KR20180094487A

KR20180094487A - 땅콩 알레르기 진단을 위한 개선된 분석방법

Info

Publication number: KR20180094487A
Application number: KR1020180017527A
Authority: KR
Inventors: 수에르 발트라우드; 로베르 스테파니; 브릭스 베티나; 바이만 알프
Original assignee: 유로이뮨 메디지니쉐 라보디아그노스티카 아게
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2018-08-23
Also published as: US10871493B2; CA2992044A1; CA2992044C; AU2017279647B2; US20180231567A1; EP3364193A1; ES2788389T3; JP2018132525A; LT3364193T; HK1263291A1; AU2017279647A1; SI3364193T1; WO2018149927A1; KR102228185B1; HRP20200585T1; CN108427001A; PL3364193T3; JP6940427B2; CN108427001B; CN113777325A

Abstract

본 발명은 대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하는 진단학적으로 유용한 담체; 대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법; 및 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

땅콩 알레르기 진단을 위한 개선된 분석방법{An improved assay for the diagnosis of peanut allergy}

본 발명은 대상자의 샘플내 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하는 진단학적으로 유용한 담체; 대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체의 존재나 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법, 및 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.

식품 알레르기 중에서, 땅콩 (Arachis hypogea)과 관련되는 알레르기는 비교적 흔하고 대체로 영구적이며 심각한 경우가 종종 있기 때문에, 연구 대상으로 큰 관심을 끌고 있다. 미국의 식품 과민증 치사율 등록에 따르면, 땅콩이 63명의 사망자 중 59%의 트리거임을 시사하고, 청소년 및 성년 초반의 사람들이 가장 큰 위험에 처해 있으며, 천식 및 과민 상태에서의 에피네프린 주사 지연도 추가적인 위험 인자임을 가리키고 있다. 땅콩은 도처에 있는 흔한 식품이며, 소량에도 자주 반응하는 이같은 영향을 받는 환자는 섭취를 피하기 위한 수많은 장애물에 직면하게 되고, 삶의 질 측면에서 부정적인 결과를 경험한다.

땅콩 알레르기는 주로 2가지 상황에서 의심이 된다: 환자가 심각한 알레르기 반응을 보이거나, 다른 식품 또는 공기중 알레르기 유발 물질에 대한 알레르기 반응이 관측되는 경우이다. 양성 피부 단자검사 (skin prick-test, SPT), 또는 현재 임상 질환에 대해 진단 신뢰도가 충분치 않은 땅콩-특이적 IgE 분석에서 땅콩 민감성이 발견되면, 환자는 이중 맹검 위약대조 식품유발시험 (double-blind placebo-controlled food challenge, DBPCFC)에 기초한 진단을 제공하는 전문 센터에 보내진다. 이 절차가 식품 알레르기 진단을 위해서는 최적의 표준이지만, 이를 적용하기 위해선 입원을 필요로 하며 비용이 많이 든다. 또한, 숙련된 의사의 통제하에서도 땅콩 DBPCFC는 심각하거나 생명을 위협하는 반응을 일으킬 수도 있다.

따라서, 땅콩 알레르기를 앓는 의심 대상자로부터의 샘플에서 특이적 항체의 검출에 기초한 땅콩 알레르기 진단을 위한 개선된 분석방법에 대해 많은 관심을 보이고 있다.

종래 최신기술에 기재된 분석법은 예컨대 천연이나 재조합 알레르겐 (알레르기 유발원) (Flinterman, A. E., van Hoffen, E., den Hartog, Jager C. F., Koppelman, S., Pasmans, S. G., Hoekstra, M. O., Bruijnzeel-Koomen, C. A., Knulst, A. C., Knol, E. F. (2007))을 이용하여 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 및 Ara h 6 등의 주요 땅콩 알레르겐을 검출하는 것에 의존하며: 땅콩 알레르기가 있는 아동은 대부분 시간이 경과해도 여전히 안정된 상태로 남아있는 Ara h 2 및 Ara h 6 (Clin Exp Allergy 2007;37; 1221-1228; de Leon, M. P., Drew, A. C., Glaspole, I. N., Suphioglu, C., O'Hehir, R. E., Rolland, J. M. (2007): 및 주요 땅콩 알레르겐 Ara h 2 과 나무 견과류 알레르겐 간의 IgE 교차반응성 (Mol Immunol 2007; 44: 463-471)을 인지한다.

Ara h 2 및 Ara h 6은 콘글루틴형 2S 저장 단백질로서 프롤라민 상과(superfamily)에 속한다. 이 패밀리의 일원들은 3개 또는 4개의 분자내 이황화물 결합을 형성하는 약 100개의 아미노산 잔기로 된 서열내에 위치하는 6개 또는 8개의 시스테인 잔기로 된 보존 패턴이 존재하는 것을 특징으로 한다. 이들은 열처리 및 단백질 가수분해에 대해 안정적이다.

Ara h 2는 땅콩의 주요 알레르겐으로 상이한 분자량(molecular weights, MWs)을 갖는 2종의 동형체로 발생되며, 이는 MW 1,414 Da의 12-아미노산 삽입체에서 기인한다. 1차 단백질 서열에서, Ara h 6은 Ara h 2와 53%의 동일성을 나타내고, Ara h 2와 비교시 8개가 아닌 10개의 시스테인을 갖는 반면, N-글리코실화 부위는 갖고 있지 않다. Ara h 2와 마찬가지로, Ara h 6은 소화에 저항성이 있으며, 가열 특히 베이킹 공정에서 안정적이다. Ara h 6의 3차 구조는 밝혀져 있으며, 4개 이상의 α-나선 구조와 이황화물 결합의 위치 파라미터가 동정되었다. 생리학적 조건하의 소화 실험에서, Ara h 2 및 Ara h 6은 환원 조건하에서도 안정된 절편을 형성한다. 이는 Ara h 2와 Ara h 6 간의 교차 반응성이 IgE 반응성 형태 에피토프에 영향을 받는다는 발상을 뒷받침한다 (Schmidt, H., Krause, S., Gelhaus, C., Petersen, A., Janssen, O., and Becker, W. M. (2010): Detection and structural characterization of natural Ara h 7, the third peanut allergen of the 2S albumin family, J Proteome Res 2010; 9: 3701- 709.).

Ara h 7은 또 다른 땅콩 알레르겐으로서, 그의 동형 Ara h 7.0101이 파지(phage) 디스플레이 시스템에 의해 최초로 동정 및 클론화되었다. 그러나 초기에는 천연 대응체(counterpart)가 땅콩 추출물에서 발견되지 않았으며, 이는 종래 최신기술에서 알레르기에 대한 상기 물질의 영향이 낮다고 기재된 이유 중 하나이다.

Schmidt 등은 (2008, Detection and Structural Characterization of Natural Ara h 7, the Third Peanut Allgergen of the 2S Albumin Family), 또 다른 동형체가 존재하는 것을 발견하였으며 (Ara h 7.0201), 7.0101에 추가하여, Ara h 7.0도 데이터베이스 UNIPROT에 발표된 또 다른 동형체이다. 그러나 Schmidt 등은 진단 응용분야에 대해서는 언급하지 않았으며, 여기에는 순수한 단백질체 연구가 있다.

또한, Ara h 7.0101 반응성에 따라 사전 선택한 것으로서, Schmidt 등에서 사용한 6명의 환자 혈청 중 5개만이 Ara h 7.0201에 대한 양성 IgE 결합을 나타냈으며, 이는 후자가 사실상 반응성이 낮고 (!), 심지어 Ara h 7.0101보다도 낮은 진단값을 갖는 것을 시사한다. 그러므로, Ara h 7.0201는 본 발명자가 인지하는 바와 같이 현재까지 정규 진단법에 이용된 적이 없다.

또한, 다수의 연구에서 정제된 땅콩 단백질 (Ara h 1-3, Ara　h 6)을 이용하여 소정 범위의 면역학적 파라미터를 평가하고, 임상적 중증도와 저농도 Ara h 2 및 6, 그리고 고농도 Ara h 1 및 3의 인지 간의 상관관계를 발견하였으며, 이는 Ara h 2의 명백히 증가된 효능을 나타낸다 (Peeters, K. A., Koppelman, S. J., van Hoffen, E., van der Tas, C. W., den Hartog, Jager C. F., Penninks, A. H., Hefle, S. L., Bruijnzeel-Koomen, C. A., Knol, E. F., and Knulst, A. C. (2007): Does skin prick test reactivity to purified allergens correlate with clinical severity of peanut allergy? (Clin Exp Allergy. 2007 Jan; 37(1):108-15.).

땅콩 알레르겐 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 6 및 Ara h 7에 대한 IgE 항체 반응성은 재조합 알레르겐을 함께 이용하여 땅콩-알레르기 환자를 대상으로 연구 조사했다. Codreanu 등은 2개의 땅콩-알레르기 환자 집단에서 땅콩 알레르기의 진단시에 단백질의 역할을 평가했다. 특이적 IgE의 측정은 ImmunoCAP 테스트를 수반한 UniCAP 플랫폼을 이용하여 수행했다. 보고에 따르면, Ara h 2는 땅콩-알레르기 환자가 가장 흔히 민감해지는 알레르겐으로서, 77 내지100% 의 케이스에 검출가능한 IgE 항체가 존재하며, Ara h 6가 그 뒤를 따른다 (38 내지 80% 케이스). 이와 대조적으로, 이들의 데이터는 Ara h 7에 대한 단일민감성 환자는 없음을 시사한다 (Codreanu, F., Collignon, O., Roitel, O., Thouvenot, B., Sauvage, C., Vilain, A. C., Cousin, M. O., Decoster, A., Renaudin, JM., Astier, C., Monnez, JM., Vallois, P., Morisset, M., Moneret-Vautrin, D. A., Brulliard, M., Ogier, V., Castelain, M. C., Kanny, G., Bihain, B. E., and Jacquenet, S. (2011): A novel immunoassay using recombinant allergens simplifies peanut allergy diagnosis (Int Arch Allergy Immunol, 2011;154(3):216-26.). Ara h 7에 대한 단일민감성 환자가 없다는 이러한 발견은 정규 진단을 위한 동형체 Ara h 7를 사용하지 않는 또 다른 이유가 되었으며, 이는 상기 물질이 땅콩-알레르기 환자를 동정하는 진단 테스트의 민감도를 증가시키지 않는 것으로 믿었기 때문이다.

현재, 땅콩 알레르기가 있는 다수의 환자들은 종래의 테스트 결과에 기초한 알레르기 진단을 받을 수 없다. 땅콩 알레르기에 연관된 증상의 심각성을 고려할 필요가 없고, 최대 민감도를 갖는 진단법에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 땅콩 알레르겐에 대한 항체의 검출에 기초한 진단 분석법의 종래 최신기술과 관련된 단점을 극복하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 과제는, 종래의 분석 시스템을 이용해서는 진단되지 않거나 오진하게 되는 환자의 알레르기를 진단할 수 있는 신규한 항원, 신규한 분석법, 신규한 시약 및 신규한 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 과제는 견과류 알레르기, 바람직하게는 땅콩 알레르기가 있는 환자에게서 IgE 항체를 검출하기 위한 개선된 항원을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 과제는 견과류 알레르기, 바람직하게는 땅콩 알레르기 진단을 위한 대안적인 방법과 대안적인 시약을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 과제는, 공지의 견과류 알레르기, 바람직하게는 땅콩 알레르기의 진단 방법 및 시약과 조합하여 사용시, 전체적인 진단 신뢰도, 특히 민감도를 증가시키는 방법 및 시약을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 과제는 자원, 특히 시간 및 사용한 항원의 수를 최소한으로 투자하면서도 견과류 알레르기, 바람직하게는 땅콩 알레르기의 진단을 가능하게 하고, 전체적인 진단 신뢰도, 특히 민감도를 최대화할 수 있는 방법 및 시약을 제공하는 데 있다.

상술한 본 발명의 해결과제는 첨부한 독립항 및 종속항에 기재된 주제에 의해 해결된다.

제 1측면에서, 본 발명의 과제는 대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하는 진단학적으로 유용한 담체에 의해 해결된다.

제 1측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 담체는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹으로부터의, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3 및 Ara h 9로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체, 가장 바람직하게는Ara h 2에 대한 항체 및/또는 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 더 포함한다.

제 1측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, 진단학적으로 유용한 담체는 비드, 테스트 스트립, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로어레이, 셀룰로오스 유래의 고형 고분자, 바람직하게는 웨스턴 블롯, 라인 블롯 및 도트 블롯으로 이루어진 그룹으로부터의 블롯, 유리면, 바이오칩 및 멤브레인으로 이루어진 그룹에서 선택되며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트나 라인 블롯이다.

제 2측면에서, 본 발명의 과제는 대상자로부터의 샘플에서 항원 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하고, 바람직하게는 하나 이상의 추가적인 항원, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹으로부터의, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3 및 Ara h 9로 이루어진 그룹으로부터의 항원에 대한 항체, 가장 바람직하게는 Ara h 2에 대한 항체 및/또는 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단과, 또한 선택적으로는 포획된 항체를 특이적으로 검출하는 수단을 더 포함하는 진단학적으로 유용한 담체를 포함하는 키트에 의해 해결된다.

제 2측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, 진단학적으로 유용한 담체는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 더 포함하고, 여기서 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단과, 또한 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단이 개별 담체에 존재한다.

제 2측면의 바람직한 구현예에서, 진단학적으로 유용한 담체는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 더 포함하며, 여기서 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단과, 또한 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단이 하나의 담체에 존재하고, 바람직하게는 하나의 담체에 공유결합 되어 있다.

제 3측면에서, 본 발명의 과제는 견과류 알레르기, 더 바람직하게는 땅콩 알레르기를 진단 또는 진단에 조력하는 방법으로, 대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는SEQ ID NO7, SEQ ID N0NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 해결된다.

