ES2562406T3 - Dispositivo capilar de flujo lateral de reacción multietapa - Google Patents

Abstract

Un dispositivo (24, 46) capilar de flujo lateral que comprende: a) una matriz (18) de flujo capilar absorbente de un solo camino que tiene un extremo (26) aguas arriba y un extremo (28) aguas abajo que definen una dirección (30) de flujo, siendo dicha matriz (18) compresible; b) por lo menos dos depósitos (32) que incluyen un primer depósito aguas arriba y un segundo depósito aguas abajo en comunicación de fluido con dicha matriz (18) de flujo capilar cada uno a través de sus respectivas primera y segunda zonas (34) de recepción de líquido, estando situados los depósitos (32) entre los extremos y separados entre sí en la dirección (30) de flujo definida por la matriz (18) capilar; cada uno de dicho primer y segundo depósitos (32) está en contacto con sus respectivas dichas zonas (34) de recepción de líquido, por medio de una abertura que constituye un conducto hueco que tiene un borde (36), caracterizado por el hecho de que: cada uno de dichos bordes (36) está presionando sobre dicha matriz (18), en el que los bordes (36) están presionados sobre dicha matriz (18) cuando la matriz (18) está seca; en el que una porción de dicha matriz de flujo capilar entre dichos dos bordes (36) es una zona (35) de creación de interfase; y en el que el dispositivo (24, 46) es apropiado para un drenaje secuencial de dichos depósitos (32) en la dirección aguas abajo.

Description

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DESCRIPCION

Dispositivo capilar de flujo lateral de reaccion multietapa Campo y antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la biologla y deteccion de analitos de fluidos biologicos y medioambientales, principalmente en puntos de atencion mas particularmente, a un dispositivo capilar de flujo lateral, por ejemplo, para realizar ensayos de union especlfica.

El uso de ensayos de union especlfica es de gran valor en varias aplicaciones cllnicas y otras aplicaciones, vease por ejemplo, la solicitud de patente PCT US2004/031220 publicada como WO 2005/031335. Los ensayos de union especifica implican la deteccion y preferentemente la determinacion cuantitativa de un analito en una muestra en la que el analito es un miembro de un par de union especlfica que consiste en un ligando y un receptor. El ligando y el receptor que constituyen un par de union especifica estan relacionados por el hecho de que el receptor y el ligando se unen mutua y especlficamente. Los ensayos de union especlfica incluyen ensayos inmunologicos que implican reacciones entre anticuerpos y antlgenos, reacciones de hibridacion de ADN y ARN, y otras reacciones de union especlfica tales como las que implican hormonas y otros receptores biologicos. Los ensayos de union especlfica se pueden practicar segun varios metodos conocidos en la tecnica. Tales ensayos incluyen ensayos de union competitiva, ensayos sandwich “directos” e “indirectos” como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 4.861.711; patente de EE.UU. No. 5.120.643; patente de EE.UU. No. 4.855.240 o documento EP 284.232.

Debido a que el complejo formado de o por una reaccion de union especlfica generalmente no es directamente observable se han ideado varias tecnicas para marcar un miembro del par de union especlfica para que se pueda observar la reaccion de union. Los marcadores conocidos incluyen radiomarcadores, cromoforos y fluoroforos y enzimas cuya presencia se puede detectar por medio de detectores de radiacion, espectrofotometros o a simple vista. Cuando se marca un miembro de un par de union especlfica con un marcador enzimatico, se puede detectar un complejo por la activacion enzimatica de un sistema de reaccion que incluye un grupo substrato/cofactor que genera una senal en el que un compuesto tal como un colorante se activa para producir una senal detectable.

Los dispositivos capilares de flujo lateral, tales como el dispositivo 10 capilar de flujo lateral representado en la Figura 1, son bien conocidos en los campos de analisis y deteccion y se usan a menudo para la implementacion rapida y simple de un ensayo de union especlfica de analito en una muestra 12 llquida. La muestra 12 se coloca en el dispositivo 10 capilar de flujo lateral a traves de un deposito 14 para entrar en contacto con una zona 16 de recepcion del llquido de una matriz 18 de flujo capilar absorbente. La zona 16 de recepcion incluye un reactivo marcado soluble configurado para unirse al analito que esta presente en la muestra 12. La muestra 12 que incluye el analito unido al reactivo marcado, migra por flujo capilar para llenar toda la matriz 18 de flujo capilar y para migrar adicionalmente a un drenaje 23 de llquido. Durante el flujo capilar de la muestra 12 de la zona 16 de recepcion del llquido hacia el drenaje 23 de llquido, la muestra 12 pasa por la zona 20 de reaccion que es observable a traves de una ventana 22 de observacion. La zona 20 de reaccion comprende un anti-analito que junto con el analito constituye un par de union especlfica. El analito en la muestra 20 forma un complejo con el anti-analito y de este modo es capturado en la zona 20 de reaccion. A medida que el reactivo marcado se une al analito, y a medida que el analito se concentra en la zona 20 de reaccion, se produce una senal observable en la zona 20 de reaccion, en la que la intensidad de la senal observable se relaciona con la cantidad de analito en la muestra.

Los dispositivos capilares de flujo lateral tales como el dispositivo 10 son extremadamente utiles ya que estos son faciles de utilizar incluso por una persona no experta o en condiciones no de laboratorio y son relativamente baratos de producir.

Un inconveniente de los dispositivos capilares de flujo lateral conocidos tales como el dispositivo 10 es que una muestra se extiende uniformemente en todas las direcciones hasta que encuentra un borde para fluir capilarmente, tal como un borde de la matriz de flujo capilar. De este modo, la muestra y cualquier analito en ella se distribuyen dentro de todo el volumen de la matriz de flujo capilar y se desperdician. Serla ventajoso ser capaces de permitir el transporte de toda la muestra anadida a una matriz de flujo capilar a la vecindad de una respectiva zona de reaccion.

Un inconveniente adicional de los dispositivos capilares de flujo lateral conocidos es que estos no estan configurados para reacciones multietapa. Para realizar un ensayo de union multietapa usando un dispositivo capilar de flujo lateral tal como el dispositivo 10, se anaden reactivos llquidos en serie. Por ejemplo, se proporciona un dispositivo 10 en el que una zona 16 de recepcion de llquido no incluye un reactivo marcado.

Primero, se anade una muestra 12 que incluye analito por medio del deposito 14, pasa a la matriz 18 de flujo capilar a traves de la zona 16 de recepcion de llquido y se transporta por flujo capilar al drenaje 23. Cuando la muestra 12 pasa a traves de la zona 20 de reaccion, el analito en la muestra 20 forma un complejo con el anti-analito localizado en la zona de reaccion y de este modo es capturado en la zona 20 de reaccion.

Cuando toda la muestra 12 se ha drenado a la matriz 18 de flujo capilar, se anade un primer llquido reactivo que contiene un reactivo marcado configurado para unirse al analito a traves del deposito 14, pasa a la matriz 18 de flujo capilar a traves de la zona 16 de recepcion de llquido y se transporta por flujo capilar al drenaje 23. Cuando el primer

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llquido reactivo pasa a traves de la zona 20 de reaccion, el reactivo marcado en el primer llquido reactivo se une al analito capturado en la zona de reaccion.

Cuando el reactivo marcado incluye una enzima, entonces cuando todo el primer llquido reactivo se ha drenado a la matriz 18 de flujo capilar, se anade un segundo llquido reactivo que contiene un substrato de enzima a traves del deposito 14, pasa a la matriz 18 de flujo capilar a traves de la zona 16 de recepcion de llquido y se transporta por flujo capilar al drenaje 23. Cuando el segundo llquido reactivo pasa a la zona 20 de reaccion, el substrato enzimatico en el reacciona con el marcador enzimatico, produciendo una fuerte senal observable en la zona 20 de reaccion, en la que la intensidad de la senal observable esta relacionada con la cantidad de analito en la muestra.

Es sabido que los ensayos de union multietapa son significativamente mas sensibles y precisos que los ensayos de union de una sola etapa. De este modo, hay un deseo de realizar ensayos de union miltietapa como se describe anteriormente. Esta claro, sin embargo, que es muy diflcil si no imposible conseguir resultados precisos y repetibles para tal procedimiento complejo sin el uso de un caro sistema robotico situado en un laboratorio. Incluso con el uso de un sistema robotico, dado que cada llquido sucesivo se anade sobre una zona 16 de recepcion de llquido ya humeda con un llquido precedente, la mezcla de los dos llquidos ocurre invariablemente, lo que conduce a un resultado impredecible, que afecta adversamente a la duracion de una etapa dada, evitando la realizacion de una reaccion verdaderamente secuencial, y afectando a la repetitividad y precision.

En la patente de EE.UU. No. 5.198.193 se ensena un dispositivo de flujo capilar con multiples caminos capilares que conducen a una sola zona de reaccion, teniendo cada camino una longitud diferente y/o una valvula para permitir la variacion del tiempo de llegada de un llquido a la zona de reaccion. Tal dispositivo no es efectivo ya que en cada interseccion de caminos capilares que incluyen dos llquidos diferentes, se producen flujos paralelos, analogos a los producidos cuando se anade llquido sucesivamente sobre una matriz de flujo capilar ya humeda como se discute anteriormente.

Ademas, las valvulas descritas en tal dispositivo capilar de flujo lateral son diflciles de fabricar.

En la patente europea No. EP 1044372 se ensena un dispositivo capilar de flujo lateral en el que se anade la muestra y llquidos reactivos a dos o mas posiciones adyacentes junto con una matriz de flujo capilar que es substancialmente una tira de material absorbente, por ejemplo, nitrocelulosa soportada con poliester de tamano de poro de 8 micrometros. Se colocan N+1 separadores estrechos (por ejemplo, 1 mm), se colocan tiras hidrofobas impermeables de material (cinta adhesiva de mylar o poliester) perpendicularmente a la direccion de flujo para definir N zonas anchas (por ejemplo, 5 mm) de recepcion de llquido aguas arriba de una zona de reaccion localizada aguas arriba de un drenaje de llquido. Cuando se anaden llquidos simultaneamente a las zonas de recepcion de llquido una porcion de cada llquido se absorbe a traves de la superficie superior de la matriz de flujo capilar en la zona de recepcion de llquido. El llquido que no se absorbe inmediatamente permanece en forma de gotas sobre la superficie de una zona respectiva de recepcion de llquido, en la que las gotas adyacentes se previene que se mezclen o fluyan a lo largo de la superficie de la matriz de flujo capilar por los separadores. En los casos en los que los llquidos se anaden simultaneamente se forma una interfase entre los dos llquidos en el volumen de la matriz debajo del separador, mientras que queda llquido en exceso sobre la superficie de una zona de recepcion de llquido. El llquido de una primera, la mas aguas abajo, zona de recepcion de llquido, se transporta aguas abajo por flujo capilar pasada la zona de reaccion hasta el drenaje de llquido. Cuando todo el llquido en la primera zona de recepcion de llquido se agota, la segunda zona de recepcion de llquido se transporta aguas abajo por flujo capilar pasada la zona de reaccion hasta el drenaje de llquido.

Aparentemente las ensenanzas del documento EP 1044372 proporcionan la capacidad de realizar reacciones mutietapa usando un dispositivo capilar de flujo lateral, pero en la practica las ensenanzas estan severamente limitadas por limitaciones impuestas por la estructura del dispositivo capilar de flujo lateral.

Una primera limitacion es que la cantidad de llquido anadido a una zona de recepcion de llquido es limitada. El llquido se anade en forma de una gota que descansa sobre una zona de recepcion de llquido. Si la tension superficial del llquido es insuficiente, por ejemplo, debido al tamano o debido a detergentes en el llquido, si la matriz de flujo capilar es muy hidrofila o si el dispositivo capilar de flujo lateral se perturba, la gota se colapsa y se derrama del dispositivo capilar de flujo lateral.

Una segunda limitacion es que los llquidos se deben anadir simultaneamente. Si los llquidos se anaden no simultaneamente, un llquido anadido a una primera zona de recepcion de llquido fluye a una segunda zona adyacente de recepcion de llquido. Cuando se anade un segundo llquido a la segunda zona de recepcion de llquido, el segundo llquido fluye a un volumen de la matriz desde la parte superior a traves de partes secas de la segunda zona de recepcion de llquido mientras que el segundo llquido fluye dentro del mismo volumen lateralmente. Los dos llquidos se mezclan, y como se discutio anteriormente, conduce a resultados impredecibles, afecta adversamente a la duracion de una etapa dada, previene la realizacion de una verdadera reaccion secuencial, y afecta tanto a la repetitividad como a la precision de los resultados.

Una tercera limitacion es que las ensenanzas del documento EP 1044372 pueden conducir a la formacion de caminos capilares multiples. Como se senalo anteriormente, un separador es una tira de material suave unida

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usando adhesivo a la superficie superior de la matriz que tiene caracterlsticas de escala micrometrica. Como resultado, se forman caminos capilares en el espacio entre un separador y la matriz de flujo capilar a traves de los cuales se pueden mezclar dos llquidos en zonas de recepcion de llquido adyacentes y como se discutio anteriormente, conduce a un resultado impredecible, afecta negativamente a la duracion de una etapa dada, previene la realizacion de una reaccion verdaderamente secuencial, y afecta tanto a la repetitividad como a la precision de los resultados.

Una desventaja adicional de las ensenanzas del documento EP 1044372 es la dependencia de los adhesivos para fijar los separadores a la matriz de flujo capilar. En la tecnica se sabe que los adhesivos, especialmente adhesivos no polimerizantes, son atraldos y con el tiempo migran a materiales absorbentes tales como nitrocelulosa que son apropiados para su uso como matrices de flujo capilar (vease, por ejemplo, Kevin Jones; Anne Hopkins, effect of adhesive migration in lateral flow assays; IVD Technology, September 2000). De este modo, despues de un perlodo de almacenamiento, el adhesivo que fija un separador a una matriz de flujo capilar de un dispositivo realizado segun las ensenanzas del documento EP 1044372 migrarla a los poros de la matriz de flujo capilar en la region en la que se va a formar la interfase llquido-llquido. La presencia de un adhesivo hidrofobo en la matriz bloquea los poros o modifica las propiedades capilares de los poros de modo que una interfase formada entre los llquidos es indefinida y no clara, lo que conduce a la mezcla de los dos llquidos de la interfase y a los efectos negativos concomitantes. Otra desventaja de usar adhesivos es el posible desprendimiento de los separadores de la matriz durante el almacenamiento prolongado.

