectious Disease Reports (4):315-22). 이는 특히 변연계 뇌염 환자 집단(예외없이 자가면역에 의해 야기되는 것으로 문헌에 기재되어 있다)에서 우려된다(Melzer et al. (2015) Limbic Encephalitis: Potential Impact of Adaptive Autoimmune Inflammation on Neuronal Circuits of the Amygdala. Front. Neurol. 3;6:171).

특히 취약한 집단은 장기 이식을 받는 환자이다. 어쨌든 약해진 상기 환자의 상태와 별개로, 이식후 수년에 걸친 고용량의 약물, 면역억제제의 투여는 기회 감염과 같은 매우 광범위하게 다양한 질병들의 발생을 촉진한다. 특히 고형 장기 이식시 중대한 문제는 신경학적 합병증으로, 어쨌든 수용자의 10% 내지 59%에서 발생한다(Senzolo et al. (2009) Neurologic complications after solid organ transplantation. Transpl. Int. (3):269-78, 10-59%).

많은 경우에, 이들 신경학적 합병증이 무엇에 의해 야기되는 지가 불분명하다. 가능성으로는 신경학적 감염 증상뿐만 아니라, 투여된 면역억제제의 신경독성이 있다. 예를 들어, 코르티코스테로이드의 투여는 근육병의 위험성을 증가시킨다. 간부전 역시 신경학적 증상의 형태로 발현될 수 있다(Shalimar et al. (2015) Management in Acute Liver Failure. J. Clin. Exp. Hepatol. (5):S104-S115).

포유동물에서 보르나바이러스 감염은 이미 100년도 전에 기재되었다. 말의 경우, 포유동물 보르나바이러스 BoDV-1이 뇌염을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 이 경우에 발생하는 것은 비화농성 수막뇌염(뇌 및 대뇌 세포막의 염증)의 발생의 결과로서, 중추신경계에서 지속되는 질병이다. 병든 동물들은 운동 장애를 나타내고, 행동 문제에 의해 구분되며, 다수의 경우 상기 감염의 결과로서 사망한다.

문헌 [Hoffmann et al. (2015) A variegated squirrel bornavirus associated with fatal human encephalitis, N Engl J Med 2015; 373, pages 154-162]은 오색청솔모를 감염시키는 보르나바이러스("VSBV-1", 즉 오색청솔모 보르나바이러스-1)에 의한, 기존에 병이 있는(고혈압, 당뇨병 및/또는 비만증) 다수의 남성 노인 환자의 말단 바이러스 감염을 기재한다. 상기 환자들은 모두 폐색전증에 이르는 혈전증을 앓았다. 상기 환자들은 뇌염을 앓았으나, 상기 뇌염은 변연계 뇌염은 아니며, 변연계 분포없이 대뇌 피질 영역에 부종 병변을 동반하는 일련의 증상이었다. 완전한 BoDV-1 바이러스로 감염된 고양이 세포주에 기반한 간접적인 면역형광 시험(indirect immunofluorescence test, IIFT)을 사용하여 보르나바이러스에 대한 항체를 검출하였다.

2000년대 초에, 연구 그룹은 정신과적 질환과, 말을 감염시키는 종의 보르나바이러스에 의한 감염 간에 추정되는 연관성에 대해서 보고하였다. 상기 결과는 독립된 전문가들에 의해 재현될 수 없었으며, 따라서 전문 분야에서는 인정되지 않았다. 반대로, 로버트 코흐 연구소(Robert Koch Institute)는 하기의 결론에 도달한다: "현재의 발견에 따르면, 보드(Bode) 등(2001) 에 의해 기재된 시험은 의미있는 진단법에는 부적합한 것으로 간주해야 한다"(https://www.rki.de/DE/Content/Forsch/Forschungsschwerpunkte/NeueRisiken/NeuartigeErreger/Einstellung_Projekt_Bornavirus.html, retrieved on 14 December 2017). 인간에서 BoDV-1에 의해 야기된 뇌염은 지금까지 종래 기술에서 기재되지 않았다.

언론 보도에서, 프리드리히 뢰플러(Friedrich L

ffler) 연구소는 VSBV-1의 검출을 위한 시험의 개발에 대해서 보고하고 있다(http://www.wir-sind-tierarzt.de/2015/07/bestaetigt-bunthoernchen-uebertragen-bornaviren/, retrieved on 14 December 2017).

상기 배경에 대하여, 본 발명의 목적은, 바람직하게는 종래 기술에 기재된 시스템들에 비해, 특히 특이적 및/또는 민감성에 대해 개선된 진단 신뢰성으로, 바이러스 감염, 보다 특히 보르나바이러스 감염의 진단을 위한 개선된 검출 시스템을 제공하는 것이다.

더욱 또한, 본 발명의 목적은 뇌염의 진단, 보다 특히 차별적인 진단을 위한 검출 시스템을 제공하는 것이며, 변연계 뇌염에 주력하여, 자가면역 뇌염과, 감염에 의해 야기된 뇌염, 특히 바이러스 감염에 의해 야기된 뇌염, 더욱 바람직하게는 변연계 뇌염 간의 구분을 가능하게 하는 상기 검출 시스템을 제공하는 것이다.

더욱 또한, 본 발명의 목적은 이식후 합병증, 특히 신경학적 증상을 갖는 합병증의 진단, 치료 및 예방을 가능하게 하는 검출 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 첨부된 독립항들 및 종속항들의 발명의 주제에 의해 달성된다.

첫 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 샘플, 바람직하게는 인간 샘플에서 보르나바이러스, 바람직하게는 포유동물 2 보르나바이러스, 더욱 바람직하게는 VSBV-1, 및 포유동물 1 보르나바이러스, 더욱 바람직하게는 BoDV-1을 포함하는 그룹으로부터의 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 변연계 뇌염, PNS, 뇌척수염, 백색질뇌증, 망막염 또는 시신경 위축의 진단 방법에 의해 달성된다.

두 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 샘플, 바람직하게는 인간 샘플에서 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 이식후 신경학적 합병증을 예견하거나 또는 장기 제공자 또는 제공자 장기를 선별하는 방법에 의해 달성된다.

세 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 샘플, 바람직하게는 인간 샘플에서 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 자가면역 뇌염과 감염에 의해 야기된 뇌염을 구별하는 방법에 의해 달성된다.

바람직한 실시태양에서, 상기 검출은 상기 샘플에서, 바람직하게는 보르나바이러스의 N, P 및 X 단백질을 포함하는 그룹으로부터의 보르나바이러스-특이적 폴리펩티드에 대한 항체를 검출함으로써 달성된다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 샘플을, BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 담체와 접촉시킨다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 포획된 항체를 효소 활성, 형광 또는 화학발광에 의해 검출한다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 멤브레인-기반 면역블럿, 바람직하게는 웨스턴 블럿 또는 라인 블럿, 하나 또는 하나 이상의 비드, 면역형광을 위해 배열된 바이오칩, 및 ELISA 미세적정 플레이트를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.

네 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 담체에 의해 달성된다.

바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 단순포진 HSV-1, 단순포진 HSV-2, 인간 헤르페스바이러스 HHV-6, 인간 헤르페스바이러스 HHV-7, 광견병 바이러스, LCMV, 웨스트나일 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 토스카나 바이러스, 수두 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스, 말 뇌염 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 라크로스 바이러스, 리프트 밸리열 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, A형 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 장내 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 파와산 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스를 포함하는 그룹으로부터의 적어도 하나의 바이러스에 대한 항체의 포획 수단을 추가로 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 NMDAR, AMPAR, GAD65, 암피피신, GABA(A), GABA(B), DPPX, LgI1, CASPR2, IGLON5, SNARE, NBC1, 플로틸린 및 ITPR을 포함하는 그룹으로부터의 신경학적 항원에 대한 항체의 포획 수단을 추가로 포함한다.

다섯 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 담체 및 또한 포획된 항체의 검출을 위한 수단 또는 샘플의 존재의 검출에 대한 대조군을 포함하는 키트에 의해 달성된다.

여섯 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 뇌염, PNS, 뇌척수염, 백색질뇌증, 망막염 또는 시신경 위축의 진단, 이식후 합병증의 예후, 뇌염 또는 이식후 합병증의 치료법의 모니터링 또는 자가면역 뇌염과 감염에 의해 야기된 뇌염 간의 구별을 위한 담체 또는 키트, 또는 보르나바이러스의 검출에 적합한 프라이머, 또는 이러한 프로브의 사용에 의해 달성된다.

일곱 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 담체 또는 키트, 또는 자가면역 뇌염과, 감염에 의해 야기된 뇌염, 바람직하게는 변연계 뇌염 간의 구별을 위한 NMDAR에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 담체의 사용에 의해 달성된다.

여덟 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 뇌염의 진단, 바람직하게는 변연계 뇌염의 차별적인 진단을 위한 진단제 또는 키트의 제조를 위한 BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N, VSBV-P, NMDAR, AMPAR, GAD65, 암피피신, GABA(A), GABA(B), DPPX, LgI1, CASPR2, IGLON5, SNARE, NBC1, 플로틸린 및 ITPR 또는 이들의 변이체를 포함하는 그룹으로부터의 항원 폴리펩티드의 사용에 의해 달성된다.

아홉 번째 태양에서, 본 발명의 목적은 이식후 합병증 또는 뇌염, 바람직하게는 변연계 뇌염의 예방 또는 치료를 위한 보르나바이러스에 대해 유효한 약제의 사용에 의해 달성된다.

본 발명은 환자, 특히 인간 환자에서 보르나바이러스에 의한 감염이, 관련 샘플을 보르나바이러스의 종에 대한 항체뿐만 아니라, BoDV-1 및 VSBV에 대한 항체에 대해서 시험할 때 특히 신뢰할 수 있게 진단될 수 있다는 발명자들로부터의 놀라운 발견을 기반으로 한다.

더욱 또한, 본 발명은 변연계 뇌염이 자가면역 질병의 형태로 발생할 뿐만 아니라, 바이러스 감염, 특히 보르나바이러스에 의한 감염의 결과로서 발생할 수 있고, 보르나바이러스에 대한 항체의 검출에 의해 진단할 수 있다는 발명자들로부터의 놀라운 발견을 기반으로 한다.