제 3측면의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 대상자로부터의 샘플에서, 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹에서, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3 및 Ara h 9로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 추가적인 항원, 가장 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6에 대한 항체의 존재를 검출하는 단계를 더 포함한다.

제 3측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID N0NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체의 존재, 및 하나 이상의 추가적인 항원, 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6에 대한 항체의 존재를 동시에 검출한다.

제 3측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID N0NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체의 존재, 및 하나 이상의 추가적인 항원, 바람직하게는 Ara h 6 및/또는 Ara h 2에 대한 항체의 존재를 공간적으로 분리된 결합 반응에서 검출한다.

제 3측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체의 존재, 및 하나 이상의 추가적인 항원, 바람직하게는 Ara h 6 및/또는 Ara h 2에 대한 항원의 존재를 원 포트 반응에서 검출한다.

제 3측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 진단학적으로 유용한 본 발명에 따른 담체를 대상자로부터의 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다.

어느 측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, 대상자는 알레르기, 바람직하게는 견과류 알레르기, 더 바람직하게는 땅콩 알레르기가 있거나 의심되는 대상을 말한다.

어느 측면의 또 다른 구현예에서, Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6에 대한 항체는 Ara h 7 동형 7.0201, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID N0NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대해 단일특이적 항체이다.

제 4측면에서, 본 발명의 과제는 SEQ ID NO 8, 더 바람직하게는SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201또는 그의 변형체, 또한 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5, 및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 항원, 가장 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6을 포함하는 약제학적 조성물에 의해 해결된다.

제 5측면에서, 본 발명의 과제는 SEQ ID NO 8, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함하는 폴리펩티드에 의해 해결된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 고정화, 정제 및/또는 융합 단백질이거나, 바람직하게는 정제, 더 바람직하게는 고정화 및 정제, 가장 바람직하게는 정제, 재조합 및 고정화 처리된다.

제 6측면에서, 본 발명의 과제는 땅콩 알레르기 진단을 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드, 담체 또는 키트의 용도에 의해 해결되고, 이때 바람직하게는 민감도가 증가된다.

제 7측면에서, 본 발명의 과제는 땅콩 알레르기 진단용 키트의 제조를 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도에 의해 해결되고, 이때 바람직하게는 진단 민감도가 증가한다.

바람직하게는 SEQ ID NO 8, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함하는 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드와 함께 Ara h 2 및/또는 Ara h 6, 또는 그의 변형체를 포함하는 조성물이다.

제 8측면에서, 본 발명의 과제는 항체, 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는SEQ ID NO8에 대해 특이적으로 결합되는 IgE클래스 항체에 의해 해결되며, 이는 바람직하게는 단리되어 있는 항체이다. 상기 항체는 친화성 리간드로서 항원을 이용하는 환자 샘플로부터의 표준 프로토콜을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.

제 9측면에서, 본 발명의 과제는 땅콩 알레르기 진단 또는 땅콩 알레르기 진단용 키트의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도에 의해 해결된다.

본 발명은 Ara h 7 동형 7.0201, 더 구체적으로 그의 놀라운 면역반응성 C-말단, 특히 SEQ ID NO8을 포함한 에피토프에 대한 항체의 검출에 중점을 두고 있으며, 이는 견과류 알레르기가 의심되는 환자로부터의 샘플에서 실행하는 진단방법의 일부이다. 더 놀라운 것은 알레르기 환자의 일부는 SEQ ID NO8을 포함한 Ara h 7 동형 7.0201에 단일특이적 항체만을 갖고 있으며, 다른 Ara h 7 동형체, 더 구체적으로 7.0101 및 Ara h 7.0에는 결합되지 않아 Ara h 2 또는 Arah h 6가 단독으로 존재하게 된다.

이 점은 종래에 발표된 연구와는 상반되는 것으로서, 예를 들어, Codreanu 등은 임의의(!) Ara h 7 동형에 대한 항체의 검출이 Ara h 2 및/또는 Ara h 6의 검출 결과로 얻은 데이터에 필적하거나, 특히 이보다 낮은 값으로 진단값을 제한했음을 시사한다. 특히, 이들 연구는 임의의 Ara h 7 동형에 대한 단일특이적 항체를 갖는 환자가 없는 점을 시사한다.

본 발명은 진단학적으로 유용한 담체에 관한 것으로, 바람직하게는 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 대상자, 바람직하게는 포유동물 대상자, 더 바람직하게는 인간 대상자로부터의 체액 샘플과 접촉시키기 위한 고형 담체이며, 상기 수단은 상기 담체와 관련되어 있다. 바람직한 구현예에서, 고형 담체는, 더 바람직하게는 비드, 테스트 스트립, 마이크로타이터 플레이트, 블롯, 유리면, 바이오칩 및 멤브레인으로 이루어진 그룹에서, 더 바람직하게는 블롯, 테스트 스트립 및 멤브레인으로 이루어진 그룹에서 선택된 진단 디바이스이다. 가장 바람직한 구현예에서, 진단학적으로 유용한 담체는 마이크로타이터 플레이트나 라인 블롯이다 (Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gram-negative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65; WO2013041540). 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이 "라인 블롯"이란 용어는, 더 바람직하게는 멤브레인 기반이며 하나 이상의 항체 포획 수단, 바람직하게는 폴리펩티드로 각기 코팅되어 있는 테스트 스트립을 말한다. 2개 이상의 수단이 사용될 경우, 이들은 담체 상에서 공간적으로 분리되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게, 밴드의 폭은 테스트 스트립 폭의 30%, 더 바람직하게는 40, 50, 60, 70 또는 80%이다. 테스트 스트립은 충분히 길고 적절한 조건 하에, 특히 인간 혈청이나 항체 접합체 또는 이들 모두의 존재하에 샘플과 접촉한 상태인지 확인하기 위한 하나 이상의 대조 밴드를 포함할 수 있다. 복수의 라인 블롯이 상용화되어 있으며, 예컨대 EUROIMMUN사 제품이 있다 (Lubeck, 독일).

본 발명을 실시하기 위해 이용한 대상자로부터의 샘플은 면역글로불린으로 부르기도 하는 항체를 포함한다. 통상적으로, 샘플은 대상자의 면역글로불린 전체의 대표적인 세트(representative set)를 포함하는 체액이다. 그러나, 일단 제공된 샘플은 대상자의 면역글로불린 전체나 임의의 면역글로불린급, 바람직하게는 IgE의 분별, 원심분리, 농축 또는 단리 공정을 포함할 수 있는 추가적인 처리를 거치게 되며, 이는 다양한 등급의 면역글로불린의 상대적인 분포에 영향을 줄 수 있다. 샘플은 전혈, 혈청, 뇌척수액 및 타액으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있으며, 혈청이 바람직하다. 가장 바람직한 구현예에서, 샘플은 IgE클래스 항체를 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 샘플은 IgA, IgG 및 IgE클래스, 바람직하게는 IgG와 IgE, 더 바람직하게는 IgG1, IgG4 및 IgE 중의 대상자의 항체의 대표적인 세트를 포함하며, 이때 각종 항원 대 항체의 갯수의 비가 대상자에게서 얻은 샘플내에서의 비와 비교하여 본질적으로 다르지 않은 것이 가장 바람직하다.

진단학적으로 유용한 담체는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을, 선택적으로 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6 등의 하나 이상의 추가적인 항원과 조합하여 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용하는 바와 같이, "Ara h 7 동형 7.0201", "Ara h 2", "Ara h 6", "Ara h 1", "Ara h 3", "Ara h 5", "Ara h 8" 및 "Ara h 9" 란 용어는 데이터베이스 코드 B4XID4 (Ara h 7 동형 7.0201, 신호 펩티드가 없는 발현 서열: SEQ ID NO2) 및 Q6PSU2 (Ara h 2, 신호 펩티드가 없는 발현 서열: SEQ ID NO4), Q647G9 (Ara h 6, 신호 펩티드가 없는 발현 서열: SEQ ID NO5), P43238 (Ara h 1), O82580 (Ara h 3), Q9SQI9 (Ara h 5), B0YIU5 또는 Q6VT83 (Ara h 8의 2개의 동형체), 및 B6CG41 또는 B6CEX8 (Ara h 9의 2개의 동형체) 및 이들 각각의 변형체로 표현되는 폴리펩티드를 말한다. 바람직하게, 본원에서 사용하는 바와 같이, "Ara h 7"이란 용어는 3가지 Ara h 7 동형체 전체를 말하며, "Ara h 7.0101"이란 용어는 SEQ ID NO1의 서열을 갖는 동형체를 말하고, "Ara h 7.0"이란 용어는 SEQ ID NO3의 서열을 갖는 동형체를 말한다. 본원에 걸쳐서 언급하는 임의의 데이터베이스 코드는 본원의 우선일에 온라인으로 NCBI 데이터베이스를 통해 이용할 수 있는 폴리펩티드 서열을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 Ara h 7.0201에 결합된 샘플에서 항체가 검출되나, 이는 다른 Ara h 7 동형체, 더 구체적으로 Ara h 7.0101 및 Ara h 7.0 중 임의의 것에 대한 항체는 아니며, 따라서 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단이 상기 목적을 위해 구성되고, 바람직하게는 SEQ ID NO8 또는 그의 변형체를 포함하는 그룹으로부터 선택된 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO6, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함하는 폴리펩티드이다.

바람직하게, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체이다. 더 바람직하게, 이 항체는 3가지 Ara h 7 동형체가 공유하는 에피토프에는 결합되지 않는다.

바람직한 구현예에서, 본원에서 사용하는 바와 같이, "[항원] X에 대한 항체 및 [항원] Y에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단"이란 용어는 [항원] Y가 아닌 [항원] X단독에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단과, [항원] X가 아닌 [항원] Y단독에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 합친 것을 말한다.

예를 들어, X는 Ara h 2 이고 Y는Ara h 6일 수 있다. 이 경우, Ara h 2 및 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단은 Ara h 2에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단, 및 추가로 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하게 된다. 예를 들어, 공간적으로 서로 분리되어 있는 Ara h 2 및 Ara h 6이 코팅된 라인 블롯은 Ara h 2 및 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단이다.

본 발명에 따르면, 담체는 항체를 특이적으로 포획하는 하나 이상의 수단을 포함하며, 바람직하게는 하나 이상, 더 바람직하게는 2개 이상, 더 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 수단을 포함하고, 이들 수단 중 각각은 서로 상이한 항체를 특이적으로 포획할 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 담체는 Ara h 2, Ara h 7 동형 7.0201 및 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 검출하는 수단을 포함한다. 상기 수단은 상기 담체 상에 고정화되는 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 항체를 특이적으로 포획하는 수단은, Ara h 2, Ara h 7 동형 7.0201 및 Ara h 6으로 이루어진 그룹으로부터의 항원, 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201 등과 같이, 검출 또는 포획될 항체가 결합되어 있는 항원 또는 그의 변형체를 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진 폴리펩티드이다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체의 검출에 이용할 경우, SEQ ID NO8로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함한다. 폴리펩티드는 선형 펩티드 또는 폴드형 폴리펩티드(folded polypeptide)일 수 있으며, 후자의 경우 바람직하게는, Ara h 7 동형 7.0201과 본질적으로 동일한 폴드가 적용되는 변형체로서, 이는 CD 분광법으로 확인할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 펩티드나 폴리펩티드는 포획 또는 검출된 항체에 대한 에피토프를 적어도 7개, 바람직하게는 10개, 더 바람직하게는 15개 이상 포함한다. 상기 항원은 이것이 부착되는 불용성 담체와 함께 반응 혼합물에서 분리될 수 있으며, 이때 항원은 간단한 방식, 예컨대, 여과, 원심분리, 디캔팅(경사분리) 등에 의해 샘플과 접촉한다. 상기 항원은 가역적 또는 비가역적 방식으로 고정화될 수 있다. 예를 들어, 고농도의 염을 첨가하여 마스킹할 수 있는 이온 상호작용을 통해 분자가 담체와 상호작용하는 경우, 또는 분자가 분할성 공유결합을 통해 결합되는 경우에, 고정화화는 가역적이다. 이와 대조적으로, 수성액에서 분해되지 않는 공유결합을 통해 분자가 담체에 고정되어 있는 경우에, 고정화는 비가역적이다. 폴리펩티드는, 예를 들어 항체 또는 폴리펩티드에 대해 친화성을 갖는 다른 독립체를 고정화 처리한 다음, 폴리펩티드를 첨가하여 폴리펩티드-항체 복합체를 형성함으로써, 간접적으로 고정화될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 담체는 비드, 테스트 스트립, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로어레이, 셀룰로오스 유래의 고형 고분자, 바람직하게는 웨스턴 블롯, 라인 블롯 및 도트 블롯으로 이루어진 그룹으로부터의 블롯, 유리면, 슬라이드, 바이오칩과 멤브레인으로 이루어진 그룹에서 선택되며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트나 라인 블롯이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 담체는 비드, 테스트 스트립, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로어레이, 셀룰로오스 유래의 고형 고분자, 라인 블롯과 도트 블롯으로 이루어진 그룹에서 선택된 블롯, 유리면, 슬라이드 및 바이오칩으로 이루어진 그룹에서 선택되며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트나 라인 블롯이다.

진단학적으로 유용한 담체가 비드인 경우, 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 각각 담지하는 비드의 혼합물을 사용할 수 있다. 이 혼합물은 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8, 또는 그의 변형체에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 담지하는 하나 이상의 비드를 포함한다. 또한, 비드 혼합물은 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9 및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상, 가장 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 각각 운반하는 하나 이상의 추가적인 비드를 더 포함할 수 있다.

진단학적으로 유용한 담체가 비드인 경우, 이 비드는 대안적으로, Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8, 또는 그의 변형체에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단에 추가하여, Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5, 및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9 및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상, 가장 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6에 대한 항체일 수 있는 항체를 특이적으로 포획하는 하나 이상의 부가적인 수단을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게, 이러한 비드는 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단, Ara h 2에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단, 및 Ara h 6에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함한다.