En la patente de EE.UU. No. 4.981.786 se ensena un dispositivo capilar de flujo lateral con dos depositos. La provision de un dispositivo capilar de flujo lateral con dos o mas depositos permite la adicion de dos o mas llquidos sucesivos sin contaminacion mutua: una vez que se ha anadido un llquido a un primer deposito, los restos de llquido permanecen en las paredes del deposito. Cualquier llquido anadido a traves del mismo deposito se contaminara con los restos. En un primer dispositivo capilar de flujo lateral que se ensena en la Patente de EE.UU. No. 4.981.786, dos o tres depositos distintos estan en comunicacion de fluido con una matriz de flujo capilar por medio de zonas de recepcion de llquido distintas y separadas flsicamente. Situada en una de las zonas de recepcion de llquido esta una zona de reaccion que incluye un reactivo de captura. Un drenaje de llquido esta en comunicacion capilar con la matriz de flujo capilar aguas abajo de los dos depositos. Aunque no esta del todo claro en la descripcion, se entiende que el uso del primer dispositivo capilar de flujo lateral incluye anadir un pequeno volumen de muestra a traves de un deposito para proporcionar un punto de muestra a la zona de reaccion en la matriz de flujo capilar y subsecuentemente para anadir uno o mas reactivos, cada reactivo a traves de un deposito diferente.

En un segundo dispositivo capilar de flujo lateral que se ensena en la Patente de EE.UU. No. 4.981.786, dos depositos distintos estan en comunicacion de fluido con una matriz de flujo capilar por medio de zonas de recepcion de llquido distintas y separadas flsicamente. En comunicacion capilar con el borde aguas arriba de la matriz de flujo capilar esta un deposito de llquido que se puede activar para liberar un llquido reactivo que subsecuentemente migra aguas abajo. Una zona de reaccion esta situada aguas abajo de los dos depositos. Un drenaje de llquido esta en comunicacion capilar con la matriz de flujo capilar aguas abajo de la zona de reaccion.

En ambos dispositivos capilares de flujo lateral se ensenan varias caracterlsticas estructurales para mantener una matriz de flujo capilar en su lugar pero hacer solo un mlnimo contacto con ellos. Ademas, se observa que hay poco o ningun contacto entre los depositos y la matriz de flujo capilar en una respectiva zona de recepcion de llquido, y si hay contacto es solo un ligero contacto que es el resultado de la expansion de la matriz de flujo capilar al humedecerse. Tales caracterlsticas excluyen el uso de los dispositivos capilares de flujo lateral como dispositivos efectivos para reacciones multietapa de una manera analoga a la descrita en el documento EP 1044372. Cuando se anade un primer llquido a un primer deposito y, simultaneamente, se anade un segundo llquido a un segundo deposito adyacente aguas arriba, el primer y segundo llquidos ambos fluyen dentro de la matriz de flujo capilar a traves de una respectiva zona de recepcion de llquido. Cuando se juntan los dos llquidos, se forma una interfase y el primer llquido empieza a fluir aguas abajo. Incontrolablemente, comienza a gotear llquido de la matriz de flujo capilar en cualquier punto en el que exista un camino capilar alternativo, por ejemplo, por las estructuras de apoyo sobre las que descansa la matriz de flujo capilar o a lo largo de las paredes dispuestas lateralmente que mantienen la matriz de flujo capilar en su lugar. Tambien asciende llquido por cualquier objeto en contacto con la superficie superior de la matriz de flujo capilar, por ejemplo, cuando un deposito entra en contacto con la matriz de flujo capilar. Como resultado, se fuga llquido de todas las zonas de recepcion de llquido a traves de cualquier camino capilar alternativo, llenando el dispositivo capilar de flujo lateral con llquido y convirtiendo en inservibles los resultados de un experimento.

Serla muy ventajoso tener un dispositivo capilar de flujo lateral o metodos para usar dispositivos capilares de flujo lateral para la realization de reacciones multietapa en los campos de la biologla y la medicina, particularmente para el diagnostico que no tengan por lo menos algunas de las desventajas de la tecnica anterior.

Sumario de la invencion

Las realizaciones de la presente invencion tratan con exito por lo menos algunos de los inconvenientes de la tecnica anterior proporcionando un dispositivo capilar de flujo lateral y un metodo que incluye el uso de un dispositivo capilar de flujo lateral que permite la realizacion de reacciones multietapa. Las realizaciones de la presente invencion

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permiten la realizacion de reacciones multietapa tales como ensayos de union multietapa con precision y repetitivamente incluso en condiciones no de laboratorio e incluso por operarios menos expertos.

Segun las ensenanzas de la presente invencion se proporciona un dispositivo capilar de flujo lateral que comprende:

a) una matriz de flujo capilar absorbente de un solo camino que tiene un extremo aguas arriba y un extremo aguas abajo que definen una direccion de flujo, siendo dicha matriz compresible;

b) por lo menos dos depositos que incluyen un primer deposito aguas arriba y un segundo deposito aguas abajo en comunicacion de fluido con dicha matriz de flujo capilar cada uno a traves de sus respectivas primera y segunda zona de recepcion de llquido, estando situados los depositos entre los extremos y separados entre si en la direccion de flujo definida por la matriz capilar;

cada uno de dicho primer y segundo deposito esta en contacto con sus respectivas zonas de recepcion de llquido, por medio de una abertura que constituye un conducto hueco que tiene un borde. Caracterizado por el hecho de que:

dicho borde esta presionando dicha matriz,

en el que los bordes estan presionados dentro de dicha matriz cuando la matriz esta seca;

en el que una porcion de dicha matriz de flujo capilar entre dichos dos bordes es una zona de creacion de interfase; y

en el que el dispositivo es apropiado para un drenaje secuencial de dichos depositos en la direccion aguas abajo.

En realizaciones de la invencion, dicha matriz comprende fibras de vidrio y dichos capilares estan comprendidos en espacios entre las fibras.

En realizaciones de la invencion el dispositivo de la reivindicacion 2, dicha matriz comprende libras de vidrio.

En realizaciones de la invencion dicha presion aplicada por dichos bordes a la matriz de flujo capilar comprime la matriz y reduce el area superficial/volumen a no mas del 40% del grosor.

En realizaciones de la invencion, en frente de cada uno de dichos bordes esta dispuesto un componente de soporte que soporta dicha matriz contra dicha presion.

En realizaciones de la invencion dicha matriz esta suspendida entre dichos bordes y dichos componentes de soporte.

En realizaciones de la invencion dicha matriz esta unida a un soporte impermeable.

En realizaciones de la invencion, dicho soporte impermeable esta en contacto con por lo menos un componente de soporte que soporta dicho soporte impermeable contra dicha presion.

En realizaciones de la invencion, en frente de cada uno de dichos bordes esta dispuesto un componente de dicho soporte que soporta dicha matriz contra dicha presion.

En realizaciones de la invencion, el dispositivo comprende, aguas abajo de por lo menos una dicha zona de recepcion de llquido, una zona de reaccion que comprende por lo menos una entidad de captura configurada para capturar un material que fluye a traves de dicha matriz de flujo capilar.

En realizaciones de la invencion, el dispositivo comprende, un drenaje de llquido en comunicacion de fluido con dicha matriz de flujo capilar aguas abajo de la zona de reaccion.

En realizaciones de la invencion, dicha comunicacion de fluido a traves de dichas zonas de recepcion de llquido es una comunicacion de fluido no capilar.

En realizaciones de la invencion, dicha zona de creacion de interfase tiene una longitud de por lo menos 50% de una dimension de dicha zona de recepcion de llquido en dicha direccion de flujo.

En realizaciones de la invencion, la expansion inducida por llquido de dicha zona de creacion de interfase no esta restringida.

En realizaciones de la invencion, el dispositivo comprende adicionalmente una carcasa que contiene dicha matriz de flujo capilar.

En realizaciones de la invencion, los lados de dicha matriz de flujo capilar no tienen contacto con dicha carcasa.

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Se proporciona adicionalmente segun la invencion, un kit para el montaje de un dispositivo capilar de flujo lateral segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

a) una matriz de flujo capilar absorbente de un solo camino que tiene un grosor; y por lo menos dos dispositivos que tienen b) y c):

b) un primer componente, que incluye un deposito con por lo menos una pared configurada para mantener llquidos y un area inferior, dicha area inferior definida por un conducto hueco no capilar con un borde y por lo menos una extension que sobresale de una superficie exterior de dicha pared; y

c) un segundo componente, que incluye un cuerpo con una plataforma contra-soporte en un extremo superior y por lo menos una extension que sobresale de dicho cuerpo en el que una dicha extension de dicho primer componente y una dicha extension de dicho segundo componente estan configuradas para acoplarse mutuamente de modo que dicho borde y dicha plataforma contra-soporte estan separadas por una distancia y son sustancialmente paralelas, en el que dicha substancia es suficiente de modo que un dicho borde presiona sobre dicha matriz cuando esta seca cuando dichos dos componentes estan acoplados alrededor de dicha matriz.

En realizaciones del kit de la invencion, dicha matriz esta unida a un refuerzo impermeable.

En una realizacion del kit de la invencion dicha matriz de flujo capilar comprende adicionalmente una zona de reaccion que comprende por lo menos una entidad de captura configurada para capturar material que fluye a traves de dicha matriz de flujo capilar.

Breve descripcion de los dibujos

La invencion se describe aqul, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia especlfica ahora a los dibujos en detalle, se insiste en que los particulares mostrados son a modo de ejemplo y para fines de discusion ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invencion unicamente, y se presentan en pro de proporcionar lo que se cree que es la descripcion mas util y facilmente entendible de los principios y aspectos conceptuales de la invencion. En este sentido, no se hace ningun intento de mostrar detalles estructurales de la invencion con mas detalle de lo que es necesario para una comprension fundamental de la invencion.

En los dibujos:

La FIG. 1 (tecnica anterior) representa un dispositivo capilar de flujo lateral de un deposito;

La FIG. 2 representa esquematicamente una realizacion de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion que incluye tres depositos de llquido y una matriz de flujo capilar sin un soporte, en corte transversal;

La FIG. 3 representa esquematicamente la formacion de columnas verticales de llquido en un dispositivo capilar de flujo lateral segun el metodo de la presente invencion;

La FIG. 4 representa esquematicamente una realizacion de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion, que incluye cuatro depositos de llquido y una matriz de flujo capilar con un soporte, en corte transversal;

La FIG. 5A representa esquematicamente una realizacion de un dispositivo de la presente invencion util para preparar un dispositivo capilar de flujo lateral;

La FIG. 5B representa esquematicamente una vista superior de un dispositivo capilar de flujo lateral hecho de un kit montado de la presente invencion que incluye dos dispositivos de la figura 5A y una matriz de flujo capilar de fibra de vidrio soportada por plastico;

La FIG. 5C representa esquematicamente una vista lateral de un dispositivo capilar de flujo lateral hecho de un kit montado de la presente invencion que incluye dos dispositivos de la figura 5A y matriz de flujo capilar de fibra de vidrio soportada por plastico;

La FIG. 6A representa esquematicamente una realizacion de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion, despiezado en seccion transversal para mostrar los componentes;

La FIG. 6B representa esquematicamente una matriz de flujo capilar del dispositivo capilar de flujo lateral de la figura 6A;

La FIG. 6C es una representacion esquematica del dispositivo capilar de flujo lateral de la Figura 6A, montado en corte transversal;

Las Figs. 7 son resultados del experimento 2, descrito a continuacion, la deteccion de un analito segun las ensenanzas de la presente invencion;

Las Figs. 8 son resultados del experimento 3 descrito a continuacion, comparando la deteccion de un analito segun las ensenanzas de la presente invencion (8A y 8B) y usando un dispositivo capilar de flujo lateral de un solo deposito

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(8C y 8D);

La FIG. 9 son resultados del experimento 4 descrito a continuacion, una curva de calibracion para el ensayo de competicion de 11-deshidro-TxB2 obtenida segun las ensenanzas de la presente invencion; y

La FIG. 10 son resultados del experimento 10 descrito a continuacion, que muestran la correlacion entre la intensidad de fluorescencia emitida por una zona de reaccion de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion y el volumen total de llquido anadido.

Realizaciones preferidas de la invencion

La presente invencion es de un dispositivo capilar de flujo lateral y metodos de usar el dispositivo capilar de flujo lateral. La presente invencion permite la realizacion de reacciones multietapa efectivas y repetibles tales como ensayos de union especlfica multietapa, por ejemplo, para pruebas serologicas.

En la descripcion, las realizaciones se refieren a un metodo analltico para la deteccion de un analito que es un biomarcador tal como un antlgeno, anticuerpo, metabolito, material toxico u otro material detectable de un ser humano u otra fuente viva, tales como sangre, orina, tejido, o de una fuente no viva, tal como una fuente medioambiental como agua, suelo o aguas residuales. En la descripcion, las realizaciones se refieren a unir el analito a un anti-analito inmovilizado en una zona de reaccion en la matriz de flujo capilar que junto con el analito constituye un par de union especlfica tal como un anticuerpo, antlgeno, ADN u otro miembro de par de union especifica (sbp) y que el analito unido es detectado a continuacion directamente o por medio de un reactivo marcado que produce una senal detectable o que produce una senal detectable despues de haber sido expuesto a un tercer reactivo que reacciona con el reactivo marcado y produce una senal detectable que se puede visualizar o medir, por medio de un instrumento de lectura.

Los principios, usos e implementaciones de las ensenanzas de la presente invencion se pueden comprender mejor con referencia a la descripcion, figuras y ejemplos adjuntos, cuya lectura cuidadosa permite a un experto en la tecnica implementar las ensenanzas de la presente invencion sin excesivo esfuerzo o experimentacion. En las figuras, los numeros de referencia similares se refieren a partes similares en todas ellas.

Antes de explicar por lo menos una realizacion de la invencion en detalle, se debe entender que la invencion no esta limitada en su aplicacion a los detalles establecidos aqul. La invencion se puede implementar con otras realizaciones y se puede practicar o llevar a cabo de varias maneras. Tambien se entiende que la fraseologla y terminologla empleada aqul es para fines descriptivos y no se debe considerar limitante.

En general, la nomenclatura utilizada aqul y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invencion incluyen tecnicas de los campos de la biologla, ingenierla de diagnostico, ciencia de materiales y flsica. Tales tecnicas estan meticulosamente explicadas en la bibliografla.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados aqul tienen el mismo significado que se entiende comunmente por una persona de experiencia media en la tecnica a la que pertenece la invencion. Ademas, las descripciones, materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o ensayo de la presente invencion.

Tal como se usan aqul, los terminos "que comprende" y "que incluye" o sus variantes gramaticales se deben tomar como que especifican las caracterlsticas, numeros enteros, etapas o componentes citados, pero no excluyen la adicion de una o mas caracterlsticas, numeros enteros, etapas, componentes o sus grupos. Este termino abarca los terminos "que consiste en y "que consiste esencialmente en”.

La frase "que consiste esencialmente en” o sus variantes gramaticales cuando se usa aqul se debe tomar como especificar las caracterlsticas, numeros enteros, etapas o componentes citados, pero no excluye la adicion de una o mas caracterlsticas, numeros enteros, etapas, componentes o sus grupos, pero solo si las adicionales caracterlsticas, numeros enteros, etapas, componentes o sus grupos no alteran materialmente las nuevas y basicas caracterlsticas de la composicion, dispositivo o metodo reivindicado.