더욱 또한, 본 발명은 신경학적 증상 및 질병, 각각 뇌척수염, 백질뇌증, 망막염 또는 시신경 위축을 포함하는 이식후 합병증이 보르나바이러스, 특히 BoDV-1의 전염에 의해 야기될 수 있고, 보르나바이러스에 대한 항체의 검출을 통해 진단되고 적합하게 치료될 수 있다는 발명자들로부터의 놀라운 발견을 기반으로 한다. 더욱 또한, 샘플 중에서 보르나바이러스에 대한 항체를 검출함으로써 장기 제공자 및 제공자 장기의 품질을 검사하는 것이 가능하다. 유사하게, 장기 수용자의 예방학적 항바이러스 치료 또는 면역화의 지시 여부를 명확하게 할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "변연계 뇌염"이란 용어는 중추 신경계의 신경학적 질병을 의미하는 것으로 이해되며, 여기에서 MRI 검사는 변연계에 속하는 뇌 영역 중 이상 신호 강도, 특히 측두-내부 신호 상승, 보다 특히 수일내에 정상화되지 않는 상기 상승을 나타낸다. 더욱 바람직하게, 단기 기억 장애, 측두엽 발작 및 정동 장애로 이루어지는 그룹으로부터의 3가지 증상 중 적어도 하나가 발생한다. 특징적인 MRI 기록들이 문헌, 예를 들어 문헌 [Simon/Greenberg/Aminoff, Clinical Neurology, 7th edition, 2009, on page 66 (Figs. 1-23)]에 개시되어 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "진단한다"란 용어는 평가를 지원하거나, 또는 먼저 피실험자가 질병을 앓고 있는지의 여부 또는 평균적인 사람보다 더 높은 확률로 질병을 앓는지, 또는 과거에 앓았는지 또는 미래에 앓을 것인지의 여부에 관하여, 및 또한 질병이 진행 중인지의 여부 또는 미래에 어떻게 전개될 것인지에 대한 평가를 허용하거나, 또는 특정 치료가 작용할 것인지의 여부를 평가하기 위해서 정보를 획득하는 과정을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 제공자 또는 제공자 장기로부터의 샘플 중 보르나바이러스의 검출은 보르나바이러스에 의해 야기된 이식후 합병증의 확률이 증가됨을 나타낸다. 더욱 또한, 상기와 같은 검출은 환자가, 면역억제성 치료(이는 자가항체 형성의 예방 또는 감소를 목적으로 한다)로부터가 아니라, 예를 들어 리바비린에 의한 항바이러스 치료로부터 이익을 얻을 수 있음을 보인다. 다시 말해, "진단한다"란 용어는 진단을 수행할 뿐만 아니라, 질병의 경우에 질병의 진행 또는 치료법의 성공의 예견 및 모니터링을 포함한다.

바람직하게, 상기 진단은 단순히 항체가 존재하는지의 여부를 검출하기에 충분하며, 상기 항체의 검출 가능한 농도가 상기 샘플 중에 존재하는지의 여부를 측정하는 것도 가능하다. 바람직한 실시태양에서, 측정되는 것은 진단되는 환자 중의 항체의 상대적인 농도가 평균적인 건강한 사람에서보다 더 높은 지의 여부이다. 측정될 수 있는 것은 상기 농도가 평균적인 건강한 사람으로부터의 샘플에서보다 1.1, 보다 바람직하게는 1.2, 1.5, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 또는 100000의 인자만큼 더 높은지의 여부이다.

보르나바이러스, 바람직하게는 VSBV-1 또는 BoDV-1을 포함하는 그룹으로부터의 보르나바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있는 경우, 이는 환자가 보르나바이러스 감염을 앓을 증가된 확률을 가리키거나 또는 뇌염, 바람직하게는 변연계 뇌염이 자가면역 질병에 의해서가 아니라, 바이러스 감염에 의해 야기됨을 가리킨다. 더욱 또한, 뇌염을 앓고 있는 환자에서 상기와 같은 항체의 검출은 상기 환자가 PNS를 앓고 있지 않고 따라서 PNS-관련된 암, 예를 들어 폐의 소-세포암을 앓고 있지 않음을 가리킨다.

보르나바이러스에 대한 항체의 검출, 및 상기로부터 추론되는 보르나바이러스에 의한 감염은 항바이러스 약제에 의한 치료학적 또는 예방적 치료 또는 각각의 치료학적 작용들을 입증한다. 예를 들어, 리바비린이 보르나바이러스에 대해 유효함을 입증하는 것이 가능하였다. 다른 한편으로, 면역억제제의 투여는 완벽하게 실패하게 되는데, 그 이유는 상기가 상당한 부작용과 관련될 뿐만 아니라, 환자의 면역계를 바이러스 및 기회 감염에 대해 약화시키기 때문이다. 보르나바이러스에 대한 항체의 부재, 및/또는 NMDAR에 대한 자가항체의 존재는, 예를 들어 리툭시맵, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트 모페틸, 정맥내 면역글로불린, 타크로리무스, 시클로스포린, 메토트렉세이트 및 아자티오프린을 포함하는 그룹으로부터의 면역억제제에 의한 치료학적 또는 예방적 치료를 입증한다.

바람직한 실시태양에서, 구별되는 것은 진단되는 환자가 보르나바이러스에 대해 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상 또는 3개 이상의 상이한 항체를 갖는 지의 여부이며, 상기 항체는 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X, 보다 바람직하게는 BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N 및 VSBV-P에 대한 항체의 그룹 중에서 임의로 선택된다. 보다 특히, 상기 그룹으로부터의 하나의 항원에 대한 하나의 항체의 검출은 상기 환자가 초기 또는 잠복 감염을 앓고 있음을 가리키는 반면, 상기 그룹으로부터의 하나 이상의 항원, 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 항원에 대한 항체들의 검출은 임상적으로 분명한 감염을 가리킨다.

당해 분야의 숙련가는 상기와 같은 검출이 일반적으로 혼자의 포괄적인 진단을 허용하는 것이 아니라, 추가적인 태양들, 예를 들어 샘플 중에서 측정하고자 하는 매개변수들, 병적 이력, 임상적 증상, 병력 또는 영상화 방법, 예를 들어 MRI로부터의 결과를 고려해야 함을 이해한다. 상기 숙련가는 또한 본 발명에 따른 방법의 가치가 간접 진단 또는 감별 진단(여기에서 질병의 배제는 환자가 유사한 증상을 갖는 또 다른 질병을 앓고 있음을 가리킨다)을 수행할 수 있는데 있을 수 있음을 이해한다. 바람직한 실시태양에서, 보르나바이러스에 대한 항체의 검출은 환자가 자가면역 질병이 아닌 변연계 뇌염을 앓고 있음을 가리킬 수 있다. 더욱 또한, 상기와 같은 검출은 환자가 방종양 증후군 및/또는 암, 바람직하게는 소세포 폐암을 앓고 있지 않음을 가리킬 수 있다. 환언하면, NMDA 수용체에 대한 자가항체의 검출은 환자가 바이러스 야기된 뇌염, 특히 변연계 뇌염을 앓고 있지 않음을 가리킬 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 당해 분야의 숙련가는 우선일의 관련 교과서, 예를 들어 문헌 [Simon/Greenberg/Aminoff, Clinical Neurology, 7th edition, 2009]로부터 자명한 바와 같이, 중요성을 본 명세서에 언급된 임상적 증상들에 둔다.

상기 보르나바이러스는 바람직하게는 포유동물을 감염시키는 보르나바이러스이다. 더욱 바람직하게, 상기 보르나바이러스는 인간을 감염시키는 보르나바이러스이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 보르나바이러스는 포유동물 2 보르나바이러스, 더욱 바람직하게 VSBV-1, 및 포유동물 1 보르나바이러스, 더욱 바람직하게 BoDV-1을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.

바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "포유동물 1 보르나바이러스"는 AJ311524_BoDV-2_1998, AJ311522_BoDV-1_1980, BDU04608_BoDV-1_1929, AJ311523_BoDV-1_1994, AB246670_BoDV-1_2004, 및 AB258389_BoDV-1_1997을 포함한다(문헌 [Tappe et al. (2018) Fatal limbic encephalitis in a zoo animal caretaker caused by variegated squirrel bornavirus: Zoonotic bornaviruses as occupational risk](사본 제출됨)을 참조한다).

바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "포유동물 2 보르나바이러스"는 LT594387_BH122/15-2_씨 프레보스티이(C. prevostii)_2015, KY488724_BH22/16-36_씨 프레보스티이_2016, KY488723_BH22/16-37_씨 프레보스티이_2016, KY488727_BH22/16-16_티 스윈호에이(T. swinhoei)_2016, LT594389_BH49/15-1_씨 프레보스티이_2015, KY488726_BH22/16-34_씨 프레보스티이_2016, LT594388_BH133/15_씨 프레보스티이_2015, KY488722_BH22/16-38_씨 프레보스티이_2016, KY488725_BH22/16-35_씨 핀레이소니이(C. finlaysonii)_2016, LT594383_BH3/16-2_씨 프레보스티이_2016, LT594381_BH122/15-1_씨 프레보스티이_2015, LT594382_BH48/15-1_에스 바리에가토이데스(S. variegatoides)_2015, LN713681_에이치 사피엔스(H. sapiens)_2015, LN713680_에스 바리에카토이데스_2015, LT594386_BH3/16-1_씨 프레보스티이_2016, LT594384_BH49/15-6_에스 바리에가토이데스_2015, LT594385_BH49/15-11_에스 바리에가토이데스_2015, LT594391_BH48/15-2_에스 바리에가토이데스_2015, LT594390_BH75/15_에스 바리에가토이데스_2015, KY488728_BH21/16_씨 프레보스티에_2016, MF597762_BH55/16_에이치 사피엔스_2016 및 KY488729_BH12/16_씨 프레보스티이_2016을 포함한다(문헌 [Tappe et al. (2018) Fatal limbic encephalitis in a zoo animal caretaker caused by variegated squirrel bornavirus: Zoonotic bornaviruses as occupational risk](사본 제출됨)을 참조한다).

