IT9067625A1 - Dispositivo e materiali per immunoanalisi. - Google Patents

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Description

DESCRIZIONE DELL'Invenzione Industriale avente per titolo:
DISPOSITIVO E MATERIALI PER IMMUNOANALISI.
RIASSUNTO
La presente invenzione si riferisce a un dispositivo del tipo a migrazione per il rivelamento della presenza di un analita |in un campione di fluido biologico attraverso l'impiego di reazioni immunochimiche ligando-recettore e a materiali filtranti particolarmente selezionati, trattati e sistemati.
DESCRIZIONE
Sono stati descritti vari metodi per rivelare la presenza d i un analita in un campione di fluido biologico attraverso 1 uso dell 'immunochimica. Nel cosiddetto metodo "a sandwich", ad esempio, un analita bersaglio quale un antigene viene "posto a sandwich" tra un anticorpo marcato e un anticorpo immobilizzato su un supporto solido. Il saggio viene letto osservando la presenza e la quantità di complesso legato antigene-anticorpo marcato. Nel metodo di immunoanalisi mediante competizione, 1'anticorpo fissato a una superficie solida viene a contatto con un campione contenente una quantità incognita di analita antigene e con un, antigene marcato delio stesso tipo. La quantità di antigene marcato fissata alla superficie solida viene quindi determinata per dare una misura indiretta della quantità di analita antigene nel campione.
Poiché questi e altri metodi discussi nel prosieguo sono in grado di individuare sia anticorpi che antigeni, essi vengono in generale indicati come saggi immunochimici ligando-recettore o semplicemente immunoanalisi.
I dispositivi di immunoanalisi in fase solida, siano essi del tipo a sandwich o del tipo a competizione, garantiscono il rilevamento sensibile di un analita in un campione di fluido biologico quale il sangue o l'urina. I dispositivi di immunoanailisi in fase solida incorporano un supporto solido al quale è fissato un elemento di una coppia ligando-recettore, di solito un antlcorpo, un antigene o un aptene. Le forme più comuni di supporti solidi erano in passato piastre, tubi o grani di pollstirene, noti dai campi della radioimmunoanaiisi e dell1immunoanalisi enzimatica. Più recentemente come supporti solidi sono stati utilizzati vari materiali porosi, quali nylon, nitrocellulosa, acetato di cellulosa, fibre di vetro ed altri polimeri porosi.
Sono stati descritti un certo numero di corredi di prova autonomi per immunoanalisi che fanno uso di materiali porosi come veicoli in fase solida di componenti immunochimici quali antigeni, apteni o anticorpi. Questi corredi di prova sono di solito del tipo ad asta d'immersione, a scorrimento o a migrazione.
Nelle forme più comuni di analisi mediante asta ad immersione, come evidenziano caratteristicamente i corredi di prova per l'accertamento della gravidanza e dell'ovulazione, componenti immunochimici come ad esempio anticorpi sono fissati a una fase solida. Il dispositivo di analisi viene "immerso" per l’incubazione in, un campione sospettato di contenere un anaiita antigene sconosciuto. Si aggiunge quindi un anticorpo marcato con enzima, vuoi simultaneamente vuoi dopo un periodo di incubazione. Il dispositivo viene quindi lavato e inserito m una seconda soluzione contenente un substrato per l'enzima. L'enzima marcante, ove presente, interagisce con il substrato, provocando la formazione di prodotti colorati che si depositano in qualità di precipitato sulla fase solida ovvero producono un cambiamento cromatico visibile nella soluzione di substrato. Baxter et al., brevetto europeo A0125118, illustrano detta immunoanalisi ad asta d'immersione del tipo a sandwich. Kali et al., brevetto europeo A0282192, illustrano un dispositivo ad asta d'immersione per l'impiego in saggi del tipo a competizione.
Dispositivi di immunoanalisideltipo a scorrimento furono progettati per eliminare la necessità delle fasi di estesa incubazione e ingombrantee lavaggio associate ai saggi ad asta mersione Valkir.s et.al., brevetto USA n 4632901, descrivono un dispositivo comprendente un anticorpo (specifico a un analita entigene bersaglio) legato a una membrana porosa o filtro cui I è aggiunto un campione liquido. Via via che il liquido fluisce! attraverso la membrana, l1analita bersaglio si lega all'anticorpo. L'aqqiunta del campione è seguita dall'aggiunta dell'anticorpol marcato. Il rilevamento visivo dell'anticorpo marcato fornisce un’indicazione della presenza di analita antiqene bersaglio nel campione.
Korom et al., brevetto europeo A0299359, descrive una variazione nel dispositivo di scorrimento nella quale l1anticorpo marcato è incorporato in una membrana che funge da sistema di consegna dei reagente.
Il requisito delle molteplici fasi di aggiunta e lavaggio con i dispositivi di immunoanalisi del tipo ad asta d'immersione e a scorrimento aumenta la probabilità che personale poco adde--strato e utenti domestici ottengano risultati erronei.
Nei saggi del tipo a migrazione, una membrana viene impregnata con i reagenti necessari per condurre l'analisi. Viene fornitai una zona di rivelamento dell'analita nella quale l'analita marcato si lega ed è possibile leggere l’indice del saggio. Si veda, ad esempio Tom et al., brevetto USA n. 4.366.241, e Zuk, brevetto europeo A0143574.
La sensibilità delle analisi del tipo a migrazione tuttavia spesso è ridotta dalla presenza o formazione nel campione di indesiderabili componenti solidi che bloccano il passaggio dello analita marcato alla zona di rivelamento. La sensibilità della analisi declina altresì quando i dispositivi di analisi a migrazione vengono inondati da un eccesso di campione liquido.
I dispositivi di saggio a migrazione di solito incorporano reagenti che sono stati fissati ad agenti marcanti colorati, in modo da consentire l'individuazione visibile dei risultati del saggio senza l'aggiunta di ulteriori sostanze. Si veda, ad esempio, Bernstein, brevetto USA n. 4.770.853, May et al., WO 88/08534, e Ching et al., brevetto europeo Α029942Θ,
Tra gli agenti marcanti vi sono le particelle di sol di oro· quali quelle descritte da Leuvering nei brevetto USA n. 4313734, le particelle di sol di colorante quali sono descritte da Gribnau et al. nel brevetto USA n. 4.373.932 e da May et al. in WO 88/08534, il latice colorato quale è descritto da May, supra, Snyder, brevetti europei A0280559 e 0281327 e coloranti incapsi!-lati in liposomi secondo quanto descritto da Campbell et al. brevetto USA n. 4.703.017. Questi contrassegni colorati sono in generale limitati in rapporto ai metodi di immobilizzazione, che si dimostrano adatti. Per di più, essi richiedono una quantita relativamente grande di molecole di ligando e possono comportarereagenti costosi, con incremento conseguente dai costi. La presente invenzione comprende un dispositivo per il rivelamento della presenza diun analita in un campione di fluido biologico tramite l'impiego di reazioni immunochimiche ligandorrecettore e materialifiltranti particolarmente selezionati, trattati e disposti. La natura dell'invenzione risulterà evidente grazie alla seguente descrizione e ai disegni allegati, nei quali:
la figura 1 è una vista in sezione trasversale di un tipico dispositivo di analisi unidirezionale;
la figura 2 è una vista in sezione trasversale di una seconda realizzazione di un dispositivo di analisi unidirezionale;
la figura 3 è una vista in sezione trasversale di un tipico dispositivo bidirezionale;
la figura 3 è una vista prospettica di un dispositivo di analisi come illustrato in figura 2 (mostrato in parziale tratteggio) racchiuso in un involucro plastico con un'unica apertura;
la figura 5 è una vista dall'alto di un dispositivo di analisi multidirezionale; e
la figura 6 è una vista prospettica di un dispositivo di analisi come illustrato in figura 2 (mostrato in tratteggio parziale) racchiuso in un involucro plastico con due aperture.
Facendo ora riferimento alla figura 2, sulla base 20 trovano posto il cuscinetto serbatoio 10, l’elemento filtrante 12 e la membrana 16, che contiene una sostanza immobilizzata definita nella zona di indice del saggio 18. Il cuscinetto serbatoio 10 possiede porosità e volume sufficienti a ricevere e contenere un campione liquido sul quale si debba realizzare l'analisi.
L'elemento filtrante 12 e adiacente e contiguo attraverso una superficie relativamente ridotta del cuscinetto serbatoio 10 rispetto ai volume del cuscinetto 10 in modo da dosare il passaggio del campione liquido uscente dal cuscinetto serbatoio 10 nell'elemento filtrante 12.
Nella zona definita 18 della membrana 16 si trova una sostanza immobilizzata che può legarsi a eventuali complessi specifici ligando-recettore contenuti nel campione che passa attraverso l 'elemento filtrante 12.
in questa realizzazione un reagente in grado di produrre uno specifico complesso ligando-recettore viene aggiunto al campione, dove reagisce formando il complesso (supponendo che contenga l'analita appropriato) e il campione viene quindi portato a cortatto con il cuscinetto serbatoio 10. Il campione migra attraverso l'elemento filtrante 12, dove rimangono intrappolati eventuali componenti indesiderati presenti nel campione, e prosegue verso la membrana 16. Se presente, l'analita marcato si lega alla zona dell'indice di saggio 18 producendo un segnale visivamente apprezzabile.
