CN114062666A - 一卡式定量检测rf、aso、crp和ccp的检测板的制备方法 - Google Patents
一卡式定量检测rf、aso、crp和ccp的检测板的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：制备样品垫，制备反应膜，将所得的样品垫和反应膜搭接在底板上，所述反应膜包括标记区、检测区和质控区，所述标记区设置有荧光标记线，所述检测区包括依次排列的RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线，所述质控区包括质控线。通过将四个检测指标，同时制备到一个试纸条上，使检测试纸条只需一根，达到真正意义上的一次上样同时出来四个检测结果，可以极大的降低试纸条生产成本，并且操作简单方便，重复性好，同时样本量需求少，只需单次上样，大大缩短加样时间和检测等待时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测装置领域，具体地说，是涉及一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法。
背景技术
类风湿因子（RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体，存在于类风湿性关节炎患者及某些自身免疫性疾病患者血清或关节液内，正常人体内基本没有或含量很低，阳性常见于类风湿性关节炎患者（RA），某些免疫性疾病如SLE、皮肌炎、干燥综合症等。
链球菌溶血素"O"（SLO）是A族溶血性链球菌的重要代谢产物之一，它是一种具有溶血活性的蛋白质，能溶解人及一些动物的红细胞。同时链球菌溶血素"O"具有抗原性，能刺激机体产生相应的抗体，故也称抗“O”（ASO）。A族溶血性链球菌在人体中作为正常菌群存在，正常人体内的ASO具有一定的基础值。ASO主要用于协助诊断风湿病，当存在链球菌感染时，其效价会升高，风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、急性扁桃体炎等ASO明显升高，少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病人亦可使ASO增高。
C-反应蛋白（CRP）是急性时相反应蛋白，正常情况下含量极微量，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高，类风湿关节炎活动时CRP一般轻度或中度增高，急性风湿热活动期CRP可非常明显增高。因此CRP是协助诊断风湿与类风湿疾病的指标，亦是区分病情活动与非活动，改善或恶化，疗效的敏感指标。
抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-CCP)，是一个环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，是由类风湿患者的B淋巴细胞自发分泌的一种免疫球蛋白，而其他疾病患者和正常人群的B淋巴细胞一般不自发分泌抗CCP抗体。因此，对于类风湿关节炎具有高度的特异性。
CN 104459140 B公开了一种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素 O、抗环瓜氨酸肽抗体、C反应蛋白的检测试剂盒，该试剂盒采用荧光微球免疫层析法，但该方法试剂卡互相独立，一卡一项，生产相对复杂，且荧光微球标记效率较低。CN 204882563 U公开了一种类风湿关节炎试剂盒，该试剂盒采用胶体金法同时检测RF、CCP和CRP，操作简便快速，易观察，但胶体金免疫层析法具有准确性和稳定性不高的局限性。
目前市面上尚缺少可以一卡同时、快速、准确、定量检测上述四项指标的检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法。
1. 本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：制备样品垫，制备反应膜，将所得的样品垫和反应膜搭接在底板上，所述反应膜包括标记区、检测区和质控区，所述标记区设置有荧光标记线，荧光标记线为用荧光物质对山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体和CCP抗原进行标记，将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在试纸条的标记区形成；所述检测区包括依次排列的RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线，CRP检测线、ASO检测线、RF检测线和CCP检测线为将鼠抗人CRP抗体、RF抗原、ASO抗原和CCP抗原用包被液稀释到1～1.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在检测区形成；所述质控区包括质控线，质控线为将羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在质控区形成；用样本稀释液稀释样本，将稀释后的样本加到样品垫上检测；
