CN112986578B - 一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条及其制备方法，硝酸纤维素膜检测层上设置有一条检测线和一条质控线，检测线上包被所需的肽段及肽段组合，质控线上包被兔抗人血清蛋白，胶体金分别标记肽段和鼠抗人血清蛋白，混合后制备胶体金结合垫。制备步骤：制备筛选获得的肽段配成溶液；采用柠檬酸盐还原法制备的胶体金，用于标记鼠抗人血清蛋白和选定的多肽，并纯化这些金标蛋白和多肽；将前述物料用于胶体金结合垫、检测层的制备，组装获得用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。本发明以筛选出的肽段或肽段组合作为血清中特异性Ig E筛查试纸条的检测抗原及标记对象，能有效改善试纸条的性能，提高检测的稳定性和准确性。

Description

一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测领域，涉及一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条及其制备方法。
背景技术
过敏反应是人们对某些食物/环境等外界刺激产生的一种不良反应，在医学上属于一种变态反应，多由特异性Ig E介导。过敏的完整诊断包括临床病史、流行病学与免疫学病因、皮肤试验与过敏原特异性Ig E抗体检测试验等。
体外特异性Ig E抗体检测包括免疫印记法、放射变应原吸附诊断、荧光酶标法、酶联免疫法、免疫层析试纸条检测等。体外ImmunoCAP系统因其良好的重复性、精确性及全自动的技术，被视为体外sIg E检测方法的“金标准”，但该技术不仅需要精密的仪器，严苛的测试环境和昂贵的试剂耗材，还需要配备熟练操作的技术人员。而免疫层析试纸条检测技术具有操作简便、结果快速且稳定、不需要大型设备及成本低廉等优点，可以广泛应用于过敏原检测及血清中特异性Ig E的筛查。
已有用于筛查食物过敏特异性Ig E的试纸条大多数采用过敏原全蛋白作为检测线抗原，但蛋白质分离纯化的过程较为复杂，抗原的批间稳定性差；蛋白质容易受物理化学条件的影响而变性，存储稳定性差；全蛋白可能含有非特异性结合位点，导致出现假阳性。已有用于筛查食物过敏特异性Ig E的试纸条大多数将金标蛋白质喷洒在膜上得到胶体金结合垫，但全蛋白中各组分的等电点差异较大，胶体金标记效率不一。
发明内容
本发明的目的是提出一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明所述的一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条，其特征在于：硝酸纤维素膜检测层上设置有一条检测线（T线）和一条质控线（C线），检测线上包被所需的肽段及肽段组合，质控线上包被兔抗人血清蛋白，胶体金分别标记肽段和鼠抗人血清蛋白，混合后制备胶体金结合垫。
本发明所述的一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条的制备方法，按如下步骤。
（1）肽段的制备：根据检测的对象，筛选并合成所需特异性Ig E的3-45肽的肽段，将肽段或其组合（包括2-25种肽段）分别用作金标肽段和检测线肽段。
（2）肽段溶液的制备：将合成的肽段分别溶解在0.8-1.1％NaCl溶液中，使其最终溶度为0.5-5mg/ml，即得到待金标的肽段溶液和检测线肽段溶液。
（3）胶体金的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。
（4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为1-10:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物。
（5）金标多肽的制备：用0.08-0.13M HCl溶液或0.08-0.13M K2CO3溶液调节步骤（2）中待金标的肽段溶液，使溶液达到其最适pH值，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，肽段溶液与胶体金溶液的体积比为1-10:100，同时加入稳定剂以防止肽段与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-肽段结合物。对于肽段组合，则将各多肽分别标记后，再按照浓度需求混合在一起。
（6）金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂中，使其浓度达到5-30％；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
（7）胶体金结合垫的制备：用三维平面点膜喷金仪，将各金标多肽及金标鼠抗人血清蛋白按5-10:1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.8-1.2pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
（8）检测层的制备：用三维平面点膜喷金仪，将步骤（2）中检测线肽段溶液均匀喷在检测线上，将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线。喷液量为0.8-1.8pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
（9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
肽段可以直接人工合成，不同批次之间稳定性良好；合成的肽段存储稳定性的远优于全蛋白。过敏原蛋白，尤其是食物过敏原蛋白，在人体中都只有部分片段以多肽被Ig E识别引发过敏反应，利用多肽检测血清中的特异性Ig E，结果更贴近事实。多轮筛选研究发现，有很多肽段能够且只能够与相应的Ig E特异性结合，这有效保证了多肽抗原检测结果的准确性。在用胶体金标记肽段时，肽段的等电点是确定的，胶体金能够稳定标记。利用肽段组合作为抗原时，也可分别标记肽段后，再将标记好的肽段混合使用。
本发明以筛选出的肽段或肽段组合作为血清中特异性Ig E筛查试纸条的检测抗原及标记对象，能有效改善试纸条的性能，提高检测的稳定性和准确性。
附图说明
图1为本发明用于食物过敏特异性Ig E筛查的试纸条示意图；其中，1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜检测层，4为吸水垫，5为检测线T线，6为质控线C线，7为PVC底板。