Nella realizzazione illustrata in figura 2 è presente, in aggiunta al cuscinetto serbatoio 10, all'elemento filtrante 12 e alla membrana 16, un secondo elemento filtrante 14 che è sistemato sulla base 20. Il cuscinetto serbatoio 10 possiede porosità e volume sufficienti a ricevere e contenere un campione liquido sul quale si debba realizzare l'analisi. Il primo elemento filtrante 12 è adiacente e contiguo attraverso una superficie relativamente ridotta del cuscinetto serbatoio 16 rispetto al volume del cuscinetto 10 in modo da dosare il passaggio dei campione liquido uscente dal cuscinetto serbatoio 10 nel primo elemento filtrante 12. In questa realizzazione, un reagente suscettibile di produrre uno specifico complesso ligando-recettore è uniformemente impregnato nel primo elemento filtrante 12. Quando il campione liquido emerge dal cuscinetto serbatoio 10, viene a contatto con il reagente impregnato nel primo elemento filtrante 12, dove reagisce formando lo specifico complesso o gli specifici complessi ligando-recettore (supponendo che il campione contenga l'analita o gli analiti adatti). L'uso del primo elemento filtrante come sistema di consegna del reagente elimina la necessità di una fase separata di aggiunta del reagente.
Il secondo elemento filtrante 14, adiacente al primo elemento filtrante 12 e in posizione distale rispetto al cuscinetto serbatoio 10, ha lo scopo di consentire il passaggio di eventuali! complessi specifici ligando-recettore contenuti o formati nel campione liquido, impedendo al contempo il passaggio di componenti di maggiori dimensioni, presenti vuoi nel campione originario vuoi perché formatisi successivamente, ad esempio nel primo elemento filtrante 12
La membrana 16 è adiacente al secondo elemento filtrante 14· e in posizione distale rispetto al primo elemento filtrante 12'. La membrana 16 possiede porosità e volume sufficienti ad assorbire una percentuale sostanziale del campione ricevuto nel cuscinetto serbatoio 10 dopo il passaggio attraverso il primo elemento filtrante 12 e il secondo elemento filtrante 14.
Nella zona definita 18 della membrana 16 si trova una sostanza immobilizzata suscettibile di legarsi a qualsiasi complesso specifico ligando-recettore formato e contenuto nel campione che passa attraverso il primo elemento filtrante 12 e il secondo elemento filtrante 14.
Nell'uso, un campione liquido viene applicato al cuscinetto serbatoio del dispositivo illustrato in figura 2. Il campione migra attraverso il primo elemento filtrante 12, dove gli analiti bersaglio, se presenti nel campione, si legano al reagente marcato. Il campione continua la sua migrazione attraverso il secondo Elemento filtrante 14, dove rimangono intrappolati eventuali componenti indesiderati che possono essere presenti nel campione, e quindi alla membrana 16. Se presente, l'analita marcato si lega quindi alla zona dell'indice di saggio 18 producendo un segnale visivamente apprezzabile.
In via alternativa, 1'immunoanalisi può essere realizzata applicando un campione al secondo elemento filtrante 14 del dispositivo illustrato in figura 2. Si applica quindi una soluzione tampone al cuscinetto serbatoio 10, la soluzione migra attraverso il primo elemento filtrante 12 ricostituendo ivi i reagenti marcati. Soluzione e reagenti migrano attraversoil secondo elemento filtrante.14, dove l'anallta bersaglio, se presente, si lega ai reagenti marnati,e raggiungono la membrana 16. L'analita marcato,se presente,si lega quindi alla zonadell'indicedi saggio 18 producendo un segnale visivamente apprezzabile.
Facendo ora riferimento alla figura 3, sulla base 120 trovano posto un comune cuscinetto serbatoio 110, i primi elementi filtranti 112A e 112B, i secondi elementi filtranti 114A e 114B e le membrane 115A e 116B,contenenti una sostanza immobilizzata disposta nelle zone definite di indice di saggio 118A e 118B. Il comune cuscinetto serbatolo 110 possiede porosità e volume sufficienti a ricevere e contenere un campione liquido sul quale si debba realizzare l’analisi. I orimi elementi filtranti 112A e 112B sono adiacenti e contigui attraverso una superficie reladivamente ridotta del comune cuscinetto serbatoio 110 rispetto al volume del cuscinetto 110 onde dosare il passaggio del campione liquido dal cuscinetto serbatoio 110 ai primi elementi filtranti 112A e 112B. Un reagente suscettibile di produrre uno specifico complesso ligando-recettore è uniformemente impregnato nei primi elementi filtranti 112A e 112B. I secondi elementi filtrnti 114A e 114B sono adiacenti ai primi elementi filtranti 112A e 112B, rispettivamente, e in posizione distale rispetto al comune cuscinetto serbatoio 110, e funzionano in mudo da consentire il passaggio di eventuali complessi specifici ligandorecettore formatisi nel campione liquido ma da impedire il passaggio di componenti di maggiori dimensioni ivi contenuti. Le membrane 116A e 116B hanno porosità e volume sufficienti ad assorbire una quantità sostanziale del campione ricevuto nel comune cuscinetto serbatoio 110. La sostanza immobilizzata nelle zone 118A e 118B ha lo scopo di legare qualsiasi complesso specifico ligando-recettore formatosi.
Nell'uso, un campione liquido viene applicato al cuscinetto serbatoio comune 110, il campione migra attraverso 1 primi elementi filtranti 112A e 112B, dove gli aneliti bersaglio, se presenti nel campione si legano ai reagenti marcati ivi impregnati, quindi attraverso i secondi elementi filtranti 114A e 114B dove rimangono intrappolati eventuali componenti indesiderabili del campione fluido, e infine alle membrane I16A e 116B. Gli aneliti marcati bersaglio, se presenti, si legano alle zone di indice di saggio 118A e 118B. La realizzazione della figura 3 consente perciò l'analisi simultanea e indipendente di due analiti ovvero due saggi paralleli per lo stesso analita, in ciascun caso servendosi di un solo campione.
Riferendosi alla figura 4, un dispositivo di analisi quale quello illustrato in figura 2 è racchiuso nell'involucro 222. L'involucro 222 ha un'apertura 224 situata direttamente sopra il cuscinetto serbatoio 210 e una finestra d'osservazione 226 piazzata direttamente sopra la zona dell'indice di saggio 218 e la zona di controllo dell'indice di saggio 228. La finestra 226 può essere una semplice apertura ovvero comprendere un maferiale trasparente che protegga le zone 218 e 228 ma consenta l'ispezione visiva. Il campione liquido viene aggiunto attraverso l'apertura 224 ed è assorbito dal cuscinetto serbatoio 210, migrando quindi attraverso il primo elemento filtrante 212 e trdsportando gli appropriati reagenti marcati attraverso il secondo elemento filtrante 214, nel quale rimangono intrappolati eventuali componenti indesiderati del campione, e quindi alla membrana 216, dove l'analita marcato, se presente, si lega alla zona de|ll'indice di saggio 218. Il reagente inarcato non legato si lega alla zona di controllo dell'indice di saggio 228. Entrambe le zone 218 e 228 possono essere visualizzate per mezzo della finestra d'osservazione 226
Facendo riferimento alla figura 5, la base 320, formata da un materiale resistente all'umidità come ad esempio un materiale plastico, è segmentata in una molteplicità di regioni equivalenti 311A, 3118, 311C, 311D, 311E e 311F per mezzo del divisore 322. Ogni regione comprende un primo elemento filtrante 312 un secondo elemento filtrante 314 e una membrana 316, tutti di sposti nella base 320 tra i divisori 322. Lo stesso o un reagente può essere depositato in ciascun primo elemento filtrante 312, consentendo test paralleli per il medesimo analita ovvero una pluralità di analisi diverse sullo stesso campione. Ciascuna membrana 316 contiene una sostanza immobilizzata, com'è opportuno per il reagente nel primo elemento filtrante associato alla corrispondente membrana, depositata nella zona definita dell 'indice di saggio 318. Il normale cuscinetto serbatoio 310, è collocato in posizione centrale rispetto alle varie regioni.
Neil'uso, un campione fluido posto sul cuscinetto serbatoio 310 migra contemporaneamente attraverso i primi elementi filtranti 312 nei quali gli analiti bersaglio, se presenti, si legano agli anticorpi marcati. Il campione passa quindi attraverso il secondo elemento filtrante 314 e giunge alla membrana 316, dove gli analiti bersaglio marcati, se presenti, si legano alla corrispondente sostanza immobilizzata nella zona dell'indice di saggio 318, producendo un segnale visivamente apprezzabile..
La realizzazione illustrata in figura 6 può essere utilizzata in immunoanalisi. Un dispositivo di analisi quale quello rappresentato in figura 2 è racchiuso nell'involucro 522. L'invulucro 522 presenta una prima apertura 524 situata direttamente sopra il cuscinetto serbatoio 510, una seconda apertura 530 situata direttamente sopra il secondo elemento filtrante, e una finestra d'osservazione 526 piazzata direttamente sopra la zona dell'indice di saggio 518 e la zona di controllo dell'indice di saggio 528. La finestra 526 può essere una semplice apertura ovvero può comprendere un materiale trasparente che protegga le zone 518 e 528 ma consenta un'ispezione visiva. Nell'uso, un campione (ad esempio un siero) viene applicato direttamente sul secondo elemento filtrante 514 attraverso la seconda apertura 530. Una soluzione tampone è quindi applicata al cuscinetto serbatoio 510 attraverso la prima apertura 524, la soluzione migra attraver so il primo elemento filtrante 512 ricostituendo ivi i reagenti marcati. Soluzione e reagenti migrano attraverso il secondo elemento filtrante 514, ove l'analita bersaglio, se presente, si lega ai reagenti marcati, e quindi raggiungono la membrana 516. L'analita marcato, se presente, si lega quindi alla zona dell'indice di saggio 518 producendo un segnale visivamente apprezzabile. Il reagente marcato non legato si lega alla zona di controllo dell'indice di saggio 528. Entrambe le zone degli indici 518 e 528 possono essere visualizzate tramite la finestra d 'osservazione 526
Indipendentemente dalla configurazione, gli elementi filtranti e i cuscinetti confinano tra loro o si sovrappongono l'uno all'altro in modo da definire un'interfaccia per il passaggio del campione. Si è rilevato vantaggioso se la membrana ha un elevato rapporto area/spessore, laddove l’elemento filtrante ad essa adiacente presenta un rapporto area/spessore relativamente minore Onde assicurare un'interfaccia adeguata, è quindi opportuno collocare l'adiacente elemento filtrante in relazione di sovrapposizione rispetto alla membrana.