모든 보르나바이러스를 문헌 [Tappe et al. (2018) Fatal limbic encephalitis in a zoo animal caretaker caused by variegated squirrel bornavirus: Zoonotic bornaviruses as occupational risk](사본 제출됨)에 의해 공개된 데이터와 함께 문헌 [Shahhosseini N, L

hken R, J

st H, Jansen S, B

rstler J, Rieger T, Kr

ger A, Yadouleton A, de Mendonca Campos R, Cirne-Santos CC, Ferreira DF, Garms R, Becker N, Tannich E, Cadar D, Schmidt-Chanasit J. (2017) Infect Genet Evol.; 55:260-268]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 전체 게놈 서열분석에 의해 식별할 수 있다.

시험되는 샘플은, 항체가 검출되는 경우, 환자로부터의 전형적인 항체 세트를 함유하는 샘플이다. 바람직하게, 상기는 혈청, 혈장, 타액 및 CSF를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.

특히 바람직한 실시태양에서, 상기 바이러스를 또한, 바람직하게는 PCR, 더욱 바람직하게는 역전사 PCR을 통해 보르나바이러스-특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 분자 유전학적 수단에 의해 식별하고 검출한다. 상기 프라이머 및/또는 프로브은 BoDV-1 및/또는 VSBV-1에 특이적일 수 있다. VSBV-1의 검출을 위한 예시적인 프라이머, 프로브 및 상응하는 프로토콜은 문헌 [Hoffmann et al. (2015) A variegated squirrel bornavirus associated with fatal human encephalitis, N Engl J Med 2015; 373, pages 154-162]에 기재되어 있다. 모든 공지된 포유동물 포르나바이러스 및 조류를 감염시키는 보르나바이러스의 대부분의 검출을 위한 광범위한 시험에 적합한 시약 및 방법뿐만 아니라, BoDV-1의 검출을 위한 시약 및 방법이 문헌 [Bourg et al. (2016) Virology Journal; 13:151]에 기재되어 있다.

간단히, 보르나바이러스를 먼저 상업적으로 입수할 수 있는 키트[매그맥스(MagMAX)^TM 바이러스 RNA 단리 키트(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)]를 사용하여 인간 샘플로부터 바이러스 핵산을 추출함으로써, 분자 유전학적 수단에 의해 상기 샘플 중에서 검출할 수 있다. 그 후에, 상기 바이러스 게놈을 서열분석[Schlottau et al., 2018] 및 획득된 서열과 문헌, 예를 들어 문헌 [Schlottau et al., 2018; GenBank: LN713681 for VSBV-1; KU748787,　AJ311521,　AY374521,　AY374519, for BoDV-1; AJ311524 for BoDV-2]로부터 공지된 서열과의 비교에 의해 측정할 수 있다.

한편으로, 보르나바이러스를 RT-PCR에 의해 검출할 수 있다. 이를 위해서, 바이러스 RNA를 적합한 키트, 예를 들어 바이랄 미니 키트(Viral Mini Kit)(퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 추출할 수 있다. 보르나바이러스의 검출을 문헌 [Bourg et al.(2016)]에 기재된 프라이머들인 "순방향 프라이머 보르나-2048-F": 5'-CGC GAC CMT CGA GYC TRG T-3' 및 "역방향 프라이머 보르나-2118-R": 5'-GAC ARC TGY TCC CTT CCK GT-3'을 사용하여 P 유전자의 61 bp 단편 및 X 유전자의 단부의 증폭에 의해 달성할 수 있다. 상기 검출을 아가로스 젤 전기영동에 의해 달성한다. BODV-1의 정량적인 검출을 하기의 프라이머 및 프로브를 사용하여 X 및 P 유전자의 161 bp 단편의 증폭에 의해 달성할 수 있다: BoDV1-1288-F TAGTYAGGAGGCTCAATGGCA,　BoDV-1449-R GTCCYTCAGGAGCTGGTC,　BoDV1-1346-프로브 FAM-AAGAAGATCCCCAGACACTACGACG-BHQ1 (Schlottau et al., 2018). BODV-1의 정량적인 검출은 하기의 프라이머 및 프로브를 사용하여 M 및 G 유전자의 74 bp 단편의 증폭에 의해 달성할 수 있다: BoDV1-2262-F CAATYAATGCAGCYTTCAATGTCTT,　BoDV1-2336-R GAATGTCYGGGCCGAGAG,　BoDV-2316-프로브 FAM-CCARCACCAATGTTCCGAAGCCG-BHQ1 (Schlottau et al., 2018).

상기 바이러스를 또한 조직 절편의 검사를 통해 면역조직화학적 수단에 의해 검출할 수 있다. 이는 제공자 장기(이 경우 혈액 샘플은 존재하지 않는다) 검사시 옵션이다.

바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "이식후 합병증"이란 용어는 신체의 일부, 바람직하게는 조직 또는 고형 장기, 더욱 바람직하게는 간, 신장, 폐, 장, 췌장 및 심장을 포함하는 그룹 중에서 선택된 고형 장기의 이식후 합병증을 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 합병증은 신경학적 증상의 발생을 포함하며 뇌염, 바람직하게는 변연계 뇌염을 포함할 수 있다. 추가의 특히 바람직한 실시태양에서, 감염은 "이식후 합병증"의 경우에 발생한다. 바람직한 실시태양에서, 신경학적 증상은 사지마비, 신경병증, 의식혼탁, 구음장애, 서동, 떨림, 불안정한 보행, 손상된 인지기술 및 기억 및 신경염을 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 이식후 합병증은 시각기능의 장애, 바람직하게는 신경학적 안과학적 증상 및/또는 질병, 특히 바람직하게는 시신경 위축을 포함한다.

시간의 면에서, "이식후 합병증"은 수혜자에 수술적 처치 후, 바람직하게는 1개월까지, 상기 처치 후 처음 6개월내, 또는 6개월 지나 발생하는 합병증이다.

장기 제공자 또는 제공자 장기의 선별을 위해서, 적합한 샘플을 이식 수행전에 상기 제공자 또는 그의 장기로부터 수집할 수 있다. 제공자의 경우에, 혈액, 타액 또는 CSF 샘플이 바람직하다. 장기의 경우에, 시험되는 것은 혈액 또는 조직 잔사, 각각의 샘플이다. 상기 조직은 간, 신장, 폐, 장, 췌장, 심장 및 뇌를 포함하는 그룹 중에서 선택된 장기로부터 기원할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자가면역 뇌염"은 하나 또는 하나 이상의 자가항체의 발생과 관련된 뇌염을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 자가항체는 바람직하게는 NMDAR (EP2057466 B1), GABA(A) (EP2863231 A1), GABA(B) (EP2483417 B1), DPPX (US9719993 BB), LgI1 또는 CASPR2 (US9250250 BB), IGLON5 (EP2905622 A1), SNARE (EP17001205), NBC1 (EP3026434 A1), flotillin (EP3101424 A1), DAGLA (EP18196867), SNARE (EP17001205) 및 ITPR (EP3018478 A1)를 포함하는 그룹 중에서 선택된 신경세포 자가항원에 대한 자가항체이다. 자가항원의 적합한 서열들은 괄호안에 나타낸 특허 명세서들에 개시되어 있다.

바람직한 실시태양에서, 보르나바이러스는 샘플 중에서 검출된다. 이는 상기 바이러스 또는 그로부터 유래된 분자 또는 상기 바이러스 또는 그로부터 유래된 분자에 대한 환자 항체가 샘플 중에서 검출됨을 의미한다.

자가면역-야기된 뇌염, 보다 특히 NMDA 수용체 뇌염(그러나 보르나바이러스에 의한 감염에 의해 야기된 뇌염은 아닌)은 종양의 발생과 빈번히 관련된다. 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "PNS"(방종양성 신경학적 증후군)란 용어는 종양의 존재에 의해, 예를 들어 종양 발생 에피토프 또는 호르몬과 같은 물질의 방출 또는 상기 물질의 상승된 양의 방출에 의해 간접적으로 야기되는 전신 질병을 의미하는 것으로 이해되며, 상기 종양이 유래된 세포는 필적할만한 상황하에서 상기 물질을 방출하지 않거나 상기와 같은 양으로 방출하지 않을 것이다. 상기 직접적인 또는 간접적인 결과는 자가항체의 형성일 수 있으며, 이는 우선적으로는 신경계의 구조 또는 부분에 대한 것이고, 임의의 경우에 신경학적 증상의 발생과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되며 우선적으로는 상기 증상을 야기한다. NMDA 수용체 뇌염은 난소의 기형종의 발생과 관련될 수 있음이 공지되어 있다. 상기 종양은 자가면역에 의해 야기된 뇌염의 경우에 검출될 수 없다.

본 발명에 따른 검출을 상기 보르나바이러스에 특이적인 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체, 바람직하게는 그에 대한 항체의 검출을 통해 달성할 수 있다. 상기 항체는 바람직하게는 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X, 바람직하게는 BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N 및 VSBV-P를 포함하는 그룹으로부터의 바이러스 폴리펩티드에 대한 항체이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 검출되는 것은 상기 환자가 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹으로부터의 바이러스 폴리펩티드에 대한 1, 2, 3, 4 또는 1 이상, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 항체를 갖는지의 여부이다.