图2为本发明实施例5检测结果照片。
具体实施方式
本发明筛选肽段或肽段组合，捕捉人血清中的特异性Ig E，并以此初步表征患者过敏情况。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1。花生过敏特异性Ig E筛查试纸条。
1)肽段的制备：根据检测的对象，选择花生过敏原蛋白优势表位肽，合成金标肽段ELQGDRRCQSQLER、RDPYSPSQDPYSPS，合成检测线肽段RLPFSPSQDPFSPS。
2)肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段ELQGDRRCQSQLER、RDPYSPSQDPYSPS分别溶解到0.9％NaCl溶液中，使溶度都为2mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段RLPFSPSQDPFSPS溶解到0.8％NaCl溶液中，使其溶度为5mg/ml，即得到检测线肽段溶液。
3)胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。
4)金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为BSA（牛血清白蛋白）和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。
5)金标肽段的制备：用0.13M HCl溶液分别调节金标肽段ELQGDRRCQSQLER、RDPYSPSQDPYSPS溶液的pH值至6.77、4.71，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段ELQGDRRCQSQLER与胶体金溶液的体积比为8:100，金标肽段RDPYSPSQDPYSPS与胶体金溶液的体积比为5:100，同时加入BSA以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。
6)金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
7)胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段ELQGDRRCQSQLER、RDPYSPSQDPYSPS及金标鼠抗人血清蛋白8：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.8pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
8)检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将2中检测线肽段溶液均匀喷洒，得到T检测线，喷液量为1.8pL/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pL/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。
9)试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
10)结果判断：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本产品利用花生过敏原蛋白优势表位肽及其突变体，提供一种用于花生过敏特异性Ig E筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了10个血样，其中来源于花生过敏患者的血样8个。检测结果显示，全部8个花生过敏患者的血样中特异性Ig E均为阳性，且其他2个非花生过敏患者的血清Ig E检测结果均为阴性。
实施例2 。用于花生过敏特异性Ig E筛查的试纸条。
1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段RDYYSPSQDYYSPS、RLPFSPSQDPFSPS，合成检测线肽段ELQGDRRCQSQLERRDPFSPSQDPFSPS。
2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段RDYYSPSQDYYSPS、RLPFSPSQDPFSPS分别溶解到0.9％NaCl溶液中，使其溶度为2mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段ELQGDRRCQSQLERRDPFSPSQDPFSPS溶解到1.1％的NaCl溶液中，使其溶度为4mg/ml，即得到检测线肽段溶液。
3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。
4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为BSA（牛血清白蛋白）和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。
5）金标肽段的制备：用0.13M HCl溶液分别调节金标肽段RDYYSPSQDYYSPS、RLPFSPSQDPFSPS溶液的pH值至4.71、6.34，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段RDYYSPSQDYYSPS与胶体金溶液的体积比为8:100，金标肽段RLPFSPSQDPFSPS与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入BSA以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。
6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段RDYYSPSQDYYSPS、RLPFSPSQDPFSPS及金标鼠抗人血清蛋白6：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.2pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2中检测线肽段ELQGDRRCQSQLERRDPFSPSQDPFSPS肽段溶液均匀喷洒，得到T检测线，喷液量为1.5pL/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pL/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。