Incorporando almeno un elemento filtrante prima della zona dell 'indice di saggio si consegue un incremento di sensibilità; rispetto alle precedenti analisi del tipo a migrazione. Il filtro, che di preferenza è stato trattato per ridurre eventuali idrofobicità intrinseche, intrappola i componenti indesiderati nei campione fluido ,e consente un libero passaggio dell'analita ma rcato, Si consegue così una quantità proporziona lmente maggiore di analita legato alla zone dell'indice di saggio, e risultati più accurati dell'analis i.
Inoltre, scegliendo una membrana dell'opportuna trama e dimensioni dei pori, il secondo elemento filtrante può agire come sistema di lisi cellulare controllato. Ad esempio, in una immunoanalisi realizzata su un campione di sangue intero è vantaggioso scegliere come secondo elemento filtrante una membrana che mantenga l’integrità delle cellu le ematiche mentre è attraversata dal siero. Si impedisce cosi lo scoloramento associato alla lisi delle cellule ematiche in conseguenza della diffusione nella zona dell'indice di saggio.
Quando il dispositivo viene usato per condurre una lmmunoanalisi, questo ulteriore elemento filtrante può agire anche in modo da ricevere direttamente campioni. In generale, questi saggi sono realizzati su campioni di sangue intero o siero che· vengono individuati direttamente sul filtro. Segue l'applicazione di una soluzione tampone ai cuscinetto serbatoio. Tipiche soluzioni tampone includono, senza esservi limitate, soluzione' tampone idrogenofosfato-diidrogenofosfato, soluzione salina, Tris-HCl e acqua. Esempi di anticorpi rivelabili per questa via includono, senza esservi limitati, gli anticorpi da sindrome da immunodeficienza acquisita, rosolia, epatite e Lymes.
Un’altra fonte di declino della sensibilità dell'analisi, l ' ίnondazione del campione viene altresì evitata grazie all ' incorporazione del cuscinetto serbatoio nel dispositivo. Ilcuscinetto serbatoi o può trattenere una grossa quantità di campione viene quindi dosata attraverso il dispositivo in conseguenza dell'efficace interf accia nelle 2one successive. Questo aspetto dell invenzione la rende particolarmente adatta. ad esempio, per usi domestici , laddove il dispositivo può essere posto in un getto di urina senza di misurare la del camplone applicato al dispositivo .
Il cuscinetto serbatoio, il elemento filtrante, il secondo elemento filtrante e la membrana sono costituiti di vari materiali filtranti. Tipici materiali filtranti per l’uso nel cuscinetto serbatoio includono, senza esservi limitati, materiali leganti a basso contenuto proteico quali cellulosa, poliesteri, poliuretani e fibra di vetro con dimensioni dei pori comprese tra 0,45 e 60 pm. Tipici materiali da usare nel primo elemento filtrante Includono, senza esservi limitati, materiali cellulosici (ad esempio, carta Whatman ET31> o fibra di vetro con dimensioni dei pori comprese tra 0,45 e 60 pm. Tipici materiali da usare nel secondo elemento filtrante sono materiali idrofili includenti, senza esservi limitati, poliuretano, poliacetato, cellulosa, fibra di vetro e nylon con dimensioni dei pori comprese tra 0,45 e 60 pm. Tipici materiali da usare nella membrana includono, senza esservi limitati, nylon, cellulosa, polisolfone, polivinilidendifluoruro, acetato di cellulosa, poliuretano, fibra di vetro e nitrocellulosa.
L'intero assetto di cuscinetti e membrane è fissato a un materiale solido che fornisce supporto e unità per i dispositivo. Questo supporto può essere formato da un foglio sottile di vetro o materiale plastico che sia stato tagliato alle dimensioni appropriate per racchiudere tutti i contenuti dell'analisi, garan tendo al contempo faciliti di impiego all'utente.
Un'altra realizzazione della presente invenzione consente di rivelare analiti multipli in un unico campione fluido grazie alla presenza di più di un tipo specifico di reagente marcato e allo stesso numero di tipi del corrispondente reagente immobilizzato. Il dispositivo può essere fatto funzionare unidirezionalmente con reagenti marcati multipli impregnati in un primo -elemento filtrante e corrispondenti sostanze immobilizzate mul-; tiple definite in diverse zone degli indici di saggio sulla membrana. Nella realizzazione bidirezionale o multidirezionale, più di una serie di componenti, vale a dire primo elemento filtrante, secondo elemento filtrante e membrana, è associata ad un serbatoio comune.
In ogni caso, i reagenti incorporati nel primo elemento filtrante vengono essiccati o liofilizzati sopra o nell'elemento onde consentire la loro ricostituzione in seguito al contatto con un campione liquido. Altri reagenti utili per incrementare la specificità o aumentare il numero di complessi ligando-recettore creati e fissati e quindi aumentare la sensibilità del dispositivo di analisi possono essere altresì inclusi nel cuscinetto filtrante, ovvero nel primo di due cuscinetti filtranti che coritengano il reagente. Questi reagenti ausiliari includono, senza esservi limitati, tamponi, detergenti e anticoagulanti.
Includendo un'ulteriore zona degli indici di saggio affinché funga da controllo sulla membrana in posizione adiacente alla prima zona e distale rispetto al secondo elemento filtrante, ili dispositivo di analisi presenta un monitoraggio interno che indica se il campione liquido è migrato attraverso l'intero dispdsitivo. Le zone di controllo degli indici di saggio in generale utilizzano anticorpi immobilizzati (ad esempio anti-immunoglobiiline) nei riguardi dei reagenti marcati che sono stati aggiunti all'analita o incorporati nel primo elemento filtrante. Facendo riferimento alla realizzazione di figura 2, ad esempio, un campione liquido migra attraverso il primo elemento filtrante dove ricostituisce il reagente marcato e lo trasporta alla membrana Il reagente marcato non legato all'analita bersaglio si lega alila zona di controllo dell'indice di saggio, creando un'indicazione visivamente apprezzabile del completamento del test.
L'intero dispositivo di analisi, sia esso strutturato in modo unidirezionale, bidirezionale o multidirezionale, può essere racchiuso in materiale plastico impervio al liquido. Questo involucro di norma presenza un'apertura sopra il filtro del serbatoio onde ricevere il campione. L'intero involucro può essere trasparente ovvero può essere trasparente una sua parte sopra la zona! di rilevamento dell'analita onde poter osservare i risultati deil'analisi. I dispositivi racchiusi in plastica sono particolarmente utili e convenienti per l'uso in corredi di prova diagnostici casalinghi, ma è possibile utilizzare anche altri materiali come ad esempio carta trattata.
In aggiunta, la superficie superiore circondante l'apertura può essere curva ed estesa verso il basso in modo da costituire un ricettacolo a tazza che termina e impegna una parte del cuscinetto serbatoio. In questo modo la quantità di campione introdotta nel dispositivo viene dosata e il campione non può bypassare eventuaii componenti del dispositivo.
La presente invenzione può essere usata sia con analisi per competizione sia con analisi a sandwich. Nei saggi per competizione un'ulteriore inclusione di un antigene marcato (identico all’antigene bersaglio) è presente separatamente o come parte del primo elemento filtrante. Questo antigene marcato compete con 1 'antigene proveniente dal campione nel legarsi alla zona di rilevamento
I dispositivi e metodi diagnostici descritti nella presente. invenzione possono essere usati in qualsiasi reazione ligandorecettore e sono particolarmente idonei per quelle reazioni caratterizzate da componenti immunochimici, quali anticorpi, antigeni e apteni. Nelle analisi in cui si vogliano rivelare molecole contenenti ligando, ad esempio antigeni o apteni, sia il reagente marcato che la sostanza immobilizzata nella zona dell'indice di saggio sono molecole in grado di fissarsi al liganda. Più specificamente, quando ligandi sono antigeni, tanto ireagenti marcati quanto ireagenti immobilizzati saranno anticorpi.
Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali, essendo ben noti nella tecnica i metodi per la loro produzione. E' preferibile servirsi di anticorpi mongclonali marcati nel primo elemento filirante e di anticorpi policlonaii nella zona dell'indice di saggio onde conseguire un massimo legame. Tuttavia si può utilizzare qualsiasi combinazione di anticorni monoclonali-policlonali. Mei caso di corredi di prova per gravidanza e ovulazione gli anticorpi sono rivolti rispettivamente alla gonadotropina corionica umana e agli ormoni luteinizzanti e vengono incorporati nel dispositivo, Nei casi in cui si desideri l'individuazione di una molecola capace di fissarsi ad un liqando, ad esempio un anticorpo, immunoglobulina G marcata di topo anti-umana viene utilizzata come reagente che, come osservato, può essere incorporato nel primo elemento filtrante e un antigene specifico all'anticorpo bersaglio è immobilizzato nella zona dell'indice di saggio. Si può utilizzare qualsiasi antigene naturale o sintetico, così come catene poiipeptidiche con attività antigenica. Esempi di antigenl che possono essere immobilizzati sul dispositivo includono, senza esservi limitati, il virus della rosolia, il virus di Lymes, il virus della sindrome da immunodeficienza acquisita, il virus dell'epatite, il virus della toxoplasmosi, il citomegalovirus e il virus di Epstein Barr.
Nelle analisi in cui si voglia il rive-lamento simultaneo di più di un anticorpo in un unico campione, dal momento che la stessa immunoglobulina marcata anti-umana (reagente) riconosce e si lega a tutti gli anticorpi umani presenti nel campione, si deve soltanto incorporare gli antiqeni per ciascun antlcorpo bersaglio in distinte zone di indice sulla membrana.