荧光物质标记工艺包括以下步骤：
抗体的准备：每50μL体系中，准备0.2mg山羊抗人IgM单克隆抗体，0.2mgASO抗原，0.2mg鼠抗人CRP单克隆抗体，0.2mg CCP抗原，放于室温平衡20min；
荧光素的准备：荧光素用DMSO溶解至1μmol/L备用；
标记：将每50μL体系中加入2μL荧光素的比例进行配比，加入到备好的的蛋白液中，搅拌混匀，剩余体积用pH 9.5碳酸氢钠补足，反应2h；
透析：标记完成抗体，用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍，在PBS缓冲液中透析12小时以上即得标记好的荧光抗体。
试剂盒采用免疫荧光双抗体/抗原夹心法定量检测人血清、血浆和全血中RF/ASO/CRP/CCP的含量。当样本中含有RF/ASO/CRP/CCP时，RF/ASO/CRP/CCP分别与检测板上荧光标记的山羊抗人IgM抗体、荧光标记的ASO抗原、荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体、荧光标记的CCP抗原结合形成复合物，通过层析作用扩散到检测线时分别与包被的RF抗原、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体、CCP抗原结合。因此样本中RF/ ASO/ CRP/CCP含量越高，检测线上复合物积累量越多。荧光抗体的信号强度反映了被捕获的RF/ASO/CRP/CCP数量。
作为一种优选方案，所述荧光素为Biotium公司的CF647荧光染料。
作为一种优选方案，所述包被液为称量Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.24g,NaCl8g,KCl 0.2g,海藻糖10g,溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000 mL制备所得。
作为一种优选方案，所述包被液为海藻糖5g，Tris 1.21g，溶解于超纯水，用HCl调解PH值至8.0，然后定容至1L制备所得。
作为一种优选方案，样本稀释液为称量Na2HPO4•12H2O 2.865g，NaH2PO4•2H2O0.272g，NaCl 7.948g，Tween-20 1mL，TX-100 1mL， BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000mL制备所得。
作为一种优选方案，样本稀释液为称量Tris 1.21g，Tween-20 1mL，Triton X-1001mL，BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用HCl调pH至8.0，定容至1000mL制备所得。
作为一种优选方案，所述样品垫为玻璃纤维或硝酸纤维素膜或全血过滤垫。
作为一种优选方案，所述样品垫的制备方法为:放于样品垫处理液中浸泡后，取出于37℃干燥箱中干燥12小时然后加入干燥剂封存。
作为一种优选方案，所述样品垫处理液为含有1%BSA、0.05% Tween-20和0.05%叠氮钠的磷酸盐缓冲溶液。
作为一种优选方案，所述样品垫处理液为含有1%BSA、0.05% Tween-20和0.05%叠氮钠的0.01MTris-HCl缓冲溶液。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：
通过将四个检测指标，同时制备到一个试纸条上，使检测试纸条只需一根，达到真正意义上的一次上样同时出来四个检测结果，可以极大的降低试纸条生产成本，并且操作简单方便，重复性好，同时样本量需求少，只需单次上样，大大缩短加样时间和检测等待时间。
以固相反应取代液相反应，应用荧光染料标记的鼠抗人IgM抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP抗体和CCP抗原，直接包被在硝酸纤维素膜上，与传统的试纸条检测方法相比，固相反应具有稳定性好，容易常温保存等优势，且将标记抗体直接包被在硝酸纤维素膜，省去传统结合垫的处理及容易聚集、释放不好的问题，增加检测结果的准确性，生产工艺更简单。
本发明经筛选后采用的新型荧光染料作为示踪物标记抗体，其具有较强的耐光性，不易淬灭，可稳定2年；且荧光量子产量高，易与被标记的抗体结合而不影响被标记物的特异性；水溶性好，同时最大限度的提高了信噪比；且包被于硝酸纤维素膜上，更容易释放，重复性好；以新型荧光染料替代传统的胶体金、量子点和荧光颗粒，进一步提高了检测的灵敏度、准确性和重复性。
与传统的检测方法相比，还具有检测线性范围宽的优势，测量范围广，测量结果精确，检测灵敏度高，可用于类风湿早期诊断，提高类风湿早期诊断的准确性，减少误诊率。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是本发明一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、 “右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“ 顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