그러나, 본 발명의 교시 내용은 에컨대 Ara h 7 동형 7.0201 같은 폴리펩티드를 경우에 따라 본원에서 구체적으로 또는 암시적으로, 예컨대, 기능, 명칭, 서열 또는 수탁번호 등을 명시한 정확한 서열을 가진 Ara h 2 및/또는 Ara h 6 등의 하나 이상의 추가적인 항원과 조합하여 사용함으로써 뿐만 아니라, 이러한 폴리펩티드의 변형체를 사용함으로써 수행할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본원에서 사용하는 바와 같이, "변형체"란 용어는 전체길이의 적어도 하나의 절편, 보다 구체적으로는, 전체길이 서열에 비해서 하나 이상의 아미노산에 의해 일단 또는 양단이 절단된 하나 이상의 아미노산이나 핵산 서열을 말할 수 있다. 이러한 절편은 최초 서열이나 그 변형체의 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150 또는 200개 이상의 연속 아미노산을 갖는 펩티드를 포함하거나 이것을 코딩한다. 변형체의 총 길이는 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 아미노산일 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예에서, "변형체"는 하나 이상의 절편 뿐만 아니라, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 포함하는 그의 절편, 바람직하게는 25개 이상, 더 바람직하게는 50개 이상, 더욱 바람직하게는 200개 이상의 연속 아미노산을 함유한 절편과도 관계가 있으며, 이 아미노산은 언급한 기준 아미노산 서열 또는 그의 절편에 대해 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상의 동일성을 갖고, 이때 생물학적 활성, 예컨대, 관심 항체에 특이적으로 결합되는 능력 또는 폴리펩티드의 폴드나 구조에 필수적인 부분 이외의 아미노산은 결실 또는 치환되고 및/또는 이러한 하나 이상의 필수적인 아미노산이 보존 방식으로 대체되거나 및/또는 아미노산들이 폴리펩티드의 생물학적 활성이 적어도 부분적으로 보존되는 방식으로 첨가 또는 결실된다. 종래 최신기술은 주어진 2개의 핵산이나 아미노산 서열을 배열하고 동일성 정도를 계산하는데 이용되는 다양한 방법을 포함하고 있으며, 예를 들어, Arthur Lesk (2008) (Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3^rd edition)을 참조한다. 바람직한 구현예에서, the Clustal W 소프트웨어 (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948)를 디폴트 설정을 적용하는데 이용한다.

바람직한 구현예에서, 변형체는 또한 화학적 변형, 예를 들어, 동위원소 표지 또는 글리코실화, 포스포릴화, 아세틸화, 디카르복실화, 시트룰린화, 히드록실화 등의 공유결합 변형을 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면 폴리펩티드 변형 방법을 숙지하고 있다. 또한, 변형체는 다른 공지의 폴리펩티드나 그의 변형체와 함께 융합 방식으로 생성할 수도 있다.

폴리펩티드 변형체는 생물학적 활성을 갖는다. 바람직한 구현예에서 이러한 생물학적 활성은 각각의 항체에 결합되는 능력이다. 예를 들어, Ara h 7 동형 7.0201의 변형체는 땅콩 알레르기가 있는 대상자에게서 얻은 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체, 바람직하게는 IgA, IgE 또는 IgG클래스 항체, 더 바람직하게는 IgE, IgG1 또는 IgG4클래스 항체에 특이적으로 결합되는 능력을 가지며, 이는 상기 항체가 결합될 에피토프를 상기 변형체가 포함하기 때문이다. 바람직하게는, 알레르기 환자로부터의 샘플에서 항체가 인지하는 에피토프를 포함하며, 이 항체는 Ara h 7 동형 7.0201, 더 바람직하게는 SEQ ID NO8을 함유한 에피토프, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8, 또한 더 바람직하게는 동형체 7.0101 또는 7.0에는 결합되지 않는다. 당해 분야의 숙련가라면 최초의 Ara h 7 동형 7.0201 서열에서 출발하여 생물학적 활성을 갖는 변형체를 고안할 수 있으며, SEQ ID NO8의 중요성을 숙지하고, 점 돌연변이, 절단 등의 변형을 도입한 다음, 땅콩 알레르기가 있는 대상자로부터의 샘플에서 변형체가 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 IgE 항체에 결합하는지 여부를 테스트하거나, 바람직하게는 실시예 1에 상세하게 기재한 바와 같이 ELISA를 이용함으로써, 상기 변형체가 여전히 생물학적 활성을 갖는 지를 확인한다.

폴리펩티드를 예컨대 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단으로 사용하는 경우, 본 발명의 교시내용을 실행하는데 이용하면, 상기 폴리펩티드는 내인성 형태로 폴리펩티드를 포함하는 조직, 산물 또는 세포로부터, 더 바람직하게는 폴리펩티드를 과잉발현하는 세포, 이러한 세포의 조(crude) 또는 농축 용해물로부터 본질적으로 순물질인 정제된 및/또는 단리된 폴리펩티드로의 어떤 형태 및 어떤 정제 순도로 제공할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드로서, 본원에서 사용한 바와 같이, "천연 폴리펩티드"란 용어는 폴드형 폴리펩티드, 더 바람직하게는 조직이나 세포로부터, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포나 조직으로부터, 선택적으로 비-재조합 조직이나 세포로부터 정제된 폴드형 폴리펩티드를 말한다. 천연 폴리펩티드를 사용하는 경우, 자연 상태와 비교하여 농축되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 폴리펩티드는 재조합 단백질일 수 있으며, 본원에서 사용한 바와 같이, "재조합체"란 용어는 제조 과정의 어느 단계에서 유전공학적 접근법에 따라 제조된 폴리펩티드를 말하는 것으로서, 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 세포나 조직내 강한 과잉발현 프로모터에 융합시키거나 또는 폴리펩티드 자체의 서열을 가공하는 방법에 의해 제조된 폴리펩티드를 말한다. 당해 분야의 숙련가라면 핵산 및 코딩된 폴리펩티드의 가공방법 (예, Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH or in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) and for producing and purifying native or recombinant polypeptides (예, Handbooks "Strategies for Protein Purification", "Antibody Purification", published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification 참조)을 숙지하고 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드로서, 여기서 "단리된"이란 용어는 생물공학적 또는 합성기술적 접근법에 따라 제조된 상태와 비교하여 농축된 것으로서, 바람직하게는 순물질 상태, 즉. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 및 코마씨 블루 염색법과 육안검사를 통해 판단시, 각 샘플내 폴리펩티드의 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% 이상이 상술한 폴리펩티드로 구성되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 항체 포획 수단으로 사용된 담체 상의 어떤 폴리펩티드도 순수하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따르면, 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 제공하는 방법이 제공되며, 이 방법은: a) Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계와, b) 상기 샘플을 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단과 접촉시키되, 항체 및 상기 수단을 포함하는 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계와; c) 상기 복합체를 단리하고, 선택적으로 항체를 복합체로부터 방출 및/또는 검출하는 단계를 포함한다.

샘플을 제공하는 본 발명에 따른 대상자는 항체, 바람직하게는IgA, IgE 또는 IgG, 더 바람직하게는 IgE, IgG1 또는 IgG4클래스 또는 이와 균등한 알레르기-관련 항체를 생성하는 유기체, 더 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 범위에는, Ara h 7 동형 7.0201 등의 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하는 진단학적으로 유용한 담체가 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이, "항체를 특이적으로 포획하는"이란 표현은, 항체가 결합되고 샘플로부터 제거되는 한편, 다른 항체들, 바람직하게는 동일 등급의 항체들은 본질적으로 결합되지 않고 샘플에 그대로 남게 되는 결과에 관심이 있는 항체에 특이적으로 결합되는 능력을 말한다.

본 발명에 따른 진단학적으로 유용한 담체는 항체, 바람직하게는 진단학적으로 유의미한 항체를 특이적으로 포획하는 하나 이상의 수단용 스캐폴드(scaffold)로서 역할을 한다. 상기 담체는 진단방법을 수행하는데 적합하다. 항체를 특이적으로 포획하는 유리된 가용성 수단이 아닌 담체를 사용함으로써, 상기 수단 및 항체를 포함하는 복합체를 샘플로부터 단리 및 분리하는 것과, 예를 들어, 상기 수단, 복합체 또는 담체에 비특이적으로 결합되는 임의의 분자를 제거하기 위한 목적으로 상기 복합체를 세적하는 것이 보다 쉽고 간단하다. 바람직한 구현예에서, 진단학적으로 유용한 담체는, 바람직하게는 비드, 테스트 스트립, 마이크로타이터 플레이트, 블롯 및 멤브레인으로 이루어진 그룹에서 선택된 진단 디바이스이며, 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트나 라인 블롯이다.

본 발명에 따르면, 포획된 항체를 특이적으로 검출하는 수단이, 선택적으로 키트의 일부로서 제공된다. 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이, "포획된 항체를 특이적으로 검출하는"이란 표현은 항체, 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201를 특이적으로 포획하는 수단에 특이적으로 결합되는 항체가 샘플 내에 존재하는 임의의 다른 항체와 달리 포획후 검출되는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이, "특이적으로 결합되는"이란 표현은 pH7의 PBS 완충액 내에서 비아코어 (Biacore) 장비를 이용하여 25℃에서 표면 플라즈마 공명에 의해 측정시 해리상수가 1 x 10^-5 M, 더 바람직하게는 1 x 10^-7 M, 더 바람직하게는 1 x 10^-8 M, 더 바람직하게는 1 x 10^-9 M, 더 바람직하게는 1 x 10^-10 M, 더 바람직하게는 1 x 10^-11 M, 더 바람직하게는 1 x 10^-12 M인 것을 특징으로 하는 결합반응보다 상기 결합이 더 강하다는 것을 의미한다.

바람직한 구현예에서, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단 및 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단은 개별 담체 상에 존재한다. 이것은 상기 수단이 단일 담체에 부착되지 않고, 손상없이 서로 분리되거나 및/또는 분리될 수 있는 하나 이상의 담체에 부착되는 것을 의미한다. 예를 들어, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단은 제 1테스트 스트립에 부착될 수 있고, 또한 Ara h 2에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단은 상기 제 1테스트 스트립과 별개인 또 다른 테스트 스트립에 부착된다.

또 다른 바람직한 구현예에서, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단 및 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단은 하나의 담체 상에 존재하며, 바람직하게는 이 담체에 공유결합되어 있다. 이것은 담체를 손상시키지 않고는 분해될 수 없는 하나의 담체 상에 상기 수단이 부착됨으로써, 상기 수단이 개별 담체 상에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 수단은 모두 1개의 테스트 스트립, 특히 라인 블롯 형태의 테스트 스트립 상에 코팅될 수 있다.

본 발명의 교시내용에 따르면 바람직하게는 알레르기 진단용, 더 바람직하게는 땅콩 알레르기 진단용 키트가 제공된다. 이러한 키트는 본 발명의 방법을 실시하는데 필요한 특수 시약을 포함하는 용기이며, 특히 본 발명에 따른 진단학적으로 유용한 담체와, 또한 선택적으로 본 발명의 방법을 실시하는데 필요한 하나 이상의 용액으로서, 바람직하게는 샘플 희석 완충액, 세척 완충액 및 2차 항체 등의 특이적으로 포획된 임의의 항체를 검출하는 수단 및 선택적으로는 상기 2차 항체 검출 수단을 함유한 완충액으로 이루어진 그룹에서 선택된 용액이나 이들 용액을 모두 포함하는 용기이다. 또한, 키트의 사용방법 및 본 발명의 폴리펩티드를 대상자, 바람직하게는 인간 대상자의 체액 샘플, 예컨대, 라인 블롯과 접촉시키는 본 발명의 진단학적으로 유용한 담체에 관한 상세 설명서도 포함되며, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 본 발명의 수단이 상기 라인 블롯에 고정화 처리되어 있다. 또한, 키트는 양성 대조군, 예를 들어 Ara h 7 동형 7.0201에 결합되는 것으로 알려진 재조합 항체 및 음성 대조군, 예를 들어 소 혈청 알부민 같이 Ara h 7 동형 7.0201에 대해 검출가능한 친화성이 없는 단백질을 더 포함할 수 있다. 마지막으로, 이러한 키트는 검정 곡선을 작성하기 위한 Ara h 7 동형 7.0201-결합 항체를 포함하는 표준용액을 더 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 디바이스, 바람직하게는Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체 및 선택적으로 Ara h 2 및/또는 Ara h 6 같은 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단으로 코팅된 라인 블롯 등의 블롯 기반 디바이스를 포함한다.

본 발명에 따르면, 하나 이상의 포획된 항체를 검출하는 수단이 필요하며 키트 안에 포함될 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면 사용가능한 다양한 방법을 숙지하고 있으며, 이들은 또한 종래 최신기술에 기재되어 있다 (예, Zane, H. D. (2001), Immunology-Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, in particular in Chapter 14.). 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 포획된 항체들의 불변부에 결합되는 2차 항체는 상응하는 1차 항체로서 이용되고, 이러한 2차 항체는 검출하기 쉬운 표지, 예를 들어, 형광, 방사성 또는 효소반응성 표지와 관련될 수 있으며, 후자의 경우 비색법, 분광법 또는 또 다른 분석방법을 이용하여 검출가능한 분자의 발생 또는 화학발광 반응에 촉매 작용을 할 수 있다. 더 바람직한 구현예에서, 2차 항체는 형광, 방사성 및 화학발광 표지로 이루어진 그룹에서 선택된 표지와 관련이 있다.