Gli agenti marcanti usati nel dispositivo possono essere sia diretti che indiretti. Gli agenti marcanti diretti venqono preferiti in quanto non richiedono ulteriori fasi onde visualizzare i risultati del test. Esempi di agenti marcanti diretti includono, senza esservi limitati, sol metallici, sol di coloranti, latice particolato, indicatori cromatici, materia colorata contenuta nei liposomi e sol non metallici come ad esempio sol di carbonio.
Secondo un ulteriore aspetto, l'invenzione si riferisce a un agente marcante immunochimico particolarmente adatto per l'impiego nel dispositivo di cui sopra, ma utilizzabile anche in altri saggi immunologie!, in particolare come marcatore immunochimico in cui un ligando immunologico o molecole capaci di legarsi al ligando sono legate direttamente o indirettamente alla superficie di nerofumo finemente partlcolato.
Il marcatore immunologico può essere schematicamente illustrato come C-L o C-X:L, ove C è il nerofumo in particelle fini, i 'V rappresenta un legame di adsorbimento, L è un componente contenente un'unità di ligando o di legame al ligando, X è un agènte ligante, e indica un legame covalente.
L può essere formato esclusivamente da unità di 1ugando o capaci di unirsi al ligando, nel qual caso viene adsorbito direttamente sul carbonio. In via alternativa, l'unità di ligando o capacé di unirsi al ligando può essere fissata ad un elemento che fa da ponte sia per mezzo di un legame covalente sia per via immunologica (nel prosieguo indicato con ). Ad esempio, l'unità di ligando o capace di unirsi al ligando può essere fissata in modo covalente a un agente legante, come ad esempio glutaraldeide, che a sua volta è fissata in modo covalente ad un elemento "ponte" proteico, quale siero albumina bovina (BSA), a sua voi ta adsorbito sul carbonio. Parimenti, avidina o streptoavidina possono essere collegate tramite biotina alla molecola di ligando o capace di unirsi al ligando, adsorbendo l'avidina o streptoavidina sulle particelle di carbonio. In via alternatina, un anticorpo primario, agente da unità di ligando o capace di unirsi al ligando, viene legato immunologicamente a un anticorpo secondario e 1'anticorpo secondario adsorbito alle particelle di carbonio. Tipiche strutture della realizzazione C-L includono perciò:
C-(ligando),
C-(molecola unentesi al ligando),
C-(proteina:X:ligando),
C-(proteina:X:molecola unentesi al ligando),
C-(2*Ab*l.Ab), e
C-(proteina:X:2.Ab*l-Ab).
In una seconda realizzazione, un di Y è sia adsorbito sulla particella di carbonio che legato in modo covalente all 'unità di ligando o capace di unirsi al ligando per formare un marcatore di formula generale C-Y:L. L'agente di legame Y può essere un'unica specie molecolare, Y’, come verrà più dettaglia-
ad esempio un agente legante:proteina:agente legante:
C-Y' :(ligando) ,
C-Y' :(molecola unentesi al ligando),
C-Y' :proteina:X:( ligando), e
C-Y' :proteina:X: (molecola unentesi al ligando).
Si noterà che la principale differenza tra le due realizzazioni consiste nel fatto che nella prima realizzazione un ligando, una molecola capace di unirsi al ligando o una proteina (ad esemplo un anticorpo, sieroalbumina bovina o avidina) è adsorbito sulle particelle di carbonio, mentre nella seconda realizzazione un membro di una particolare classe di composti organici che no da agente legante è adsorbito sulle particelle di carbonio legato in modo covalente ad un ligando, una molecola capace di unirsi al ligando o una proteina.
I suddetti sol di carbonio possono essere preparati seguendo vari metodi. Il ligando e le molecole capaci di unirsi al ligarìdo possono essere semplicemente aggiunti ad una sospensione delle particelle di carbonio per produrre strutture C-(ligando) e C-(molecola unentesi al ligando). Nei casi in cui il ligando o la si può preparare la piena struttura diparticelle non di carbonio. ad esempio (proteina:X:ligando ), (proteina:X:molecola unentesi e quindiaggiungerla ad una sospensione delle particelle di carbonio per l’adsorbimento. In via alternativa, si può dapprima adsorbire la parte terminale della struttura di particelle non di carbonio sulle particelle di carbonio e quindi introdurre per via chimica il resto della struttura a particelle non di carbonio. Ad esempio, una proteina quale sieroalbumina bovina, avidina o streptoavidina può essere adsorbita sulle particelle di carbonio e quindi legata, servendosi ad esempio di glutaraldelde per la sieroalbumina bovina o di biotina per l'avidina o la streptoavldlna o alla molecola capace di unirsi al ligando Analogamente un secondo anticorpo può essere adsorbito sulle particelle di Carbonio e un primo anticorpo unito quindi ad esso per via immunologica.
li reagente di legame V idoneo per legare in modo covalentè il li e le molecole capaci di unirsi al li ad esempio apteni, antigeni o anticorpi, o per collegarsi in modo covalente a gruppi "punte" proteici, include immidi, azidi, isotiocianat imrnidoesteri e dialdeidi, come ad esempio maleimmide, succinimmide, fenilazide, glutaraldeide, N-idrossisuccinimmide estere, fenilisotlocianato, acido 44'-diisotiocianostilbenzen-Z,2’-disolfonico, 4-N,N-dimetilamminoazobenzen-4'-isotiocianato, isotio-' cianato di fluorosceina, rodamminoisotiocianato, e simili.
Come nel caso della prima realizzazione, la completa struttura di particelle non di carbonio, preparata facendo reagire il ligando (o la molecola capace di unirsi al ligando), un'eventuale proteina "ponte" e l’agente di legame, può essere adsorbita sulla superficie del nerofumo a particelle fini. In via alternativasi nuò adsorbire dapprima il solo reagente di legame sul nerofumo finemente particolato e quindi legarlo in modo covalente al ligando. alla molecola capace di unirsi al ligando e/o alla oroteina "ponte”.
In ciascuno dei suddetti procedimenti è opportuno in generale aggiungere un coadiuvante di sospensione alla sospensione acquosa del nerofumo finemente particolato come ad esempio un polialchilenolicole o un polisaccaride. Come si osserverà nel pròsiequo, sostanze analoghe vengono aggiunte in seguito come agente protettore dopo aver legato il llqando immunoloqico o le molecole capaci di unirsi al liqando al nerofumo finemente particolato. La quantità aggiunta in questo stadio è quindi relativamente piecola, in generale essendo quella appena sufficiente per favorire la sospensione delle particelle di carbonio.
Il reagente di legame viene quindi lasciato (i) reagire in modo covalente con il ligando lmmunologico o le molecole capaci dl unirsi al ligando e (il)assorbire su nerofumo in particelle fini,sia simultaneamente che In sequenza. In relazione al particolare reagente di legame, la reazione di legame si conduce in generale per parecchie ore a valori di pH compresi tra circa 7.0 e circa 9.5.
Si possono utilizzare numerosi nerofumi finemente particolati reperibili sul mercato, come ad esempio Monarch 1,000. 120 o i 880, Vulcan XC72 o XC72R. o Reqal 250R o 500R. L'idoneità di ciascuno di essi può essere agevolmente determinata omogeneizzando il materiale in una soluzione tampone e misurando la densità ottica.
Di preferenza, il nerofumo finemente partlcolato con il ligando o la molecolacapace di unirsi al ligando legati in modo covalente o passivo viene trattato con un polialchilenglicole o uni polisaccaride quale agente protettivo per minimizzare l'idrofobicità e massimizzare la dispersibilità. Materiali idonei per detto rivestimento sono polietilengllcole con un peso molecolare compreso tra circa 100 e circa 20.000, di preferenza tra circa 5.000 e 12.000, e polisaccaridi protettivi quali destrano con peso molecolare compreso tra circa 10.000 e circa 500.000, preferibilmente tra circa 10.000 e circa 50.000. Questo rivestimento puo essere facilmente ottenuto ponendo a contatto il nerofumo legato con una soluzione acquosa allo 0,5-5% peso/volume del polietilenglicole o destrano.
In un'altra realizzazione, il marcatore immunochimico viene trattato con almeno un tensioattivo ionico o non ionico bioiogicamente accettabile, come ad esempio un sale di alchiltrimetilammonio a catena lunga, deossicolato di sodio, Tritons, Tweens, etc.. in un ambito di concentrazione compreso tra circa 0,01 e circa 0,53⁄4. Dopo ognuno di detti trattamenti, che possono essere numerosi, con tipi uguali o diversi di detergenti, il marcatore immunochlmlco viene lavato per rimuovere il detergente in eecesso.
Il risultante marcatore immunochimico può quindi essere so speso In un mezzo acquoso. Dette sospensioni acquose del marcatore immunochimico sono particolarmente utili per la fabbricazione di dispositivi di immuripanalisi, sia quelli della presente invenzione sia quelli di altre strutture. Di preferenza la sospensione acquosa include almeno un tampone onde fornire un pK al quale il ligando immunologico marcato o la molecola capace di unirsi al ligando sia stabile; ad esempio, il limite comprelo tra circa 6 e circa 9 e di preferenza tra circa 6,5 e circa 8,5.
Gli esempi seguenti serviranno a caratterizzare ulteriormente la natura della presente invenzione, ma non dovrebbero essere Untesi come limitativi della sua portata, che è definita esclusivamente dalle rivendicazioni allegate.
Procedimento di sensibilità
Le sensibilità vengono determinate negli esempi seguenti pre parando soluzioni standard di gonadotropina corionica umana in concentrazioni di 25 mIU/ml, 50 mIU/ml, 75 mlU/ml e 100 mIU/ml. Campioni (0,15-0,20 mi) dello standard sono applicati al dispositivo di analisi e la sensibilità viene determinata in base alla capacitàdeldispositivo dirivelare una determinata concentrazione di gonadotropina corionica umana.