实施例1：一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，制备样品垫，制备反应膜，将所得的样品垫和反应膜搭接在底板上，所述反应膜包括标记区、检测区和质控区，所述标记区设置有荧光标记线，荧光标记线为用荧光物质对山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体和CCP抗原进行标记，将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在试纸条的标记区形成；所述检测区包括依次排列的RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线，CRP检测线、ASO检测线、RF检测线和CCP检测线为将鼠抗人CRP抗体、RF抗原、ASO抗原和CCP抗原用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在检测区形成；所述质控区包括质控线，质控线为将羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在质控区形成；用样本稀释液稀释样本，将稀释后的样本加到样品垫上检测；
荧光物质标记工艺包括以下步骤：
抗体的准备：每50μL体系中，准备0.2mg山羊抗人IgM单克隆抗体，0.2mgASO抗原，0.2mg鼠抗人CRP单克隆抗体，0.2mg CCP抗原，放于室温平衡20min；
荧光素的准备：荧光素用DMSO溶解至1μmol/L备用；
标记：将每50μL体系中加入2μL荧光素的比例进行配比，加入到备好的的蛋白液中，搅拌混匀，剩余体积用pH 9.5碳酸氢钠补足，反应2h；
透析：标记完成抗体，用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍，在PBS缓冲液中透析12小时以上即得标记好的荧光抗体。
如图1所示，检测板包括上盖1和下盖2以及设置在上盖1和下盖2之间的试纸条3，上盖1和下盖2之间形成检测腔，试纸条3位于检测腔内，本实施例中，检测腔为下盖2上的凹槽4，试纸条3与凹槽4形状适配，且上盖1和下盖2均为条状，凹槽4也为长条状，相应的试纸条3也为长条状。所述试纸条3包括底板5以及依次搭接地粘贴于底板5上的样品垫6、反应膜7和吸水纸8等各层膜结构，各层之间紧密相连且部分重叠。底板5为低荧光特性，承载前述各种膜结构，其根据试纸条3的形状对应裁剪而成，本实施例中为长条形。样品垫6为待检样品收集区，其前端搭接粘贴于底板5的前端上，后端搭接覆盖于反应膜7的前端。样品垫6为玻璃纤维或硝酸纤维素膜或全血过滤垫。反应膜7为硝酸纤维素膜，是一种低荧光特性膜，硝酸纤维素膜分为标记区9、检测区10和质控区11，标记区9具有一条荧光标记线12，为包含荧光染料标记的鼠抗人IgM抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP抗体和CCP抗原的按1：1：1：1混合的混合标记线，检测区10包含RF检测线13、ASO检测线14、CRP检测线15和CCP检测线16，质控区11包含质控线17，所述RF检测线13包被RF抗原，ASO检测线14包被ASO抗原，CRP检测线15包被鼠抗人CRP单克隆抗体，CCP检测线16包被CCP抗原，所述质控线17包被羊抗鼠抗体。荧光标记线12、RF检测线13、ASO检测线14、CRP检测线15和CCP检测线16和质控线17为六条平行带，六条平行带沿硝酸纤维素膜的宽度方向设置并间隔一定距离，且具有一定深度。硝酸纤维素膜的前端搭设于样品垫6上，后端搭设于吸水纸8上，之中间部分粘贴于底板5上。
吸水纸8前端覆盖于反应膜7上，后端固定于底板5上。
本实施例中，指向吸水纸8端的方向为前，指向样品垫6端的方向为后。
样本类型为全血、血清、血浆。样本需要用样本稀释液稀释，将稀释后的样本加到样品垫上进行检测。
本实施例中，上盖1包括加样区18、观察区19和吸水区20，所述加样区18对应样品垫6设置，所述观察区19对应反应膜7设置，所述吸水区20对应吸水纸8设置。
本实施例中的荧光素为Biotium公司的CF647荧光染料，具有较强的耐光性，不易淬灭，可稳定2年；且荧光量子产量高，易与被标记的抗体结合而不影响被标记物的特异性；水溶性好，同时最大限度的提高了信噪比；且包被于硝酸纤维素膜上，更容易释放，重复性好；以新型荧光染料替代传统的胶体金、量子点和荧光颗粒，进一步提高了检测的灵敏度、准确性和重复性。
包被液的配制：称量Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.24g,NaCl 8g,KCl 0.2g,海藻糖10g,溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000 mL。