대안적으로, 생물학적 기능 분석법을IgE클래스 항체라는 조건하에 하나 이상의 포획된 항체를 검출하는 수단으로 이용할 수 있으며, 이는 바람직하게는 IgE 항체에 의한 호염기구 활성화에 기초한 분석법이다. 이러한 분석법은 종래 최신기술에 기재되어 있다 (예, Hausmann, O. V., Gentinetta, T., Bridts, C. H., and Ebo, E. G. (2009): The Basophil Activation Test in Immediate-Type Drug Allergy, Immunol. Allergy Clin. N. Am. 29, 555-566).

바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이, "진단"이란 용어는, 과거나 진단 시점 또는 미래에 환자가 일반적인 경우, 또는 바람직하게는 유사한 증상을 가진 비교 대상자보다 더 쉽게 걸리는 질병이나 장애 여부를 분석하는 방편이 될 수 있는 정보를 수득하고, 질환의 진행 양상이나 미래에 예상되는 진행 방식을 발견하거나, 또는 특정 치료, 예를 들어, 알레르기 환자의 탈민감화를 위한 약물 등 적절한 약물의 투여에 관하여 환자의 반응성을 평가하기 위한 절차를 말한다. 다시말해, "진단"이란 용어는 질병이나 장애의 과정을 진단할 뿐만 아니라, 예측 및/또는 관찰하는 것도 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이, "진단"이란 용어는, 본 발명에 따라 분석하는 샘플의 대상자가 견과류 알레르기, 바람직하게는 땅콩 알레르기를 갖는지 여부를 알 수 없음을 암시하며, 이는 예컨대 Ara h 2, Ara h 6 및 Ara h 7으로 이루어진 그룹에서 선택된 땅콩-특이적 알레르겐, 바람직하게는 Ara h 7에 대한 항체가 혈액내에 존재함으로써 입증된다.

그러므로, "진단"이란 용어는, 바람직하게는 본 발명에 따른 진단방법이나 시약이 파라미터는 차치하고 단일 테스트에 기초한 진단을 결정하기에 확실하고 충분한 것을 암시하는 것이 아니라 "감별 진단", 즉, 진단 파라미터의 범위에 기초하여 가능한 조건 범위를 고려한 전반적인 진단 절차에 일조하는 것을 언급할 수 있다. 또한 "진단"이란 용어는 환자에게 가장 유망한 치료요법을 선택하는데 이용한 방법이나 작용제를 말할 수도 있다. 다시말해, 방법이나 작용제는 대상자를 위한 치료요법을 선택하는 것과 관련될 수 있다.

본 발명은 대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은: a) 대상자에게서 샘플을 구하는 단계와; b) 진단학적으로 유용한 담체와 항체, 더 구체적으로는, 항체를 특이적으로 포획하는 수단과 항체를 포함하는 복합체의 형성에 적합한 조건하에서, 샘플을 본 발명에 따른 진단학적으로 유용한 담체와 접촉시키는 단계와; c) 예컨대 샘플을 제거함으로써 상기 복합체를 단리시키는 단계와; d) 선택적으로 상기 복합체를 세척하는 단계와; e) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 이 방법은 바람직하게는 시험관내 방법이다. 본 발명에 따른 예측, 진단, 방법 또는 테스트 키트용 복합체의 검출은 면역확산 기술, IgE 항체에 의한 호염기구 활성화, 면역전기영동 기술, 광산란 면역분석법, 응집 기술, 또는 방사능라벨 면역분석법, 비색분석 등의 효소 면역분석법, 화학발광 면역분석법 및 면역형광 기술로 이루어진 그룹에서 선택된 라벨 면역분석법 등으로 이루어진 그룹에서 선택된 방법을 이용하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 복합체는 면역확산 기술, IgE 항체에 의한 호염기구 활성화, 면역전기영동 기술, 광산란 면역분석법, 응집 기술, 또는 방사능표지 면역분석법, 비색분석 등의 효소 면역분석법, 화학발광 면역분석법 및 면역형광 기술로 이루어진 그룹에서 선택된 라벨 면역분석법 등으로 이루어진 그룹에서 선택된 방법에 의해 검출된다. 당해 분야의 숙련가라면 이러한 방법을 숙지하고 있으며 이들 방법은 또한 종래 최신기술에 기재되어 있다 (예, Zane, H. D. (2001): Immunology-Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, in particular in Chapter 14.).

많은 경우에, 항체의 부재 또는 존재를 검출하는 것은 경우에 따라 항체의 농도가 소정의 문턱값, 바람직하게는 실시예 1에 기재한 바와 같이, 이 방법에 의한 암시적 검출한계 내에서 ELISA 측정법으로 설정된 바와 같은 특정 한계값을 초과하는지 여부를 결정하는 것을 의미하고, 이는 종종 샘플에서 이 검출한계가 진단을 위해 충분하다는 것을 시사한다. 항체를 검출할 수 있으면, 이는 임상의사의 진단에 중요한 정보가 될 것이며, 환자에게 질병이 있을 가능성이 높다는 것을 가리킨다. 바람직한 구현예에서, 혈청내 항체의 상대농도는 평균적인 건강한 대상자에게서 발견할 수 있는 레벨과 비교하여 결정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이, "존재를 검출하는"이란 표현은 임의의 바탕 레벨을 훨씬 초과하는 신호를, 관심 항체가 존재하거나 또는 이 항체가 건강한 대상자에서보다 더 많이 존재하는 것을 나타내는, 적절한 복합체 검출법을 이용하여 검출할 수 있는지 여부를 검사하기에 충분하다는 것을 의미한다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 표현은 농도가 평균적인 건강한 대상자에게서 발견된 관심 항체의 농도보다 0.1배 이상, 바람직하게는 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 또는 100000 배 더 높은지 여부를 측정하는 것을 수반할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 적어도 어떤 항체, 예컨대, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체, Ara h 2에 대한 항체 및/또는 Ara h 6에 대한 항체 등의 부재나 존재를 동시에, 즉, 한번에 검출한다. 이는 정해진 기간에 진단 정보의 최대값을 얻을 수 있으므로 효율적인 진단 절차 측면에서 편리하다. 물론 모든 반응을 수행하기에 충분한 용량을 사용할 수 있다는 전제조건이 따른다.

바람직한 구현예에서, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체, 및 Ara h 2에 대한 항체 및/또는 Ara h 6에 대한 항체 등과 같이 2개 이상의 항체의 부재 또는 존재 여부는 공간적으로 분리된 반응에서 검출된다. 이것은 이들 반응이 서로 분리된 용기내의 상이한 반응 혼합물에서 진행되는 것을 의미한다.

하나 이상의 항체가 검출되면, 원 포트 반응에서 방법을 실행할 수 있다. 바람직하게는, 본원에서 사용한 바와 같이, "원 포트 반응"이란 용어는 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 수행한 둘 이상, 바람직하게는 모든 반응이, 둘 이상의 반응을 각각의 개별 용액과 반응 용기에서 수행하는 것을 고려한 실험 설정과 대조적으로, 반응 간의 물리적 장벽 없이 하나의 반응 용기내의 동일한 반응 혼합물에서 실행되는 것을 의미한다.

검출대상 항체는 단일특이적 항체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에서 사용한 바와 같이, "단일특이적 항체"란 용어는 하나의 항원에만, 바람직하게는 하나의 진단학적 관련 항원에만, 더 바람직하게는 Ara h 7, Ara h 2 및 Ara h 6으로 이루어진 그룹으로부터의 단일 진단학적 관련 항원에만 결합되는 항체를 말한다. 더 바람직한 구현예에서, 검출대상 단일특이적 항체는 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는SEQ ID NO8에 결합될 수 있으나, 동형 Ara h 70101, Ara h 7.0 등, 또는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6 등의 다른 알레르겐에는 결합되지 않는다. 환자가 단일특이적 항체만 갖고 있으면, 이들의 알레르기는, 상기 단일특이적 항체를 특이적으로 포획 및 검출하는 수단을 사용하는 경우, 혈청 테스트에 의해서만 검출가능하다. SEQ ID NO8을 포함하지 않는 것으로서 7.0201 이외의 Ara h 동형체에 대한 항체를 검출하는 수단에 기초한 진단분석법을 이용하는 경우, 분석 결과는 거짓-음성이 될 가능성이 있는데, 이는 Ara h 7 동형 7.0201, 더 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대해 단일특이적 항체를 검출할 수 없기 때문이다.

본 발명은, 진단학적으로 유용한 담체의 민감도 향상, Ara h 7에 대한 항체, 바람직하게는 Ara h 7에 대한 단일특이적 항체의 검출, 땅콩 알레르기 진단용 키트의 제조 또는 견과류 알레르기, 바람직하게는 땅콩 알레르기 진단 방법을 위하여, Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를, 선택적으로 Ara h 2 및/또는 Ara h 6 등의 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단과 조합하여 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단의 용도를 제공한다.

본 발명은Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 특이적으로 결합되는 항체의 용도를 제공하며, 이 항체는 바람직하게는 단일특이적 항체이다. 더 바람직하게, 상기 항체는 환자의 샘플에서 검출 또는 이로부터 단리되며, IgA, IgE 또는 IgG클래스 항체, 더 바람직하게는 IgE, IgG1 또는 IgG4클래스 항체, 가장 바람직하게는 IgE클래스 항체이다.

본 발명은 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 특이적으로 결합되는 항체 또는 그의 절편을 제공하고, 이 항체는 바람직하게는 단일특이적 항체이다. 이 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 이 항체는 폴리클로날 항체일 수 있다. 상기 항체는 다수의 진단 응용분야에 유용하며, 예를 들어, 샘플로부터 항체결합력을 측정하는데 이용할 수 있다. 대안적으로, 항체는 경쟁적 ELISA 등의 경쟁적 분석법에 이용할 수 있다. 대안적으로, 항체는 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8을 포함하는 폴리펩티드를 고정화 처리하는데 이용할 수 있다. 대안적으로, 항체는 양성 대조군으로 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면, 예컨대 재조합 방법을 이용하여 이러한 항체를 수득하는 방법을 숙지하고 있다. 제조방법은 항체의 정제 및/또는 단리 단계를 수반할 수 있다.

본 발명은 약제학적 조성물, 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8 또는 그의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를, 선택적으로 Ara h 2 및/또는 Ara h 6, 또는 그의 변형체 등의 하나 이상의 추가적인 항원과 조합하여 포함하는 백신을 제공하고, 이때 상기 조성물은 바람직하게는 대상자, 바람직하게는 포유동물 대상자, 더 바람직하게는 인간에게 투여하기에 적합하다. 이러한 약제학적 조성물은 약제학적 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 이 약제학적 조성물은 예를 들어 경구적, 비경구적, 흡입 스프레이 사용, 국소적, 점안액 사용, 직장내, 비강내, 구강내, 질내 또는 이식 저장소 등의 경로를 통해 투여할 수 있다. 본원에서 사용한 바와 같이, "비경구적"이란 용어는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척수강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 적절한 투약 형태, 예를 들어, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 및 용액 형태, 바람직하게는 멸균 형태로 제공할 수 있다. 상기 조성물은 질병, 바람직하게는 알레르기의 치료방법에 사용할 수 있으며, 이 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 유효량만큼 대상자에게 투여하는 것을 포함한다. Ara h 7의 저알레르기성 변형체 및 선택적으로는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6 등의 하나 이상의 추가적인 항원을 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면 공지 알레르겐의 저알레르기성 변형체의 생성방법을 숙지하고 있다.

본 발명은 Ara h 7 동형 7.0201를 포함하는 백신, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 알레르기, 바람직하게는 견과류 알레르기, 더 바람직하게는 땅콩 알레르기를 치료, 예방 또는 완화시키지만, 대상자에게 본 발명의 약제 조성물을 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명은 Ara h 7 동형 7.0201, 더 바람직하게는, SEQ ID NO8, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO6, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를, 바람직하게는Ara h 2 및/또는 Ara h 6, 또는 그의 변형체와 조합하여 포함하는 폴리펩티드를, 민감도가 증가된 진단 분석법을 달성하는 땅콩 알레르기 진단용 키트의 제조를 위한 용도로 제공한다. 이러한 제조는, 진단학적으로 유용한 담체 상에 Ara h 7 동형 7.0201, 더 바람직하게는, SEQ ID NO6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8을, 바람직하게는Ara h 2 및/또는 Ara h 6, 또는 그의 변형체와 조합하여 포함하는 폴리펩티드를 고정화시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 Ara h 7 동형 7.0201, 더 바람직하게는, SEQ ID NO8, 더 바람직하게는SEQ ID NO7, SEQ ID NO6, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를, 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6, 또는 그의 변형체와 조합하여 포함하는 폴리펩티드를, 바람직하게는 알레르기성 조건 특히 견과류 알레르기, 더 특이적으로 땅콩 알레르기를 예방, 완화 또는 치료할 목적의 의약품, 바람직하게는 백신의 제조를 위한 용도를 제공한다.

도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같이 ELISA법으로 검출한 땅콩 민감성 환자의 Ara h 7 동형체에 대한 IgE 결합을 도시한다.
도 2 는 실시예 2에 기재된 바와 같이 라인 블롯으로 검출한 땅콩 민감성 환자의 Ara h 2 및 Ara h 6을 비롯해, Ara h 7 동형체에 대한IgE 결합을 도시한다.
도 3은 실시예 3에 기재된 억제 실험을 도시한다. 최대 억제력은 고정화된 알레르겐 민감성 환자에게서 5가지 땅콩 성분에 대해 관찰했다. 수평선은 평균값을 표시한다. 회색 개방 마크는 한번 고정화되는 경우 동일 알레르겐에 의한 억제력을 나타낸다.
도 4 는 Ara h 7.0201 C-말단의 선형 펩티드에 대한 혈청 IgE의 에피토프 매핑 결과를 도시한다. 표준화된 신호-대-잡음 비율 (z-스코어)을 마이크로어레이 상의 모든 펩티드에 대해 표시한다. 양성 결합은 적어도 6개의 연속 펩티드가 3보다 큰 z-스코어값을 수득하는 것을 조건으로 한다.