El termino "metodo" se refiere a maneras, medios, tecnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada que incluyen, pero no se limitan a, aquellas maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos, o facilmente desarrollados a partir de maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las tecnicas pertinentes. La implementacion de los metodos de la presente invencion implica realizar o completar tareas o etapas seleccionadas manualmente, automaticamente, o una de sus combinaciones.

Aqul, el termino "analito" se refiere al compuesto o composicion a detectar o analizar cuantitativamente y que tiene por lo menos un epltopo o sitio de union. Un analito puede ser cualquier substancia para la que existe un miembro de union especlfica al analito de origen natural o para el que se puede preparar un miembro de union especlfica del analito, por ejemplo, carbohidrato y lectina, hormona y receptor, acidos nucleicos complementarios, y similares. Ademas, los posibles analitos incluyen virtualmente cualquier compuesto, composicion, agregacion, u otra

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substancia que se puede detectar inmunologicamente. Es decir, el analito, o una de sus porciones, sera antigenico o haptenico que tiene por lo menos un sitio determinante, o sera un miembro de un par de union de origen natural.

Los analitos incluyen, pero no estan limitados a, toxinas, compuestos organicos, protelnas, peptidos, microorganismos, bacterias, virus, aminoacidos, acidos nucleicos, carbohidratos, hormonas, esteroides, vitaminas, farmacos (incluyendo los administrados con fines terapeuticos as! como aquellos administrados con fines illcitos), contaminantes, pesticidas y metabolitos o anticuerpos para cualquiera de las sustancias anteriores.

Generalmente un analito se encuentra en una "muestra" y las ensenanzas de la presente invention se aplican a la muestra para determinar la presencia de o una cantidad de analito presente en una muestra.

Aqul el termino "muestra" se refiere a cualquier cosa que pueda contener un analito para la que se desea un ensayo de analito. La muestra puede ser una muestra biologica, tal como un fluido biologico o un tejido biologico. Los ejemplos de fluidos biologicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, llquido cefalorraquldeo, lagrimas, moco, llquido amniotico o similares. Los tejidos biologicos son agregados de celulas, normalmente de un tipo particular junto con su substancia intercelular que forman uno de los materiales estructurales de un ser humano, animal, vegetal, estructura bacteriana, fungica o viral, incluyendo tejidos conjuntivo, epitelial, muscular y nervioso. Los ejemplos de tejidos biologicos tambien incluyen organos, tumores, ganglios linfaticos, arterias y celulas individuales. Ademas, un material solido sospechoso de contener el analito se puede utilizar como muestra de ensayo una vez que se modifica para formar un medio llquido o para liberar el analito. El pretratamiento puede implicar preparar plasma a partir de sangre, diluir fluidos viscosos, y similares. Los metodos de tratamiento pueden implicar filtration, destilacion, separation, concentration, inactivation de componentes que interfieren, y la adicion de reactivos. Ademas de fluidos fisiologicos, se pueden usar otras muestras tales como agua, productos alimenticios, extractos de suelo, y similares, para la realization de ensayos industriales, medioambientales, o de production de alimentos, as! como ensayos de diagnostico. La selection y pretratamiento de muestras biologicas, industriales y medioambientales antes del ensayo se conoce bien en la tecnica y no necesita ser descrita adicionalmente.

Tal como se usa aqul, la expresion "se une especlficamente" se refiere a la especificidad de union de un "miembro de par de union especlfica", que es un miembro de un par de union especlfica, es decir, dos moleculas diferentes en las que una de las moleculas se une especlficamente con la segunda molecula por medios qulmicos o flsicos. Las dos moleculas estan relacionadas en el sentido de que su union entre si es tal que son capaces de distinguir a su pareja de union de otros constituyentes de ensayo que tienen caracterlsticas similares. Los miembros del par de union especlfica se denominan ligando y receptor (anti ligando), miembro del sbp y pareja del sbp, y similares. Una molecula tambien puede ser un miembro de un sbp para una agregacion de moleculas; por ejemplo, un anticuerpo generado contra un complejo inmune de un segundo anticuerpo y su antlgeno correspondiente se puede considerar que son un miembro de sbp para el complejo inmune.

Ademas de los miembros de par de union especlfica antlgeno y anticuerpo, otros pares de union especlfica incluyen, como ejemplos sin limitation, biotina y avidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleotido complementarias, secuencias peptldicas complementarias, moleculas efectoras y receptoras, cofactores enzimaticos y enzimas, inhibidores enzimaticos y enzimas, una secuencia peptldica y un anticuerpo especlfico para la secuencia o la protelna completa, acidos y bases polimericos, colorantes y aglomerantes protelnicos, peptidos y aglomerantes protelnicos especlficos (por ejemplo, ribonucleasa, S-peptido y ribonucleasa S-protelna), metales y sus quelantes, y similares. Ademas, los pares de union especlfica pueden incluir miembros que son analogos al miembro de union especlfica original, por ejemplo, un analogo de analito o un miembro de union especlfica preparado por tecnicas recombinantes o ingenierla molecular.

Un miembro de sbp es analogo a otro miembro de sbp si ambos son capaces de unirse a otro miembro de sbp complementario identico. Tal miembro de sbp puede ser, por ejemplo, un ligando o un receptor que ha sido modificado por la substitution de por lo menos un atomo de hidrogeno por un grupo para proporcionar, por ejemplo, un ligando marcado o receptor marcado. Los miembros de sbp pueden ser analogos a o complementarios del analito o de un miembro de sbp que es complementario del analito. Si el miembro de union especlfica es un inmunorreactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, antlgeno, hapteno, o uno de sus complejos. Si se usa un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una protelna o anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimerico, o una de sus mezclas o fragmentos, as! como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de union especlfica. Los detalles de la preparation de tales anticuerpos y su idoneidad para el uso como miembros de union especlfica son conocidos por los expertos en la tecnica.

"Reactivo marcado" se refiere a una substancia que comprende un marcador detectable unido con un miembro de union especlfica. La union puede ser enlace covalente o no covalente, pero el metodo de union no es crltico para la presente invencion. El marcador permite que el reactivo marcador produzca una senal detectable que se relaciona con la presencia del analito en la muestra. El componente del miembro de union especlfica del reactivo marcador se selecciona para unirse directamente al analito o para unirse indirectamente al analito por medio de un miembro de union especlfica auxiliar, que se describe con mayor detalle aqul a continuation.

Ademas, el miembro de union especlfica puede ser marcado antes o durante, la realizacion del ensayo por medio de

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un metodo de union apropiado.

"Marcador" se refiere a cualquier substancia que es capaz de producir una senal que es detectable por medios visuales o instrumentales. Varios marcadores apropiados para su uso en la presente invencion incluyen marcadores que producen senales por medio de medios qulmicos o flsicos. Tales marcadores pueden incluir enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y marcadores radiactivos. Otros marcadores apropiados incluyen marcadores en partlculas tales como partlculas metalicas coloidales tales como oro, partlculas no metalicas coloidales tales como partlculas de selenio, partlculas tenidas o coloreadas tales como plastico coloreado o un microorganismo tenido, partlculas de latex polimericas organicas y liposomas, partlculas coloreadas, microcapsulas polimericas, sacos, eritrocitos, eritrocitos fantasmas, u otras veslculas que contienen substancias directamente visibles, y similares. Tlpicamente, un marcador visualmente detectable se usa como componente marcador del reactivo marcador, proporcionando por ello la lectura directa visual o instrumental de la presencia o cantidad del analito en la muestra de ensayo sin la necesidad de componentes que producen senal adicional en los sitios de deteccion.

La selection de un marcador particular no es crltica para la presente invencion, pero el marcador sera capaz de generar una senal detectable por si misma, o ser instrumentalmente detectable, o ser detectable en conjuncion con uno o mas componentes que producen senales adicionales.

Se pueden formar varios reactivos marcadores diferentes variando el marcador o el componente del miembro de union especlfica del reactivo marcador; se apreciara por un experto en la tecnica que la election implica la consideration del analito a detectar y los medios deseados de detection. Como se discute a continuation, tambien se puede incorporar un marcador usado en un sistema de control para el ensayo.

Por ejemplo, uno o mas componentes que producen senal se pueden hacer reaccionar con el marcador para generar una senal detectable. Si el marcador es una enzima, entonces la amplification de la senal detectable se obtiene haciendo reaccionar la enzima con uno o mas substratos o enzimas y substratos adicionales para producir un producto de reaction detectable.

Las enzimas marcadas usadas en el campo incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, glucosa oxidasa y ureasa.

En un sistema de production de senales alternativo, el marcador puede ser un compuesto fluorescente en el que no se requiera manipulation enzimatica del marcador para producir la senal detectable. Las moleculas fluorescentes incluyen, por ejemplo, fluorescelna, ficobiliproteIna, rodamina y sus derivados y analogos son apropiados para uso como marcadores en tal sistema.

El uso de colorantes para la tincion de materiales biologicos, tales como protelnas, carbohidratos, acidos nucleicos, y organismos completos esta documentado en la bibliografla. Se sabe que ciertos colorantes tinen materiales particulares preferentemente sobre la base de las qulmicas compatibles de colorante y ligando. Por ejemplo, azul de Coomassie y azul de metileno para protelnas, reactivo de Schiffs-acido periodico para carbohidratos, cristal de violeta, SafraninO y azul de Tripan para tinciones de celulas enteras, bromuro de etidio y naranja de acridina

"Componente que produce senal" se refiere a cualquier substancia capaz de reaccionar directa o indirectamente con el reactivo marcado para producir la senal que es detectable por medio visual o instrumental. El componente puede ser substrato catalizado por la enzima marcada o colorantes que pueden reaccionar qulmicamente con el reactivo de marca (dsDNA/naranja de acridina), substrato de enzimas tal como: BCIP/NBT; Fosfato de Azonaftol; 3-AEC; 4- chloronaftilol; sal de tetrazolio/PMS; Urea/indicadores de pH.

En realizaciones de la presente invencion, una matriz de flujo capilar incluye por lo menos una zona de reaccion. Una zona de reaccion es una region o volumen de la matriz que comprende por lo menos una entidad de captura configurada para capturar un material que fluye a traves de la matriz de flujo capilar en regiones definidas para la realization de la reaccion de ensayo que incluye una llnea de ensayo y una llnea de control. Una "llnea de ensayo" es la region en la zona de reaccion, en la que se realiza el ensayo analltico. La region comprende miembro de par de union especlfica (sbp) que esta inmovilizado a la matriz del camino capilar. El miembro de sbp puede ser un anticuerpo o antlgeno acido nucleico o sus modificaciones. Puede ser protelnas como avidina y sus derivados o sacaridos tales como lectinas. Que son parte del par de union que es capaz de unirse directa o indirectamente al analito de interes. Varias llneas de ensayo pueden estar en la zona de reaccion cada una de un par de union especlfica distinto para diferentes analitos. Una "llnea de control" es la region en la zona de reaccion, en la que se realiza una reaccion para confirmar la validez del ensayo; la llnea de control tambien puede ser una llnea de calibration o llneas para la correction de las senales (resultados) de ensayo obtenidas en la llnea de ensayo. La llnea de control comprende un miembro de spb inmovilizado con capacidades de union a uno o mas de los reactivos que participan en la reaccion o compuestos existentes en la muestra.

En la presente invencion, una matriz de flujo capilar es absorbente, es decir comprende un material absorbente, poroso u otro material formado de cavidades que permite el transporte capilar de llquidos a su traves, es decir, los poros definen un sistema continuo de canales de flujo capilar. En general, para los llquidos acuosos el transporte capilar requiere un camino continuo de poros de menos de alrededor de 2 mm de tamano, generalmente en el

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intervalo de 0,05 micrometros a 100 micrometros. Como se describe aqul, una matriz de flujo capilar apropiada es sustancialmente compresible, es decir, conserva la integridad estructural y no se rompe bajo la presion aplicada que conduce a una reduccion de volumen, por ejemplo, la presion aplicada por los bordes del deposito. En realizaciones, la presion aplicada a una matriz de flujo capilar perpendicularmente por un borde del deposito comprime la matriz de flujo capilar hasta sustancialmente la misma medida por toda la altura de la matriz de flujo capilar. En realizaciones, una matriz es suficientemente gruesa y suficientemente blanda como para que la compresion causada por la presion aplicada sea local para el prensado. En realizaciones, la presion aplicada por un borde a una matriz de flujo capilar comprime sustancialmente la matriz y reduce el area de la superficie interna volumen'1 hasta una profundidad de no mas del 40% del grosor.

"Material absorbente" incluye, pero no esta limitado a materiales compuestos de papel de fibra de vidrio o papel de fibra de vidrio derivatizado, celulosa y sus derivados, nylones, PVDF, polisulfonas, PTFE y polipropileno, papel y papel derivatizado, vease Eric Jallerat y Volkmar Thorn, "Filter membranes and bioseparation equipment and supplies” por IVD Technology (2004) o catalogos de fabricantes tales como como Millipor Corp. (Bedford, Massachusetts, USA), Watman Inc. (New Jersey, USA) o Ahlstrom Corp. (Helsinki, Finland).

Tlpicamente, el miembro absorbente consiste en una serie de fibras agrupadas en paralelo para formar una mecha abierta con cierta integridad mecanica debido a la union entre las fibras, con el espacio entre las fibras actuando para formar canales, que absorben llquido. Las fibras apropiadas incluyen poliester, poliamidas tales como nylon, y fibras de dos componentes, tales como polietileno/poliester, nylon/poliester y similares. Las fibras bicomponente de polietileno/poliester comprenden tlpicamente un nucleo central de poliester con una vaina externa de polietileno. Tambien se pueden usar fibras inherentemente hidrofobas tales como polipropilenos con tal de que sean humedecibles en agua, o si es necesario, se hacen humedecibles en agua por medio de otros componentes tales como tensioactivos o pollmeros hidrofilos. En principio es apropiada cualquier fibra humedecible.

Con las fibras se puede formar un miembro absorbente por una variedad de procesos, tales como el recocido para fundir parcialmente la region de la superficie/vaina y provocar la interpenetracion de las cadenas polimericas, que se establecen al enfriar. Alternativamente, se pueden usar adhesivos, tales como adhesivos de latex.

Las matrices capilares de realizaciones de la invencion son de varias formas que incluyen pero no estan limitadas a, laminas, columnas, membranas y fibras comprimidas. Los materiales apropiados incluyen, pero no estan limitados a, materiales porosos y materiales fibrosos, incluyendo tejidos, materiales fibrosos orientados de forma racional y orientados al azar. Los materiales apropiados incluyen materiales polimericos tales como pollmeros porosos que incluyen polietileno, polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE), etileno acetato de vinilo (EVA), polieter sulfona (PS), uretano termoplastico (TPU), poliamida (por ejemplo, Nylon 6) y sus copollmeros porosos tales como pollmeros porosos fabricados por Porex Corporation, Fairburn GA, USA. Los materiales apropiados incluyen materiales fibrosos tales como celulosa, materiales celulosicos, derivados de celulosa, fibras de vidrio, papel, papel de filtro, papel cromatografico, pollmeros de origen natural modificados o sinteticos, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa y algodon.