9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
10）结果判断：
Figure 981761DEST_PATH_IMAGE001
。
本产品利用花生过敏原蛋白优势表位肽及其突变体，提供一种用于花生过敏特异性Ig E筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了30个血样，其中来源于花生过敏患者的血样5个。检测结果显示，全部5个花生过敏患者的血样中特异性Ig E均为阳性，且其他25个非花生过敏患者的血清Ig E检测结果均为阴性。
实施例3。用于花生过敏特异性Ig E筛查的试纸条。
1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段RDPFSPSQDPFSPS、RLPFSPSQDPFSPS，合成检测线肽段CQS、HRDPYSPSQDPYSPSARDWYSPSQDWYSPSARDYYSPSQDYYSPS。
2）肽段溶液的制备：将上合成的肽段RDPFSPSQDPFSPS、RLPFSPSQDPFSPS分别溶解到1.1％NaCl溶液中，使其溶度为2mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的肽段CQS、HRDPYSPSQDPYSPSARDWYSPSQDWYSPSARDYYSPSQDYYSPS分别溶解到0.9％NaCl溶液中，使其溶度为5mg/ml、3mg/ml，即得到检测线肽段溶液。
3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。
4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为BSA（牛血清白蛋白）和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。
5）金标肽段的制备：用0.1M HCl溶液分别调节RDPFSPSQDPFSPS、RLPFSPSQDPFSPS溶液的pH值至4.71、6.34，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，RDPFSPSQDPFSPS与胶体金溶液的体积比为5:100，RLPFSPSQDPFSPS与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入BSA以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。
6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段RDPFSPSQDPFSPS、RLPFSPSQDPFSPS及金标鼠抗人血清蛋白7：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将2中CQS肽段溶液、HRDPYSPSQDPYSPSARDWYSPSQDWYSPSARDYYSPSQDYYSPS肽段溶液均匀混合后喷洒，得到T检测线，喷液量为1.3pL/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pL/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。
9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
10）结果判断：
Figure 977398DEST_PATH_IMAGE001
。
本产品利用花生过敏原蛋白优势表位肽及其突变体，提供一种用于花生过敏特异性Ig E筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了39个血样，其中来源于花生过敏患者的血样12个。检测结果显示，全部12个花生过敏患者的血样中特异性Ig E均为阳性，且其他27个非花生过敏患者的血清Ig E检测结果均为阴性。
实施例4。用于牛奶过敏特异性Ig E筛查的试纸条。
1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段LEIVPNSAEERL、KNRLNFLKKISQRYQ，合成检测线肽段ENLLRFFVAPFPEVFGK、SEEIVPNSVE、YTDAPSFSDIPNPIGSENSEK、NEINQFYQKFPOYLOYLY。
2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段LEIVPNSAEERL、KNRLNFLKKISQRYQ分别溶解到1.1％NaCl溶液中，使其溶度为4mg/ml、3mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段ENLLRFFVAPFPEVFGK、SEEIVPNSVE、YTDAPSFSDIPNPIGSENSEK、NEINQFYQKFPOYLOYLY分别溶解到0.9％NaCl溶液中，使其溶度为4mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml，即得到检测线肽段溶液。
3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。
4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为BSA（牛血清白蛋白）和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。
5）金标肽段的制备：用0.13M HCl溶液分别调节金标肽段LEIVPNSAEERL溶液的pH值分别至4.75，用0.13M K2CO3溶液调节金标肽段KNRLNFLKKISQRYQ溶液的pH值分别至11.67，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段LEIVPNSAEERL、KNRLNFLKKISQRYQ与胶体金溶液的体积比分别为7:100、5:100，同时加入BSA以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。