서열

본 발명은 일정 범위의 신규한 폴리펩티드, 특히 다음의 서열을 포함한다.

SEQ ID NO1 (신호 서열 Ara h 7.0101이 없는 발현 서열)

TRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHMRRRVEQEQEQEQDEYPYSRRGSRGRQPGESDENQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFWVPAGQEPVASDGEGAQELAPELRVQVTKPLRPL

SEQ ID NO2 (신호 서열 Ara h 7.0201이 없는 발현 서열)

TRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEKEQEQEQDEYPYIQRGSRGQRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQMERELRNLPQNCGFRSPSRCDLSSRTPY

SEQ ID NO3 (신호서열 Ara h 7.0이 없는 발현 서열)

TRWDPDRGSRGLRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEQEQEQEQDEYPYSQRGSRGRRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQNGEGAQELAPELRVQVTKPLRP

SEQ ID NO4 (신호서열 Ara h 2.0201이 없는 발현 서열)

RQQWELQGDRRCQSQLERANLRPCEQHLMQKIQRDEDSYGRDPYSPSQDPYSPSQDPDRRDPYSPSPYDRRGAGSSQHQERCCNELNEFENNQRCMCEALQQIMENQSDRLQGRQQEQQFKRELRNLPQQCGLRAPQRCDLEVESGGRDRY

SEQ ID NO5 (신호서열 Ara h 6.0101이 없는 발현 서열)

MRRERGRQGDSSSCERQVDRVNLKPCEQHIMQRIMGEQEQYDSYDIRSTRSSDQQQRCCDELNEMENTQRCMCEALQQIMENQCDRLQDRQMVQQFKRELMNLPQQCNFRAPQRCDLDVSGGRC

SEQ ID NO6 (Ara h 7 동형 7.0201의 C-말단)

HQMERELRNLPQNCGFRSPSRCDLSSRTPY

SEQ ID NO7 (Ara h 7 동형 7.0201의 C-말단)

NCGFRSPSRC

SEQ ID NO8 (Ara h 7 동형 7.0201의 C-말단에서 얻은 반응성 에피토프)

GFRSPS

SEQ ID NO9 (Ara h 7 동형 7.0201의 C-말단)

CGFRSPSRCD

SEQ ID NO10 (Ara h 7 동형 7.0201의 C-말단)

QNCGFRSPSRCDL

SEQ ID NO11 ( 실시예 1에서 발현된 Ara h 7 동형 7.0101)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMTRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHMRRRVEQEQEQEQDEYPYSRRGSRGRQPGESDENQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFWVPAGQEPVASDGEGAQELAPELRVQVTKPLRPL

SEQ ID NO12 ( 실시예 1에서 발현된 Ara h 7 동형 7.0201)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMTRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEKEQEQEQDEYPYIQRGSRGQRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQMERELRNLPQNCGFRSPSRCDLSSRTPY

SEQ ID NO13 (실시예 1에서 발현된 Ara h 7 동형 7.0)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMTRWDPDRGSRGLRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEQEQEQEQDEYPYSQRGSRGRRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQNGEGAQELAPELRVQVTKPLRP

SEQ ID NO14 (실시예 1에서 발현된 Ara h 2 동형 2.0201)

MSHHHHHHIEGRTMRQQWELQGDRRCQSQLERANLRPCEQHLMQKIQRDEDSYGRDPYSPSQDPYSPSQDPDRRDPYSPSPYDRRGAGSSQHQERCCNELNEFENNQRCMCEALQQIMENQSDRLQGRQQEQQFKRELRNLPQQCGLRAPQRCDLEVESGGRDRY

SEQ ID NO15 ( 실시예 1에서 발현된 Ara h 6 동형 6.0101)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMRRERGRQGDSSSCERQVDRVNLKPCEQHIMQRIMGEQEQYDSYDIRSTRSSDQQQRCCDELNEMENTQRCMCEALQQIMENQCDRLQDRQMVQQFKRELMNLPQQCNFRAPQRCDLDVSGGRC

SEQ ID NO16: 실시예 3에서 사용한 바와 같은 Ara h 1.01.01

MSHHHHHHIEGRTMKSSPYQKKTENPCAQRCLQSCQQEPDDLKQKACESRCTKLEYDPRCVYDPRGHTGTTNQRSPPGERTRGRQPGDYDDDRRQPRREEGGRWGPAGPREREREEDWRQPREDWRRPSHQQPRKIRPEGREGEQEWGTPGSHVREETSRNNPFYFPSRRFSTRYGNQNGRIRVLQRFDQRSRQFQNLQNHRIVQIEAKPNTLVLPKHADADNILVIQQGQATVTVANGNNRKSFNLDEGHALRIPSGFISYILNRHDNQNLRVAKISMPVNTPGQFEDFFPASSRDQSSYLQGFSRNTLEAAFNAEFNEIRRVLLEENAGGEQEERGQRRWSTRSSENNEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSKKGSEEEGDITNPINLREGEPDLSNNFGKLFEVKPDKKNPQLQDLDMMLTCVEIKEGALMLPHFNSKAMVIVVVNKGTGNLELVAVRKEQQQRGRREEEEDEDEEEEGSNREVRRYTARLKEGDVFIMPAAHPVAINASSELHLLGFGINAENNHRIFLAGDKDNVIDQIEKQAKDLAFPGSGEQVEKLIKNQKESHFVSARPQSQSQSPSSPEKESPEKEDQEEENQGGKGPLLSILKAFN

SEQ ID NO17: 실시예 3에서 사용한 바와 같은 Ara h 3.01.01

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMRQQPEENACQFQRLNAQRPDNRIESEGGYIETWNPNNQEFECAGVALSRLVLRRNALRRPFYSNAPQEIFIQQGRGYFGLIFPGCPRHYEEPHTQGRRSQSQRPPRRLQGEDQSQQQRDSHQKVHRFDEGDLIAVPTGVAFWLYNDHDTDVVAVSLTDTNNNDNQLDQFPRRFNLAGNTEQEFLRYQQQSRQSRRRSLPYSPYSPQSQPRQEEREFSPRGQHSRRERAGQEEENEGGNIFSGFTPEFLEQAFQVDDRQIVQNLRGETESEEEGAIVTVRGGLRILSPDRKRRADEEEEYDEDEYEYDEEDRRRGRGSRGRGNGIEETICTASAKKNIGRNRSPDIYNPQAGSLKTANDLNLLILRWLGPSAEYGNLYRNALFVAHYNTNAHSIIYRLRGRAHVQVVDSNGNRVYDEELQEGHVLVVPQNFAVAGKSQSENFEYVAFKTDSRPSIANLAGENSVIDNLPEEVVANSYGLQREQARQLKNNNPFKFFVPPSQQSPRAVA

본 발명을 다음의 비제한적 실시예를 통해 추가적으로 예시하며, 이들 실시예에서 본 발명의 추가적인 특징, 구현예, 측면 및 장점을 이해할 수 있다.

실시예 1: ELISA 법을 이용하여 땅콩-민감성 환자로부터의 혈청내 Ara h7 동형에 대한 IgE 항체의 검출

1.1. 재조합 단백질

재조합 알레르겐의 이종 발현 및 정제

Ara h 7.0101 (SEQ ID NO11), Ara h 7.0201(SEQ ID NO12), Ara h 7.0 (SEQ ID NO13), Ara h 6 (SEQ ID NO15) 및 Ara h 2 (SEQ ID NO14)는 E. coli에 존재하는 각 SEQ ID NOs.에 따른 서열을 가진 His6 융합 단백질로서 발현 정제되었으며, 그의 내용은 공지 문헌에 기재된 바와 같다 (Sitaru C, Dahnrich C, Probst C, Komorowski L, Blocker I, Schmidt E, Schlumberger W, Rose C, Stocker W, Zillikens D. Enzyme-linked immunosorbent assay using multimers of the 16th non-collagenous domain of the BP180 antigen for sensitive and specific detection of pemphigoid autoantibodies. Exp Dermatol. 2007 Sep;16(9):770-7). 정제처리는 고정화된 금속 이온 크로마토그래피를 이용하여 변성 조건에서 수행하였다.

1.2. ELISA법을 이용한 IgE 결합의 검출

3개의 Ara h 7 동형체의 IgE 결합력은 땅콩 추출물에 IgE 양성인 33명 환자의 혈청으로 배양한 효소 결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbend assay, ELISA)으로 분석하였다 (도 1). 또한, 땅콩 민감성이 없는 아토피 환자의 10개의 혈청과 23개의 건강한 혈액 공여물을 음성 대조군으로서 배양했다 (모두 음성 반응이며, 데이터는 도시되지 않음).

Sitaru 등에 기재된 바와 같이, 마이크로타이터 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 재조합 땅콩 알레르겐으로 코팅했다 (PBS에 녹인 9㎍/㎖, pH 7.5). 혈청은 블로킹 완충액 (PBS-0,1% 소 혈청 알부민)으로 1/10 (v/v) 비율로 희석하고, 웰 당100㎕를 플레이트에 중복 도포한 뒤 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

결합된 항체는 항-인간 IgE 퍼옥시다아제 접합체로 검출하고 테트라메틸벤지딘으로 염색했다 (Total IgE ELISA EV 3840-9601 E, Euroimmun, Lubeck, Germany). 620nm를 기준으로 자동 분광광도계를 이용하여 450nm에서 광학밀도 (optical density, OD)를 판독했다 (Spectra Mini, Tecan, 독일).

결과

Ara h 7 동형 7.0101, Ara h 7 동형 7.0201 및 Ara h 7.0에 대한 IgE 반응성을 66개의 인간 혈청에서 측정했다. 23개의 혈액 공여물 및 땅콩 추출물에 대한 IgE가 없는 알레르기성 환자로부터의 10개의 혈청은 모두 양성 반응을 보이지 않았다. 23개의 땅콩 추출물 양성 혈청 중에서 11개는 Ara h 7.0201에서 양성 결과를 나타냈으나, Ara h 7.0101 및 Ara h 7 각각에 대해서는 양성반응이 6개 및 10개에 불과했다.

양성 반응 혈청 중의 평균OD는 Ara h 7.0201의 경우 1.0이었다. Ara h7.0101 및 Ara h 7.0에서의 평균 OD는 훨씬 낮았다 (양쪽 모두 0.4).

이들 결과는, 한편으로는 Ara h 7.0201이 환자의 IgE에 더 크게 반응하고, 다른 한편으로는, 다른 2개의 동형체와 비교하여, Ara h7.0201를 타겟 항원으로 사용하는 IgE 항체 검출을 통해 더 많은 환자를 정확하게 진단할 수 있는 것을 보여준다 (도 1). 실제로, 일부 환자들은 Ara h 7.0201에 대한 항체 검출시에만(!) 알레르기성으로 동정 및 진단할 수 있다.

실시예 2: 라인 블롯을 이용한 IgE 항체의 검출

2S 알부민 Ara h 2, Ara h 6, 및 3개의 Ara h 7 동형체의 IgE 결합능력을 면역블롯 분석법으로 조사했다. 34명의 땅콩 민감성 대상자들로부터의 혈청 샘플 (도 2)을 라인 블롯-면역블롯과 함께 배양하고, EUROLINEScan 소프트웨어로 강도를 평가했다. 또한, 땅콩 민감성이 없는 아토피 대상자의 20개의 혈청 및 17개의 건강한 혈액 공여물을 음성 대조군으로서 배양했다 (모두 음성이며, 데이터는 도시되지 않음).

라인 블롯 면역블롯에서, 재조합 알레르겐은 표준적인 방법에 따라 나일론계 멤브레인 상에 코팅했다. 그 후, 멤브레인을 차단, 건조 및 포일 상에 고정했다. 포일을 스트립 형태로 절단하고 여기에 혈청을 배양했다.

EUROIMMUN 면역블롯 설명서에 따라 혈청 샘플을 매뉴얼대로 배양했다 (예를 들어, DPA-Dx pollen 1, DP 3210-1601-1 E). 배양과 세척 단계는 모두 실온 (+18℃ 내지 +25℃)의 로킹 쉐이커에서 수행했다. EUROIMMUN (DPA-Dx pollen 1, DP 3210-1601-1 E)에서 공급한 키트로부터 시약을 채취했다. 면역블롯 스트립은 작업강도 범용 완충액(WSUB)을 이용하여 5분간 사전배양했다. 액체 스트립을 모두 제거한 뒤, 이들 스트립을 제 1단계에서 1.0㎖의 WSUB로 하룻밤 (12 내지 24 시간) 동안 희석한 100 ㎕ 의 각 혈청 샘플로 배양했다. 제 2단계에서, 스트립은 다시 1.0㎖의 효소 접합체 (알칼리성 포스파타제-접합 항인간 IgE)로 60분간 배양했다. 제 1및 2 단계 후에 액체를 각각 흡입 제거하고, 스트립은 1.0㎖의 WSUB으로 5분씩 3회 세척했다. 제 3단계에서, 스트립은 1.0㎖의 발색원/기질 용액으로 10분간 배양했다. 그 후, 액체를 다시 흡입 제거하고 각 스트립을 탈이온수나 증류수로 1분씩 3회 세척하여 효소 반응을 중단시켰다. 마지막으로, 테스트 스트립을 평가용 프로토콜에 놓고, 공기 건조시켜 EUROLINEScan 소프트웨어로 평가했다.

결과

총 71개의 샘플을 면역블롯으로 분석했다. 땅콩 추출물에 대한 특이적 IgE (sIgE)가 없는 아토피 대상자로부터의 20개의 혈청 및 17개의 건강한 혈액 공여물 중 어느 것에서도, Ara　h　2, Ara　h　6 및 Ara h 7 의 3가지 동형체 모두에 대한 sIgE 는 검출되지 않았다. 땅콩 추출물에 대한 sIgE가 있는 대상자로부터의 34개의 샘플 중에서 17개의 샘플이 Ara　h　2 및 Ara　h　6에 양성 반응을 나타냈으며, 15개는 Ara h 7.0201에 대해, 14개는 Ara h 7.0101에 대해, 및 11개는 Ara h 7.0에 대해 각각 양성 반응을 나타냈다.