바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 포획 수단으로서 대략 40 kDa의 보르나바이러스의 핵단백질을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 포획 수단으로서 대략 23 kDa의 보르나바이러스의 인산단백질을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 포획 수단으로서, BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X, 바람직하게는 BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N 및 VSBV-P, 또는 그의 변이체들을 포함하는 그룹으로부터의 하나 또는 1 이상, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 BoDV-1-N 및 BoDV-1-P 또는 그의 변이체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 VSBV-N 및 VSBV-P 또는 그의 변이체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 BoDV-1-P 및 VSBV-P 또는 그의 변이체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 VSBV-N 및 BoDV-1-N 또는 그의 변이체를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, "BoDV-1-N", "BoDV-1-P", "VSBV-N" 및 "VSBV-P"는 본 특허 출원의 우선일에 각각 유니프롯 엔트리 P0C796 (BoDV-1-N), P0C798 (BoDV-1-P), A0A0H5BWD6 (VSBV-N) 및 A0A0H5BWK0 (VSBV-P)에 의해 기재된 서열들을 의미하는 것으로 이해된다. VSBV-X는 바람직하게는 서열 ART67059.1을 갖고, BoDV-1-X는 바람직하게는 서열 AIK27011.1을 갖는다. 모든 항목에 대해서, 상기 우선일에 입수할 수 있었던 데이터베이스의 버전 및 상기 일에 검색할 수 있었던 데이터의 진술이 관련있다. 바람직한 실시태양에서, 보르나바이러스의 N, P 또는 X 단백질은 서열 P0C796, P0C798 또는 AIK27011.1, 특히 바람직하게는 그의 변이체와 관련하여 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 일치성을 갖는 단백질을 의미하는 것으로 이해된다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따라 사용되는 담체는 하나 또는 하나 이상의 항체의 포획 수단을 함유하는 의료 장치, 바람직하게는 진단 장치이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항체의 포획 수단"이란 용어는 검출하고자 하는 항체가 단독으로 또는 충분한 양으로 또 다른 항체, 특히 동종 폴리펩티드에 결합하고 거짓-양성 결과를 우선적으로 촉발할 수도 있는 또 다른 항체의 형태의 항체보다 더 강하게 결합하도록, 상기 항체에 특이적으로 결합하는 작용제를 의미하는 것으로 이해된다.

특히, 신경학적 증상을 갖는 환자에서 상기 환자가 자가면역에 의해 야기된 뇌염 또는 감염에 의해 야기된 뇌염, 바람직하게는 변연계 뇌염을 앓고 있는지의 여부를 구분할 수 있는 것을 목적으로 하는 감별 진단의 경우, 한편으로 NMDAR에 대한 항체, 및 BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N, VSBV-P 또는 감염 중 유사하거나 혼동되는 증상을 야기하는 다른 바이러스 또는 상기로부터 유래된 항원에 대한 항체를 동시에 포획 및/또는 검출하는 것이 유리하다. 상기 목적에 적합한 담체는 NMDAR 및/또는 BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N, VSBV-P를 포함하는 그룹 중 적어도 하나의 항원 이외에, 또 다른 바이러스의 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 다른 바이러스의 다수의 항원을 포함할 수 있다. 추가로 자가항체를 검출할 수 있는 다른 항원이 또한 유용하다. 이 경우에, 아마도 항원에 의한 양성 결과는 하나의 시험 절차내에서 달성되고 제외-기준 진단을 연구할 필요는 없는 듯하다.

특히 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "특이적으로 결합한다"란 용어는 항체의 경우에, 상기 항체가 1 x 10^-5 M, 보다 바람직하게는 1 x 10^-7 M, 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M, 보다 바람직하게는 1 x 10^-9 M, 보다 바람직하게는 1 x 10^-10 M, 보다 바람직하게는 1 x 10^-11 M, 보다 바람직하게는 1 x 10^-12 M인 해리 상수를 특징으로 하는 결합 반응 또는 더 강한 결합 반응으로 상응하는 항원에 대해 결합함을 의미한다. 바람직하게, 상기 해리 상수는 상기와 관련하여, pH 7의 PBS 완충제 중에서 25℃에서 비아코어(Biacore) 장비를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되고 제조사에 의해 공급된 소프트웨어를 사용하여 계산된다.

특히 바람직한 실시태양에서, 항체의 포획 수단은 검출되는 항체 또는 그의 변이체에 의해 인식되는 에피토프를 갖는 폴리펩티드이다. 한편으로, 검출되는 항체에 대해 적합한 결합 능력을 갖는 상기와 같은 폴리펩티드의 펩티도유사물질, 예를 들어 펩토이드, 베타-펩티드 및 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드를 사용하는 것이 또한 가능하다. 당해 분야의 숙련가는 상기와 같은 분자 및 그의 설계에 친숙하다(Pelay Gimeno M, Glas A, Koch O, Grossmann TN (2015). "Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: Mimicking peptide binding epitopes". Angewandte Chemie International Edition. 54 (31): 8896-8927). 포획 수단으로서 예시적인 폴리펩티드는 인간 NMDA 수용체의 NR1 서브유닛, 그의 이량체 또는 상기 NMDA 수용체의 다른 서브유닛과의 복합체에 대한 항체의 포획을 위한 서열번호 7, 예를 들어 상기 NMDA 수용체에 대한 항체의 포획을 위한 NR2A (EP2057466으로부터 서열번호 3) 또는 NR2B (EP2057466으로부터 서열번호 1) 또는 NR2C (EP2057466 B1으로부터 서열번호 5), 인간 GABA(A) 수용체에 대한 항체의 포획을 위한 EP2863231 A1로부터의 서열번호 1 및/또는 서열번호 2, 인간 GABA(B) 수용체에 대한 항체의 포획을 위한 EP2483417 B1로부터의 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3, DPPX에 대한 항체의 포획을 위한 WO2014/041035A1으로부터의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4, LgI1 또는 CASPR2 (US9250250 BB)에 대한 항체의 포획을 위한 US9250250 BB로부터의 서열번호 2, IGLON5에 대한 항체의 포획을 위한 EP2905622 A1으로부터의 서열번호 1, NSF에 대한 항체의 포획을 위한 EP17001205로부터의 서열번호 1, STX1V에 대한 항체의 포획을 위한 EP17001205로부터의 서열번호 3, VAMP2에 대한 항체의 포획을 위한 EP17001205로부터의 서열번호 6, NBC1에 대한 항체의 포획을 위한 유니프롯(Uniprot) (EP3026434 A1 참조)으로부터의 서열 Q9Y6R1, 플로틸린에 대한 항체의 포획을 위한 O75955 (플로틸린1, 유니프롯) 및/또는 Q14254 (플로틸린2, 유니프롯) (EP3101424 A1 참조) 및 ITPR에 대한 항체의 포획을 위한 Q14643 (유니프롯) (EP3018478 A1 참조), 및 각각의 경우의 그의 변이체를 포함한다. 상기 포획 수단은 바이러스로 감염된, 바람직하게는 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 형태의 바이러스 자체일 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 단리 및/또는 정제된다.

본 발명에 따른 교시를 상기 명시된 폴리펩티드의 야생형 서열 또는 본 명세서에, 가능하게는 함축적으로 서열번호의 형태(이제부터 집합적으로 "전장(full-length) 폴리펩티드"로서, 또는 데이터베이스 암호로서 또는 일부 다른 방식으로 지칭한다)로 명시한 바와 같은 참조 서열을 사용할뿐만 아니라, 상기 서열들의 변형을 사용함으로써 수행할 수 있다.

특히 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "변이체"란 용어는 상기와 관련하여 상기 전장 폴리펩티드에 대해서 C- 및/또는 N-말단 단부에서 하나 또는 하나 이상의 아미노산에 의해 절두된 상기 전장 폴리펩티드의 적어도 하나의 단편을 의미한다. 상기와 같은 단편은 상기 전장 폴리펩티드의 서열로부터 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 600개, 바람직하게는 10개 이상의 연속적인 아미노산의 길이를 함유할 수 있다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "변이체"란 용어는 단편뿐만 아니라, 상기 전장 폴리펩티드 또는 그의 단편에 관하여, 생물학적 활성, 예를 들어 상기 전장 폴리펩티드 항원에 특이적인 항체에 결합하는 항원의 능력에 필수적인 임의의 아미노산의 결실 또는 비-보존적인 치환 없이, 적어도 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 일치성(증가하는 순으로 바람직하다)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 종래 기술은 아미노산 서열의 서열 일치성을 확립시키는 방법들을, 예를 들어 문헌 [Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, Oxford University Press, 2008, third edition]에 개시한다. 바람직한 실시태양에서, ClustalW 소프트웨어(Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948)를 상기 목적을 위한 표준 설정을 사용하여 사용한다.

또한, 본 발명에 따라 사용되는 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 화학적 변형, 예를 들어 동위원소 표지, 공유 변형, 예를 들어 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 데카복실화, 시트룰린화, 메틸화, 하이드록실화 등을 가질 수 있다.

변이체는 또한 다른 공지된 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 바람직하게는 정제 태그, 더욱 바람직하게는 His-태그, 티오레독신, 말토스-결합 단백질, 스트렙트아비딘, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 또는 그의 변이체를 포함하는 그룹으로부터의 태그와의 융합 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 전장 폴리펩티드에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 일치성을 갖는 활성 부분 또는 도메인이거나 또는 상기 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, "활성 부분 또는 도메인"이란 용어는 상기 두 경우 모두에서 전장 폴리펩티드의 생물학적 활성의 적어도 일부를 유지하는 상기 전장 폴리펩티드의 단편 또는 변이체를 의미하는 것으로 이해된다.

상기 전장 폴리펩티드의 변이체가 생물학적 활성을 갖는 것은 필수적이다. 바람직한 실시태양에서, 생물학적 활성은 상기 전장 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포획하는 항원의 능력이다. 따라서 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X의 변이체는 각각 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X에 대한 항체를 포획하는 능력을 갖는다. 바람직하게, 상기 항체는 특정 질병을 앓고 있는 환자의 혈액 중에서 특이적으로 발생하는 것이다. 예를 들어, 보르나바이러스에 대한 항체의 포획을 위한 항원의 변이체는 상기 보르나바이러스의 항원에 대한 환자로부터의 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 그 경우인지의 여부를 실시예 1에 기재된 바와 같이, 면역블럿을 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 변이체는, 예를 들어 서열번호 1(VSBV-N의 변이체), 서열번호 3(VSBV-P), 서열번호 4(BoDV-1-N) 및 서열번호 5(BoDV-1-P)를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 상기 포획 수단은 특히 바람직하게는 재조합체인 단리 및/또는 정제된 폴리펩티드이다. "단리된" 폴리펩티드는 상기와 관련하여, 상기 폴리펩티드가 그의 자연 환경으로부터 제거되었음을 의미하는 것으로 이해된다. "정제된" 폴리펩티드는 바람직한 실시태양에서, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피, 젤-여과 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함하는 그룹 중에서 선택된 크로마토그래피 방법을 사용하여 그의 자연 환경에서의 농도 및/또는 순도에 관하여 농축된 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 적어도 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 또는 99.5%의 순도를 가질 때 정제되며, 이를 시각적으로, 또는 바람직하게는 쿠마시 염색후 SDS-PAGE 젤상의 밴드의 강도 측정에 의해 평가할 수 있다.