6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段LEIVPNSAEERL、KNRLNFLKKISQRYQ及金标鼠抗人血清蛋白6：7：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段ENLLRFFVAPFPEVFGK、SEEIVPNSVE、YTDAPSFSDIPNPIGSENSEK、NEINQFYQKFPOYLOYLY肽段溶液均匀混合后喷洒，得到T检测线，喷液量为1.3pL/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pL/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。
9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
10）结果判断：
Figure 115119DEST_PATH_IMAGE001
。
本产品利用牛奶优势表位肽及其突变体，提供一种用于牛奶过敏特异性Ig E筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了22个血样，其中来源于牛奶过敏患者的血样3个。检测结果显示，全部3个牛奶过敏患者的血样中特异性Ig E均为阳性，且其他19个非牛奶过敏患者的血清Ig E检测结果均为阴性。
实施例5。用于坚果过敏特异性Ig E筛查的试纸条。
1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段SGREQSCQRQFE、CREQIQRQQYLNRCQ，合成检测线肽GGYDEDNQRQHF、QEEGIRGEEMEEMVQ、KQEVQRGGRYNQ、SLRECCQELQEV、QEQIKGEEVREL。
2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段SGREQSCQRQFE、CREQIQRQQYLNRCQ分别溶解到1.1％NaCl溶液中，使其溶度为5mg/ml、3mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段GGYDEDNQRQHF、QEEGIRGEEMEEMVQ、KQEVQRGGRYNQ、SLRECCQELQEV、QEQIKGEEVREL分别溶解到0.9％NaCl溶液中，使其溶度为3mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、3mg/ml，即得到检测线肽段溶液。
3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。
4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为BSA（牛血清白蛋白）和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。
5）金标肽段的制备：用0.08M HCl溶液分别调节金标肽段SGREQSCQRQFE溶液的pH值分别至6.36，用0.08M K2CO3溶液调节金标肽段CREQIQRQQYLNRCQ溶液的pH值分别至9.46，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段SGREQSCQRQFE、CREQIQRQQYLNRCQ与胶体金溶液的体积比分别为7:100、5:100，同时加入BSA以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。
6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段SGREQSCQRQFE、CREQIQRQQYLNRCQ及金标鼠抗人血清蛋白8：7：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段GGYDEDNQRQHF、QEEGIRGEEMEEMVQ、KQEVQRGGRYNQ、SLRECCQELQEV、QEQIKGEEVREL肽段溶液均匀混合后喷洒，得到T检测线，喷液量为1.3pL/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pL/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。
9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
10）结果判断：
Figure 701958DEST_PATH_IMAGE001
。
本产品利用碧根果、核桃、腰果优势表位肽及其突变体，提供一种用于坚果过敏特异性Ig E筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了7个血样，其中来源于坚果过敏患者的血样1个。检测结果显示，其中1个坚果过敏患者的血样中特异性Ig E均为阳性，且其他6个非坚果过敏患者的血清Ig E检测结果均为阴性，结果见图2。
实施例6。用于屋尘螨、粉尘螨过敏特异性Ig E筛查的试纸条。
1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段ANNEIKKV、PNACHYMKCPLVKGQQ、DANQNTKTA、CANHE，合成检测线肽段HGSEPCIIHRG、EANQNTKTA、DGLEI、VPGIDTNACHFMKCPLVKGQQ、WNVPKIAPKSEN、AKIRD、WNVPKIAPKSEN、GDNG、THGKIRD。
2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段ANNEIKKV、PNACHYMKCPLVKGQQ、DANQNTKTA、CANHE分别溶解到1.1％NaCl溶液中，使其溶度为4mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段HGSEPCIIHRG、EANQNTKTA、DGLEI、VPGIDTNACHFMKCPLVKGQQ、WNVPKIAPKSEN、AKIRD、WNVPKIAPKSEN、GDNG、THGKIRD分别溶解到0.9％NaCl溶液中，使其溶度为5mg/ml、2mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、4mg/ml，即得到检测线肽段溶液。
3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。
4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为BSA（牛血清白蛋白）和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。