En realizaciones, una matriz de flujo capilar absorbente de la presente invencion es una estructura uniforme, tal como una tira de papel o una combinacion de varios materiales que comprende una estructura de un solo camino. En realizaciones, una matriz de flujo capilar de la presente invencion esta unida a un material de soporte substancialmente impermeable, por ejemplo, como se conoce en el campo de la cromatografla en capa fina donde la materia fibrosa porosa esta unida a un soporte impermeable solido. Por ejemplo, generalmente un soporte es de las mismas dimensiones que la matriz de flujo capilar: cuando es menor o mayor entonces la interfase entre la matriz y el soporte puede producir un camino capilar paralelo al camino capilar definido por la matriz de flujo capilar. Los materiales apropiados de los que formar un soporte incluyen, pero no estan limitados a, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nylon, poli(butirato de vinilo), vidrio, ceramica, metales, poliuretano , neopreno, latex y caucho de silicona.

Un material excepcionalmente apropiado para preparar una matriz de flujo capilar de la presente invencion es fibra de vidrio especialmente fibra de vidrio soportada por plastico, incluyendo derivado de fibra de vidrio tal como matrices de fibra de vidrio/celulosa/poliester. Las membranas de fibra de vidrio son relativamente gruesas, (tlpicamente hasta de 2 mm), tienen tamanos de poro de 1 a 40 micrometros y un caudal de agua relativamente alto (cuando se compara con la matriz de nitrocelulosa tlpica) que permite que un gran flujo de muestra y reactivo fluya a su traves. Una ventaja adicional de la fibra de vidrio, como se senalo anteriormente, es que la fibra de vidrio es relativamente gruesa, blanda y compresible de modo que cuando se aplica presion segun las ensenanzas de la presente invencion, la compresion es local en el punto de presion.

Un material excepcionalmente apropiado para preparar una matriz de flujo capilar de la presente invencion es nitrocelulosa, especialmente de nitrocelulosa reforzada con plastico, especialmente que tiene un tamano de poro de entre 0,45 y 15 micrometros. Un material excepcionalmente apropiado para preparar una matriz de flujo capilar de la presente invencion es polietileno poroso, que tiene especialmente un tamano de poro de entre 0,2 y 20 micrometros, preferentemente entre 1 y 12 micrometros, disponible en Porex Corporation, Fairburn GA, EE.UU.

El tamano flsico real de una matriz de flujo capilar de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion

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esta determinado por muchos factores, especialmente el material del que esta hecha la matriz y el uso o usos especlficos para los que se destina el dispositivo capilar de flujo lateral. Dicho esto, en algunas realizaciones un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invention es un dispositivo capilar de flujo lateral que funciona manualmente. En realizaciones de la presente invencion, se prefiere generalmente que la longitud de una matriz de flujo capilar sea conveniente para uso manual y el almacenamiento de un dispositivo capilar de flujo lateral, es decir, generalmente, pero no necesariamente por lo menos de alrededor de 1 cm, y generalmente no mayor de alrededor de 30 cm, no mayor de alrededor de 15 cm e incluso no mayor de alrededor de 10 cm.

En realizaciones de la presente invencion, se prefiere generalmente que la anchura de una matriz de flujo capilar sea suficientemente estrecha para permitir la concentration de un material que produce una senal en un area pequena para aumentar el contraste de una senal producida y reducir la capacidad de llquido de la matriz de flujo capilar, pero tambien suficientemente ancha para permitir la simple observation de la senal por un usuario, es decir generalmente, pero no necesariamente entre alrededor de 1 mm y 20 mm.

En realizaciones de la presente invencion, se prefiere generalmente que la matriz de flujo capilar sea relativamente gruesa para permitir una alta capacidad y caudal de llquido y tambien asegurar que la presion aplicada por los bordes comprima la matriz solo localmente. Preferentemente, la matriz de flujo capilar es de hasta alrededor de 2 mm de espesor, hasta alrededor de 1 mm de espesor, y preferentemente entre alrededor de 0,05 y alrededor de 0,5 mm de espesor.

En realizaciones de la presente invencion una matriz de flujo capilar esta en comunicacion capilar con un drenaje de llquido. Un drenaje de llquido es generalmente un componente hecho de un material absorbente y que tiene una capacidad de absorcion de llquido que es significativamente mayor que la de una respectiva matriz de flujo capilar. En realizaciones de la presente invencion, un drenaje de llquido esta formado integralmente con una respectiva matriz de flujo capilar. En realizaciones de la presente invencion, un drenaje de llquido constituye por lo menos un componente distinto de una respectiva matriz de flujo capilar. En realizaciones de la presente invencion, un drenaje de llquido es de una forma o de un material que permite una mayor velocidad de movimiento capilar que a traves de una respectiva matriz de flujo capilar. Los materiales apropiados de los que se fabrica un drenaje se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 4.632.901, tales como, por ejemplo, materiales fibrosos tales como fibras de acetato de celulosa, celulosa o derivados de celulosa, poliester o poliolefinas.

En realizaciones de la presente invencion, los depositos son de cualquier forma o tamano apropiados. Como una union entre dos caras puede definir un canal capilar, en realizaciones, la superficie interior de un deposito en contacto o proximidad inmediata con una zona de reception de llquido es continua, por ejemplo, circular, oval o si no curva. El volumen de un deposito dado esta determinado por muchos factores y la implementation exacta de un respectivo dispositivo capilar de flujo lateral. Dicho esto, un deposito tlpico de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion generalmente tiene una capacidad de por lo menos alrededor de 5 microlitros, por lo menos alrededor de 20 microlitros o incluso por lo menos alrededor de 50 microlitros y generalmente no mayor de alrededor de 5.000 microlitros, no mayor de alrededor de 1.000 microlitros e incluso no mayor de alrededor de 300 microlitros.

Dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion

Una realization de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion, 24 se representa en la Figura 2. El dispositivo capilar de flujo lateral 24 incluye una matriz 18 flujo capilar absorbente de un solo camino que tiene un extremo 26 aguas arriba y un extremo 28 aguas abajo que definen una direction 30 de flujo. La matriz 18 de flujo capilar del dispositivo 24 capilar de flujo lateral es sustancialmente membrana porosa de nitrocelulosa reforzada desprovista de una capa de refuerzo.

Tres depositos, un deposito 32a aguas abajo, un deposito 32b medio y un deposito 32c aguas arriba que constituyen recipientes abiertos por arriba, estan en comunicacion de fluido no capilar (para conservar el unico camino del dispositivo 24 capilar de flujo lateral) con la matriz 18 de flujo capilar cada uno a traves de una respectiva zona 34a, 34b y 34c de recepcion de llquido. La distancia entre los bordes de las zonas de recepcion de llquido 34a, 34b y 34c es por lo menos 50% de la dimension de tal zona de recepcion de llquido en la direccion 30 de flujo, aunque en realizaciones es sustancialmente mayor. La matriz capilar entre cualquiera de las dos zonas de recepcion se define como una zona de creation de interfase. La zona 35a de creation de interfase se encuentra entre las zonas 34a y 34b de recepcion de llquido. La zona 35b de creacion de interfase se encuentra entre las zonas 34b y 34c de recepcion de llquido.

Cada deposito 32a, 32b o 32c esta en contacto con una respectiva zona 34a, 34b y 34c de recepcion de llquido a traves de una abertura en la parte inferior del deposito que constituye un conducto hueco que tiene un borde 36a, 36b y 36c. Frente a cada borde 36a, 36b y 36c estan dispuestos componentes 38a, 38b y 38c de soporte, respectivamente. Los bordes 36a, 36b y 36c presionan en la matriz 18 de flujo capilar, incluso cuando la matriz de flujo capilar esta seca, mientras que los componentes 38a, 38b y 38c de soporte soportan la matriz 18 de flujo capilar contra el prensado de modo que la matriz 18 de flujo capilar esta sustancialmente suspendida entre los bordes 36a, 36b y 36c y lo componentes 38a, 38b y 38c de soporte. Los bordes 36a, 36b y 36c y las superficies superiores de los componentes 38a, 38b y 38c de soporte son sustancialmente paralelos a la direccion 30 de flujo, lo que garantiza que la presion aplicada por un borde 36a, 36b o 36c es sustancialmente uniforme alrededor de toda la

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superficie de ese borde.

Como la matriz 18 de flujo capilar es sustancialmente compresible, el area de la superficie interna por unidad de volumen de la matriz 18 en la proximidad de un borde 36a, 36b o 36c es mayor que distante de un borde 36a, 36b o 36c. El supuesto significado de esta diferencia se discute aqul a continuacion. El material de la matriz en las zonas 35a y 35b de creacion de interfase no esta restringido para la expansion inducida por el llquido.

La matriz 18 de flujo capilar esta provista de una zona 20 de reaccion que incluye por lo menos una entidad de captura configurada para capturar un material tal como un analito o un producto de una reaccion que implica al analito que fluye a traves de la matriz 18 de flujo capilar aguas abajo de las zonas 34a, 34b y 34c de recepcion de llquido.

En la proximidad del extremo 28 aguas abajo, la matriz 18 de flujo capilar esta en comunicacion de fluido con el drenaje 23 de llquido.

La matriz 18 de flujo capilar y el drenaje 23 de llquido estan contenidos sustancialmente dentro de un alojamiento 40 tal que todos los lados de la matriz 18 de flujo capilar estan sustancialmente desprovistos de contacto con el alojamiento 40. A traves del alojamiento 40 por encima de la zona 20 de reaccion esta una ventana 22 de observacion que en realizaciones es simplemente una abertura a traves del alojamiento 40.

Para su uso, segun el metodo de la presente invencion, una primera cantidad de un primer llquido, por ejemplo, muestra que contiene analito se coloca en el deposito 32a aguas abajo, fluye a la matriz 18 de flujo capilar a traves de la zona 34a de recepcion de llquido y se extiende tanto aguas arriba como aguas abajo de la zona 34a de recepcion de llquido. Una segunda cantidad de un segundo llquido, por ejemplo, reactivo marcado, se coloca en el deposito 32b medio, fluye a la matriz 18 de flujo capilar a traves de la zona 34b de recepcion de llquido y se extiende tanto aguas arriba como aguas abajo de la zona 34b de recepcion de llquido. Una tercera cantidad de un tercer llquido, por ejemplo, componente de produccion de la senal, se coloca en el deposito 32c aguas arriba, fluye a la matriz 18 de flujo capilar a traves de la zona 34c de recepcion de llquido y se extiende tanto aguas arriba como aguas abajo de la zona 34c de recepcion de llquido.

El tercer llquido fluye aguas arriba hasta que toda la matriz 18 capilar aguas arriba de la zona 34c de recepcion de llquido se satura con el tercer llquido. En tercer llquido fluye aguas abajo de la zona 34c de recepcion de llquido hasta encontrarse con el segundo llquido que fluye aguas arriba desde la zona 34b de recepcion de llquido formando una interfase 42b estatica (vease la Figura 3) en algun lugar de la zona 35b de creacion de interfase en la que a su traves no hay sustancialmente mezcla de llquidos. Una vez que se forma la interfase 42b, y suponiendo que la cantidad de segundo y tercer llquido anadida es suficiente para no ser absorbida totalmente en la matriz 18 de flujo capilar, se forma una columna vertical de tercer llquido en el deposito 32c aguas arriba ya que se impide que el tercer llquido fluya aguas abajo por la presion aplicada por segundo llquido en el deposito 32b medio.

El segundo llquido fluye aguas abajo de la zona 34b de recepcion de llquido hasta encontrarse con el primer llquido que fluye aguas arriba desde la zona 34a de recepcion de llquido formando una interfase 42a estatica en algun lugar de la zona 35a de creacion de interfase en la que a su traves no hay sustancialmente mezcla de llquidos. Una vez que se forma la interfase 42a, y suponiendo que la cantidad del primer y segundo llquido anadida es suficiente para no ser absorbida por completo en la matriz 18 de flujo capilar, se forma una columna vertical de segundo llquido en el deposito 32b medio, se previene que el segundo llquido fluya aguas abajo por la presion aplicada por el primer llquido en el deposito 32a aguas abajo.

El primer llquido del deposito 32a aguas abajo se drena hacia abajo a traves de la zona 34a de recepcion de llquido y fluye aguas abajo en la direccion 30 de flujo pasada la zona 20 de reaccion en la que se inmoviliza el miembro de sbp (receptor). El analito si esta presente en la muestra es capturado por el miembro de sbp mientras que el llquido se absorbe en el drenaje 23 de llquido.

Cuando todo el primer llquido se drena del deposito 32a aguas abajo, la interfase primer llquido/segundo llquido comienza a moverse aguas abajo en la direccion 30 del flujo a medida que el segundo llquido desde el deposito 32b medio se drena a traves de la zona 34b de recepcion de llquido y fluye aguas abajo en la direccion 30 del flujo. Durante este tiempo, la interfase segundo liquido/tercer llquido permanece estatica. El reactivo marcado presente en el segundo llquido se une a complejo formado en la zona 20 de reaccion, si esta presente.

Cuando todo el segundo llquido se drena del deposito 32b medio, la interfase segundo liquido/tercer llquido comienza a moverse aguas abajo en la direccion 30 del flujo a medida que el tercer llquido del deposito 32c aguas arriba se drena hacia abajo a traves de la zona 34c de recepcion de llquido y fluye aguas abajo en la direccion 30 del flujo. El componente de produccion de la senal presente en el tercer llquido reacciona con el reactivo marcado unido al complejo, para generar una senal observable

Como se discutio en la introduccion, previamente se han realizado esfuerzos para implementar metodos que se asemejan al metodo de la presente invencion pero han fracasado. En los intentos de la tecnica anterior, se forma una interfase entre dos llquidos pero no se producen columnas verticales de llquido en un deposito. Mas bien, los liquidos invariablemente se fugan por varios sitios en la matriz de flujo capilar, generalmente por cualquier lugar por

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el que la matriz de flujo capilar hace contacto con un objeto flsico formando de este modo un camino capilar alternative. Por ejemplo, en un dispositivo capilar de flujo lateral multideposito tal como se describe en la Patente de EE.UU. No. 4.981.786 se producen fugas a lo largo de los componentes de soporte sobre los que descansa la matriz de flujo capilar, a lo largo de componentes de soporte lateralmente dispuestos que mantienen el flujo capilar en su lugar y hasta los puntos de contacto de los depositos con la matriz de flujo capilar, produciendo un flujo de llquido en la superficie superior de la matriz de flujo capilar.