폴리펩티드는 조직 또는 세포, 바람직하게는 재조합 조직 또는 재조합 세포의 형태로 제공될 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 진핵생물 세포, 보다 바람직하게는 곤충, 식물 또는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.

폴리펩티드는 접힌 폴딩 형태 또는 펼쳐진 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게, 폴딩은, 측정을 허용하고 단백질이 그의 3차원 폴딩을 나타낼 수 있는 완충제 중에서, 예를 들어 pH 7에서 10 mM 인산나트륨에서 CD 분광기에 의해 측정된다(예를 들어 문헌 [Banaszak L. J. (2008), Foundations of Structural Biology, Academics Press], 또는 문헌 [Teng Q. (2013), Structural Biology: Practical Applications, Springer]을 참조한다). 바람직하게, 상기 단백질은 검출되는 항체에 의해 인식되는 폴딩을 나타낸다.

포획 수단은 바람직하게는 담체 상에, 더욱 바람직하게는 공유 또는 비-공유 결합을 통해 고정화된다.

바람직한 실시태양에서, 항체는 포획후 면역확산, 면역전기영동, 광산란, 응집반응, 방사성, 효소 활성, (전기)화학발광 및 면역형광을 포함하는 그룹으로부터의 방법에 의해 검출된다. 방사성, 효소 활성, (전기)화학발광 및 면역형광에 의한 검출의 경우에, 검출 가능한 표지가 사용될 수 있다. 상기를 바람직하게는 검출되는 항체에 결합하는 2차 항체에 부착시킨다. 검출 방법은 예를 들어 문헌 [Zane, H. D. (2001), Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, particularly in chapter 14]에 기재되어 있다.

바람직한 실시태양에서, 상기 검출되는 항체는 면역글로불린 부류 G(IgG), 면역글로불린 부류 M(IgM) 및 면역글로불린 부류 A(IgA), 바람직하게는 G 또는 M, 더욱 바람직하게는 G를 포함하는 그룹으로부터의 항체이다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 부류 G, 면역글로불린 부류 M 및 면역글로불린 부류 A, 바람직하게는 G 및 M을 포함하는 그룹으로부터의 2개 이상 부류의 항체가 검출된다.

상기 검출하고자 하는 항체를 정량분석할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 검출하고자 하는 항체를 검출하고 바람직하게는 하루 넘게 정량분석한다. 더욱 바람직하게, 상기 항체는 부류 G(IgG)의 것이다. 이렇게 하여, 적정 과정이 이어질 수 있다. 이 경우에, 시간에 따라 상승하는 IgG 역가는 보르나바이러스에 의한 활동성 감염의 식별 및 각각 수동 면역 또는 접촉으로부터의 보르나바이러스에 의한 활동성 감염과 추가로 과거의 병원체에 의한 감염의 구별이 가능하다.

바람직한 실시태양에서, 담체는 멤브레인-기반 면역블럿, 바람직하게는 웨스턴 블럿, 측류 분석 또는 라인 블럿, 하나 또는 하나 이상의 비드, 면역형광을 위해 배열된 바이오칩, 및 ELISA 미세적정 플레이트를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.

본 발명은, 본 발명에 따른 담체, 및 또한 임의로 설명서, 및/또는 바람직하게는 세척액, 포획 항체의 검출을 위한 수단을 포함하는 용액, 및 양성 대조군을 포함하는 용액을 포함하는 그룹으로부터의 완충제 및 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 용액 대신에, 상기 특정 시약을 건조한 형태로, 예를 들어 분말로서, 바람직하게는 필요에 따라 상기 분말을 용해시킬 수 있는 용액과 함께 제공할 수 있다. 양성 대조군으로서, 검출되는 항체 또는 상기 항체가 결합하는 항원에 특이적으로 결합하는 그의 변이체를 사용하는 것이 가능하다. 바람직하게, 상기 담체는 샘플, 바람직하게는 혈청 샘플의 존재의 검출을 위한 대조군을 포함한다. 예를 들어, 모든 혈청 샘플 중에 존재하는 단백질을 혈청 샘플의 존재를 확인하기 위해서 검출할 수 있다. 포획 항체의 검출에 사용되는 수단은 바람직하게는 검출 가능한 표지를 갖는 2차 항체이다.

본 특허 출원에서, 신규의 폴리펩티드 및/또는 핵산을 나열한다. 이들은 하기의 서열들을 갖는다:

서열번호 1 (VSBV-N (40 kDa, His-태그))

MNITMPPKRRLLEDPDVMDDQEPEPTSPPMPKLPGKFLQYTVGGSDPHPGIGEEKDIKHNAVALLDSSRRDMFHPVTPSLVFLCLLIPGLHAAFLHGGVPKESYLSTPISRGEQTFVKVSRFYGERTASRELTELEISSIFNHCCSLLIGVVIGSSAKIRAGAEQIKKRFKTLMASLNRPSHGETATLLQMFNPHEAIDWINGQPWVGSLVLSLLTTDFESPGKEFMDQIKLVASYAQMTTYTTIKEYLAECMDATLTIPAVAHEIREFLEISAKLKNEHAELFPFLGAIRHPDAIKLAPRSFPNLASAAFYWSKKENPTMAGYRASTIQPGATVKETQLARYRRREVSRGEDGAELSGEISDIMKMIGVTGLVLEHHHHHH

서열번호 2 (VSBV-N 펩티드 (30 kDa, His-GST-태그))

MSHHHHHHHHMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKLEVLFQGPAMFVKVSRFYGERTASR

서열번호 3 (VSBV-P (23 kDa, His-태그))

MASRPSSLVESLEDEESLQTPRRVRSRSPRPKRIPQDALTQPVDRLLKNIKKNPSMISDPEQRTGREQLSNDELIKQLVTELAENSMIEAEGLRGALDDISSKVDSGLESISSLQVETLQTVQKTDYADSIKTLGENIKVLDRSMKTMMETMRLMMEKIDLLYASTAIGQSNTPMLPSHPAQPRLYPTLPSAPTADEWDILPLEHHHHHH

서열번호 4 (BoDV-1-N (40 kDa, His-태그))

MNITMPPKRRLVDDADAMEDQDLYEPPASLPKLPGKFLQYTVGGSDPHPGIGHEKDIRQNAVALLDQSRRDMFHTVTPSLVFLCLLIPGLHAAFVHGGVPRESYLSTPVTRGEQTVVKTAKFYGEKTTQRDLTELEISSIFSHCCSLLIGVVIGSSSKIKAGAEQIKKRFKTMMAALNRPSHGETATLLQMFNPHEAIDWINGQPWVGSFVLSLLTTDFESPGKEFMDQIKLVASYAQMTTYTTIKEYLAECMDATLTIPVVAYEIRDFLEVSAKLKEEHADLFPFLGAIRHPDAIKLAPRSFPNLASAAFYWSKKENPTMAGYRASTIQPGASVKETQLARYRRREISRGEDGAELSGEVSAIMKMIGVTGLNLEHHHHHH

서열번호 5 (BoDV-1-P (23 kDa, His-태그))

MATRPSSLVDSLEDEEDPQTLRRERSGSPRPRKIPRNALTQPVDQLLKDLRKNPSMISDPDQRTGREQLSNDELIKKLVTELAENSMIEAEEVRGTLGDISARIEAGFESLSALQVETIQTAQRCDHSDSIRILGENIKILDRSMKTMMETMKLMMEKVDLLYASTAVGTSAPMLPSHPAPPRIYPQLPSAPTADEWDIIPLEHHHHHH

서열번호 6 (VSBV-N 펩티드, A0A0H5BWD6의 아미노산 116-130)

FVKVS RFYGERTASR

서열번호 7 (NMDAR 수용체의 NR1 서브유닛)

MSTMHLLTFALLFSCSFARAACDPKIVNIGAVLSTRKHEQMFREAVNQANKRHGSWKIQLNATSVTHKPNAIQMALSVCEDLISSQVYAILVSHPPTPNDHFTPTPVSYTAGFYRIPVLGLTTRMSIYSDKSIHLSFLRTVPPYSHQSSVWFEMMRVYNWNHIILLVSDDHEGRAAQKRLETLLEERESKAEKVLQFDPGTKNVTALLMEARELEARVIILSASEDDAATVYRAAAMLNMTGSGYVWLVGEREISGNALRYAPDGIIGLQLINGKNESAHISDAVGVVAQAVHELLEKENITDPPRGCVGNTNIWKTGPLFKRVLMSSKYADGVTGRVEFNEDGDRKFANYSIMNLQNRKLVQVGIYNGTHVIPNDRKIIWPGGETEKPRGYQMSTRLKIVTIHQEPFVYVKPTMSDGTCKEEFTVNGDPVKKVICTGPNDTSPGSPRHTVPQCCYGFCIDLLIKLARTMNFTYEVHLVADGKFGTQERVNNSNKKEWNGMMGELLSGQADMIVAPLTINNERAQYIEFSKPFKYQGLTILVKKEIPRSTLDSFMQPFQSTLWLLVGLSVHVVAVMLYLLDRFSPFGRFKVNSEEEEEDALTLSSAMWFSWGVLLNSGIGEGAPRSFSARILGMVWAGFAMIIVASYTANLAAFLVLDRPEERITGINDPRLRNPSDKFIYATVKQSSVDIYFRRQVELSTMYRHMEKHNYESAAEAIQAVRDNKLHAFIWDSAVLEFEASQKCDLVTTGELFFRSGFGIGMRKDSPWKQNVSLSILKSHENGFMEDLDKTWVRYQECDSRSNAPATLTFENMAGVFMLVAGGIVAGIFLIFIEIAYKRHKDARRKQMQLAFAAVNVWRKNLQDRKSGRAEPDPKKKATFRAITSTLASSFKRRRSSKDTSTGGGRGALQNQKDTVLPRRAIEREEGQLQLCSRHRES

본 발명을 하기에서 도면을 참조하여 예시적인 실시태양들에 의해 설명한다. 기재된 실시태양들은 모든 태양에서 단지 예시적일 뿐이고 제한적인 것으로 이해해서는 안 되며, 서술된 특징들의 다양한 조합이 본 발명의 범위에 포함된다.