Esempio 1
A.Preparazione del marcatore.Particelle di sol d’oro vengono dlsclolte in 750 mi di acqua distillata, che viene quindiI portata all'ebollizione. Si aggiunge acido ldroaurico (da 70 a 75 mg)e si prosegue l'ebollizione per 5 minuti. Citrato di sodio (80 mg) sciolto in 10 mi di acqua distillata viene versato nella soluzione di oro e la soluzione è scaldata all'ebollizione per altri 5 minuti Dopo aver consentito alla soluzione di raffreddarsi a temperatura ambiente, il suo pH viene regolato ad un valore prossimo al punto isoelettrico per l'anticorpo monoclonale (determinato servendosi dell'elettroforesi in gel)ottenuto contro la gonadotropina corionica umana.Venti milligrammi de ll’antlcorpo monoclonale sono aggiunti alla soluzione,che viene agitata per 2 ore a temperatura ambiente. Si aggiungono 750 mil I-ligrammi di sleroalbumina bovina e la soluzione viene agitata continuamente per circa 12 ore a temperatura ambiente. Il coniugato oro colloidale-anticorpo monoclonale viene raccolto per cenitrifugazione a 10.000 giri/min in un rotore GSA per 20 minuti, scaricando la frazione surnatante e sospendendo il risultante granulo in 30 mi di sieroalbumina bovina all’1% in soluzione tampone idrogenofosfato-diidrogenofosfato (pH 7,4). La sospensione viene quindi fatta ruotare a 16.000 giri/min per 15 minuti in un rotore Sorvall SS-34. Si scarica nuovamente la frazione surnatante e si sospende il granulo in 15 ml di sieroalbumina bovi-· na all'1%.Dopo un rapido trattamento sonico,la sospensione è filtrata attraverso unfiltrodi0,2um.
B. Preparazione del dispositivo.Uncampionedimembrana preattivata di nylon (Pall Immunodyne) con dimensioni dei pori pari a 5 um viene tagliato alle dimensioni 180 mm x 25 mm e fissatoi al fondo di una sottile lastra di plastica (100 mm x 130 mm) in qualità di membrana. Una zona dell'indice di sagaio dell'enticorpo immobilizzato viene definita sulla membrana spruzzandò 36 μΐ di una soluzione di anticorpo di pecora 3 mq/ml anti-qonadotropina corionlca umana (hCG) in soluzione tampone 0,1 M di fosfato di sodio (pH 7,6) e 5% di saccarosio in una linea approssimativamente a 1,5 cm dal fondo usando un Camaq Linomat IV.
Dopo lo spruzzo, la membrana viene essiccata a 37°C per 30 minuti e quindi trattata con una soluzione di latte essiccato non grasso al 2% (Carnatlon) e saccarosio al 2% in un tampone di fosfato di sodio 0,1 M. La membrana viene poi lavata con saccarosio al 2% in fosfato di sodio 0,1 H e lasciata In riposo a temperatura ambiente approssimativamente per 12 ore onde realizzare un ulteriore essiccamento. Base e membrana possono essere conservate in un essiccatore sino al momento del successivo
Due membrane cellulosiche (Whatman ET31) vengono pretrattate con una soluzione di tampone fosfato di sodio 0,1 M (pH 7,4), sieroalbumina bovina 0,1%, latte essiccato non grasso 0,5%, saccarosio 2% e sodioazide 0,05%, e quindi incubate per mezz'ora a temperatura ambiente.
Il secondo elemento filtrante e un cuscinetto serbatoio vengono preparati essiccando le due membrane cellulosiche pretrattate in un essiccatore a vuoto per un'ora a temperatura ambiente.
Il primo elemento filtrante viene preparato incubando un frammento rettangolare di membrana cellulosica (Schleicher & Schuell) di 5 mm x 180 mm a temperatura ambiente per 30 minuti in una soiuzione di coniugato oro colloidale-antlcorpo monoclonale antir gonadotropina corionica umana in tampone di fosfato di sodio 0,1 M (pH 7,6) e saccarosio 5%. La membrana viene quindi posta su una lastra di vetro ed essiccata mediante riscaldamento a 36°C sotto vuoto costante in un liofilizzatore e conservata in un essiccatore sino all'impiego.
Il primo elemento filtrante è fissato in posizione adiacente ai secondo elemento filtrante e il secondo elemento filtrante è fissato alla base di materiale plastico in posizione contigua alla membrana. Infine, il cuscinetto serbatoio è fissato in posizione adiacente al primo elemento filtrante. La lastra in materiale plastico viene quindi tagliata in una molteplicità di strisce della lunghezza di 100 mm e della larghezza di 7,5 mm in modo che ciascuna contenga una disposizione lineare di cuscinetto serbatoio, primo elemento filtrante, secondo elemento filtrante e membrana.
Esempio 2
Si segue lo stesso procedimento dell’esempio 1B, salvo il fatto che il materiale usato per la membrana è una membrana cellulosica (Schleicher & Schuell) con pori di dimensioni pari a 12 μϊπ. Dopo aver spruzzato in linea con l'anticerpo, la membrana viene collocata in un essiccatore per 24 ore onde garantire il| massimo legame anticerpo-membrana. La membrana viene quindi incubata in un tampone di bloccaggio costituito da 1% sieroalbumina bovina, 0,5% latte essiccato non grasso, 5% trealosio, 0,05% Tween 20 e 0,05% sodioazide in tampone di borato 0,1 M entro un ambito di pH compreso tra 8,5 e 9,0. La membrana bloccata viene di nuovo essiccata in un essiccatore sotto vuoto per un'ora e tenuta in un normale essiccatore sino all'incorporamento nel di spositivo di analisi.
Esempio 3
Si prepara una striscia secondo il procedimento dell'esempio
Quando una corrente di urina viene applicata al cuscinetto serbatoio, nella zona dell'indice di saggio inizia a comparire un segnale rivelabile dopo circa 30 minuti. La sensibilità del l'analisi è circa 50 mIU/ml.
Esempio 4
Si prepara una striscia secondo il procedimento dell'esempio 1B, omettendo il primo elemento filtrante e il cuscinetto serbatoio. La striscia viene introdotta in una provetta di 100 μΐ di urina femminile contenente 10 μΐ di coniugato oro colloidale-anticorpo monoclonale anti-gonadotropina corionica umana preparato secondo l'esemplo 1. Quando il liquido migra lungo la striscia, un segnale rivelabile compare nella zona dell'indice di analisi in circa 2 minuti e diventa più intenso nel momento in cui il liquido raggiunge l'estremità della striscia (circa A-minuti). La sensibilità di questo procedimento di analisi nei confronti della gonadotropina corionica umana presente è 25 mIU/ml.
Esempio 5
Si prepara una striscia di prova sostanzialmente in accordo con il procedimento dell'esempio 1B, ma trattando il primo elemento filtrante con un anticorpo anti-gonadotropina corionica umana marcato nel modo seguente. Una sospensione al 103⁄4 (0,1 mi) di particelle di latice di polistirene colorato reperibili sul. mercato, con dimensioni comprese tra 0,1 e 0,3 pm, viene lavata tre volte con acqua distillata mediante microcentrifugazione. Il granulo finale è sospeso in 2 mi di glieina cloridrato 0,1 M tampone contenente 1 mg di sieroalbumina bovina. Dopo circa 12 ore di incubazione a temperatura ambiente su un concentratore oscillante, la sospensione di latice viene lavata tre volte con tampone di fosfato di sodio 0,1 M (pH 6,8) per rimuovere l'eccesso di sieroalbumina bovina. La sospensione risultante viene! portata a 2 mi con lo stesso tampone di fosfato, aggiungendo glutaraldeide al 25% sino ad una concentrazione finale dell'1%. Il campione viene incubato per 3 ore a temperatura ambiente e lavato altre tre volte col medesimo tampone. Centro microgrammi di anticorpo anti-gonadotropina corionica umana vengono aggiunti a 2 mi della sospensione di latice e incubati per altre tre ore a temperatura ambiente. Si aggiunge poi glicine sino ad una concentrazione finale del 2%. Dopo un’altra ora di incubazione, la sospensione di latice è lavata tre volte con lo stesso tampone e. sospesa nel medesimo tampone contenente sieroalbumina bovina al 2%. La sospensione viene rapidamente sottoposta a trattamento sonico e quindi immagazzinata a 4°C sino all'impiego.
Esempio 6
Si prepara una striscia secondo il procedimento dell’esempio 1B, omettendo il primo elemento filtrante e il cuscinetto serbatoio. La striscia di prova viene poi introdotta in una provetta contenente 5 μΐ di anticorpi anti-gonadotropina corionica umana marcati in base al procedimento 5 in 100 μΐ di urina femminile. Quando il liquido migra lungo la striscia, un segnale river labile compare nella zona dell'indice di analisi entro 2 minuti circa, intensificandosi il segnale nel momento in cui il liquido raggiunge l'estremità della striscia (circa 4 minuti). La sensibilità di questo procedimento di analisi nei confronti della gonadotropina corionica umana è 25 mIU/ml.