De este modo, en contraste con los metodos y dispositivos capilares de flujo lateral conocidos en la tecnica, las ensenanzas de la presente invencion permiten la realizacion de reacciones multietapa usando un dispositivo capilar de flujo lateral en el que cada etapa se realiza con una cantidad relativamente precisa de reactivo durante una duracion relativamente precisa. Dado que se evitan las fugas y dado que la duracion de una etapa de reaccion se determina con precision por el volumen de los diferentes llquidos anadidos, se pueden realizar muchos experimentos mutietapa diferentes para dar resultados repetibles. Ademas, ya que el volumen de llquido es el determinante principal de la duracion de una etapa dada, la duracion de una etapa dada se modifica facilmente si se requiere, permitiendo la realizacion de experimentos cineticos.

Aunque, no deseando estar vinculados a ninguna teorla, se cree que la razon del fracaso de los intentos previos y del exito del inventor en la implementacion con exito del concepto de columnas de llquido en comunicacion de fluido con una matriz capilar de flujo para su uso para realizar reacciones multietapa esta relacionada con las fuerzas que actuan sobre un llquido dentro de una matriz de flujo capilar y la eliminacion de potenciales caminos capilares alternativos.

El potencial Y de agua del llquido es la energla potencial del agua en un volumen (masa) dado y determina la direccion de flujo desde un volumen de un mas alto potencial de agua hasta un volumen con un mas bajo potencial de agua. El potencial Y de agua total de un volumen de agua es la suma de cuatro componentes del potencial: gravitacional (Yg), de la matriz (Ym), osmotico (Ys), y de presion (Yp). El potencial gravitacional depende de la posicion del agua en un campo gravitacional. El potencial de matriz depende de las fuerzas de absorcion que unen el agua a la matriz. El potencial osmotico depende de la concentracion de substancia disuelta en el agua (por ejemplo, una disolucion que tiene una alta concentracion de sal tiene un valor negativo). El potencial de presion depende de la presion hidrostatica o neumatica sobre el agua. El potencial de la matriz esta afectado por las propiedades tanto de la matriz como del llquido. El potencial de la matriz esta afectado por la atraccion del llquido hacia la matriz (hidrofilia) y por el area de la superficie de las cavidades en la matriz.

En un dispositivo capilar de flujo lateral de un solo deposito, la fuerza que actua sobre un llquido dentro de la matriz de flujo capilar incluye la fuerza aplicada por una sola columna de llquido en un deposito que contribuye a Yp. La atraccion de las moleculas de llquido con las superficies internas de la matriz de flujo capilar (Ym) es suficiente para prevenir la fuga de llquido a lo largo de los caminos capilares alternos formados, por ejemplo, en los que algun objeto flsico entra en contacto con la matriz de flujo capilar.

En un dispositivo capilar de flujo lateral multideposito descrito aqul, la fuerza que actua sobre un llquido dentro de la matriz de flujo capilar incluye la fuerza aplicada por dos columnas verticales de llquido en dos depositos que contribuyen ambas a Yp. En tales casos, Ym que es una medida de la atraccion entre las moleculas de llquido y las superficies internas de la matriz de flujo capilar es insuficiente para prevenir la fuga de llquido a lo largo de caminos de flujo capilar alternativos.

En realizaciones de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion, se eliminan los puntos de contacto excepto en los bordes de los depositos y, si estan presentes, en los componentes de soporte dispuestos enfrente, que se presionan sobre la matriz de flujo capilar. La presion de estos componentes localmente comprime la matriz y los poros en ella, reduciendo el volumen de la matriz proxima a estos componentes pero sin cambiar el area total de la superficie interna. Tal presion incrementa la energla de interaccion de la matriz de flujo capilar/liquido por unidad de volumen en la vecindad de los componentes y por lo tanto incrementa Ym. Esta energla incrementada es aparentemente suficiente para compensar la incrementada fuerza aplicada por las dos columnas de llquido. En resumen, la presion de la matriz incrementa la energla de union en la vecindad de los puntos de contacto con los bordes o componentes de soporte, reduciendo la tendencia a la fuga a traves del camino de flujo capilar alternativo formado en el punto de contacto.

En realizaciones de la presente invencion, una zona de creacion de interfase dada es relativamente ancha con relacion a zonas de recepcion de llquido que la flanquean. Una ventaja de tales realizaciones es que el tamano de la zona de creacion de la interfase significa que el llquido anadido a una de las zonas de recepcion de llquido requiere un periodo de tiempo significativo para viajar a traves de la zona de creacion de la interfase antes de llegar a la zona de recepcion de llquido vecina. Esto permite que la adicion de llquidos a diferentes depositos sea secuencial y se realice en condiciones mas diflciles (por ejemplo, no en el laboratorio), e incluso por operarios menos expertos. Una ventaja adicional de una zona de creacion de la interfase relativamente ancha es compensar las diferentes velocidades de absorcion de diferentes llquidos anadidos. Por ejemplo, la velocidad de entrada de un llquido viscoso o hidrofobo es relativamente lenta. Una zona de creacion de interfase relativamente ancha previene que los llquidos que entran en la matriz mas rapido viajen a una zona de recepcion de llquido en la que se anade un llquido viscoso o hidrofobo, permitiendo que el llquido viscoso o hidrofobo entre en la matriz y cree una clara interfase llquido-llquido

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bien definida.

Ademas, se ha encontrado que las zonas de creacion de interfase relativamente largas conducen a la formacion de interfaces mas claramente definidas que son sustancialmente perpendiculares a la direccion de flujo.

Muchos materiales usados como matrices de flujo capilar se expanden al contacto con agua. En los dispositivos capilares de flujo lateral en los que la expansion inducida por llquido en la zona de creacion de interfase esta restringida, por ejemplo, cuando se les aplica presion desde arriba, la expansion puede ser inhomogenea y se pueden formar grietas en la matriz, modificando localmente las propiedades capilares de la matriz. Si se forma la interfase en un volumen en el que cambian las propiedades capilares, la interfase formada entre llquidos puede ser indefinida y no clara, conduciendo a la mezcla de los dos llquidos en la interfase y a sus efectos negativos concomitantes. En realizaciones de la presente invencion, la expansion inducida de llquido de la zona de creacion de la interfase no esta restringida.

En realizaciones de la presente invencion, el primer llquido y el segundo llquido se anaden sustancial y simultaneamente a un deposito respectivo.

En realizaciones de la presente invencion, el primer llquido y segundo llquido se anaden secuencialmente. Cuando los llquidos se anaden secuencialmente, el orden en el que se anaden los llquidos es poco significativo, con tal de que un llquido subsecuente se anada a un deposito respectivo antes de un llquido previo migre a la zona de recepcion de llquido del deposito del llquido subsecuentemente anadido.

Como se advirtio anteriormente, el metodo de la presente invencion como se describe anteriormente no se refiere al transporte de llquidos a traves de una matriz de flujo capilar, sino que permite la realizacion de reacciones multietapa especialmente ensayos de union especlfica multietapa, en los que cada uno de los dos llquidos inicia y realiza una etapa diferente de una reaccion multietapa, por ejemplo, el transporte de un reactivo. Como es evidente para un experto en la tecnica tras la lectura cuidadosa de la presente descripcion, el volumen de cualquier llquido dado determina en gran medida la duracion de una etapa respectiva.

Dependiendo del proposito para el que se disena el dispositivo 24 capilar de flujo lateral, la zona 20 de reaccion comprende por lo menos una entidad de captura (por ejemplo, un miembro de un par de union especlfica) configurada para capturar un material (por ejemplo, un analito o un producto de reaccion que implica al analito) que fluye a traves de la matriz capilar. En realizaciones de la presente invencion, la zona de reaccion esta en una zona de recepcion de llquido de un deposito respectivo.

En realizaciones de la presente invencion, se proporciona un dispositivo capilar de flujo lateral con uno o mas reactivos pre-cargados sobre la matriz de flujo capilar. Tal precarga de reactivos es conocida en la tecnica de dispositivos capilares de flujo lateral, por ejemplo, secando reactivos sobre la matriz, por ejemplo, liofilizando, secando por pulverizacion, dispensando y secando al aire.

Resumiendo, se carga un reactivo sobre la matriz de flujo capilar de tal modo que un llquido anadido por medio de un deposito especlfico interaccionara con el reactivo. En realizaciones, por lo menos un reactivo precargado esta configurado para reaccionar con un analito anadido para producir un producto de reaccion que se transporta subsecuentemente aguas abajo a lo largo de la matriz de flujo capilar. En realizaciones, por lo menos un reactivo precargado esta configurado para ser disuelto por un llquido anadido y para ser transportado subsecuentemente aguas abajo a lo largo de la matriz de flujo capilar. En realizaciones, un reactivo precargado esta localizado sustancialmente en una zona de recepcion de llquido, especlficamente en una zona de creacion de interfase adyacente.

Las realizaciones de la presente invencion permiten precargar material tanto aguas arriba como aguas abajo de una zona dada de recepcion de llquido, permitiendo precargar material en una region relativamente grande de matriz usando metodos simples, por ejemplo, por secado por pulverizacion. Generalmente, el material precargado aguas abajo de la zona de recepcion de llquido mas aguas abajo esta cargado a cualquier distancia de la zona de recepcion de llquido, generalmente (pero no necesariamente) entre la zona de recepcion de llquido y una zona de reaccion. El material precargado en la vecindad de una zona de recepcion de llquido mas aguas abajo se carga generalmente aguas abajo de la zona de recepcion de llquido de modo que todo el material se usara cuando se introduce llquido en la zona de recepcion de llquido mas aguas arriba. Otro material precargado se carga generalmente en la zona de recepcion de llquido o un poco aguas arriba o un poco aguas abajo de la zona de recepcion de llquido, por ejemplo, hasta alrededor de 30% de la longitud de la zona de creacion de interfase adyacente.

En realizaciones de la presente invencion, enfrente de los bordes de los conductos de llquido de los depositos la matriz se une a un material de refuerzo sustancialmente impermeable para evitar la fuga de llquidos de la matriz de flujo capilar.

En la Figura 4 se representa una realizacion de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion, 46.

En el dispositivo 46 capilar de flujo lateral, la matriz 18 de flujo capilar esta unida un refuerzo 48 sustancialmente

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impermeable. Conjuntamente, la matriz 18 de flujo capilar y el refuerzo 48 sustancialmente impermeable constituyen una tira que descansa sobre la meseta 50, en el que el refuerzo 48 esta en contacto con la meseta 50. El dispositivo 46 capilar de flujo lateral esta provisto de cuatro depositos 32a, 32b, 32c y 32d con los respectivos bordes 36a, 36b, 36c y 36d que presionan la superficie superior de la matriz 18 de flujo capilar. La meseta 50 esta dispuesta enfrente de cada borde 36 de cada deposito 32 y de este modo constituye un componente de soporte que soporta la matriz 18 contra la presion de los bordes 36.

El dispositivo 46 capilar de flujo lateral esta configurado para la realizacion simple de reacciones de cuatro etapas.

Un primer reactivo 52 se precarga en la zona 34a de recepcion de llquido, siendo el primer reactivo 52 un nutriente configurado para provocar que celulas vivas que estan en contacto con el primer reactivo 52 expresen ciertas protelnas sobre las membranas exteriores.

Un segundo reactivo 54 se precarga en un area de matriz 18 capilar entre las zonas 34b y 34c de recepcion de llquido, siendo el segundo reactivo 54 una toxina.

Un tercer reactivo 56 se precarga en una zona 34d de recepcion de llquido, siendo el tercer reactivo 56 un indicador que se une a cierta protelna.

La zona 20 de reaccion incluye una entidad de captura configurada para inmovilizar celulas.

El uso del dispositivo 46 capilar de flujo lateral es sustancialmente similar al uso del dispositivo 24 capilar de flujo lateral que se describe anteriormente y es evidente para un experto en la tecnica tras la lectura cuidadosa de la presente descripcion.

Una primera muestra llquida, que incluye celulas vivas se coloca en el deposito 32a, se coloca un segundo llquido en el deposito 32b, se coloca un tercer llquido en el deposito 32c y se coloca un cuarto llquido en el deposito 34d, secuencial o simultaneamente. Se forman tres interfaces llquidas en las zonas 35a, 35b, 35c de creacion de interfase, las columnas verticales de la interfase 42a, 42b, 42c de llquido se producen en los depositos 32b, 32c y 32d. Cuando la primera muestra llquida que contiene celulas entra en contacto con el primer reactivo en la zona 34a de recepcion de llquido, las celulas comienzan a producir el metabolito especlfico. Cuando la muestra llquida llega a la zona 20 de reaccion las celulas estan inmovilizadas.

Cuando la primera muestra llquida en el deposito 32a se agota, el segundo llquido en el deposito 32b comienza a fluir a traves de la matriz 18 de flujo capilar, transportando los desechos y otro material no ligado desde la zona 20 de reaccion hacia el drenaje 23 de llquido.

Cuando el segundo llquido en el deposito 32b se agota, el tercer llquido en el deposito 32d comienza a fluir a traves de la matriz 18 de flujo capilar, llevando el segundo reactivo 54. El segundo reactivo se transporta a la zona 20 de reaccion, matando las celulas inmovilizadas.

Cuando el tercer llquido en el deposito 32b se agota, el cuarto llquido en el deposito 32d comienza a fluir a traves de la matriz 18 de flujo capilar, llevando el tercer reactivo 56. El tercer reactivo 56 se transporta a la zona 20 de reaccion, produciendo una senal visible sobre las celulas que expresaron ciertas protelnas sobre las membranas externas.

Usando una pluralidad de dispositivos 46 capilares de flujo lateral, se realizan experimentos sustancialmente identicos en los que solo se varla la cantidad de segundo llquido anadido al deposito 32b, variando de este modo el tiempo entre la exposicion de las celulas al primer reactivo 52 y la muerte de las celulas con exposicion al segundo reactivo 54. De tal modo, se estudia la cinetica de la expresion de protelnas.

En realizaciones de la invention se usa para aplicaciones distintas de aplicaciones de diagnostico que incluyen la extraction o slntesis de biomoleculas, por ejemplo, la concentration de acidos nucleicos en una muestra. Se unen partlculas de absorcion de acido nucleico a una zona de reaccion de una matriz de flujo capilar y se anade una muestra que contiene acidos nucleicos en condiciones de union dando como resultado la concentracion de acido nucleico de la muestra. En realizaciones la etapa de concentracion va seguida de etapas de lavado, elucion y/o analisis.

Metodos de fabrication de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion

En general, la fabricacion y montaje de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion esta completamente dentro de la capacidad de un experto en la tecnica tras la lectura cuidadosa de la presente description y figuras usando cualquier metodo apropiado con el que un experto en la tecnica esta bien familiarizado. Los metodos apropiados incluyen metodos que emplean una o mas tecnicas que incluyen pero no estan limitadas a, soldadura, colado, repujado, erosion qulmica, fabricacion de forma libre, moldeo por inyeccion, microerosion qulmica, micromaquinado, microenchapado, moldeo, revestimiento por giro, litografla o fotolitografla.