양성 반응성 혈청 중에서 Ara h 2, Ara h 6 및 Ara h 7.0201의 면역블롯 강도 평균값은 각각 84, 59 및 74이었으며, 반면에 Ara h 7.0101 및 Ara h 7의 평균강도는 이보다 훨씬 낮았다 (20 및 28) (도2).

이 결과는, 땅콩 추출물에 대한 sIgE를 가진 대상자에서 Ara h 7.0101 및 Ara h 7.0 보다 Ara h 7.0201의 평균 IgE 레벨이 높게 나타나는 것을 보여준다. 또한, 땅콩 추출물 IgE양성 대상자는 Ara h 2 및 Ara h 7.0201 IgE의 평균 레벨이 매우 유사하며, 이는 Ara h 7.0201 IgE가 Ara h 2와 마찬가지로 땅콩 알레르기에 대한 또 다른 주요 알레르겐 성분임을 가리키는 것이다.

실시예 3: 라인 블롯과 ELISA를 이용한 큰 규모의 환자코호트에 기초한 연구

환자 선정

상이한 땅콩 저장 단백질의 진단적 가치를 평가하기 위해, 2003년부터 2014년 9월까지 유니버시티 메디칼 센터 유트레흐트(Utrecht)에서 땅콩을 대상으로 진행한 진단학적 개방 또는 이중맹검 위약-대조 식품 유발시험 (double-blind placebo-controlled food challenge, DBPCF)에 참가한, 병력 및/또는 민감성 측면에서 땅콩 알레르기가 의심되는 성인들을 선정하였다 (n=127). 식품 유발 시험일자의 1년 전후에 정기적으로 채혈한 후, 잔류 혈청을 95명의 대상자에게 사용하였다. 상기 환자군에서, ImmunoCAP ISAC 감작 데이터의 유용성을 기준으로 40명의 땅콩 알레르기 환자 및 40명의 내성 환자 (즉, 검사에서 각각 양성 및 음성인 대상자)를 선정하였다. DBPCFCs는 전술한 바와 같이 국제 합의프로토콜에 따라 수행하였다 (Taylor SL, Hefle SL, Bindslev-Jensen C, Atkins FM, Andre C, Bruijnzeel-Koomen C, et al. "A consensus protocol for the determination of the threshold doses for allergenic foods: How much is too much?" Clin Exp Allergy 2004;34:689-95. doi:10.1111/j.1365-2222.2004.1886.x.). 모든 양성 검사는 DBPCFCs 이었다. 음성 검사는 2가지의 개방형 땅콩 검사도 포함했다. 억제력 실험에서, 땅콩 추출물에 민감하고 양성 DBPCFC이며, 또한 종래 문헌 (Peeters KABM, Koppelman SJ, van Hoffen E, van der Tas CWH, den Hartog Jager CF, Penninks AH, et al; "Does skin prick test reactivity to purified allergens correlate with clinical severity of peanut allergy?" Clin Exp Allergy 2007;37:108-15. doi:10.1111/j.1365-2222.2006.02628.x.)에서 미리 특성화한 집단으로부터 무작위 선정한 10명의 알레르기성 성인으로부터 혈청을 수집하였다.

라인 블롯

재조합 땅콩 저장 단백질 Ara h 1.0101, 2.0201, 3.0101, 6.0101 및 Ara h 7 동형 7.0201 (표 1)에 대한 감작을 실시예 2에 기재된 바와 같이 라인 블롯을 이용하여 평가했다. 요약하면, 희석 완충액에 1:11 비율로 희석한 환자의 혈청 100 ㎕를 이용하여 테스트 스트립을 궤도형 쉐이커 상에 놓고 실온에서 하룻밤 동안 배양했다. 세척 후, 효소-표지된 항-인간 IgE 항체와 배양한 다음, 기질인 니트로-블루 테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3'-인돌 포스페이트로 배앙한 후, 소프트웨어 "EUROLineScan"으로 반응을 평가했다. 밴드의 강도를 효소-알레그로-흡착제(Enzyme-Allergo-Sorbent) 시험 분류 (0-6 등급)에 상응하는 등급 및 강도 단계로 기록했다 (Williams PB, Barnes JH, Szeinbach SL. "Sullivan TJ. "Analytic precision and accuracy of commercial immunoassays for specific IgE: Establishing a standard." J Allergy Clin Immunol 2000;105:1221-30. doi:10.1067/mai.2000.105219). 3단계 이상의 강도에 상응하는 1등급 이상이면 양성으로 간주했다.

재조합 알레르겐의 이종유전자 발현 및 정제

Ara h 7.0101 (SEQ ID NO11), Ara h 7.0201 (SEQ ID NO12), Ara h 7 (SEQ ID NO13), Ara h 6 (SEQID NO15) 및 Ara h 2 (SEQ ID NO14)은 E. coli 내 N-말단 His(6x)을 가진 융합 단백질로서 신호 서열이 없이 발현했으며, 이들을 Sitaru et al.(2007)에 기재된 바와 같이 각각의 서열번호(SEQ ID NOs)로 표현했다. 이것을 고정화 금속 이온 크로마토그래피법으로 변성화 조건하에 정제했다. 억제 실험을 위해 재조합 단백질을 TBS에 투석 처리했다. (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mMNaCl, 3% 슈크로스, 1.2 mM 글루타치온, 비환원형, 3.8 mM 글루타치온, 환원형).

ELISA 및 억제 실험

Sitaru et al.에 기재된 바와 같이, 4℃에서 2시간 동안 마이크로타이터 플레이트를 고정화 재조합 땅콩 알레르겐 (PBS에 녹인 9㎍/㎖ 용액, pH 7.5)으로 코팅했다.

용량 의존형 교차-억제 실험에서, 실시예 1에 기재된 차단 완충액에 녹인 최적의 희석 혈청 (표 3 참조)을 플레이트에 도포하기 전에, 실온에서 진탕하에 최종 농도가 0.1, 1 및 10㎍/㎖인 경쟁 알레르겐으로 30분간 사전-배양했다. 차단 완충액만 첨가한 대조군과 비교한 OD 환원 백분율로서 억제값을 얻는다.

데이터 분석 및 통계

스피어맨(Spearman) 상관관계를 이용하여 sIgE 시험 결과들 간의 상관관계를 분석했다. 카이-제곱 테스트를 이용하여 내성 환자와 알레르기 환자 간에 양성 시험의 차이를 평가했다. Receiver Operating Characteristic(ROC) 곡선 아래의 면적 (AUC)을 측정하여 알레르기성과 내성을 구별하는 시험의 효력을 평가하였으며, 이는 식품 시험에서 확인된 바와 같다. SPSS Statistics21 (IBM Corporation, Armonk, NY, 미국)를 이용하여 분석을 수행하였다.

결과

땅콩 저장 단백질에 대한 감작 평가

진단 평가에 참여한 80명의 땅콩시험 환자들의 환자 특성을 표 2에 수록하였다. 중위 연령은 25세 (범위: 16-77)이고 36%가 남성이었다. 모든 땅콩 저장 단백질에 대한 감작은 땅콩 알레르기 그룹에서 훨씬 자주 발생했다. 땅콩 내성 그룹의 15%와 비교하여, 땅콩 알레르기 그룹에서는 73%가 5종의 저장 단백질 중 적어도 1종에 민감했다. 땅콩 알레르기 환자들에서 땅콩 2S 알부민 Ara h 2가 가장 크게 인지되었으며 (85%), 다른 2종의 2S 알부민 Ara h 6 및 7이 그 뒤를 따랐다 (양측 모두 60%).

가장 높은 식별값은 Ara h 6에 대해 확인되었으며 (AUC 0.85), 다음으로 Ara h 7및 2의 순서였다 (AUC 0.83 및 0.81). EUROLINE 강도값은 땅콩 저장 단백질의 ISAC ISU 결과와 큰 수준 내지 매우 큰 수준의 상관관계를 나타냈다 (r_s 값 Ara h 1: 0.73, Ara h 2: 0.87, Ara h 3: 0.80, Ara h 6: 0.84, 모두 p<0.001). Ara h 7 강도값은 EUROLINE에서 Ara h 2 및 6의 강도값과 밀접한 상관관계를 나타냈다 (양측 모두에서 r_s = 0.81 및 p<0.001). EUROLINE과 ImmunoCAP ISAC 양측에서 개별 성분에 대한 식별력을 비롯해, 감작 결과를 표 2에 수록한다.

땅콩 저장 단백질에 대한 동시-감작은 가장 일반적인 것이다. 땅콩 저장 단백질 Ara h 1, 2, 3, 6 또는 7에 대해 민감한 모든 환자들 중 거의 절반이 이들 5종에 대해 민감했으며 (46%; 온라인 보관함(Online Repository)의 도 E1 참조), Ara h 2, 6와 7에 대한 동시-감작이 그 뒤를 따랐다 (14%). 특히2S 알부민 Ara h 2, 6 또는 7에 민감한 환자들을 살펴보면, 대부분은 상기 3종의 단백질 모두를 동시-감작했다 (n=24, 68%; 도 1). 단일-감작은 Ara h 2 (n=6), Ara h 6 (n=2) 및 Ara h 7 (n=2)에서 관측되었고, 양성 땅콩 시험에서는 각각 6명 중 4명, 2명 중 1명, 및 2명 중 1명이었다.

ELISA: Ara h 2, 6 및 7 동형체의 억제 효과 분석

억제력 연구에 참가한 10명의 환자의 경우, 중위 연령은 25세이고 남성은 4명이었다. 모든 대상자에서 땅콩 추출물에 대한 감작을 검출하였고, ImmunoCAP 타이터는 1.7 내지 100 kU/L 초과의 범위이다. 먼저, ELISA에 따라 10개의 혈청을 대상으로 3종의 Ara h 7 동형체에 대한 IgE 반응성을 비롯해, Ara h 2 및 6에 대한 IgE 반응성을 평가했다. 4개의 혈청은 이들 5종의 성분에 대해 반응성을 나타냈다. 또한, 2개의 혈청은 Ara h 7.0201, Ara h 2 및 6에 반응했으며, 1개의 혈청은 Ara h 2 및 6에만 반응했다. 나머지 3명의 환자는 OD값이 너무 낮아 억제력 실험을 할 수 없었다. 각 혈청에서 최적의 희석도를 결정했다 (데이터는 도시하지 않음). 교차 억제 실험에서, 상이한 2S 알부민 간에 얻은 최대 억제량은 환자 혈청마다 변화가 있음을 확인했다 (도 3). 일부 환자에서는 억제력이 관측되지 않은 반면, 다른 환자는 다양한 고정화된 알레르겐과 억제제에 의해 부분적으로 또는 거의 완벽하게 억제되는 것을 확인했다. Ara h 7.0101 및 7 동형체의 경우, 다른 2종의 동형체는 동일한 알레르겐의 억제력과 유사한 정도의 강한 억제 효과를 달성할 수 있었다. Ara h 7.0201의 경우, 다른 2종의 에피토프가 매우 제한적인 수준의 억제력을 나타냈다.

억제력 변화는 상이한 2S 알부민 간에 더욱 뚜렷했다 (도 3). 예를 들어, 고정화된 Ara h 7.0201에 대해, Ara h 6의 억제력은 8 내지 86%의 억제율 (평균 22%)로 환산되고, Ara h 2의 억제율은 4 내지 71% (평균 16%)라는 결과를 가져왔다. 한편, Ara h 6과 Ara h 2는 Ara h 7 동형체에 의해 억제되었으나, Ara h 2를 이용할 경우 Ara h 6에 대한 slgE 억제율은 12 내지 70% (평균 43%)이었고, 그 반대의 경우 최고 77% (평균 24%)에 달했다. 요약하면, 환자 중 일부에서는 Ara h 2 및 6이Ara h 7.0201에 대한 결합을 억제할 수 있었으나, 다른 환자에서는 불가능했다. Ara h 7 동형체는 Ara h 2 및 6에 대한 결합을 거의 억제하지 못했으나, Ara h 2 및 6은 서로에 대한 결합을 억제할 수 있었다.

검토

80명의 땅콩 시험 환자군에서, Ara h 7.0201이 주요 알레르겐 Ara h 2 및 6과 거의 유사한 식별력을 갖는 것을 확인하였으며, 이는 결과들 간의 밀접한 상관관계와 함께, 동시-감작이 빈번하게 발생하기 때문이라고 설명할 수 있다. 전반적으로 ImmunoCAP ISAC와 EUROLINE 시스템 모두에서, Ara h 6이 가장 우수한 식별력을 갖고 있으며, Ara h 2보다 다소 높은 것을 확인했다.

이러한 통상적인 동시-감작과 별도로, Ara h 2, 6 또는 7.0201에 대한 단일-감작을 관측하였다. Ara h 2에 대한 단일-감작은 가장 보편적이지만 (n=6), Ara h 6 및 7.0201에 대한 단일-감작의 존재 여부를 파악하는 것이 중요한데, 이는 Ara h 2에 대한 감작만 시험할 경우 놓칠 수 있기 때문이다. 이 실험은 2명의 대상자에서Ara h 7.0201에 대한 단일-감작을 확인하는 첫번째 연구이다.

과거의 연구에서는 Ara h 7에 대한 감작을 연구 조사했으나 이는 Ara h 7 01.01 동형체에 불과했다. Ara h 7.0101을 1차 클로닝한 후, Kleber-Janke et al.은 땅콩 알레르기 병력이 확실한 40명의 땅콩 민감성 대상자 중 17명 (43%)에서 rAra h 7.0101에 대한 감작을 검출했으며, 이는 Ara h 2에 대한 감작 (85%)과 비교된다. Codreanu와 동료들은 면역시험에서 몇가지 재조합 땅콩의 역할을 조사했으며, rAra h 7.0101이 rAra h 2 및 6과 비교하여 민감도가 떨어지는 것을 확인했다.