5）金标肽段的制备：用0.08M K2CO3溶液调节金标肽段ANNEIKKV、PNACHYMKCPLVKGQQ溶液的pH值分别至9.14、9.46，用0.08M HCl溶液分别调节金标肽段DANQNTKTA、CANHE溶液的pH值分别至6.34、5.74，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段ANNEIKKV、PNACHYMKCPLVKGQQ、DANQNTKTA、CANHE与胶体金溶液的体积比分别为7:100、5:100、4:100、10:100，同时加入BSA以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。
6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段ANNEIKKV、PNACHYMKCPLVKGQQ、DANQNTKTA、CANHE及金标鼠抗人血清蛋白5：7：10：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段HGSEPCIIHRG、EANQNTKTA、DGLEI、VPGIDTNACHFMKCPLVKGQQ、WNVPKIAPKSEN、AKIRD、WNVPKIAPKSEN、GDNG、THGKIRD肽段溶液均匀混合后喷洒，得到T检测线，喷液量为1.3pL/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pL/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。
9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
10）结果判断：
Figure 925129DEST_PATH_IMAGE001
。
本产品利用屋尘螨、粉尘螨优势表位肽及其突变体，提供一种用于屋尘螨、粉尘螨过敏特异性Ig E筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了16个血样，其中来源于屋尘螨、粉尘螨过敏患者的血样4个。检测结果显示，全部4个屋尘螨、粉尘螨过敏患者的血样中特异性Ig E均为阳性，且其他12个非屋尘螨、粉尘螨过敏患者的血清Ig E检测结果均为阴性。
实施例7。用于初步食物过敏特异性Ig E筛查的试纸条。
1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段SQQIKMANKKMKKEQYSC、ELQGDRRCQSQLER、EAGLAP、PGSAG、ENLLRFFVAPFPEVFGK、SDFIEEDELK、LQKEVDRLEDE，合成检测线肽段RDPYSPSQDPYSPS、STWSELAQGDVDDCAQSQLKEDMP、AVFFPYCMRDWYGASPSQDWYSPS、LTKFTTQKQVSSLFQLWK、PRPQHPERE、GKFFEITPEKNPQLRDLDIFL、HIATNAVLFFGRCVSP、IAAV、HCLKDGKG、PKSRPDQS、YVEQ、EES、YTDAPSFSDIPNPIGSENSEK、KNRLNFLKKISQRYQ、SEEIVPNSVE、ALTDAETK、ALTDAETK、LFLQNFSASAR、FLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERA、EKD、EASQAADESERMRK、DEERM、FNSKAIVILVINEGDA、NKVE、LEIVPNSAEERL。
2）金标肽段溶液的制备：将上合成的金标肽段SQQIKMANKKMKKEQYSC、ELQGDRRCQSQLER、EAGLAP、PGSAG、ENLLRFFVAPFPEVFGK、SDFIEEDELK、LQKEVDRLEDE分别溶解到0.9％NaCl溶液中，使肽段溶度分别为2mg/ml、1mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、3mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的金标肽段RDPYSPSQDPYSPS、STWSELAQGDVDDCAQSQLKEDMP、AVFFPYCMRDWYGASPSQDWYSPS、LTKFTTQKQVSSLFQLWK、PRPQHPERE、GKFFEITPEKNPQLRDLDIFL、HIATNAVLFFGRCVSP、IAAV、HCLKDGKG、PKSRPDQS、YVEQ、EES、YTDAPSFSDIPNPIGSENSEK、KNRLNFLKKISQRYQ、SEEIVPNSVE、ALTDAETK、ALTDAETK、LFLQNFSASAR、FLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERA、EKD、EASQAADESERMRK、DEERM、FNSKAIVILVINEGDA、NKVE、LEIVPNSAEERL分别溶解到1,1％NaCl溶液中，使金标肽段溶度分别为3mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、1mg/ml、1mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、4mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、0.5mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、2mg/ml，即得到检测线肽段溶液。
3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250mL的三角角烧瓶，装入150mL的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99mL，再加入1mL1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25mL1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。
4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3 溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为BSA（牛血清白蛋白）和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。