도 1은 실시예 1에서 제조되고 사용된 바와 같은, 보르나바이러스 항원에 대한 라인 블럿 스트립의 구조를 도시한다.
도 2는 실시예 1에 따른 배양 후에, 실시예 1에서 제조된 바와 같은, 보르나바이러스 항원에 대한 라인 블럿 스트립을 도시한다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 라인 블럿 스트립을 사용하는, 변연계 뇌염 환자로부터의 샘플의 시험 결과를 도시한다.
도 4는 실시예 1에서 제조된 추가의 라인 블럿 스트립을 사용하는, 변연계 뇌염 환자로부터의 샘플의 시험 결과를 도시한다.
도 5는 2개의 상이한 배율(좌측 200x, 우측 400x)의, 면역형광에 의한 이식 환자로부터의 샘플의 시험 결과(실시예 2를 참조)를 도시한다.
도 6은 실시예 1에 따라 제조된 보르나바이러스 항원에 대한 라인 블럿 스트립을 사용하는 이식 환자로부터의 샘플의 시험을 도시한다; 실시예 2를 참조한다.

실시예 1: 오색청솔모 보르나바이러스 I(VSBV1) 및 포유동물 보르나바이러스 I(BoDV-1)에 대한 멤브레인-기반 항체 검출

1.1 유로라인(EUROLINE) 항-보르나바이러스 프로파일의 제조

니트로셀룰로스 멤브레인 상의 항원의 코팅:

VSBV-N 단백질(서열번호 1), VSBV-N 펩티드(서열번호 2), BoDV-1-N 단백질(서열번호 4), BoDV-1-P 단백질(서열번호 5) 및 VSBV-P 단백질(서열번호 3)을 이 콜라이(E. coli)에서 재조합 수단에 의해 His-태그와 융합시키고 표준 프로토콜을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 상기 정제된 단백질을 동결된 상태(-70℃)로 보관하고 코팅 과정 전에 해동시켰다.

유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 a의 제조를 위해서, 상기 항원을 각 경우에 (각각의 항원에 대해 가변적인 9 ㎍/㎖ 내지 59 ㎍/㎖의 농도로) 2개의 희석액으로 코팅하였다.

이어지는 제2 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 b에서, 상기 BoDV-1 항원의 농도를 각각의 경우에 50%까지 감소시켰다. 상기 희석된 항원을 콘택트 팁 디스펜서를 사용하여 기계에 의해 코팅하였다(문헌 [Raphael Wong, Harley Tse: Lateral Flow Immunoassay; Humana Press; 2008, page 137]을 참조한다). 도 1은 상기 유로라인의 구조를 도시하며, 이때 1은 보다 높은 항원 농도를 지칭하고 2는 보다 낮은 항원 농도를 지칭한다.

그 후에, 상기 코팅된 멤브레인을 차단하고, 세정하고, 건조시키고, 추가의 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.

담체 필름 상의 코팅의 점착:

상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일을 생성시키기 위해서, 각 항원의 라인을 플라스틱 필름 상에 고정시켰다. 이어서 개별적인 시험 스트립으로 분할하였다.

1.2. 유로라인을 사용하는 면역분석의 수행

혈청 샘플의 배양:

1. 전처리:

시험할 환자 샘플의 수에 따라, 배양 용기를, 각각의 경우에 사용 준비가 된 1.5 ㎖의 희석된 범용 완충제(ZD 1100-1050, 유로이뮨(주) (EUROIMMUN AG))로 충전하였다. 필요량의 시험 스트립을 족집게를 사용하여 상기 패키지로부터 제거하고, 각각의 경우에, 완충제가 충전된 배양 용기내에 직접 넣어 실온에서 15분 동안 락커 진탕기 상에서 배양하였다. 그 후에, 상기 액체를 상기 용기로부터 완전히 제거하였다.

2. 샘플 배양:

범용 완충제 중에서 1:51로 희석된 1.5 ㎖의 상기 환자 샘플을 시험 스트립으로 충전된 각각의 배양 용기내에 충전하고 실온(+23℃)에서 30분 동안 락커 진탕기 상에서 배양하였다.

3. 세척:

상기 액체를 각각의 용기로부터 완전히 제거하고, 각각의 경우에 사용 준비가 된 1.5 ㎖의 희석된 범용 완충제로 3 x 5분 동안 락커 진탕기 상에서 세척을 수행하였다.

4. 접합체 배양:

각각의 경우에 사용 준비가 된 1.5 ㎖의 희석된 효소 접합체(알칼리성 포스파타제-표지된 항-인간 IgG; AE 142-1030, 유로이뮨(주))를 상기 배양 용기내에 분주하고 실온(+23℃)에서 30분 동안 락커 진탕기 상에서 배양하였다.

5. 세척:

상기 액체를 상기 용기로부터 완전히 제거하였다. 단계 3을 다시 수행하였다.

6. 기질 배양:

각각의 경우에 1.5 ㎖의 기질 용액(ZW 1020-0130, 유로이뮨(주))을 상기 배양 용기내에 분주하였다. 이어서 실온(+23℃)에서 락커 진탕기 상에서 10분간 배양하였다.

7. 정지:

각각의 용기로부터 액체를 완전히 제거하고 각각의 시험 스트립을 증류수 또는 탈이온수로 3 x 1분 동안 세정하였다.

8. 평가:

상기 시험 스트립을 공기로 건조시키고 평가하였다.

혈액의 액체(liquor) 샘플의 배양:

1. 전처리:

시험할 환자 샘플의 수에 따라, 배양 용기를, 각각의 경우에 1.5 ㎖의 범용 완충제로 충전하였다. 필요량의 시험 스트립을 족집게를 사용하여 상기 패키지로부터 제거하고, 각각의 경우에, 완충제가 충전된 배양 용기내에 직접 넣었다. 실온(+23℃)에서 15분 동안 락커 진탕기 상에서 배양을 수행하였다. 그 후에, 상기 액체를 상기 용기로부터 완전히 제거하였다.

2. 샘플 배양:

1.0 ㎖의 상기 희석된 환자 샘플(액체 희석 인자 1:4, 범용 완충제 중에서 희석됨)을 시험 스트립으로 충전된 각각의 배양 용기내에 충전하였다. 이어서 실온(+23℃)에서 락커 진탕기 상에서 3시간 배양하였다.

3. 세척:

상기 액체를 각각의 용기로부터 완전히 제거하고, 각각의 경우에 사용 준비가 된 1.5 ㎖의 희석된 범용 완충제로 3 x 5분 동안 락커 진탕기 상에서 세척을 수행하였다.

4. 접합체 배양:

각각의 경우에 사용 준비가 된 1.5 ㎖의 희석된 효소 접합체(알칼리성 포스파타제-표지된 항-인간 IgG)를 상기 배양 용기내에 분주하였다. 실온(+23℃)에서 1시간 동안 락커 진탕기 상에서 배양을 수행하였다.

5. 세척:

상기 액체를 상기 용기로부터 완전히 제거하고 세척을 상기와 같이 수행하였다.

6. 기질 배양:

각각의 경우에 1.5 ㎖의 기질 용액을 상기 배양 용기내에 분주하였다. 실온(+23℃)에서 락커 진탕기 상에서 20분 동안 배양을 수행하였다.

7. 정지:

각각의 용기로부터 액체를 완전히 제거하고 각각의 시험 스트립을 증류수 또는 탈이온수로 3 x 1분 동안 세정하였다.

8. 평가:

상기 시험 스트립을 공기로 건조시키고 평가하였다.

도 2는 배양 후 예시적인 스트립을 도시한다.

평가:

유로라인스캔(EUROLINEScan) 소프트웨어(유로임뮨 메디지니쉐 라보디아그노스티카 아게(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG), 독일 뤼벡 소재)를 사용하여 측정된 강도를 하기 서술된 기준을 고려하여 경력 직원이 평가하였다. 양성 결과를 위해서, 각각의 경우에 특정한 항원 코팅(2개의 코팅된 희석액 중 하나는 덜 농축됨)은 컷-오프 위에서 반응해야 했다.

유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 a의 경우, 상기 컷-오프는 하기와 같이 정의되었다. 숫자는 상기 유로라인-스캔에서 측정된 밴드 강도에 상응한다:

BoDV-1 항원: 0-23 = 음성; 24-30 = 경계선; >30 = 양성

VSBV 항원: 0-13 = 음성; 14-20 = 경계선; >20 = 양성

유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 b의 경우, 컷-오프는 하기와 같이 정의되었다:

모든 항원: 0-13 = 음성; 14-20 = 경계선; >20 = 양성

1.3. 다양한 샘플 그룹을 사용한 결과:

NMDA-R-IFT-사전특성화된 환자 혈청:

변연계 뇌염의 증상을 앓고 있는 환자로부터의 익명의 혈청 샘플을 시험하였다.

종합하면, 배양을 첫 번째 실험에서 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 a상에서 n=60 샘플로 수행하고, 두 번째 연구에서 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 b상에서 추가로 n=49 샘플로 수행하였으며, 이들은 상기 요건을 충족시킨다. 상기 샘플을 면역형광(제품 FA 112d-1003-51, 유로이뮨 메디지니쉐 라보디아그노스티카 아게)에 의해 NMDA 수용체에 대한 자가항체의 존재에 대해 검사하였다. 그 후에, 상기를 1.1하에서 준비된 바와 같이, 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 상에서 시험하였다.

면역형광 검사의 경우에, 총 n=109 샘플로부터 n=7 샘플이 상기 항-NMDA-R IFT에서 양성으로 반응하였다. 따라서 이들 환자의 경우, 뇌염은 상기 NMDA 수용체에 대한 자가항체에 기인할 수 있다. 상기 n=7 NMDA-R-IFT-양성 혈청 중 어느 것도 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 상에서 양성으로 반응하지 않았다.

샘플이 상기 항-NMDA-R IFT에서 음성으로 반응한 나머지 n=102 환자의 경우, 질병의 원인은 해결되지 않은 채로 남아있다. 상기 그룹에 대해서, 특히 보르나바이러스 감염이 가능한 원인으로서 예상할 수 있다.

상기 n=102 샘플로부터, 총 n=14 샘플(이들 중, 첫 번째 실험에서 n=7 및 두 번째 실험에서 n=7)이 적어도 하나의 보르나바이러스 항원과 양성으로 반응하였다. 이는 보르나바이러스 감염에 의해 야기될 수도 있는 뇌염의 13.73%에 상응한다.