En un aspecto de la presente invencion, se proporciona un dispositivo y un kit que permiten la preparation simple y barata de un dispositivo capilar de flujo lateral a medida segun las ensenanzas de la presente invencion.

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Un dispositivo 60 de la presente invention util para la preparation del dispositivo capilar de flujo lateral se representa en la Figura 5A. El dispositivo 60 comprende un primer componente 62 y un segundo componente 64, conectados por medio de extensiones 66 y 68 que sobresalen por medio de una bisagra 70.

El primer componente 62 incluye un deposito 32 que tiene una pared configurada para mantener llquidos. El area mas baja del deposito 32 es una abertura 63 no capilar que define un conducto hueco con un borde 36. En realizaciones el borde 36 es relativamente amplio, por lo menos alrededor de 0,5 mm o incluso por lo menos alrededor de 1 mm. En realizaciones el borde 36 es substancialmente plano. Para ser no capilar, en realizaciones la abertura 63 no capilar es relativamente grande, teniendo en realizaciones un area de section transversal de por lo menos alrededor de 1 mm2, de por lo menos alrededor de 3 mm2 o incluso de por lo menos alrededor de 7 mm2. Enfrente de la extension 66 y sobresaliendo tambien del deposito 32 esta la protuberancia 72.

El segundo componente 64 incluye un cuerpo 74 con una plataforma 76 de contrasoporte en el extremo superior del cuerpo 74. Enfrente de la extension 68 y sobresaliendo tambien del cuerpo 74 esta la protuberancia 78.

Las protuberancias 72 y 78 estan configuradas para acoplarse mutuamente, conectando (por ejemplo, “encajando") para mantener el borde 36 y la plataforma 76 de contrasoporte separadas sustancialmente paralelas a cierta distancia predeterminada.

En el dispositivo 60, el primer componente 62 esta provisto de dos extensiones 66 y 72 para acoplarse con dos extensiones 68 y 78 del segundo componente 64. En realizaciones, se proporciona un primer componente y/o un segundo componente con solo una extension, o con mas de dos de tales extensiones cada uno.

En el dispositivo 60, las extensiones 66 y 68 se forman como una pieza para definir la bisagra 70. En realizaciones de la presente invencion, las extensiones estan configuradas para acoplarse reversiblemente o irreversiblemente, definiendo una bisagra cuando estan acopladas. En realizaciones de la presente invencion las extensiones estan configuradas para estar acopladas reversiblemente o irreversiblemente, no definiendo una bisagra cuando estan acopladas.

El uso de un dispositivo de la presente invencion tal como el dispositivo 60 en el marco de un kit de la presente invencion, se representa desde la parte superior en la Figura 5B y desde un lado en la Figura 5C. En las Figuras 5B y 5C, se representa un kit de la presente invencion que comprende dos dispositivos 60 y una tira de fibra de vidrio reforzada con plastico como matriz 18 de flujo capilar absorbente en un estado montado, constituyendo conjuntamente una realization del dispositivo de la presente invencion.

Para el montaje, una matriz 18 de flujo capilar de un grosor apropiado se corta al tamano apropiado y dos dispositivos 60 se cierran alrededor de un area apropiada de matriz 18 de flujo capilar. El grosor de la matriz 18 de flujo capilar y el diseno de los dispositivos 60 es tal que, cuando las extensiones 72 y 78 estan acopladas mutuamente, la matriz 18 de flujo capilar esta sujeta entre el borde 36 y la plataforma 76 de contrasoporte. En tal estado, las aberturas no capilares 63 definen una zona de reception de llquido. Ademas, el borde 36 presiona en la matriz 18 de flujo capilar, segun las ensenanzas de la presente invencion.

Como es evidente para un experto en la tecnica tras la lectura cuidadosa de la description, un dispositivo capilar de flujo lateral, que incluye un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion se construye y modifica facilmente a medida con el uso de las realizaciones de dispositivos de la presente invencion y realizaciones de kits de la presente invencion. Por ejemplo, la aplicacion de los reactivos deseados para definir una zona de reaction o para precargar un reactivo sobre una matriz capilar es facil de conseguir.

En la tecnica, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 4.981.786, se ensena la introduction de muestra o substrato en un deposito aguas abajo y la adicion de un vehlculo llquido en un deposito aguas arriba para transportar un reactivo localizado sobre una matriz de flujo capilar aguas abajo para entrar en contacto con la muestra o substrato. En un aspecto de la presente invencion se ensena un metodo en el que se usa tambien una muestra como vehlculo llquido.

En el metodo, se usa un dispositivo capilar de flujo lateral sustancialmente como se describe anteriormente que incluye: una primera zona de recepcion de llquido sobre la matriz de flujo capilar en comunicacion de fluido con un primer deposito, una segunda zona de recepcion de llquido sobre la matriz de flujo capilar en comunicacion de fluido con un segundo deposito aguas arriba del primer deposito, un primer reactivo precargado dentro del primer deposito y/o en una localization sobre la matriz de flujo capilar en la proximidad de la primera zona de recepcion de llquido o aguas abajo de ella; un segundo reactivo precargado en una localizacion dentro del segundo deposito y/o sobre la matriz de flujo capilar en la proximidad de la segunda zona de recepcion de llquido.

Una primera cantidad de un llquido (por ejemplo, la muestra) se anade al primer deposito de modo que el llquido fluya dentro de la matriz de flujo capilar a traves de la primera zona de recepcion de llquido para entrar en contacto con el primer reactivo, por ejemplo, para reaccionar con el primer reactivo o para solubilizar el primer reactivo.

Una segunda cantidad de un llquido (el mismo o diferente) se anade al segundo deposito de modo que el llquido fluya dentro de la matriz de flujo capilar a traves de una segunda zona de recepcion de llquido para entrar en

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contacto con el segundo reactivo. La segunda cantidad de llquido se anade antes, despues o sustancialmente simultaneamente con la adicion de la primera cantidad de llquido.

Segun las ensenanzas de la presente invencion, cuando la primera cantidad y la segunda cantidad son tales que queda llquido sustancialmente en el primer y segundo deposito respectivamente, se forma una interfase estatica entre el llquido que esta en contacto con el primer reactivo y el llquido que esta en contacto con el segundo reactivo en la zona de creacion de la interfase entre las dos zonas de recepcion de llquido. Segun las ensenanzas de la presente invencion como se describe anteriormente, la interfase se mueve solo subsecuentemente al agotamiento del llquido del primer deposito. En realizaciones, hay una zona de reaccion aguas abajo de la primera zona de recepcion de llquido sobre la matriz de flujo capilar. En realizaciones hay una zona de reaccion en la primera zona de recepcion de llquido. Como es evidente para un experto, la ventaja de este metodo es que un ensayo se hace muy simple.

Cuando el llquido anadido al primer deposito es el mismo que el anadido al segundo deposito, solo se anade un llquido (por ejemplo, por medio de un solo puerto en comunicacion con varias zonas de recepcion de llquido) como en un dispositivo capilar de flujo lateral de un solo deposito pero realiza una reaccion multietapa con todas sus ventajas. Esto reduce el numero de etapas requeridas para realizar una reaccion multietapa de otro modo compleja.

Experimental

Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, demuestran la invencion de un modo no limitante.

Experimento 1: Preparation de una realization de un dispositivo capilar de flujo lateral de la presente invencion

Se preparo un dispositivo capilar de flujo lateral tal como el dispositivo capilar de flujo lateral 80 representado en las Figuras 6A, 6B y 6C.

Una parte 82 inferior de la carcasa y una parte 84 superior de la carcasa configuradas para encajar para formar una carcasa cerrada que contiene una matriz 18 de flujo capilar y dos drenajes 86 y 88 de llquido se formaron por moldeo por inyeccion de plastico ABS (copollmero de acrilonitrilo-butadieno-estireno). La carcasa 82 inferior era sustancialmente una caja sin tapa que tiene una parte inferior con una portion 50 de meseta y una portion rebajada 90. La carcasa 84 superior era sustancialmente una tapa para la carcasa 82 inferior y estaba provista de tres depositos A, B y C, que incluyen los bordes 36a, 36b, 36c circulares, una ventana 22 de observation, y cuatro protuberancias 92 de drenaje por prensado.

La matriz 18 de flujo capilar, sustancialmente una membrana porosa de 50 mm x 32 mm de fibra de vidrio GF de grado 161 de Ahlstrom Corporation (Helsinki, Finlandia) unida a un refuerzo grueso de plastico revestido de adhesivo de 55 mm x 32 mm x 0,5 mm (poliestireno de alto impacto revestido con un adhesivo LH-50 de Advanced Microdevices Pvt. Ltd. Ambala Cantt, India) de modo que el extremo 26 aguas arriba de la matriz 18 de flujo capilar estaba alineado con un extremo del refuerzo 48 y 5 mm del refuerzo revestido de adhesivo sobresallan del extremo 93 aguas arriba del refuerzo 48.

Una llnea 20a de ensayo y una llnea 20b de control, que constituyen una zona 20 de reaccion se aplicaron en forma de dos llneas paralelas de puntos de materiales a la matriz 18 de flujo capilar usando una pipeta de laboratorio, vease la Figura 6B.

La llnea 20a de ensayo se aplico en forma de una llnea de puntos producidos aplicando 1 microlitro de 0,7 mg/ml de Ab de conejo anticabra (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. 111-005- 046) en tampon de fosfato 0,1 M (pH 6,8) y disolucion de trehalosa al 2% 36 mm desde el extremo aguas arriba de la matriz 18 de flujo capilar.

La llnea 20b de control se aplico en forma una llnea de puntos producidos por la aplicacion de 1 microlitro de Ab de conejo 0,1 mg/ml de fosfatos alcalinos anti ternera de conejo (Biogenesis 0300-1024) y 0,4 mg/ml de IgG de conejo I 5006 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en tampon de fosfato 0,1 M (pH 6,8) y disolucion de trehalosa al 2% 42 mm desde el extremo aguas arriba de la matriz 18 de flujo capilar.

Despues de la aplicacion de los puntos, la matriz 18 de flujo capilar se seco a 37°C durante 15 minutos, se trato con una disolucion de 0,5% de gelatina, 2,5% de Bacto-triptona, 1% de trehalosa en PBS y a continuation se seco a 37°C durante unas 2 horas adicionales.

Se prepararon dos drenajes 86 y 88 de llquido de papel de celulosa pura muy absorbente con un caudal muy alto (190 mm/30 min) Chr. 17 (Whatman). El drenaje 86 de llquido superior era de 32 mm x 36 mm y estaba unido al adhesivo del extremo 93 que sobresale aguas arriba del refuerzo 48 colindante con la matriz 18 de flujo capilar para asegurar la comunicacion de fluido con ella. El drenaje 88 inferior de llquido era de 7,8 mm x 83 mm.

Como se representa en la figura 6C, para el montaje del dispositivo 80 capilar de flujo lateral, el drenaje 88 inferior de llquido se coloco en la cavidad 90 de la carcasa 82 inferior, la matriz 18 de flujo capilar junto con drenaje 86 superior de llquido se colocaron en la meseta 50 del alojamiento 82 inferior con el refuerzo 48 haciendo contacto con

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la meseta 50. La carcasa 84 superior se presiono en su lugar para acoplarse y encajar conjuntamente con la carcasa 82 inferior de modo que los bordes 36 de los depositos de A, B y C presionaran dentro de la matriz 18 de flujo capilar para definir zonas 34a, 34b y 34c de recepcion de llquido y de modo que las protuberancias 92 que presionan el drenaje presionaran el extremo del drenaje 86 de llquido superior para entrar en contacto con el drenaje 88 de llquido inferior.

Experimento 2: Uso de un dispositivo capilar de flujo lateral para estudiar una reaccion enzimatica Se prepararon tres reactivos liofilizados:

Reactivo A

Reactivo 11-deshidro-TxB2-antisuero - 150 pl de anti 11-deshidro-TXB de conejo, 2999-044 (Assay Designs, Inc.) diluidos 1:1500 en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCh 0,1 mM, MgCh 1 mM en tampon de PBS pH 7,4 se colocaron en un vial, se enfriaron a -80°C y se liofilizaron durante 24 horas.

Reactivo B

Enzima marcada conjugado de 11-deshidro-TxB2 - 150 pl de conjugado de 11-deshidro-TxB2-fosfatasa alcalina, 1:80 DCC (Assay Designs, Inc.) diluidos 1:30.000 en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de pBs, pH 7,4 se colocaron en un vial, se enfriaron a -80°C y se liofilizaron durante 24 horas.

Reactivo C

Substrato AP - BCIP/NBT preparado segun las instrucciones del fabricante: preparacion patron - 1 comprimido de BCIP, B0274 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA) disuelto en DMF 1 mM, 1 comprimido de NBT, N55141 (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) disuelto en 1 ml de agua. 300 pl de la disolucion combinada, 33 pl de disolucion patron de BCIP, 333 pl de disolucion patron de NBT, en 10 ml de tampon Tris 0,1 M, pH 9,7, se colocaron en un vial, se enfriaron a -80°C y se liofilizaron durante 24 horas.

Se prepararon tres dispositivos capilares de flujo lateral:

Un primer dispositivo capilar de flujo lateral se preparo sustancialmente como se describe anteriormente con tampon de PBS seco colocado en un deposito A, reactivo B colocado en el deposito B y reactivo C colocado en el deposito C.

Un segundo dispositivo capilar de flujo lateral se preparo sustancialmente como se describe anteriormente con reactivo A colocado en el deposito A, disolucion de PbS seco colocada en el deposito B y reactivo C colocado en el deposito C.

Un tercer dispositivo capilar de flujo lateral se preparo sustancialmente como se describe anteriormente con reactivo A colocado en el deposito A, reactivo B colocado en el deposito B y reactivo C colocado en el deposito C.

A cada uno de los tres dispositivos capilares de flujo lateral se anadio agua doblemente destilada: 150 microlitros en el deposito A, 150 microlitros en el deposito B y 300 microlitros en el deposito C, un deposito despues del otro. Se vio una columna vertical de llquido en cada deposito y, como se describe anteriormente segun las ensenanzas de la presente invention, el llquido se dreno primero del deposito A, a continuation del deposito B y finalmente del deposito C. Cuando todo el llquido se dreno del deposito C, la reaccion enzimatica se detuvo por la adicion al deposito C de una disolucion de parada de 120 pl de acido sulfurico 0,25 M.

Los colores de las llneas de ensayo y llneas de control se midieron usando un lector PART Pro (LRE Technology Partner GmbH) y se representaron en la Figura 7.

Como se ve en la Figura 7, en el primer dispositivo capilar de flujo lateral, no se observo color en la llnea de ensayo y se observo color en la llnea de control; en el segundo dispositivo capilar de flujo lateral no se observo color ni en la llnea de ensayo ni en la llnea de control; y en el tercer dispositivo capilar de flujo lateral, se observo color tanto en la llnea de ensayo como en la llnea de control.

Los resultados indican que los dispositivos capilares de flujo lateral funcionaban como se esperaba.