5）金标肽段的制备：用0.13M K2CO3溶液调节SQQIKMANKKMKKEQYSC溶液的pH值至10.25，用0.08-0.13M HCl溶液分别调节ELQGDRRCQSQLER、EAGLAP、PGSAG、ENLLRFFVAPFPEVFGK、SDFIEEDELK、LQKEVDRLEDE溶液的pH值分别至6.77、4.50、6.46、6.74、4.33、4.68，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，SQQIKMANKKMKKEQYSC、ELQGDRRCQSQLER、EAGLAP、PGSAG、ENLLRFFVAPFPEVFGK、SDFIEEDELK、LQKEVDRLEDE与胶体金溶液的体积比分别为6:100、8:100、9:100、:8:100、3:100、5:100、10:100。同时加入BSA以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。
6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。
7）金标胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段SQQIKMANKKMKKEQYSC、ELQGDRRCQSQLER、EAGLAP、PGSAG、ENLLRFFVAPFPEVFGK、SDFIEEDELK、LQKEVDRLEDE及金标鼠抗人血清蛋白8：7：6：7：10：9：5：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.8pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。
8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段溶液均匀混合后喷洒，得到T检测线，喷液量为1.0pL/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pL/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。
9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
10）结果判断：
Figure 255616DEST_PATH_IMAGE001
。
本产品利用八大主要食物原优势表位肽及其突变体，提供一种用于初步食物过敏特异性Ig E筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了24个血样，其中存在食物过敏患者的血样12个。检测结果显示，全部12个食物过敏患者的血样中特异性IgE均为阳性，且其他12无食物过敏的血清Ig E检测结果均为阴性。

Claims (2)

1.一种用于血清特异性Ig E筛查的试纸条，其特征是硝酸纤维素膜检测层上设置有一条检测线和一条质控线，检测线上包被所需的肽段及肽段组合，质控线上包被兔抗人血清蛋白，胶体金分别标记肽段和鼠抗人血清蛋白，混合后制备胶体金结合垫；
合成金标肽段为ANNEIKKV、PNACHYMKCPLVKGQQ、DANQNTKTA和CANHE，合成检测线肽段HGSEPCIIHRG、EANQNTKTA、DGLEI、VPGIDTNACHFMKCPLVKGQQ、WNVPKIAPKSEN、AKIRD、WNVPKIAPKSEN、GDNG和THGKIRD。
2.权利要求1所述用于血清特异性Ig E筛查的试纸条的制备方法，其特征是按如下步骤：
（1）肽段的制备：根据检测的对象，筛选并合成权利要求1所述的特异性Ig E的肽段，将肽段组合，分别用作金标肽段和检测线肽段；
（2）肽段溶液的制备：将合成的肽段分别溶解在0.8-1.1% NaCl溶液中，使其最终溶度为0.5-5mg/ml，得到待金标的肽段溶液和检测线肽段溶液；
（3）采用柠檬酸盐还原法制备胶体金；
（4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1M K2CO3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的pH值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为1-10：100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；
（5）金标多肽的制备：用0.08-0.13M HCl溶液或0.08-0.13M K2CO3溶液调节步骤（2）中待金标的肽段溶液，使溶液达到其最适pH值，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，肽段溶液与胶体金溶液的体积比为1-10：100，同时加入稳定剂以防止肽段与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-肽段结合物；对于肽段组合，则将各多肽分别标记后，再按照浓度需求混合在一起；
（6）金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂中，使其浓度达到5-30%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存；
（7）胶体金结合垫的制备：用三维平面点膜喷金仪，将各金标多肽及金标鼠抗人血清蛋白按5-10：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.8-1.2pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用；
（8）检测层的制备：用三维平面点膜喷金仪，将步骤（2）中检测线肽段溶液均匀喷在检测线上，将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线；喷液量为0.8-1.8pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用；
（9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，得用于血清特异性Ig E筛查的试纸条。
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