다발성 경화증 환자로부터의 혈청

파종성 뇌염의 경우에, 정확한 원인이 또한 여전히 불명확하다. 그러나, 상기 뇌염은 변연계 뇌염보다는 CNS의 상이한 영역을 침범하며 대조군으로서의 역할을 한다. 시험되는 것은 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 b상에서 n=36 샘플이었으며, 이 중 n=1 혈청은 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일과 양성으로 반응하였다.

양성 대조군:

양성 대조군으로서, 하기의 샘플들을 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 a상에서 사용하였다:

n=1 항-VSBV-양성 혈액(liquor)

n=1 정신병 환자로부터의 혈청

n=2 혈청학적으로 특성화된 BoDV-1-양성 혈청

하기의 양성 대조군들을 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 b상에서 배양하였다:

n=4 다클론성 토끼 혈청(VSBV-N에 대한 하나, VSBV-P에 대한 하나, BoDV-1-N에 대한 하나, BoDV-1-P에 대한 하나, 이들은 실시예 섹션의 1.1 섹션에 서술된 서열들을 갖는 VSBV-N 단백질, VSBV-N 펩티드, BoDV-1-N 단백질, BoDV-1-P 단백질 및 VSBV-P 단백질을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 토끼의 면역화에 의해 제조되었다)

이들 총 n=8 혈청으로부터, 모두가 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 상의 적어도 하나의 항원과 양성으로 반응하였으며; 상기 다클론성 항체들은 각각의 경우에 상응하는 코팅된 항원을 인식하였다.

음성 대조군:

변연계 뇌염으로 의심되는 환자로부터 기원하지 않는 혈액 샘플을 사용하였다. 상기 혈액 샘플 중 어느 것도 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일과 양성으로 반응하지 않았으며, 이는 상기 배양 조건하에서 상기 시험 스트립의 특이적을 나타낸다.

상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 a에 대한 결과를 도 3에 묘사하고, 상기 유로라인 항-보르나바이러스 프로파일 b에 대한 결과는 도 4에 묘사한다. 이들은 NMDAR-수용체 뇌염 및 관련된 PNS 또는 관련된 암 유형을 앓고 있는 환자는 BoDV-1 또는 VSBV-1에 대한 항체를 갖지 않았음을 예시한다.

실시예 2: 이식후 합병증을 갖는 환자로부터의 샘플에서 보르나바이러스에 대한 항체의 검출

환자:

환자 1은 임상적으로 정상적인 제공자로부터 장기 기증을 받았다. 상기 이식후, 상기 수용자는 뇌염에 이르는 신경학적 합병증을 나타내었다.

음성 대조군으로서, 건강한 혈액 제공자로부터 264개의 혈액 샘플을 시험하였다.

항체 검출:

상기 환자로부터의 혈청 샘플을 유로이뮨 메디지니쉐 라보디아그노스티카 아게로부터의 항-치쿤구니야 바이러스 IIFT(주문 번호 FI 293a-1005 G)를 사용하여 검사하였으며, 이때 차이는 상기 사용된 항원이 상기 언급된 시험에 사용된 것(CHIKV-감염된 Vero 세포)이 아니고, (문헌 [Hoffmann et al. (2015) A variegated squirrel bornavirus associated with fatal human encephalitis, N Engl J Med 2015; 373, pages 154-162], 및 관련 보충 부록(19 페이지)에 기재된 바와 같은) BoDV-1-감염된 세포주 CRFK 227이라는 것이었다. 상기 제조사로부터의 설명서의 프로토콜에 따랐다.

이식후 72일째부터 정기적으로 수집한 샘플을 BoDV-1-P, BoDV-1-N, VSBV-P 및 VSBV-N에 대한 항체의 존재에 대해 시험하였다. 상기는 실시예 1에 기재된 블럿을 사용하고 상기 실시예에서와 같은 검출을 수행함을 수반하였다.

결과:

환자 1로부터 연속되는 샘플 중 일부를 간접 면역형광 시험을 사용하여 검사하였다. 상기 샘플들은 모두 양성 반응성을 나타내었다, 즉 상기 보르나바이러스-감염된 세포에서 특이적인 형광 패턴을 식별하는 것이 가능하였다. 이는 도 5의 예에 의해 묘사된다. 감염된 세포의 세포 핵에서, 상기 바이러스 항원을 함유하는 개별적인 과립 내지 다수의 과립의 형광이 존재한다. 이는 상기 환자 샘플 중 보르나바이러스-특이적 항체의 존재를 입증한다.

상기 라인 블럿에서 혈액 샘플의 시험은 이식후 72일째에도 여전히 검출 가능한 항체가 존재하지 않음을 보였다(도 6). 84일째부터, BoDV-1-P에 대한 항체의 검출이 가능하였으며, 382일째부터, VSBV-N에 대한 항체의 검출이 또한 가능하였다. 상기 혈액 제공자의 98.5%가 IIFT에 따라 음성이었다.

결론

따라서, 상기 장기 제공자는 임상적으로 명백한 감염의 발생 없이 BoDV-1으로 잠복 감염되었다는 결론을 내릴 수 있다. 상기 이식은 추정상 면역억제성 치료로 인해, 상기 장기 수용자에서 감염의 발생을 야기하였다.

실시예 3: VSBV-1에 의한 감염으로 인한 변연계 뇌염

방법

사례 연구

2013년 7월에, 슐레스비히 홀스타인 출신의 45세된 사육사는 발열, 발성장애, 기침, 인두염, 현기증 및 눈밑 감각이상을 나타내었다. 이들 증상에 이어서 운동실조, 혼수상태 및 뇌하수체 부전이 있었다. 상기 환자는 어떠한 전력도 없었다. CSF의 분석은 림프구성 밸혈구증가증을 보였다. 말초 혈액 중 염증 매개변수가 상대적인 호중구증가증 및 림프구감소증과 함께 상승하였다. 머리의 초기 MRI 검사는 정상적인 결과를 보였다. 3주후 추적 MRI 검사는 기저핵 및 상부 척수에서 양측 변연계 분포(중앙 측두엽, 전두 대상다발, 뇌섬엽, 해마, 시상하부, 뇌실주위 시개)를 갖는 병변을 보였다. 형태학적으로, 변연계 뇌염은 1주일 이내에 진행된 것으로 진단되었다. 중추신경계의 감염 및 자가면역 질병에 대한 광범위한 실험 시험은 정상적인 결과를 보였다. 근원하는 신생물은 발견되지 않았다. 반복된 뇌파도는 일반적인 느린 활동성 및 비경련성 간질 발작을 보였다. 현미경검사, 배양 또는 PCR은 어떠한 신경향성 세균, 진균, 기생충 또는 바이러스도 보이지 않았다. 면역조직화학에 의해, 크로이츠펠트-야콥병을 제외시킬 수 있었다. 양측성 폐렴 때문에, 상기 환자는 인공 호흡을 필요로 했으며, 광범위 항-감염 요법(아시클로버 포함), 항경련제, 및 상기 질병의 나중 과정에서 스테로이드로 치료되었다. 상기 증상 개시후 3개월 이내에, 상기 환자는 최종적으로 그 당시 미확인된 병인의 뇌척수염으로 사망하였다.

PCR

보관 중인 동결된 CSF 및 포르말린-고정, 파라핀-포매된 뇌 조직, 심근, 폐 조직, 신장 조직, 간 조직, 비장 조직, 췌장 조직, 골수 및 장 조직을 상기 분석을 위해 제공하였다. VSBV-1-특이적 실시간 RT-PCR을 문헌 [Hoffmann et al.(2015)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

면역조직화학

VSBV-1 및 BoDV-1의 N 및 P 단백질에 대한 다클론성 항혈청을 각각의 재조합 항원으로 면역된 토끼로부터 획득하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피(데이비스 바이오테크놀로지(Davis Biotechnologie), 독일 레겐스부르크 소재)에 의해 정제하였다. 상기 토끼 항혈청 및 사전-면역 혈청의 반응성을 면역형광 항체 시험(immunofluorescence antibody test, IFAT)에 의해, 실시예 1에 기재된 보르나바이러스 면역블럿의 도움으로 시험하였다. 10개의 관련되지 않은 인간 뇌-조직 샘플을 음성 대조군으로서 사용하였다. 프로테이나제 K에 의한 전처리 및 내인성 페록시다제의 차단 후에, 상기 환자로부터의 FFPE 섹션을 항혈청(PBS 중 1:1000 내지 1:5000, 실온에서 하룻밤 동안)과 함께 배양하였다. 그 후에, 상기를 염소 항-토끼 비오틴화된 중합체 항체, 스트렙트아비딘-양고추냉이 페록시다제 복합체 및 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC) 기질(DCS, 독일 함부르크 소재)과 함께 배양하였다.

혈청학적 시험

혈청 및 CSF 중의 보르나바이러스-특이적 IgG 항체의 검출을 위해서, BoDV-1로 안정하게 감염된 세포주를 표준적인 간접 면역형광 시험(IFAT)(Hoffmann et al., 2015)에 사용하였으며; 또한, ELISA 및 면역블럿을 전개하였다.

VSBV-1 IgG ELISA를 위해서, VSBV-1 N 및 P 단백질의 서열을 클로닝하고 이 콜라이 균주 BL21 GOLD(DE3)(노바겐 메르크(Novagen-Merck), 독일 다름스타트 소재) 중에서 말토스-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)과의 융합 단백질의 형태로 발현시켰다. 상기 단백질을 아밀로스 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고 용출시켰다. 상기 N-말단 MBP-태그를 3C 프로테아제에 의해 4℃에서 하룻밤새 절단하였다. 상기 프로테아제의 제거 후에, 상기 단백질 샘플을 젤-여과 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200, 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich), 독일 뮌헨 소재)에 의해 추가로 정제하였다. 미세적정 플레이트(폴리솝(Polysorp), 눈크(Nunc), 덴마크 로스클리데 소재)를 2 ㎍/㎖ VSBV-1 N 또는 P 단백질로 4℃에서 하룻밤새 코팅하였다. 6% BSA로 차단한 후에, 1% BSA 희석 용액 중에서 희석된 인간 혈청을 가하였다. 37℃에서 2-시간 배양 후에, 100 ㎕의 항-인간 IgG(다코 사이토메이션(Dako Cytomation), 독일 함부르크 소재, 1:6000 희석됨)를 가하고, 상기 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 실온에서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 함께 5분간 배양한 후에, 상기 반응을 중지시켰다. 마지막으로, 광학 밀도(optical density, OD)를 450 ㎚(참조: 620 ㎚)에서 측정하였다. 각 혈청 샘플에 대한 최종 OD 값을 VSBV-1 N 또는 P 단백질을 함유하는 웰과 MBP를 함유하는 웰 간의 차이로서 측정하였다. 1:400의 혈청 희석에 대한 최종 OD 값은, 평균 OD가 평균 OD + 200명의 건강한 혈액 제공자들로부터의 대조용 샘플에 대해 획득된 표준 편차의 3배를 초과하는 경우의 양성으로 간주하였다.