Experimento 3: detection de TxB2 para comparar un dispositivo capilar de flujo lateral multideposito con un dispositivo capilar de flujo lateral de un solo deposito para realizar una reaccion multietapa

Se prepararon dos dispositivos A y B capilares de flujo lateral sustancialmente como se describe en el Experimento 1 con una matriz de flujo capilar de 50 mm x 32 mm y se prepararon dos reactores C y D de flujo capilar con una matriz de flujo capilar mas corta de 40 mm x 32 mm y se montaron de modo que solo el borde 34a del deposito estuviera en contacto con la matriz 18 de flujo capilar.

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Se prepararon cinco llquidos de reaccion:

1. Una disolucion diluyente de BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCh 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS pH

7,4;

2. Reactivo A de anti 11-deshidro-TXB2 de conejo (Assay Designs, Inc. 999-044) diluido 1:15.000 en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCh 0,1 mM, MgCh 1 mM en tampon de PBS pH 7,4

3. Reactivo B de conjugado de 11-deshidro-TxB2-fosfatasa alcalina (Assay Designs, Inc. 1:80 DCC) diluido 1:30.000 en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS pH 7,4.

4. Reactivo C de BCIP/NBT preparado segun las instrucciones del fabricante: preparacion patron - 1 comprimido de BCIP (Sigma-Aldrich B0274) que se disuelve en 1 ml de DMF, 1 comprimido de NBT (Sigma-Aldrich N55141) que se disuelve en 1 ml de agua, disolucion final: 33 pl de disolucion patron de BCIP, 333 pl de disolucion patron de NBT en 10 ml de tampon Tris 0,1 M, pH 9,7; y

5. Reactivo D, una disolucion de parada de acido sulfurico 0,25 M.

Uso de dispositivos capilares de flujo lateral multideposito

150 pl de reactivo A, 150 pl de reactivo B y 300 pl de reactivo C se anadieron simultaneamente a los depositos A, B y C respectivamente del dispositivo A capilar de flujo lateral.

150 pl de disolucion diluyente, 150 pl de reactivo B y 300 pl de reactivo C se anadieron simultaneamente a los depositos A, B y C respectivamente del dispositivo B capilar de flujo lateral.

Despues del drenaje secuencial completo de las tres disoluciones en el orden A, B y C, se anadieron 150 pl de reactivo D al deposito C.

Los colores de las llneas de ensayo y llneas de control se midieron usando un lector PART Pro (LRE Technology Partner GmbH) y se representaron en la Figura 8A y 8B.

Uso de dispositivos capilares de flujo lateral de un solo deposito

Al deposito A del dispositivo C capilar de flujo lateral se anadieron uno tras otro 150 pl de reactivo A, 150 pl de reactivo B, 300 pl de reactivo C y 120 pl de reactivo D, cada llquido sucesivo solo despues de que el llquido previo se habla drenado completamente del deposito.

Al deposito A del dispositivo D capilar de flujo lateral se anadieron uno tras otro 150 pl de reactivo A, 150 pl de disolucion diluyente, 300 pl de reactivo B y 300 pl de reactivo C y 120 pl de reactivo D, cada llquido sucesivo solo despues de que el llquido previo se habla drenado completamente del deposito.

Los colores de las llneas de ensayo y llneas de control se midieron usando un lector PART Pro (LRE Technology Partner GmbH) y se representaron en la Figura 8C y 8D.

Al comparar las Figuras 8A y 8C y las Figuras 8B y 8D se ve que los resultados obtenidos usando un dispositivo capilar de flujo lateral multideposito cuando se anaden todos los reactivos al comienzo del experimento son sustancialmente los mismos que los resultados obtenidos usando un dispositivo capilar de flujo lateral de un solo deposito cuando se anaden los reactivos durante el experimento.

Se midio el tiempo de duracion del drenaje de cada deposito y se calculo el caudal (minutos para que 100 pl viajaran 1 cm a traves de la matriz de flujo capilar), los resultados se muestran en la Tabla 1.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 1: Caudal [minutos para que 100 pi viajaran 1 cm]

Llquido

Deposito Dispositivo A Dispositivo B Dispositivo C Dispositivo D

A

A

0:00:57 0:00:57

B

B

0:01:10 0:01:16

C

C

0:01:08 0:01:10

D

C 0:01:16 0:01:19

A

A

0:00:55 0:00:54

B

A 0:01:14 0:01:10

C

A 0:01:12 0:01:08

D

A 0:01:16 0:01:10

Experimento 4: curva de calibracion para el ensayo de competicion de 11-deshidro-TxB2

Cinco dispositivos capilares de flujo lateral sustancialmente como se describe anteriormente en el experimento 1

Se prepararon cinco llquidos reactivos:

1. Una disolucion diluyente de BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCl2 0,1 mM, MgCh 1 mM en tampon de PBS pH

7,4;

2. Reactivo A de anti 11-deshidro-TXB2 de conejo (Assay Designs, Inc. 999-044) diluido 1:1.500 en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS pH 7,4

3. Reactivo B de conjugado de 11-deshidro-TxB2-fosfatasa alcalina (Assay Designs, Inc. 1:80 DCC) diluido 1:3.000 en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS pH 7,4.

4. Reactivo C de BCIP/NBT preparado segun las instrucciones del fabricante: preparacion patron - 1 comprimido de BCIP (Sigma-Aldrich B0274) que se disuelve en 1 ml de DMF, 1 comprimido de NBT (Sigma-Aldrich N55141) que se disuelve en 1 ml de agua, disolucion final: 33 pl de disolucion patron de BCIP, 333 pl de disolucion patron de NBT en 10 ml de tampon Tris 0,1 M, pH 9,7; y

5. Reactivo D, una disolucion de parada de acido sulfurico 0,25 M.

Se prepararon cinco disoluciones de muestra que contienen 5, 1, 0,2, 0,04, 0 ng/ml de analito 11-deshidro-TxB2 (800735) de Assay Designs, Inc. disuelto en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,25%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS pH 7,4.

Para el primer dispositivo capilar de flujo lateral se anadieron a los depositos A, B, y C respectivamente 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo A y 135 pl de muestra que contiene 5 ng/ml de analito, 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo B y 135 pl de muestra que contiene 5 ng/ml de analito y 300 pl de reactivo C.

Para el segundo dispositivo capilar de flujo lateral, se anadieron a los depositos A, B y C 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo A y 135 pl de muestra que contiene 1 ng/ml de analito, 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo B y 135 pl de muestra que contiene 1 ng/ml de analito y 300 pl de reactivo C.

Para el tercer dispositivo capilar de flujo lateral se anadieron a los depositos A, B y C 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo A y 135 pl de muestra que contiene 0,2 ng/ml de analito, 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo B y 135 pl de muestra que contiene 0,2 ng/ml de analito y 300 pl de reactivo C.

Para el cuarto dispositivo capilar de flujo lateral se anadieron a los depositos A, B y C 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo A y 135 pl de muestra que contiene 0,04 ng/ml de analito, 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo B y 135 pl de muestra que contiene 0,04 ng/ml de analito y 300 pl de reactivo C.

Par el quinto dispositivo capilar de flujo lateral se anadieron a los depositos A, B y C 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo A y 135 pl de muestra que contiene 0 ng/ml de analito, 150 pl de una mezcla de 15 pl de reactivo B y 135 pl de muestra que contiene 0 ng/ml de analito y 300 pl de reactivo C.

Despues de drenaje completo de los tres depositos en el orden A, B y C segun las ensenanzas de la presente invention, se anadieron 120 pl de reactivo D al deposito C de cada uno de los dispositivos capilares de flujo lateral.

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40

Los colores de las llneas de ensayo y llneas de control se midieron usando un lector PART Pro (LRE Technology Partner GmbH) y se calculo el nivel de analito unido del analito marcado en cada concentracion de analito como la relacion b/b0 entre la reflexion a cada concentracion 5, 1, 0,2, 0,04 ng/ml (b) y la reflexion a 0 ng/ml (b0). Se obtuvo una curva de calibracion representando los resultados, Figura 9.

Experimento 5: Determinacion cuantitativa de 11-deshidro-TxB2 en orina

Se prepararon tres dispositivos capilares de flujo lateral sustancialmente similares al tercer dispositivo capilar de flujo lateral descrito en el Experimento 2 con reactivo A liofilizado en el deposito A, reactivo B liofilizado en el deposito B y reactivo C liofilizado en el deposito C.

A cada uno de los tres dispositivos capilares de flujo lateral se anadieron: 150 pl de muestra de orina al deposito A, 150 pl de la misma muestra de orina al deposito B y 300 pl de agua doblemente destilada al deposito C. Despues del drenaje completo secuencial de los depositos A, B y C segun las ensenanzas de la presente invencion, se anadieron 120 pl de disolucion de parada D al deposito C.

Los colores de las llneas de ensayo y llneas de control se midieron usando un lector PART Pro (LRE Technology Partner GmbH) y se determino la concentracion de analito 11-deshidro-TxB2 en cada muestra de orina con referencia a la curva de calibracion de la Figura 9. Se determino que la primera muestra de orina contenla 5251 pg/ml, la segunda muestra de orina 907 pg/ml y la tercera muestra de orina 540 pg/ml de 11-deshidro-TxB2.

Experimento 6: Flujo de llquido secuencial en un dispositivo capilar de flujo lateral

Se preparo un dispositivo E capilar de flujo lateral sustancialmente como se describe anteriormente en el Experimento 1 con una matriz de flujo capilar de 50 mm x 32 mm. Se preparo un dispositivo F capilar de flujo lateral con una matriz de flujo capilar mas corta de 40 mm x 32 mm y se monto de modo que solo el borde 36a del deposito A estuviera en contacto con la matriz 18 de flujo capilar. Las matrices de flujo capilar de ambos dispositivos E y F capilares de flujo lateral careclan de zonas de reaccion y solo se trataron con una disolucion de gelatina al 0,5%, Bacto-Triptona al 2,5% y trehalosa al 1% en PBS.

Se prepararon varios llquidos de reaccion, disolucion diluyente, reactivo A (amarillo), reactivo B (azul) y reactivo C (rojo) como se describe en el Experimento 3.

Uso de un dispositivo capilar de flujo lateral multideposito

Se anadieron 150 pl de reactivo A, 150 pl de reactivo B y 300 pl de reactivo C, uno tras otro, a los depositos A, B y C respectivamente del dispositivo E capilar de flujo lateral. Se observo un drenaje secuencial de los depositos A, B y C segun las ensenanzas de la presente invencion con una interfase bien definida que se observo que se movla segun las ensenanzas de la presente invencion.

Uso de un dispositivo capilar de flujo lateral de un solo deposito

Al deposito A del dispositivo F capilar de flujo lateral se anadieron uno tras otro 150 pl de reactivo A, 150 pl de reactivo B y 300 pl de reactivo C, cada llquido sucesivo solo despues de que el llquido previo se habla drenado completamente.

El tiempo de drenaje para cada deposito se midio y listo en la Tabla 2.

Tabla 2: Tiempo de drenaje

Llquido

Deposito Dispositivo E Dispositivo F

A

A

0:3:07

B

B

0:10:01

C

C

0:25:20

A

A

0:03:03

B

A 0:08:14

C

A 0:18:13

Experimento 7: Deteccion de anticuerpos de HIV 1 en una muestra de suero sangulneo

Se preparo un dispositivo capilar de flujo lateral sustancialmente como se describe anteriormente en el Experimento 1 con una llnea 20b de control como se describe en el Experimento 1 pero con una llnea de ensayo 20a aplicada en

5

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50

forma de ilnea de puntos producidos aplicando 1 microlitro de 0,7 mg/ml de antlgeno de protelna recombinante de HIV 1, HIV-101 (ProSpec-Tany TechnoGene LTD) en tampon de fosfato 0,1 M (pH 6,8) y disolucion de trehalosa ai 2% 36 mm desde el extremo aguas arriba de la matriz 18 de flujo capilar.

En el deposito A se coloco una disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de 1 mg/ml de peptidos gp41 y gp120 sinteticos biotinilados diluida en BSA al 1%, suero de bovino fetal al 1%, TWEEN-20 al 0,5% en tampon de PBS, pH 7,4.

En el deposito B se coloco una disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de conjugado de Streptavidina-fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 003-050-083) diluido en BSA al 1%, TWEEN-20 al 0,5%, ZnCl2 0,1 mM, MgCh 1 mM en tampon de PBS, pH 7,4.

En el deposito C se coloco una disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de BCIP/NBT preparado segun las instrucciones del fabricante. Preparacion patron - 1 comprimido de BCIP (Sigma-Aldrich B0274) que se disuelve en 1 ml de DMF, 1 comprimido de NBT (Sigma-Aldrich N55141) que se disuelve en 1 ml de agua. Una disolucion final: 33 pl de disolucion patron de BCIP, 333 pl de disolucion patron de NBT en 10 ml de tampon Tris 0,1 M, pH 9,7.

Se anadieron 150 pl de una muestra de suero, 150 pl de una muestra de suero y 300 pl de agua doblemente destilada, uno tras otro, a los depositos A, B y C respectivamente del dispositivo capilar de flujo lateral. Se observo el drenaje secuencial de los depositos A, B y C segun las ensenanzas de la presente invencion. Despues de que el llquido en el deposito C se dreno completamente se anadieron 120 pl de reactivo D (disolucion de parada de acido sulfurico 0,25 M) al deposito C.

La aparicion de dos llneas discontinuas coloreadas, una en la llnea de ensayo y otra en la llnea de control, indicaba la presencia de anticuerpos para HIV 1 en la muestra de suero.

Experimento 8: Deteccion de antlgeno superficial de hepatitis B en una muestra de suero sangulneo usando un dispositivo capilar de flujo lateral de dos depositos.

Un dispositivo capilar de flujo lateral se preparo sustancialmente como se describe anteriormente en el Experimento 1 excepto que la matriz de flujo capilar era de 45 mm x 32 mm y el drenaje de llquido inferior era de 7,8 mm x 73 mm y con una llnea 20b de control como se describe en el Experimento 1, pero con una llnea 20a de ensayo aplicada en forma de una llnea de puntos producidos aplicando 1 microlitro de 0,7 mg/ml de anticuerpo monoclonal de raton anti- HBsAg (Fitzgerald Industries International, Inc. 10-H05) en tampon de fosfato 0,1 M (pH 6,8) y disolucion de trehalosa al 2%. Cuando esta montado en la carcasa, los bordes 34a y 34b de los depositos A y B estaban en contacto con la matriz 18 de flujo capilar pero el borde 36c de deposito C no estaba en contacto con la matriz 18 de flujo capilar.

En el deposito A se coloco una disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de conjugado de anti-HBsAg de conejo y fosfatasa alcalina diluido en BSA al 1%, suero fetal bovino al 1%, Tween-20 al 0,5%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS, pH 7,4.