样本稀释液的配制：称量Na2HPO4•12H2O 2.865g，NaH2PO4•2H2O 0.272g，NaCl7.948g，Tween-20 1mL，Triton X-100 1mL，BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000mL。
样品垫的制备：将样品垫放于样品垫处理液中浸泡后，取出于37℃干燥箱中干燥12小时然后加入干燥剂封存备用；样品垫处理液是含有1%BSA、0.05% Tween-20和0.05%叠氮钠的磷酸盐缓冲溶液。
反应膜的制备：分别将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在NC膜标记区，形成标记线；分别将RF抗原、ASO抗原、鼠抗人CRP抗体和CCP抗原用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量从左到右依次喷涂在反应膜检测区，形成RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线；将羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在反应膜质控区，形成质控线，将划好线的反应膜放置在37℃烘箱中干燥2h；
组装和切割试纸条：下述操作都必须在湿度小于40%，温度25℃的环境中完成。
（1）试纸板的组装：将样品垫、划线后的反应膜和吸水纸依次搭接粘贴在PVC底板上，保持各片材接头处均有1.0-2.0mm的重合长度，形成这种层叠结构是为了保证试纸条各材料之间具有一致的传递性。无层叠或层叠结构没处理好的话，则会影响测试结果。（2）试纸条的裁剪：使用切条机将组装好的试纸板切成3.8mm宽的试纸条。（3）将切好的试纸条，样品垫一端位于加样孔端，封装到上盖和下盖之间，然后装到装有干燥剂的检测板袋中，即得到联合检测板。
实施例2:实施例2与实施例1不同之处在于：
实施例2所用包被液的配制：海藻糖5g，Tris 1.21g，溶解于超纯水，用HCl调解PH值至8.0，然后定容至1L。
实施例3：本实施例中与实施例1不同之处在于：
所用样本稀释液的配制：称量Tris 1.21g，Tween-20 1mL，Triton X-100 1mL，BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用HCl调pH至8.0，定容至1000mL。
实施例4：本实施例中与实施例1不同之处在于：
所用样品垫处理液的配制：含有1%BSA、0.05% Tween-20和0.05%叠氮钠的0.01MTris-HCl缓冲溶液。
实施例5：本实施例中与实施例1不同之处在于：
反应膜的制备为：分别将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在NC膜标记区，形成标记线；分别将鼠抗人CRP抗体、ASO抗原、CCP抗原、RF抗原用包被液稀释到1.25mg/mL，以1.0μL/cm的喷量从左到右依次喷涂在反应膜检测区，形成CRP检测线、ASO检测线、CCP检测线、RF检测线。
实施例6：本实施例中与实施例1不同之处在于：
反应膜的制备为：分别将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在NC膜标记区，形成标记线；分别将鼠抗人CRP抗体、ASO抗原、CCP抗原、RF抗原用包被液稀释到1.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量从左到右依次喷涂在反应膜检测区，形成CRP检测线、ASO检测线、CCP检测线、RF检测线。
试剂盒采用免疫荧光双抗体/抗原夹心法定量检测人血清、血浆和全血中RF/ASO/CRP/CCP的含量。当样本中含有RF/ASO/CRP/CCP时，RF/ASO/CRP/CCP分别与检测板上荧光标记的山羊抗人IgM抗体、荧光标记的ASO抗原、荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体、荧光标记的CCP抗原结合形成复合物，通过层析作用扩散到检测线时分别与包被的RF抗原、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体、CCP抗原结合。因此样本中RF/ASO/CRP/CCP含量越高，检测线上复合物积累量越多。荧光抗体的信号强度反映了被捕获的RF/ASO/CRP/CCP数量。
该发明试剂盒将四个检测指标，同时制备到一个试纸条上，使检测试纸条只需一根，达到真正意义上的一次上样同时出来四个检测结果，可以极大的降低试纸条生产成本，并且操作简单方便，重复性好，同时样本量需求少，只需单次上样，大大缩短加样时间和检测等待时间。