본 연구에서의 억제 실험은 Ara h 7.0201이 Ara h 7.의 가장 관련성이 큰 동형체임을 나타냈다. Ara h 7.0101 및 7.0에 대한 sIgE가 있는 환자의 혈청에서, 다른 동형체에 의한 강한 억제력은 3종의 Ara h 7 동형체 모두에 존재하는 에피토프가 인지됨을 시사한다. 한편, Ara h 7.0201에 민감한 대상자들 중에서, 다른 동형체들에 의한 억제력이 결핍된 경우, 이는 다른 2종의 동형체에는 존재하지 않는 특이적인 에피토프에 대한 동시-감작을 가리킨다. 임의의 Ara h 7 동형체에 감작되는 6개의 혈청 중 4개에서, 3종의 Ara h 7 동형체들 모두에 대한 동시-감작이 있었다. 이는, Ara h 7.0201에 대한 결합이 다른 동형체들에 의해 억제될 수 없는 반면, Ara h 7.0201 주변의 다른 경로가 동형체들에 대한 결합을 억제할 수 있다는 것에 모순이 있음을 나타낸다. 이에 대한 한가지 설명은, 1명의 환자에서 특이적이고 교차-반응성이 있는 Ara h 7.0201의 복수의 에피토프가 인지되는 것, 즉, 하나의 Ara h7 동형체에 존재하는 특이적인 에피토프(들)에 대한 다량의 slgE가, 이 에피토프가 결핍된 다른 동형체들의 억제력 저하를 가져오기 때문이다. 영향을 주는 또 다른 변수는, 용해된 폴드형 알레르겐 대 고체 상에 고정화 및 코팅된 알레르겐들 간의 IgE에 대한 에피토프의 접근성 차이일 수 있다.

2S 알부민의 교차-억제는, Ara h 2 및 6에 대한 IgE가 Ara h 7 동형체에 의해 억제될 수 없지만, 서로에 의해 다소 확장될 수 있음을 보여준다. 이것은 Ara h 7 동형체의 일부가 아닌 Ara h 2 및 6이 공유한 에피토프에 의해 설명할 수 있다.

결론적으로, 본 연구는 Ara h 7 동형 7.0201이 세번째 임상 관련 땅콩 2S 알부민이며, 집단 수준에서 Ara h 2 및 6에 필적하는 땅콩 알레르기 식별력을 갖는 사실을 확인했다. 땅콩 저장 단백질, 더 구체적으로는 2S 알부민에 대한 동시-감작이 가장 보편적인 반면, 개별 환자에서 Ara h 2, 6 또는 7 중 어느 하나에 대한 단일-감작은 단일 2S 알부민 검사시 오진의 위험을 야기할 수 있다.

실시예 4: 펩티드 마이크로어레이를 이용한 특이적 Ara h 7 에피토프에 대한 IgE 항체의 검출

펩티드 마이크로어레이 배양 및 시각화

중복 서열을 가진 Ara　h　7.0201의 15량체(15mer) 펩티드 (SEQ ID NO2) (오프셋: 1, 중복 인쇄된 모든 펩티드)를 포함하는 펩티드 마이크로어레이를 시중에서 구입하여 (PEPperPRINT), Ara h 7.0201의 C-말단을 커버했다 (SEQ ID NO6). 배양 실험을 위해, 마이크로어레이를 궤도형 쉐이커 상에서 작동강도 범용 완충액 (WSUB, 실시예 2 참조)으로 RT(실온) 조건하에 1시간 동안 차단했다. 추가로 설명하는 모든 배양 조치도 WSUB에서 수행했다. 3명의 땅콩 양성 환자 및 2명의 땅콩 음성 환자의 혈청을 1:4로 희석하여 4℃에서 하룻밤 배양했다. 결합된 IgE 항체를 검출하기 위해, 비오티닐화된 항-IgE IT-28 (Squarix)을 1:5000으로 희석하고 어레이 상에서 실온하에 1시간 동안 배양했다. 세정후, 어레이를 형광 뉴트라비딘(Neutravidin) 800 (Thermo Fisher)을 이용하여 실온에서 1시간 동안 배양한 후 1:5000으로 희석했다. 펩티드 마이크로어레이 슬라이드를 800nm (강도: 8.5) 파장의 리코르 오딧세이(Licor Odyssey) 화상기로 스캔했다. 화상의 초점은 0.8mm로 설정했고, 최대 해상도 (21 ㎛)를 선택하여 최대 감도를 확보했다.

평가

스캔 후, TIFF 이미지 및 펩티드 맵 파일을 펩티드 분석기 소프트웨어 (SICASYS)에 저장하고 모든 단일 펩티드에 상응하는 신호들을 정량분석했다. 초기 데이터를 CSV 파일로 출력하고, 어레이 상에서 모든 단일 Ara h 7 펩티드 (S_Ara) 및 공백 지점 (S_Blank)에 대한 신호-대-잡음 비율의 log2 값을 계산했다. 보다 확실하고 표준화된 평가를 위하여, 모든 단일 펩티드에 대한 z-스코어 (Zi)를 다음의 식에 따라 계산했다:

상기 계산법에 근거하여, 양성 결합 에피토프를 z-스코어가 3.0 이상인 (p=0.003) 6개 이상의 연속 펩티드의 검출값으로 정의했다. 마이크로소프트 엑셀로 데이터를 시각화했다 (도 4).

결과

2개의 음성 혈청에서 에피토프가 검출되지 않은 반면, 3번 혈청을 사용시 이전에 공지되지 않은 Ara h 7.0201 에피토프를 검출할 수 있으며, 이는 GFRSPS 서열 (아미노산 129-134) (SEQ ID NO2에 따른 아미노산 잔기 번호)을 포함한다. z-스코어 경계선보다 아래에 있지만, 이 에피토프는 1번 혈청에 대해서도 검출가능하다. 상기 서열은 Ara h 7.0201에 고유한 것이므로, 이 에피토프는 다른 두 동형체와 비교하여 Ara h 7.0201의 개선된 활성에 관련된 것이라고 판단할 수 있다.

표

[표 1] : EUROLINE 스트립에 존재하는 땅콩 저장 단백질. Becker and Jappe [5] 및 Van Erp 등 [7] et al.에서 발췌.

[표 2] : 집단내 40명의 땅콩 내성 및 40명의 땅콩 알레르기성 환자에 대한 환자 특성 및 민감성 데이터.

IQR: 사분위수 범위. AUC: 곡선 아래의 면적. CI: 신뢰구간

* 양성 테스트를 위해 제조사에서 권고한 경계값을 이용함. † 저항성과 알레르기성 대상자 간의 양성 테스트 수의 차이에 대한 p 값 (카이-제곱 검정). ‡n = 79

[표 3] : 실시예 3에 기재된 용량 의존형 억제 실험을 위한 혈청의 개별 희석물.