상기 보르나바이러스 IgG 면역블럿을 위해서, 실시예 1에서 제조된 스트립을 사용하였다. 상기를 실온에서 혈청(30분, 1:51) 또는 CSF(3시간, 1:4)와 배양한 다음 알칼리성 포스파타제 접합체(30분 또는 1시간, 각각의 경우에 1:10), 및 기질로서 니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(10 또는 20분)와 함께 배양하였다. 상기 검출된 항체의 강도를 유로라인스캔 소프트웨어(유로이뮨(주), 독일 뤼벡 소재)를 사용하여 자동으로 평가하였다. 확인을 위해서, 150명의 건강한 혈액 제공자로부터의 샘플을 시험하였다.

결과

뇌염 환자로부터의 샘플에 대한 혈청학

보르나바이러스-특이적 IgG 항체가 면역형광(IgG 종점 역가 1:2560) 및 ELISA에 의해 핵 패턴의 형태로, 상기 환자의 CSF 중에서 고농도로 검출되었다. 강한 IgG 반응성이 VSBV-1 N 폴리펩티드에 대한 면역블럿 상에서, VSBV-1-P 및 BoDV-1-P 항원에 대해 보다 적은 정도로 나타났다(표 1).

[표 1] 뇌염 환자 및 사육사에 대한 혈청학적 시험 결과

BoDV-1, 보르나 질병 바이러스; CSF, 혈액(liquor); ELISA, 효소-결합 면역형광 분석; IFAT, 면역형광 항체 시험; VSBV-1, 오색청솔모 보르나바이러스 1; N/A, 측정할 수 없음; +, 매우 양성; (+), 약간 양성; o, 면역블럿 반응 없음.

^*결과를 유로라인스캔 소프트웨어를 사용하여 농도측정에 의해 획득하였으며 이를 반정량적인 범주로 옮겼다(음성, o: 0-13; 약간 양성, (+): 14-20; 양성, +: 21-255).

§1:400의 혈청 희석에 대한 최종 OD값은, 평균 OD가 평균 OD + 음성 대조용 샘플에 대해 획득된 표준 편차의 3배를 초과하는 경우의 양성으로 간주하였다.

#IgG 종점 역가는 양성 면역형광 신호를 생성시키는 최고 분석물 희석의 역으로서 정의된다.

사육사의 혈청학적 시험

모두 14명의 사육사로부터의 혈청을 ELISA-, 면역형광- 및 면역블럿-시험을 수행했다. 6명의 사육사는 오색청솔모와 정기적으로 접촉시켰고, 이들 중 5명은 가끔 접촉시켰다. 나머지 개인은 단지 드물게 접촉시켰다. 상기 면역블럿으로부터 판단시, 상기 14명의 혈청 중 6개는 VSBV-1-N에 대해, 4개는 BoDV-1-N에 대해 양성으로 또는 약간 양성으로 반응하였으나, 상응하는 P 항원에 대해서는 어느 것도 반응하지 않았다. 상기 면역형광 시험은 2가지 사례에서 낮은 역가를 나타낸 반면, ELISA 결과는 음성이었다. 상기 혈청학적 반응성은 상기 보고된 청솔모와의 접촉 강도와 상관이 없었다. 상기 면역블럿에 따르면, 상기 혈액 제공자의 13.5%, 4.5%, 1.5% 및 6%는 각각 VSBV-1-N, BoDV-1-N, VSBV-1-P 및 BoDV-1-P 항원과 양성으로 또는 약간 양성으로 반응하였다. 상기 혈액 제공자 중 한 명은 하나 이상의 보르나바이러스 항원과 반응하였다.

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Ser Ser Phe Lys Arg Arg Arg Ser 885 890 895 Ser Lys Asp Thr Ser Thr Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Gln Asn Gln 900 905 910 Lys Asp Thr Val Leu Pro Arg Arg Ala Ile Glu Arg Glu Glu Gly Gln 915 920 925 Leu Gln Leu Cys Ser Arg His Arg Glu Ser 930 935

Claims (21)

1. 인간으로부터 채취한 샘플에서 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 변연계 뇌염을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 검출은 샘플에서 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 보르나바이러스-특이적 폴리펩티드에 대한 항체를 검출함으로써 달성하는, 방법.
2. 인간으로부터 채취한 샘플에서 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 이식후 신경학적 합병증을 예견하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 검출은 샘플에서 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 보르나바이러스-특이적 폴리펩티드에 대한 항체를 검출함으로써 달성하는, 방법.
3. 인간으로부터 채취한 샘플에서 보르나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 자가면역 뇌염과 감염에 의해 야기된 뇌염을 구별하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 검출은 샘플에서 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 보르나바이러스-특이적 폴리펩티드에 대한 항체를 검출함으로써 달성하는, 방법.
4. 삭제
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 BoDV-1-N, BoDV-1-P, BoDV-1-X, VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 담체와 접촉시키는, 정보를 제공하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 포획된 항체를 효소 활성, 형광 또는 화학발광에 의해 검출하는, 정보를 제공하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 담체는 웨스턴 블럿 또는 라인 블럿, 하나 또는 하나 이상의 비드, 면역형광을 위해 배열된 바이오칩, 및 ELISA 미세적정 플레이트를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 정보를 제공하는 방법.
8. 제 5 항에 있어서, 상기 담체는 단순포진 HSV-1, 단순포진 HSV-2, 인간 헤르페스바이러스 HHV-6, 인간 헤르페스바이러스 HHV-7, 광견병 바이러스, LCMV, 웨스트나일 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 토스카나 바이러스, 수두 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스, 말 뇌염바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 라크로스 바이러스, 리프트 밸리열 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, A형 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 장내 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 파와산 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스 및 일본 뇌염바이러스를 포함하는 그룹으로부터의 적어도 하나의 바이러스에 대한 항체의 포획 수단을 추가로 포함하는, 정보를 제공하는 방법.
9. 제 5 항에 있어서, 상기 담체는 NMDAR, AMPAR, GAD65, 암피피신, GABA(A), GABA(B), DPPX, LgI1, CASPR2, IGLON5, SNARE, NBC1, 플로틸린 및 ITPR을 포함하는 그룹으로부터의 신경학적 항원에 대한 항체의 포획 수단을 추가로 포함하는, 정보를 제공하는 방법.
10. BoDV-1-N, BoDV-1-P 및 BoDV-1-X 를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 항체의 포획 수단 및 VSBV-N, VSBV-P 및 VSBV-X를 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 담체로, NMDAR, AMPAR, GAD65, 암피피신, GABA(A), GABA(B), DPPX, LgI1, CASPR2, IGLON5, SNARE, NBC1, 플로틸린 및 ITPR을 포함하는 그룹으로부터의 신경학적 항원에 대한 항체의 포획 수단을 추가로 포함하는 담체.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 담체는 단순포진 HSV-1, 단순포진 HSV-2, 인간 헤르페스바이러스 HHV-6, 인간 헤르페스바이러스 HHV-7, 광견병 바이러스, LCMV, 웨스트나일 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 토스카나 바이러스, 수두 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스, 말 뇌염바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 라크로스 바이러스, 리프트 밸리열 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, A형 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 장내 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 파와산 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스 및 일본 뇌염바이러스를 포함하는 그룹으로부터의 적어도 하나의 바이러스에 대한 항체의 포획 수단을 추가로 포함하는 담체.
12. 자가면역 뇌염과 변연계 뇌염 간의 구별을 위하여, NMDAR에 대한 항체의 포획 수단을 포함하는 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 담체를 사용하는 보르나바이러스 검출 방법.
13. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 뇌염의 진단, 이식 후 합병증의 예후, 뇌염 또는 이식 후 합병증의 치료법의 모니터링 또는 자가면역 뇌염과 감염에 의해 야기된 뇌염 간의 구별을 위한 담체.
14. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 담체는 NMDAR 에 대한 항체의 포획 수단을 포함하고, 자가면역 뇌염과 변연계 뇌염 간의 구별을 위한 담체.
15. 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 담체 및 또한 포획된 항체의 검출을 위한 수단 또는 샘플의 존재의 검출에 대한 대조군을 포함하는 키트.
16. 제 13 항에 따른 담체를 포함하는 키트.
17. 제 14 항에 따른 담체를 포함하는 키트.
18. 변연계 뇌염의 차별적인 진단을 위한, BoDV-1-N, BoDV-1-P, VSBV-N, VSBV-P, NMDAR, AMPAR, GAD65, 암피피신, GABA(A), GABA(B), DPPX, LgI1, CASPR2, IGLON5, SNARE, NBC1, 플로틸린 및 ITPR 또는 이들의 변이체를 포함하는 그룹으로부터의 둘 이상의 항원 폴리펩티드를 포함하는 키트.
19. 제 6 항에 있어서, 상기 담체는 웨스턴 블럿 또는 라인 블럿, 하나 또는 하나 이상의 비드, 면역형광을 위해 배열된 바이오칩, 및 ELISA 미세적정 플레이트를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 정보를 제공하는 방법.
20. NMDAR 에 대한 항체의 포획 수단을 포함하고, 자가면역 뇌염과 감염에 의해 야기된 뇌염을 구별하기 위한 담체.
21. 제 20 항에 있어서, 감염에 의해 야기된 뇌염이 변연계 뇌염인 담체.

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