Esempio 7
Dieci milligrammi di particelle di carbonio Vulcan XC72 venugono omogeneizzati in 2 mi di tampone di Tris-cloridrato 20 mM (pH 6,8) contenente 40 mM di cloruro di sodio e il 2% di destrano 9400. Dopo due ore di incubazione a temperatura ambiente, alla soluzione si aggiunge una soluzione di 5 mg di isotiocianato di fluoresceina in 1 mi di tampone di Tris-cloridrato. La miscela viene sottoposta a trattamento rapido sonico e quindi incubata approssimativamente per 12 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, alla soluzione di carbonio si aggiungono 20 mi di tampone di fosfato di sodio 0,1 M (pH 7,6) in cloruro di sodio 0,1 M , centrifugando quindi a 4°C e 15.000 giri/min. Questa fase è ripetuta tre volte e il granulo ottenuto viene sospeso in 20 mi di tampone fosfato. Dopo un rapido trattamento sonico, alla sospensione si aggiungono 3 mg di un anticorpo monoclonale attivo contro la gonadotropina corionica umana, e la miscela viene incubata per 6 ore a temperatura ambiente. La miscela è poi centrifugata tre volte a 15.000 giri/min onde rimuovere l’anticorpo non reagito. Il granulo finale è sospeso in 20 mi di tampone di Hepes 0,1 M (pH 7,5) contenente Γ 1Ϊ di sieroalbumina bovina, il 5% di saccarosio, cloruro di sodio 0,1 M e lo 0,05% di sodioazide. Si aggiunge cetiltrimetilammonio bromuro sino a raggiungere una concentrazione finale dello 0,025%. Si incuba poi per 30 minuti e si centrifuga a 15.000 giri/min. Il granulo ottenuto è sospeso in 20 mi di tampone di Hepes 0,1 M (pH 7,5) contenente l'l% di' sieroalbumina bovino, il 5% di saccarosio, 0,1 M di cloruro di! sodio e lo 0,05% di sodioazide, sottoposto a rapido trattamento sonico e diluito con deossilato di sodio ad una concentrazione finale dello 0,1%, e infine incubato per 30 minuti a temperatura ambiente e ricentrifugato. Il granulo viene di nuovo sospeso in 20 mi di tampone di Hepes 0,1 M (pH 7,5) contenente 1'1% di sieroalbumina bovina, il 5% di saccarosio, 0,1 M di cloruro di sodio I e lo 0,05% di sodioazide, e quindi sottoposto a rapido trattamento sonico.
Questo sol di carbonio viene introdotto in luogo dell'oro colloidale sul primo elemento filtrante delle strisce di prova preparate in base all esempio lb omettendo il cuscinetto serbatoio. Le strisce di prova sono essiccate in un essiccatore sotto vuoto per circa un'ora e conservate in essiccatore a temperatura amb ente sino all'impiego.
Onde effettuare analisi su gonadotropina corionica umana o ormone luteinizzante, 100 μΐ di un campione di urina vengono introdotti in una provetta di coltura, inserendo poi nella provetta la striscia. In seguito al contatto con il campione di urina, i coniugati particella di carbonio-anticorpo immediatamente si solubilizzano e migrano verso la membrana. Un test positivo risponde a un colore intenso delle particelle di nerofumo concentrate nell'indice. Il limite di individuazione è circa 25 m U/ml sia nell'analisi della gonadotropina corionica umana che nel saggio dell'ormone luteinizzante.
Esempio 8
Si prepara una striscia secondo il procedimento dell'
1B, omettendo il primo elemento filtrante e il cuscinetto serbatoio. La striscia di prova viene quindi introdotta in una provetta contenente l'anticorpo marcato con sol di carbonio (5 μΐ), mescolandovi un campione di urina contenente gonadotropina corionica umana (100 ul). Un segnale rivelabile comincia ad apparire dopo circa un minuto. La sensibilità di questo saggio risulta di circa 25 mIU/ml.
Esempio 9
Reagenti di sol di carbonio rivestiti di anticorpi monoclonali contro la qonadotropina corionica umana o l'ormone luteinizzante (5 μΐ per provetta) vengono liofilizzati. Le provette possono essere conservate in un essiccatore a temperatura ambiente sino al momento dell'impiego.
Per condurre analisi di gonadotropina corlonlca umana o di ormone luteinizzante, 100 μΐ di campione di urina vengono dispersi in una provetta di coltura contenente il sol di carbonio essiccato o liofilizzato. Il reagente al carbonio immediatamente va in soluzione in seguito al contatto con il campione di urina. Una striscia di prova preparata come nell'esempio 1B ma senza il primo elemento filtrante e il cuscinetto serbatoio, e sulla) quale sia stata irrorata una linea di anticorpo di pecora antii gonadotropina corionica umana intera (3 pg per striscia) in qu lità di indice, viene quindi introdotta nella provetta. Quando la miscela del campione in migrazione raggiunge l'indice, comineia ad apparire una banda nera se il campione di urina conteneva gonadotropina corionica umana o ormone luteinizzante. La sensi bilità dei saggi utilizzanti il reagente al carbonio essiccato o liofilizzato è in entrambi i casi pari a circa 25 mIU/ml. Il reagente al carbonio essiccato o liofilizzato rimane attivo, e.videnziando la medesima sensibilità in seguito all' immagazzinamento per oltre un anno a temperatura ambienta.
Esempio 10
Sipreparò un dispositivo di analisi secondo l ' esempio 18 eli minando il primo elemento filtrante e ilcuscinetto serbatoio e utilizzando 1 mg/ml di anticorpo anti-tiroxina come spray in linea sulla membrana.
Dopo l'introduzione in una miscela di 3 μ di sol di carbonio legato a tiroxina (si veda l 'esempio 21) e 100 ul di siero (saggio competitivo), la banda di controllo comincia ad apparire entro 2 minuti circa . A livelli di tiroxina (non marcata) nel campione di siero maggiori di circa 60 ng/ml , non si ha alcuna f orma -zione di banda (una debole banda appare a 59 ng/ml). Viceversa , per prodarre una banda forte come la banda di controllo in assenza di tiroxina nel campione di siero sono necessari meno di 10 ng/ml di tiroxina.
Esempio 11
Si preparò un dispositivo di analisi secondo l'esempio 1B eli -minando il primo elemento filtrante e il cuscinetto serbatoio e utilizzando 2 mq/ml di antigene di Lymes commercialmente reperibile (OEM Concepts) come spray in linea sulla membrana.
Quando l'estremità del dispositivo contenente il serbatoio viene immersa in una miscela di 100 ul di siero umano e 3 pi di particelle di carbonio marcate con isotiocianato di fluoresceina coniugato con anticorpo d i capra anti-immunoqlobulina G umana (si veda l'esemn .io 211. un sennale rivelabile compare entra circa 4 minuti se il campione è sieropositivo.
Esempio 12
Un dispositivo di analisi venne preparato secondo l'esempio li. Dieci microlitri di siero umano furono sparsi sul secondo elemento filtrante. Il dispositivo venne introdotto in una orovetta contenente una sosDensione di 100 u.1 di particelle di carbonio (5 iti) marcate con isotiocianato di fluoresceina coniugato con anticorpo di capra anti-immunoalobulina G umana (si veda 1 esempio 21) in 20 mM di etilendiamminotetraacetato. Un seanale rivelabile compare entro 5 minuti se il campione è sierooositivo.
Esempio 13
Si preparò un dispositivo di saggio secondo l'esempio 11, salvo il fatto che 2 mq/ml di antigene della rosolia (Virai Antiqens, Inc.) furono spruzzati in linea sulla membrana.
Quando il cuscinetto serbatoio viene posto a contatto con 1(IO μΐ di siero umano e 5 μΐ di particelle di carbonio marcate con isotiocianato di fluoresceina coniuqato con anticorpo di capra anti-immunoglobulina G umana (si veda l'esempio 21), un segnale rivelabile compare entro circa 2 minuti se il campione è siero positivo.
Esempio 14
Si preparò un dispositivo di saggio secondo l'esempio 13. Dieci microlitri di siero furono sparsi sul secondo elemento filtrante e ildispasitivo venne Introdotto in una provetta contenente una sospensione di 100 ul di particelle di carbonio marcate con isotiocianato di fluoresceina coniugato conanticorpo di capra anti-immunoglobulina G umana (si vedal'esempio 21), in PO mM dietilendiamminotetraacetato.
Un segnale rivelabile compare entro circa 1 minuti se il campione è sieropositivo.
Esempio 15 Si preparò un dispositivo di saggio secondo l'esempio 11, spruzzando un'altra linea di antigene della rosolia parallelamente a circa 7 mm dalla linea dell'antigene di Lymes.
Un campione sieropositivo di rosolia (10 ul) venne sparso sul secondo elemento filtrante. Il dispositivo venne introdotto in una provetta contenente una sospensione di 100 μl di particelle di carbonio (10 ul ) marcate con isotiocianato di fluoresceina coniugato con anticorpo di capra anti-immunoglobulina G umana i (si veda l'esempio 21). in 20 mM di etilendiamminotetraacetato.
Un segnale rivelabile comparve entro circa 5 minuti lungo la linea dell'antigene della rosolia.
Esempio 16
Si seguì il procedimento l'esempio 15, salvo il fatto che un campione sieropositivo di rosolia e Lymes (20 pi) venne sparso· sulla membrana. Due segnali rivelabili cominciarono a comparire entro circa 5 minuti.
Esempio 17
L'idoneità di vari materiali dicarbonio per la preparazione dei sol di carbonio e dei diversi tamponi relativi si può fàdimente accertare in base alle tecniche seguenti.
A. Miscele di 5 mg di vari nerofumi (Monarch 1.000, Monarchi 880, Monarch 120f Reoal 250R. Regai 500R, Vulcan XC72R e Vulcan XC72, tutti ottenuti daIla Cabot) e 100 ul di polietilenalicole ai 2% (6.000-8.000) vengono macinate per 5 minuti e diluite sino a 10 mi con tampone salino di fosfato contenente 2 ma di un anticorpo monoclonale contro la gonadotropina corionica umana. Dopo un rapido trattamento sonico per disperdere le particelle di carbonio nella soluzione dell'anticorpo monoclonale, le miscele vengono incubate per 6 ore a temperatura ambiente e aqitando. Al termine dell'incubazione, il campione è lavato tre volte mediante centrifugazione per rimuovere l'eventuale eccesso di antlcorpo. Ciascuna centrifugazione è condotta a 15.000 giri/min per 20 minuti usando 10 mi di soluzione tampone idroqenofosfato-dildrogenofo sfato. Il granulo finale è sospeso in 10 mi di soluzione tampo ne idrogenofosfato-diidrogenofosfato al 3% e sottoposto a breve trattamento sonico per garantire la completa dispersione delle particelle di carbonio.