<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG <120> An improved assay for the diagnosis of peanut allergy <130> 17PP016 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO1 (expressed sequence without signal sequence of Ara h 7.0101) <400> 1 Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser Arg Trp Asp Ala 1 5 10 15 Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu Gln Arg Ala Asn 20 25 30 Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Met Arg Arg Arg Val Glu Gln Glu Gln 35 40 45 Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Arg Arg Gly Ser Arg Gly 50 55 60 Arg Gln Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asn Gln Glu Gln Arg Cys Cys Asn 65 70 75 80 Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Gln Ala Leu 85 90 95 Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Trp Val Pro Ala Gly Gln Glu 100 105 110 Pro Val Ala Ser Asp Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala Pro Glu Leu 115 120 125 Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro Leu 130 135 <210> 2 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO2 (expressed sequence without signal sequence of Ara h 7.0201) <400> 2 Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser Arg Trp Asp Ala 1 5 10 15 Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu Gln Arg Ala Asn 20 25 30 Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val Glu Lys Glu Gln 35 40 45 Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ile Gln Arg Gly Ser Arg Gly 50 55 60 Gln Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln Arg Cys Cys Asn 65 70 75 80 Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Gln Ala Leu 85 90 95 Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln Gln Asp Arg Ser 100 105 110 Gln Leu His Gln Met Glu Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Asn Cys 115 120 125 Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu Ser Ser Arg Thr Pro Tyr 130 135 140 <210> 3 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO3 (expressed sequence without signal sequence of Ara h 7.0) <400> 3 Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Leu Arg Trp Asp Ala 1 5 10 15 Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu Gln Arg Ala Asn 20 25 30 Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val Glu Gln Glu Gln 35 40 45 Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Gln Arg Gly Ser Arg Gly 50 55 60 Arg Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln Arg Cys Cys Asn 65 70 75 80 Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Gln Ala Leu 85 90 95 Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln Gln Asp Arg Ser 100 105 110 Gln Leu His Gln Asn Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala Pro Glu Leu 115 120 125 Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro 130 135 <210> 4 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO4 (expressed sequence without signal sequence of Ara h 2.0201) <400> 4 Arg Gln Gln Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg Cys Gln Ser Gln Leu 1 5 10 15 Glu Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Gln His Leu Met Gln Lys Ile 20 25 30 Gln Arg Asp Glu Asp Ser Tyr Gly Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln 35 40 45 Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Asp Arg Arg Asp Pro Tyr Ser 50 55 60 Pro Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser Ser Gln His Gln Glu 65 70 75 80 Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn Asn Gln Arg Cys Met 85 90 95 Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu Gln 100 105 110 Gly Arg Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro 115 120 125 Gln Gln Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Glu Val Glu 130 135 140 Ser Gly Gly Arg Asp Arg Tyr 145 150 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO5 (expressed sequence without signal sequence of Ara h 6.0101) <400> 5 Met Arg Arg Glu Arg Gly Arg Gln Gly Asp Ser Ser Ser Cys Glu Arg 1 5 10 15 Gln Val Asp Arg Val Asn Leu Lys Pro Cys Glu Gln His Ile Met Gln 20 25 30 Arg Ile Met Gly Glu Gln Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Ile Arg Ser 35 40 45 Thr Arg Ser Ser Asp Gln Gln Gln Arg Cys Cys Asp Glu Leu Asn Glu 50 55 60 Met Glu Asn Thr Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met 65 70 75 80 Glu Asn Gln Cys Asp Arg Leu Gln Asp Arg Gln Met Val Gln Gln Phe 85 90 95 Lys Arg Glu Leu Met Asn Leu Pro Gln Gln Cys Asn Phe Arg Ala Pro 100 105 110 Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Ser Gly Gly Arg Cys 115 120 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO6 (C-terminus of Ara h 7 isotype 7.0201) <400> 6 His Gln Met Glu Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Asn Cys Gly Phe 1 5 10 15 Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu Ser Ser Arg Thr Pro Tyr 20 25 30 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO7 (C-terminus of Ara h 7 isotype 7.0201) <400> 7 Asn Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO8 (reactive epitope from C-terminus of Ara h 7 isotype 7.0201) <400> 8 Gly Phe Arg Ser Pro Ser 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO9 (C-terminus of Ara h 7 isotype 7.0201) <400> 9 Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO10 (C-terminus of Ara h 7 isotype 7.0201) <400> 10 Gln Asn Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO11 (Ara h 7 isotype 7.0101, as expressed in example 1) <400> 11 Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ser Met Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser 20 25 30 Arg Trp Asp Ala Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu 35 40 45 Gln Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Met Arg Arg Arg Val 50 55 60 Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Arg Arg 65 70 75 80 Gly Ser Arg Gly Arg Gln Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asn Gln Glu Gln 85 90 95 Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met 100 105 110 Cys Gln Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Trp Val Pro 115 120 125 Ala Gly Gln Glu Pro Val Ala Ser Asp Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu 130 135 140 Ala Pro Glu Leu Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro Leu 145 150 155 <210> 12 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO12 (Ara h 7 isotype 7.0201, as expressed in example 1) <400> 12 Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ser Met Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser 20 25 30 Arg Trp Asp Ala Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu 35 40 45 Gln Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val 50 55 60 Glu Lys Glu Gln Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ile Gln Arg 65 70 75 80 Gly Ser Arg Gly Gln Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln 85 90 95 Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met 100 105 110 Cys Gln Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln 115 120 125 Gln Asp Arg Ser Gln Leu His Gln Met Glu Arg Glu Leu Arg Asn Leu 130 135 140 Pro Gln Asn Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu Ser Ser 145 150 155 160 Arg Thr Pro Tyr <210> 13 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO13 (Ara h 7 isotype 7.0, as expressed in example 1) <400> 13 Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ser Met Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Leu 20 25 30 Arg Trp Asp Ala Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu 35 40 45 Gln Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val 50 55 60 Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Gln Arg 65 70 75 80 Gly Ser Arg Gly Arg Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln 85 90 95 Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met 100 105 110 Cys Gln Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln 115 120 125 Gln Asp Arg Ser Gln Leu His Gln Asn Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu 130 135 140 Ala Pro Glu Leu Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro 145 150 155 <210> 14 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO14 (Ara h 2 isotype 2.0201, as expressed in example 1) <400> 14 Met Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg Thr Met Arg Gln 1 5 10 15 Gln Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg Cys Gln Ser Gln Leu Glu Arg 20 25 30 Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Gln His Leu Met Gln Lys Ile Gln Arg 35 40 45 Asp Glu Asp Ser Tyr Gly Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro 50 55 60 Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Asp Arg Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser 65 70 75 80 Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser Ser Gln His Gln Glu Arg Cys 85 90 95 Cys Asn Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Glu 100 105 110 Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu Gln Gly Arg 115 120 125 Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Gln 130 135 140 Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Glu Val Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gly Arg Asp Arg Tyr 165 <210> 15 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO15 (Ara h 6 isotype 6.0101, as expressed in example 1) <400> 15 Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ser Met Arg Arg Glu Arg Gly Arg Gln Gly Asp Ser Ser Ser 20 25 30 Cys Glu Arg Gln Val Asp Arg Val Asn Leu Lys Pro Cys Glu Gln His 35 40 45 Ile Met Gln Arg Ile Met Gly Glu Gln Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp 50 55 60 Ile Arg Ser Thr Arg Ser Ser Asp Gln Gln Gln Arg Cys Cys Asp Glu 65 70 75 80 Leu Asn Glu Met Glu Asn Thr Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln 85 90 95 Gln Ile Met Glu Asn Gln Cys Asp Arg Leu Gln Asp Arg Gln Met Val 100 105 110 Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Met Asn Leu Pro Gln Gln Cys Asn Phe 115 120 125 Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Ser Gly Gly Arg Cys 130 135 140 <210> 16 <211> 615 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO17: Ara h 1.01.01 as used in example 3 <400> 16 Met Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg Thr Met Lys Ser 1 5 10 15 Ser Pro Tyr Gln Lys Lys Thr Glu Asn Pro Cys Ala Gln Arg Cys Leu 20 25 30 Gln Ser Cys Gln Gln Glu Pro Asp Asp Leu Lys Gln Lys Ala Cys Glu 35 40 45 Ser Arg Cys Thr Lys Leu Glu Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Pro 50 55 60 Arg Gly His Thr Gly Thr Thr Asn Gln Arg Ser Pro Pro Gly Glu Arg 65 70 75 80 Thr Arg Gly Arg Gln Pro Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Pro 85 90 95 Arg Arg Glu Glu Gly Gly Arg Trp Gly Pro Ala Gly Pro Arg Glu Arg 100 105 110 Glu Arg Glu Glu Asp Trp Arg Gln Pro Arg Glu Asp Trp Arg Arg Pro 115 120 125 Ser His Gln Gln Pro Arg Lys Ile Arg Pro Glu Gly Arg Glu Gly Glu 130 135 140 Gln Glu Trp Gly Thr Pro Gly Ser His Val Arg Glu Glu Thr Ser Arg 145 150 155 160 Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser Arg Arg Phe Ser Thr Arg Tyr Gly 165 170 175 Asn Gln Asn Gly Arg Ile Arg Val Leu Gln Arg Phe Asp Gln Arg Ser 180 185 190 Arg Gln Phe Gln Asn Leu Gln Asn His Arg Ile Val Gln Ile Glu Ala 195 200 205 Lys Pro Asn Thr Leu Val Leu Pro Lys His Ala Asp Ala Asp Asn Ile 210 215 220 Leu Val Ile Gln Gln Gly Gln Ala Thr Val Thr Val Ala Asn Gly Asn 225 230 235 240 Asn Arg Lys Ser Phe Asn Leu Asp Glu Gly His Ala Leu Arg Ile Pro 245 250 255 Ser Gly Phe Ile Ser Tyr Ile Leu Asn Arg His Asp Asn Gln Asn Leu 260 265 270 Arg Val Ala Lys Ile Ser Met Pro Val Asn Thr Pro Gly Gln Phe Glu 275 280 285 Asp Phe Phe Pro Ala Ser Ser Arg Asp Gln Ser Ser Tyr Leu Gln Gly 290 295 300 Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Ala Phe Asn Ala Glu Phe Asn Glu 305 310 315 320 Ile Arg Arg Val Leu Leu Glu Glu Asn Ala Gly Gly Glu Gln Glu Glu 325 330 335 Arg Gly Gln Arg Arg Trp Ser Thr Arg Ser Ser Glu Asn Asn Glu Gly 340 345 350 Val Ile Val Lys Val Ser Lys Glu His Val Glu Glu Leu Thr Lys His 355 360 365 Ala Lys Ser Val Ser Lys Lys Gly Ser Glu Glu Glu Gly Asp Ile Thr 370 375 380 Asn Pro Ile Asn Leu Arg Glu Gly Glu Pro Asp Leu Ser Asn Asn Phe 385 390 395 400 Gly Lys Leu Phe Glu Val Lys Pro Asp Lys Lys Asn Pro Gln Leu Gln 405 410 415 Asp Leu Asp Met Met Leu Thr Cys Val Glu Ile Lys Glu Gly Ala Leu 420 425 430 Met Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Met Val Ile Val Val Val Asn 435 440 445 Lys Gly Thr Gly Asn Leu Glu Leu Val Ala Val Arg Lys Glu Gln Gln 450 455 460 Gln Arg Gly Arg Arg Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu 465 470 475 480 Gly Ser Asn Arg Glu Val Arg Arg Tyr Thr Ala Arg Leu Lys Glu Gly 485 490 495 Asp Val Phe Ile Met Pro Ala Ala His Pro Val Ala Ile Asn Ala Ser 500 505 510 Ser Glu Leu His Leu Leu Gly Phe Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn His 515 520 525 Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Lys Asp Asn Val Ile Asp Gln Ile Glu 530 535 540 Lys Gln Ala Lys Asp Leu Ala Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gln Val Glu 545 550 555 560 Lys Leu Ile Lys Asn Gln Lys Glu Ser His Phe Val Ser Ala Arg Pro 565 570 575 Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Pro Glu Lys Glu Ser Pro Glu 580 585 590 Lys Glu Asp Gln Glu Glu Glu Asn Gln Gly Gly Lys Gly Pro Leu Leu 595 600 605 Ser Ile Leu Lys Ala Phe Asn 610 615 <210> 17 <211> 527 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO18: Ara h 3.01.01 as used in example 3 <400> 17 Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ser Met Arg Gln Gln Pro Glu Glu Asn Ala Cys Gln Phe Gln 20 25 30 Arg Leu Asn Ala Gln Arg Pro Asp Asn Arg Ile Glu Ser Glu Gly Gly 35 40 45 Tyr Ile Glu Thr Trp Asn Pro Asn Asn Gln Glu Phe Glu Cys Ala Gly 50 55 60 Val Ala Leu Ser Arg Leu Val Leu Arg Arg Asn Ala Leu Arg Arg Pro 65 70 75 80 Phe Tyr Ser Asn Ala Pro Gln Glu Ile Phe Ile Gln Gln Gly Arg Gly 85 90 95 Tyr Phe Gly Leu Ile Phe Pro Gly Cys Pro Arg His Tyr Glu Glu Pro 100 105 110 His Thr Gln Gly Arg Arg Ser Gln Ser Gln Arg Pro Pro Arg Arg Leu 115 120 125 Gln Gly Glu Asp Gln Ser Gln Gln Gln Arg Asp Ser His Gln Lys Val 130 135 140 His Arg Phe Asp Glu Gly Asp Leu Ile Ala Val Pro Thr Gly Val Ala 145 150 155 160 Phe Trp Leu Tyr Asn Asp His Asp Thr Asp Val Val Ala Val Ser Leu 165 170 175 Thr Asp Thr Asn Asn Asn Asp Asn Gln Leu Asp Gln Phe Pro Arg Arg 180 185 190 Phe Asn Leu Ala Gly Asn Thr Glu Gln Glu Phe Leu Arg Tyr Gln Gln 195 200 205 Gln Ser Arg Gln Ser Arg Arg Arg Ser Leu Pro Tyr Ser Pro Tyr Ser 210 215 220 Pro Gln Ser Gln Pro Arg Gln Glu Glu Arg Glu Phe Ser Pro Arg Gly 225 230 235 240 Gln His Ser Arg Arg Glu Arg Ala Gly Gln Glu Glu Glu Asn Glu Gly 245 250 255 Gly Asn Ile Phe Ser Gly Phe Thr Pro Glu Phe Leu Glu Gln Ala Phe 260 265 270 Gln Val Asp Asp Arg Gln Ile Val Gln Asn Leu Arg Gly Glu Thr Glu 275 280 285 Ser Glu Glu Glu Gly Ala Ile Val Thr Val Arg Gly Gly Leu Arg Ile 290 295 300 Leu Ser Pro Asp Arg Lys Arg Arg Ala Asp Glu Glu Glu Glu Tyr Asp 305 310 315 320 Glu Asp Glu Tyr Glu Tyr Asp Glu Glu Asp Arg Arg Arg Gly Arg Gly 325 330 335 Ser Arg Gly Arg Gly Asn Gly Ile Glu Glu Thr Ile Cys Thr Ala Ser 340 345 350 Ala Lys Lys Asn Ile Gly Arg Asn Arg Ser Pro Asp Ile Tyr Asn Pro 355 360 365 Gln Ala Gly Ser Leu Lys Thr Ala Asn Asp Leu Asn Leu Leu Ile Leu 370 375 380 Arg Trp Leu Gly Pro Ser Ala Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr Arg Asn Ala 385 390 395 400 Leu Phe Val Ala His Tyr Asn Thr Asn Ala His Ser Ile Ile Tyr Arg 405 410 415 Leu Arg Gly Arg Ala His Val Gln Val Val Asp Ser Asn Gly Asn Arg 420 425 430 Val Tyr Asp Glu Glu Leu Gln Glu Gly His Val Leu Val Val Pro Gln 435 440 445 Asn Phe Ala Val Ala Gly Lys Ser Gln Ser Glu Asn Phe Glu Tyr Val 450 455 460 Ala Phe Lys Thr Asp Ser Arg Pro Ser Ile Ala Asn Leu Ala Gly Glu 465 470 475 480 Asn Ser Val Ile Asp Asn Leu Pro Glu Glu Val Val Ala Asn Ser Tyr 485 490 495 Gly Leu Gln Arg Glu Gln Ala Arg Gln Leu Lys Asn Asn Asn Pro Phe 500 505 510 Lys Phe Phe Val Pro Pro Ser Gln Gln Ser Pro Arg Ala Val Ala 515 520 525

Claims

대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO 6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하는 진단학적으로 유용한 담체로서,
상기 담체는 바람직하게는 비드, 테스트 스트립, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로어레이, 셀룰로오스 유래의 고형 고분자, 바람직하게는 웨스턴 블롯, 라인 블롯 및 도트 블롯으로 이루어진 그룹으로부터의 블롯, 유리면, 슬라이드, 바이오칩 및 멤브레인으로 이루어진 그룹에서 선택되고, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트 또는 라인 블롯인 담체.
제 1항에 있어서, 상기 담체는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹으로부터의, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3 및 Ara h 9로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체, 더 바람직하게는 Ara h 2에 대한 항체 및/또는Ara h 6에 대한 항체, 가장 바람직하게는 Ara h 2에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 더 포함하는 담체.
제 1항 또는 2항에 따른 진단학적으로 유용한 담체, 및
선택적으로, 포획된 항체를 특이적으로 검출하는 수단을 포함하는 키트.
제 3항에 있어서, 상기 진단학적으로 유용한 담체는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단을 포함하고,
동형체 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO 6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단, 및 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단이 개별 담체에 존재하거나, 또는
동형체 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO 6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단, 및 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체를 특이적으로 포획하는 수단이 하나의 담체에 존재하고, 바람직하게는 하나의 담체에 공유결합되어 있는 키트.
대상자로부터의 샘플에서 Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO 6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제 5항에 있어서, 대상자로부터의 샘플에서, 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5로 이루어진 그룹에서, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3 및 Ara h 9로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 추가적인 항원, 가장 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6에 대한 항체의 존재를 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 5항 또는 제6항에 있어서, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체의 존재나 부재 및 하나 이상의 추가적인 항원, 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6에 대한 항체의 존재가 동시에 검출되는 방법.
제 5항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대한 항체의 존재나 부재, 및 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체의 존재를 공간적으로 분리된 결합 반응에서 검출하는 방법.
제 5항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, Ara h 7 동형 7.0201에 대한 항체의 존재 및 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 항체의 존재를 원 포트 반응에서 검출하는 방법.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 동형 7.0201에 대한 항체는 Ara h 7, 바람직하게는 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO 6, 더 바람직하게는 SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 대해 단일특이적 항체인, 담체, 키트 또는 방법.
SEQ ID NO 8, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함하는 폴리펩티드, 및 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9, Ara h 8 및 Ara h 5, 및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의, 더 바람직하게는 Ara h 2, Ara h 6, Ara h 1, Ara h 3, Ara h 9 및 그의 변형체로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 추가적인 항원, 가장 바람직하게는 Ara h 2 및/또는 Ara h 6을 포함하는 약제학적 조성물.
SEQ ID NO 8, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO6, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201, 또는 그의 변형체를 포함하는 폴리펩티드로서,
상기 폴리펩티드는 재조합, 고정화 정제 또는 융합 단백질이고, 바람직하게는 정제 및 재조합 및 고정화 처리되는 폴리펩티드.
땅콩 알레르기 진단을 위한 제12항에 따른 폴리펩티드, 제1항 또는 제2항 중 어느한 항에 따른 담체, 또는 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도로, 바람직하게는 진단민감도가 증가되는 용도.
땅콩 알레르기 진단용 키트의 제조를 위한 제 12항에 따른 폴리펩티드의 용도에 있어서, 바람직하게는 진단 민감도가 증가되는 용도.
제11항의 약제학적 조성물, 제12항에 따른 폴리펩티드, 또는 제13항 또는 제14항에 따른 용도에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO8, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO6으로 이루어지며, 가장 바람직하게는 Ara h 7 동형 7.0201 또는 이의 변형체는 상기 폴리펩티드 및 Ara h 2 및/또는 Ara h 6 또는 이의 변형체를 포함하는 조성물 내에 있는 약제학적 조성물.
Ara h 7 동형 7.0201, 바람직하게는 SEQ ID NO6, 더 바람직하게는SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 및 SEQ ID NO10으로 이루어진 그룹으로부터의 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO8에 특이적으로 결합되는 항체로서, 이는 바람직하게는 단리되어 있는 항체, 바람직하게는 IgE, IgG1 및 IgG4클래스 항체.
땅콩 알레르기의 진단 또는 땅콩 알레르기 진단용 키트의 제조를 위한 제 16항에 따른 항체의 용도.