该发明试剂盒以固相反应取代液相反应，应用荧光染料标记的鼠抗人IgM抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP抗体和CCP抗原，直接包被在硝酸纤维素膜上，与传统的试纸条检测方法相比，固相反应具有稳定性好，容易常温保存等优势，且将标记抗体直接包被在硝酸纤维素膜，省去传统结合垫的处理及释放不好的问题，增加检测结果的准确性。与传统的检测方法相比，还具有检测线性范围宽的优势，测量范围广，测量结果精确，检测灵敏度高。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：制备样品垫，制备反应膜，将所得的样品垫和反应膜搭接在底板上，所述反应膜包括标记区、检测区和质控区，所述标记区设置有荧光标记线，荧光标记线为用荧光物质对山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体和CCP抗原进行标记，将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在试纸条的标记区形成；所述检测区包括依次排列的RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线，CRP检测线、ASO检测线、RF检测线和CCP检测线为将鼠抗人CRP抗体、RF抗原、ASO抗原和CCP抗原用包被液稀释到1～1.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在检测区形成；所述质控区包括质控线，质控线为将羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在质控区形成；用样本稀释液稀释样本，将稀释后的样本加到样品垫上检测；
荧光物质标记工艺包括以下步骤：
抗体的准备：每50μL体系中，准备0.2mg山羊抗人IgM单克隆抗体，0.2mgASO抗原，0.2mg鼠抗人CRP单克隆抗体，0.2mg CCP抗原，放于室温平衡20min；
荧光素的准备：荧光素用DMSO溶解至1μmol/L备用；
标记：将每50μL体系中加入2μL荧光素的比例进行配比，加入到备好的的蛋白液中，搅拌混匀，剩余体积用pH 9.5碳酸氢钠补足，反应2h；
透析：标记完成抗体，用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍，在PBS缓冲液中透析12小时以上即得标记好的荧光抗体。
2.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述荧光素为Biotium公司的CF647荧光染料。
3.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述包被液为称量Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.24g,NaCl 8g,KCl 0.2g,海藻糖10g,溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000 mL制备所得。
4.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述包被液为海藻糖5g，Tris 1.21g，溶解于超纯水，用HCl调解PH值至8.0，然后定容至1L制备所得。
5.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：样本稀释液为称量Na2HPO4•12H2O 2.865g，NaH2PO4•2H2O 0.272g，NaCl 7.948g，Tween-20 1mL，TX-100 1mL，BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000mL制备所得。
6.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：样本稀释液为称量Tris 1.21g，Tween-20 1mL，Triton X-100 1mL，BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用HCl调pH至8.0，定容至1000mL制备所得。
7.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维或硝酸纤维素膜或全血过滤垫。
8.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述样品垫的制备方法为:放于样品垫处理液中浸泡后，取出于37℃干燥箱中干燥12小时然后加入干燥剂封存。
9.根据权利要求8所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述样品垫处理液为含有1%BSA、0.05% Tween-20和0.05%叠氮钠的磷酸盐缓冲溶液。
10.根据权利要求8所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述样品垫处理液为含有1%BSA、0.05% Tween-20和0.05%叠氮钠的0.01MTris-HCl缓冲溶液。
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