Per il saggio della gonadotropina corionica umana, 20 μΐ del sol di carbonio e 200 μΐ del campione di urina vengono dispersi e miscelati a fondo in una provetta di coltura (10 x 75 mm)l La miscela viene quindi lasciata migrare in una striscia di carta Whatman (31ET) della larghezza di 5 mm e dell'altezza di 100 mm, spruzzata in linea con anticorpo di pecora anti-gonadotropina corionica umana e bloccata con l'l% di sieroaibumina bovina in soluzione tampone idrogenofosfato-diidrogenofosfato (pH 7,4).
Vulcan XC72 sembra dare il miglior rapporto segnale/rumore i ad una concentrazione di gonadotropina corionica umana pari a 200 mIU/ml. Risultati analoghi si ottengono con Vulcan XC72R, ma il segnale positivo è lievemente più basso.
B. Cinque milligrammi degli stessi nerofumi vengono sospesi in 2 mi di tampone 20 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenente 40 mM di cloruro di sodio e il 2% (peso/volume) di destrano 9400, mediante omogeneizzazione. Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente, un mi di soluzione al 3% di sieroaibumina bovina viene aggiun to alla sospensione di carbonio omogeneizzata. La miscela è sottoposta a rapido trattamento sonico e ulteriormente incubata per circa 12 ore a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, 5 μΐ della miscela vengono introdotti in una bacinella contenente 1 mi di acqua distillata. Per ciascun campione si misura il c ciente di assorbimento a 700 nm. I risultati sono i seguenti:
Fonte di nerofumo Densità ottica a 700 nm Monarch 1.000 0,2333
Monarch 860 0,3129
Vulcan XC72R 0,6878
Vulcan XC72 0,7428
Monarch 120 0,6225
Regal 250R 0,3567
Regal 500R 0,4372
C. Nerofumo Vulcan XC72 viene sospeso in varie soluzioni tampone a diverso pH. Cinque milligrammi di particelle di carbonio Vulcan XC72 sono omogeneizzati in 2 mi di varie soluzioni tampone contenenti il 2% di destrano 9400 e incubate per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, 5 μΐ di ciascun omogenato vengono aggiunti a 1 mi di acqua distillata. Un millilitro di sieroalbumina bovina al 33⁄4 nello stesso tampone è aggiunto alla miscela che viene quindi sottoposta a trattamento sonico e incubata per circa 12 ore a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, 5 μΐ della miscela sono sospesi in 1 mi di acqua distilliata e si misura il coefficiente di assorbimento a 700 nm. I risultati sono i seguenti:
3me si può osservare, le soluzioni tampone con valori di pH Compresi approssimativamente tra 6,8 e 8 sono particolarmente buone per la dispersione delle particelle di carbonio.
Esempio 18 A una miscela di 1 mg di anticorpo antigonadotropina corionica umana in 1 ml di tampone borato 0,3 M (pH 9,0) si aggiungono agitando 50 ug di isotiocianato di fluoresceina . L'agitazione è proseguita per un’ora e la miscela viene quindi fatta passare attraverso una colonna Sephadex G-25 per eliminare l'isotiocianato non reagito e altri materiali non desiderati II rapporto anticorpo/isotiocianato era approssimativamente 1:3.
A una sospensione acquosa di 1 mg di nerofumo (Vulcan 72) si aggiunqono 0,5 mg del coniugato dell'anticorpo· La miscela è sottoposta a trattamento sonico, incubata per circa 12 ore a tempera tura ambiente e sottoposta a tripla centrifugazione. Il granulo finale, sospeso in un tampone quale è descritto nell’esempio 12, può essere conservato a 4°C sino al momento dell'impiego,
Prodotti analoghi si possono ottenere utilizzando anticorpi anti-ormone luteinizzante, anticorpi di capra anti-immunoglobulina G umana e anticorpi di capra anti-immunoqlobulina M umana.
Esempio 19 A 10 mi di una sospensione acquosa di 5 mg di nerofumo (Vulcan 72) si aggiungono 200 μΐ di antisiero di capra anti-topo. La miscela viene sottoposta a trattamento sonico e incubata per circa 12 ore a temperatura ambiente. SI aggiunge poi un mg di anticorpo anti-gonadotropina corionica umana e la miscela è incubata per 2 ore a temperatura ambiente e sottoposta tre volte a centrifuga zione. Il granulo finale, sospeso in un tampone quale è descritto nell'esempio 12, può essere conservato a 4°C sino al momento dell'impiego.
Esemplo 20
A una sospensione di 5 mg di nerofumo in 10 mi di soluzione tampone idrogenofosfato-diidrogenofosfato (PBS) si aggiungono 2 mg di avidina. Dopo aver incubato per 2 ore a temperatura ambiente, si aggiungono 5 mi di sieroalbumina bovina al 3% in PBS. Lasciato in riposo 2 ore, si aggiungono 0,5 mg di anticorpo biòtinilato anti-gonadotropina corionica umana in sieroalbumina bovina all'1% in PBS. Effettuata l'incubazione per un'altra ora, la miscela viene sottoposta a centrifugazione tre volte. Il granulo finale, sospeso in un tampone quale è descritto nell'esempio 12 e quindi sottoposto a rapido trattamento sonico, può essere conservato a 4°C fino al momento dell'impiego.
Esempio 21 Dieci milligrammi di particelle di carbonio Vulcan XC72 vengono omogeneizzati in 2 mi di tampone 20 mM Tris-cloridratoo {pH 6,8) contenente 40 mM di cloruro di sodio e 2% di destrano 9400. Dopo aver incubato per 2 ore a temperatura ambiente, alla soluzione si aggiunge una soluzione di 5 mg di isotiocianatp di fluoresceina in un mi di tampone Tris-cloridrato. La miscela viene sottoposta a rapido trattamento sonico e incubata approssimativamente per 12 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, alla soluzione di carbonio si aggiungono 20 mi di tampone idrogenofosfato-diidrogenofosfato 0,1 m (pH 7,6) in cloruro di sodio 0,1 M, centrifugando poi a 4°C e 15.000 qiri/min. Questa fase è ripetuta tre volte e il granulo risultante è sospeso ini 20 mi di tampone idrogenofosfato-diidrogenofasfato,
Due milligrammi di sieroalbumina bovina vengono aggiunti a 2 mi della suddetta sospensione e la miscela è incubata per 6 ore e quindi sottoposta tre volte a centrifugazione. Si aggiunqe un eccesso di glutaraldeide (1%) e, dopo aver incubato per 3 ore a temperatura ambiente, si allontana l'eccesso mediante centrifugazione. Si aggiunge una soluzione di 10 pq di tiroxina in sufficiente dimetilformammide e si incuba la miscela per 3 ore a temperatura ambiente, sottoponendo poi a centrifugazioine per tre volte. Il granulo finale, sospeso in un tampone guade è descritto nell’esempio 12 e quindi sottoposto a rapido trattamento sonico, può essere conservato a 4°C fino al momento dell'impiego.