En deposito B se coloco una disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de BCIP/NBT preparada segun las instrucciones del fabricante. Preparacion patron - 1 comprimido de BCIP (Sigma-Aldrich B0274) que se disuelve en 1 ml de DMF, 1 comprimido de NBT (Sigma-Aldrich N55141) que se disuelve en 1 ml de agua. Una disolucion final: 33 pl de disolucion patron de BCIP, 333 pl de disolucion patron de NBT, en 10 ml de tampon de Tris 0,1 M, pH 9,7.

Se anadieron 300 pl de una muestra de suero y 300 pl de agua destilada dos veces, uno tras otro, a los depositos A y B, respectivamente, del dispositivo capilar de flujo lateral. Se observo drenaje secuencial de los depositos A y B segun las ensenanzas de la presente invencion. Despues de que el llquido en el deposito B se dreno completamente, se anadieron 120 pl de disolucion de parada de acido sulfurico 0.25 M al deposito B.

La aparicion de dos llneas discontinuas coloreadas, una en la llnea de ensayo y otra en la llnea de control, indicaba la presencia de antlgeno superficial de hepatitis B en la muestra de suero.

Experimento 9: Deteccion de senal fluorescente - muestras de gran volumen

Se prepararon cuatro dispositivos capilares de flujo lateral sustancialmente como se describe en el Experimento 1, en los que la zona 20 de reaccion inclula solo una llnea 20a de ensayo pero ninguna llnea de control.

Se preparo un reactivo H de anticuerpo anti-raton-cy5 de conejo (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. 515175-045) diluido en BSA al 1%, suero fetal bovino al 1%, Tween-20 al 0,5%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS, pH 7,4.

Se anadieron 200 pl de reactivo H al deposito C del primer dispositivo capilar de flujo lateral.

Se anadieron 200 pl de reactivo H a los depositos B y C del segundo dispositivo capilar de flujo lateral.

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50

Se anadieron 200 |jl de reactivo H a los depositos A, B y C del tercer dispositivo capilar de flujo lateral.

Se anadieron 200 jl de reactivo H a los depositos A, B y C del cuarto dispositivo capilar de flujo lateral. Despues del drenaje completo del llquido del deposito C, se anadieron 200 jl adicionales de reactivo H al deposito C.

Habla una correlacion lineal entre la intensidad de fluorescencia emitida por una llnea 20b de ensayo dada tal como se mide por el Inmunolector PART (LRE Technology Partner GmbH) y el volumen total de llquido anadido al respectivo dispositivo capilar de flujo lateral, vease el grafico en la Figura 10.

Experimento 10: Deteccion de la secuencia de ADN HPV 16

Se preparo un dispositivo capilar de flujo lateral sustancialmente como se describe en el Experimento 1, en el que la matriz 18 de flujo capilar era nitrocelulosa Prima 40 (Schleicher & Schuell).

Se preparo una zona 20 de reaccion aplicando una llnea de puntos 36 mm desde el extremo aguas arriba de la matriz de flujo capilar, cada punto producido aplicando 1 microlitro de 5 jg/ml de sonda de oligonucleotido (5'GTTTC AGGACCCACAGGAGCGACCC (nt 106-130)) en NaCl 1,5 M y Na-citrato 0,15 M, disolucion de pH 7,0. Despues de secar a 37°C durante 15 minutos, la matriz 18 de flujo capilar se irradio con luz ultravioleta durante 5 minutos para fijar el ADN a la matriz 18 de flujo capilar.

Se sometio ADN celular de celulas CaSki a 30 ciclos de amplificacion por PCR usando un primer cebador (5'AAGGGCGTAACCGAAATCGGT (nt 26-46)) y un segundo cebador biotinilado (5'GTTGTTTGCAGCTCTGTGC (nt 150-168)) especlficos para secuencias HPV 16. La PCR se termino con una etapa de desnaturalizacion y enfriamiento rapido a 4°C.

En el deposito A del dispositivo capilar de flujo lateral se colocaron 50 jl de producto de PCR desnaturalizado biotinilado, se diluyo 1:10 en disolucion enfriada con hielo de NaCl 0,6 M, Ficoll 400 al 0,02%, gelatina al 0,02%, PVP al 1%, tampon de fosfato 20 mM, pH 7,5.

En deposito B del dispositivo capilar de flujo lateral se colocaron 50 jl de conjugado de Estreptavidina y fosfatasa alcalina (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. 003-050-083) se diluyo en BSA al 1%, Tween-20 al 0,5%, ZnCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM en tampon de PBS, pH 7,4.

En el deposito C del dispositivo capilar de flujo lateral se colocaron 150 jl de reactivo C, se preparo BCIP/NBT segun las instrucciones del fabricante: preparacion patron - 1 comprimido de BCIP (Sigma-Aldrich B0274) que se disuelve en 1 ml de DMF, 1 comprimido de NBT (Sigma-Aldrich N55141) que se disuelve en 1 ml de agua. Disolucion final: 33 jl de disolucion patron de BCIP, 333 jl de disolucion patron de NBT, en 10 ml de tampon Tris 0,1 M, pH 9,7.

Se observo el drenaje secuencial de los depositos A, B, y C segun las ensenanzas de la presente invencion. Despues de que el llquido en el deposito C se drenara completamente, una llnea de color purpura en la zona de reaccion indicaba la presencia de las secuencias de ADN VPH 16.

Experimento 11: Deteccion de anticuerpos de HIV-1 usando conjugado liofilizado en una zona de reaccion.

Se preparo un dispositivo capilar de flujo lateral sustancialmente como se describe anteriormente en el Experimento 7 excepto que se colocaron reactivos liofilizados como sigue:

En la zona de reaccion se coloco disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de 1 mg/ml de peptidos gp41 y gp120 sinteticos biotinilados diluidos en BSA al 1%, suero bovino fetal al 1%, Tween-20 al 0,5% en tampon de PBS, pH 7,4.

El deposito A se mantuvo vaclo.

En el deposito B se coloco una disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de conjugado de Estreptavidina y fosfatasa alcalina (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. 003-050-083) diluido en BSA al 1%, Tween-20 al 0,5%, ZnCl2 0,1 mM, MgCh 1 mM en tampon de PBS, pH 7,4.

En el deposito C se coloco una disolucion liofilizada (como se describe anteriormente) de BCIP/NBT preparada segun las instrucciones de preparacion del fabricante. Preparacion patron - 1 comprimido de BCIP (Sigma-Aldrich B0274) que se disuelve en 1 ml de DMF, 1 comprimido de NBT (Sigma-Aldrich N55141) que se disuelve en 1 ml de agua. Una disolucion final: 33 jl de disolucion patron de BCIP, 333 jl de disolucion patron de NBT, en 10 ml de tampon Tris 0,1 M, pH 9,7.

150 jl de una muestra de suero se aplicaron a la matriz18 de flujo capilar a traves de ventana 22 de observacion, se anadieron 150 jl de muestra de suero al deposito B y 300 jl de agua doblemente destilada se anadieron al deposito C. Se observo el drenaje secuencial de los depositos B y C segun las ensenanzas de la presente invencion. Despues de que el llquido en el deposito C se drenara completamente se anadieron 120 jl de disolucion de parada de acido sulfurico 0,25 M al deposito C.

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La aparicion de dos ilneas discontinuas coloreadas, una en la ilnea de ensayo y la otra en la llnea de control, indicaba la presencia de anticuerpos para VIH 1 en la muestra de suero.

En la seccion experimental anterior las ensenanzas de la presente invencion se ejemplificaron para el estudio de reacciones enzimaticas y para la deteccion de analitos especlficos en una muestra. Como es evidente para un experto en la tecnica tras la lectura cuidadosa de la presente descripcion, las ensenanzas de la presente invencion son aplicables a muchos campos diferentes en los que se requiere la realization de reacciones multietapa, que incluyen pero no estan limitados a, qulmica medioambiental, biologla celular y bioqulmica.

Los metodos y procedimientos se han descrito aqul en forma de una serie de etapas en un orden seleccionado por ser lo mas facil de entender. Se debe hacer hincapie en que tal orden no es limitante, y se puede implementar cualquier metodo o procedimiento descrito aqul en el que las etapas se realizan en cualquier orden razonable para lograr el resultado deseado.

Aunque la invencion se ha descrito junto con sus realizaciones especlficas, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Por consiguiente, la presente invencion se pretende que abarque todas estas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, se han descrito ensenanzas de la presente invencion en las que tiene lugar una reaction a temperatura ambiente. En realizaciones de la presente invencion, un dispositivo capilar de flujo lateral se mantiene en un medio mas caliente o mas frlo, por ejemplo, un congelador, un refrigerador, o una incubadora de modo que una reaccion se realiza a una temperatura que es mas caliente o mas frla que la temperatura ambiente o para asegurar que se mantiene una temperatura especlfica deseada. Las realizaciones en las que se mantiene un dispositivo capilar de flujo lateral a una temperatura controlada incluyen durante toda una reaccion o durante solo parte de una reaccion.

Se aprecia que ciertas caracterlsticas de la invencion, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, tambien se pueden proporcionar en combination en una sola realizacion. A la inversa, varias caracterlsticas de la invencion, que se describen, por brevedad, en el contexto de una unica realizacion, tambien se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinacion apropiada.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un dispositivo (24, 46) capilar de flujo lateral que comprende:

   a) una matriz (18) de flujo capilar absorbente de un solo camino que tiene un extremo (26) aguas arriba y un extremo (28) aguas abajo que definen una direccion (30) de flujo, siendo dicha matriz (18) compresible;

   b) por lo menos dos depositos (32) que incluyen un primer deposito aguas arriba y un segundo deposito aguas abajo en comunicacion de fluido con dicha matriz (18) de flujo capilar cada uno a traves de sus respectivas primera y segunda zonas (34) de recepcion de llquido, estando situados los depositos (32) entre los extremos y separados entre si en la direccion (30) de flujo definida por la matriz (18) capilar;

   cada uno de dicho primer y segundo depositos (32) esta en contacto con sus respectivas dichas zonas (34) de recepcion de llquido, por medio de una abertura que constituye un conducto hueco que tiene un borde (36),

   caracterizado por el hecho de que:

   cada uno de dichos bordes (36) esta presionando sobre dicha matriz (18),

   en el que los bordes (36) estan presionados sobre dicha matriz (18) cuando la matriz (18) esta seca;

   en el que una porcion de dicha matriz de flujo capilar entre dichos dos bordes (36) es una zona (35) de creacion de interfase; y

   en el que el dispositivo (24, 46) es apropiado para un drenaje secuencial de dichos depositos (32) en la direccion aguas abajo.
2. 2. El dispositivo (24, 46) de la reivindicacion 1, comprendiendo dicha matriz (18) fibras de vidrio y dichos capilares estan comprendidos en espacios entre las fibras.
3. 3. El dispositivo (24, 46) de la reivindicacion 2, comprendiendo dicha matriz (18) fibras de vidrio.
4. 4. El dispositivo (24, 46) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha presion aplicada por dichos bordes (36) a la matriz de flujo capilar comprime la matriz (18) y reduce el area superficial/volumen a no mas del 40% del grosor.
5. 5. El dispositivo (24, 46) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que enfrente de cada uno de dichos bordes (36) esta dispuesto un componente (38) de soporte que soporta dicha matriz (18) contra dicha presion.
6. 6. El dispositivo (24, 46) de la reivindicacion 5, en el que dicha matriz (18) esta suspendida entre dichos bordes (36) y dichos componentes (38) de soporte.
7. 7. El dispositivo (24, 46) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha matriz (18) esta unida a un refuerzo (48) impermeable.
8. 8. El dispositivo (24, 46) de la reivindicacion 7, en el que dicho refuerzo (48) impermeable esta en contacto con por lo menos un componente (38) de soporte que soporta dicho refuerzo (48) impermeable contra dicha presion.
9. 9. El dispositivo (24, 46) de la reivindicacion 8, en el que enfrente de cada uno de dichos bordes (36) esta dispuesto uno de dichos componentes (38) de soporte que soporta dicha matriz (18) contra dicha presion.
10. 10. El dispositivo (24, 46) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente, aguas abajo de por lo menos una dicha zona (34) de recepcion de llquido, una zona (20) de reaccion que comprende por lo menos una entidad de captura configurada para capturar un material que fluye a traves de dicha matriz (18) de flujo capilar.
11. 11. El dispositivo (24, 46) de la reivindicacion 10, que comprende adicionalmente un drenaje de llquido en comunicacion de fluido con dicha matriz (18) de flujo capilar aguas abajo de la zona (20) de reaccion.
12. 12. El dispositivo (24, 46) de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha comunicacion de fluido a traves de dichas zonas (34) de recepcion de llquido es comunicacion de fluido no capilar.
13. 13. El dispositivo (24, 46) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha zona (35) de creacion de interfase tiene una longitud de por lo menos 50% de una dimension de una dicha zona (34) de recepcion de llquido en dicha direccion (30) de flujo.
14. 14. El dispositivo (24, 46) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la expansion inducida por llquido de dicha zona (35) de creacion de interfase no esta restringida.
15. 15. El dispositivo (24, 46) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente una carcasa (40) que contiene dicha matriz (18) de flujo capilar.
16. 16. El dispositivo (24, 46) de la reivindicacion 15, en el que los lados de dicha matriz (18) de flujo capilar estan desprovistos de contacto con dicha carcasa (40).

    5 17. Un kit para montaje de un dispositivo (24, 46) capilar de flujo lateral segun cualquiera de las

    reivindicaciones precedentes, que comprende:

    a) una matriz (18) de flujo capilar absorbente de un solo camino que tiene un grosor; y por lo menos dos dispositivos que tienen b) y c):

    b) un primer componente (62), que incluye un deposito (32) con por lo menos una pared configurado para contener 10 llquidos y un area inferior, dicha area inferior definida por un conducto (63) hueco no capilar con un borde (36) y por

    lo menos una extension (66) que sobresale de una superficie exterior de dicha pared; y

    c) un segundo componente (64), que incluye un cuerpo (74) con una plataforma (76) contra-soporte en un extremo superior y por lo menos una extension (68) que sobresale de dicho cuerpo (74) en el que una dicha extension (66) de dicho primer componente (62) y una dicha extension (68) de dicho segundo componente (74) estan configuradas

    15 para acoplarse mutuamente de modo que dicho borde (36) y dicha plataforma (76) contra-soporte esten separados por una distancia y sean sustancialmente paralelos, en el que dicha distancia es suficiente de modo que un dicho borde (36) presione sobre dicha matriz (18) cuando esta seca cuando dichos dos componentes (62, 64) se acoplan alrededor de dicha matriz (18).
17. 18. El kit de la reivindicacion 17, en el que dicha matriz (18) esta unida a un refuerzo (48) impermeable.

    20 19. El kit de la reivindicacion 17 o la reivindicacion 18, comprendiendo adicionalmente dicha matriz (18) de flujo

    capilar una zona (20) de reaccion que comprende por lo menos una entidad de captura configurada para capturar un material que fluye a traves de dicha matriz (18) de flujo capilar.