Claims (1)

  1. Rivendicazioni : (1) Dispositivo di analisi immunochimica, caratterizzato dall fatto che comprende: un elemento di base; un apparato disposto su detto elemento di base, comprendendo detto apparato: (i) un cuscinetto serbatoio avente porosità e volume sufficienti a ricevere e contenere un campione liquido su cui si deve realizzare il saggio; (ii) una membrana disposta in posizione distale rispetto a detto cuscinetto serbatoio, avendo detta membrana porosità e volume sufficienti ad assorbire una percentuale sostanziale del campione accolto in detto cuscinetto serbatoio;e (iii) almeno una zona filtrante interposta e contigua a detta membrana e detto cuscinetto serbatoio. essendo detta zona filtrante (a) contigua attraverso una superficie di detto cuscinetto serbatoio che è abbastanza piccola rispetto al volume di detto cuscinetto serbatoio da dosare il passaggio del campione liquido da detto cuscinetto serbatoio a detta zona filtrante, e (b) capace di agire in modo da consentire il passaggio di ogni complesso specifico liqando-recettore in detto campione da detto cuscinetto serbatoio a detta membrana impedendo al contempo il passeggio di componenti di dimensioni maggiori di quelli allora contenuti in detto campione; e almeno una sostanza immobilizzata disposta in almeno una zona di detta membrana e definente un indice di saggio, essendo detta sostanza immobilizzata in grado di legare uno specifico complesso ligando-recettore contenuto nel campione per formare detto indice di saggio. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'elemento di base è in materia plastica o vetro. 3. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto cuscinetto serbatoio si estende oltre detto elemento di base. 4 Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che almeno un reagente in grado di produrre uno specifico complesso ligando-recettore è uniformemente impregnato in e attraverso almeno una parte di detta zona filtrante 5. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto reagente trasporta un marcatore. 6 Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il marcatore è un marcatore diretto. 7 Di spositivo di analisi secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che il marcatore è un sol metallico, un sol non metallico, un sol di colorante, un indicatore cromatico o un latice particolato. ispositivo di analisi secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che il marcatore è un sol di carbonio. 9. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che il marcatore è un marcatore indiretto. 10. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 4, carat¬ zata sono molecole capaci di legarsi al ligando. 11. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che almeno uno tra detto reagente e detta sostanza immobilizzata un anticorpo monoclonale. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che almeno uno tra detto reagente e detta sostanza immobilizzata è un anticorpo policlonale. 13. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 1, carat terizzata dal fatta che detta sostanza immobilizzata è un ligan do. Dispositivo di analisi secondo larivendicazione 13, carattezizzato dal fatto che detta sostanza immobilizzata è un antigene o un aptene. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 1, carattetizzato dal fatto che detta zona filtrante comprende almeno un primo elemento filtrante disposto su detto elemento di base in posizione adiacente a detto cuscinetto serbatoio e contigua attraverso una superficie di detto cuscinetto serbatoio abbastanza piccola ri spetto alvolume di detto cuscinetto serbatoio da dosare il passaggio del campione liquido da detto cuscinetto serbatoio a detto primo elemento filtrante; e un secondo elemento filtrante disposto su detto elemento di base in posizione adiacente a eiascun primo elemento flitcante e distale rispetto a detto cuscinetto serbatoio, essendo detto secondo elemento filtrante in grado di consentire il passaggio di qualsiasi specifico complesso ligando ecettore in detto campione ma di impedire il passaggio di componenti più grandi allora contenuti in det to campione. 16. Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che almeno un reagente capace di produrre uno specifico complesso liqando-recettore è uniformemente impregnato in e attraverso almeno una parte di detto primo elemento filtrante 17.Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che detto cuscinetto detto primo elemento filtrante , detto secondo elemento filtrante e detta membrana sono ciascuno formato daun materiale di membrana microporosa, 18 Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 17, caratterizzao dal fatto che ogni membrana microporosa comprende nylon, materiale cellulosico,polisolfone,polivinilidendifluoruro o poliestere. 19 Dispositivo di analisi secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detto primo elemento filtrante è presente un additivo capace di incrementare la produzione o il legame di complessi specifici ligando-recettore. 20, Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che include un involucro. impervio all’umidità circondante detto dispositivo comprendendo detto involucro un'aperturadefinita in detto involucro, la cui superficie su va ed estesa verso il basso formando un ricettacolo a tazza ohe conclude e impegna una parte di detto cuscinetto serbatoio, essendo detta apertura capace di ricevere e dosare il passaggio del campione liquido su detto cuscinetto serbatoio. e un sistema in grado di consentire l ispezione visiva di detta zona dell indice di io disposto sopra detta zona. 21.)Marcatore Immunochimico caratterizzato dal fatto che comprende nerofumo finemente particolato sul quale sia immobilizzato un componente adsorbito che termina in posizione distaie rispetto al punto di adsorbimento con un ligando immunologicamente attivo o una molecola capace di lgarsi al llgando immunologicamente attiva. 2.Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 21, caratterizato di fatto che detto componente è costituito da apteni, antigeni o anticorpi immonologicamente attivi adsorbiti sulla superficie di detto nerofumo. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che detto componente comprende il ligando immunologico o le molecole capaci di legarsi al liqando legati in modo covalente tramite un reagente di legame, e che detto rea gente di legame è adsorbito sulla superfide di detto nerofumo. 24. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 23. ca ratterizzato dal fatto che il reagente di legame è una immide. una azide un isotiocianato, un immidoestere o una dialdeide. 5.marcatore lmmunochimico secondo la rivendicazione 24. ca ratterizzato dal fatto che il reagente di legame è maleimmide succinimmide, fenilazide glutaraldeideo N-idrossisuccinimmide estere. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che il reagente di legame è un isotiocianato 27 Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 26, caratterizzato dal fatto che l'isotiocianato è fenilisotiocianato acido 4,4' dlisotiocianostilben 2,2' disolfonico 4-N,N-dimetilamminoazobenzen-4' -isotiocianato, fluorescein isotiocianatoi o rodammin isotiocianato. 28. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 26, caratterizzato dal fatto che il reagente di legame è feniiisotiocianato. 29. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 26, catratterizzato dal fatto che il reagente di legame è acido 4-,4'-diisotiocianostilben-2 ,21-disolfonico 30. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 26, caratterizzato dal fatto che il reagente di legame è 4-N,N-dimetllamminoazobenzen-4 1-isotiocianato. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 26, caratterizzato dal fatto che 1 'isotiocianato è isotiocianato di f luoresceina . Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 26, caratterizzato dal fatto che il reagente di legame è isotiocianato di rodammina. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che il nerofumo finemente particolato e 1 li componente immobilizzato in modo adsorbito su di esso sono rivestiti con polietilenglicole avente un peso molecolare compreso tra circa 200 e circa 20.000 ovvero destrano avente un peso molecolare compreso tra circa 10.000 e circa 500.000. 34. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 33, caratterizzato dal fatto che il destrano ha un peso molecolare com35. Marcatore immunochimico secondo La rivendicazione 33,caratterizzato dal fatto che il polietllenglicoleha un pesomolecolare compreso tra circa 5.000 e circa12.000. 36) Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 21 ratterizzato dal fatto che detto componente comprendeilligando Immunochimico o le molecole capaci di legarsi al ligando immunochimico legate ad una proteina e che detta proteina è adsorbita sulla superficie di detto nerofumo. 37. Marcatore Immunochimico secondo la rivendicazione le capaci di legarsi al ligando immunoloaico sono leaate in modo covalente a detta proteina tramite un legame immunoloaico. 38.)Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 36. Ca ratterizzato dal fatto che il liaando immunoloaico o le molecole capaci di leaarsi al liaando immunoloaico sono legate in modo covalente a detta proteina tramite un reaaente di leaame. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 21. caratterizzato dal fatto che detto componente comprende il ligando immunologico o le molecole capaci di leqarsi al liqando immunoloqico fissate a una proteina, che detta proteina è legata in modo covalente a un reaqente di legame e che detto reagente di legame è adsorbito sulla superficie di detto nerofumo. Marcatore immunochimico secondo la rivendicazione 39, caratterizzato dal fatto che il ligando immunologico o le molecole capaci di legarsi al ligando immunologico sono fissate in modo covalente a detta proteina tramite un secondo reagente di legame. 41 Sospensione acquosa di un marcatore immunologico secondo la rivendicazione 21. 2.Sospensione acquosa secondo la rivendicazione 41,caratterizzata dal fatto che Include almeno un tampone in grado di assicurare un pH al quale il ligando immunologico immobilizzato è stabile e ricadente in un ambito compreso tra circa 6 e 9. 43. Sospensione acquosa secondo la rivendicazione 42. caratterizzata dal fatto che include almeno un tampone in grado di fornire un pH compreso tra circa 6,5 e circa 8,5. 44.)Metodo di preparazione di un marcatore lmmunochlmico secondo la rivendicazione 23, caratterizzato dal fatto che comprende 1'unione di un ligando immunologico o di molecole capaci di legarsi al ligando immunologico al nerofumo finemente particolato così da consentire, simultaneamente o in sequenza, ad un reagente di legame di (i) reagire in modo covalente con il ligando immunologico o le molecole capaci di legarsi al ligando immunologico e (ii) di essere adsorbito sul nerofumo finemente particolato 45.)Metodo secondo la rivendicazione 44, caratterizzato dal fatto che il marcatore inununochimlco viene posto a contatto con una soluzione acquosa di un polietilenglicole avente un peso mó lecolare compreso tra circa 100 e circa 20.000. 6. Metodo secondo la rivendicazione 44, caratterizzato dal fatto che il nerofumo finemente particolato viene posto a contatto con una soluzione acquosa di un destrano avente un peso mo-, lecolare compreso tra circa 10.000 e circa 500.000. 47.) Metodo secondo la rivendicazione 44, caratterizzato dal! fatto che il ligando immunologico o le molecole capaci di legarsi al ligando immunologico sono fissate al nerofumo finemente parf ticolato per mezzo di una immide, una azide, un isotiocianato, un immidoestere o una dialdeide 8 Metodo secondo la rivendicazione 44, caratterizzato dal fatto che il ligando immunologico o le molecole capaci di legarsi al ligando immunologico sono fissate al nerofumo finemente particolato per mezzo di un isotiocianato. Metodo secondo la rivendicazione 44, caratterizzato dal fatto che il ligando immunologico o le molecole capaci di legarsi al ligando Immunologico sono fissate al nerofumo finemente parf ticolato tramite fenilisotiocianato, acido 4,4'-diisotiocianost iilben-2 .2'-disolfonico. 4-N.N-dimetilamminoazobenzen-4 '-isotiocianato, fluorescein isotiocianato o rodammin isotiocianato. 50 Metodo secondo la rivendicazione 44, caratterizzato dal fatto che il ligando immunologico legato o le molecole capaci di legarsi al ligando immunologico legato e il nerofumo finemerite particolato sono sospesi in un mezzo acquoso da un tamponato ad un pH compreso-tra circa 6 e circa 9 e al quale il ligando immunologico immobilizzato o la molecola capace di legarsi al ligando immunologico immobilizzato siano stabili. 51.Metodo secondo la rivendicazione 50, caratterizzato dal fatto che la sospensione acquosa è trattata con almeno un tensioattivo ionico o non ionico biologicamente accettabile. 52.ln un dispositivo di prova immunochimica utilizzante una reazione tra un ligando immunoloqico o molecole capaci di leqarsi al ligando immunologico e un analita, il miqlioramento caretterizzato dal fatto che comprende l'impiego di un marcatore immunochimico comprendente nerofumo finemente particolato sul quale è immobilizzato e adsorbito un componente che termina in posizione distale rispetto al punto di adsorbimento con un ligando immunologicamente attivo o una molecola capace di legarsi al ligando immunologicamente attivo di detta reazione. 3^ Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che include un involucro impervio all'umidità circoni dante detto dispositivo, includendo detto involucro una prima apertura definita in detto involucro, la cui superficie superiore sia curva ed estesa verso il basso formando un ricettacolo a tazza che termina e impegna una parte di detto cuscinetto serbatoio, essendo detta prima apertura capace di ricevere e dosare il pa saggio del liquido su detto cuscinetto serbatoio, una seconda apertura definita in detto involucro direttamente sopra detto secondo elemento filtrante, essendo detta seconda apertura capace di consentire l'applicazione diretta del campione su detto elemento filtrante, e un sistema funzionante per consentire l'ispézione visiva di detta zona dell'indice di saggio disposto sopri detta zona
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