JPH0217444A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上皇■里立ユ 本発明は抗原もしくは抗体を含有する試料に、抗体もし
くは抗原を結合させたカーボンブラックもしくはラテッ
クスを加えて抗原−抗体反応を行わせ、反応液に光を照
射して発生する音波の強さの変化を測定することにより
抗原−抗体反応速度を測定する方法に関する。

″　・　′　び。占 抗原抗体反応を利用する生体微量成分の測定に際しＲＩ
　Ａ　（Ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ）が現
在最も多用されている。

この方法は数Ｐｇのものが測定できる高怒度のものであ
るが、■放射性同位元素（Ｒ１）を使うので取り扱いに
特別な施設や器具が必要である■ＢＦ分離匿作や洗浄操
作が必要であり、操作が繁雑である■結果が得られるま
で数時間かかる等の欠点がある。又近年Ｒｒの代わりに
酵素を指標として使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が
用いられている。この方法では特別の施設や器具は必要
ではないがやはりＢＦ骨分離洗浄操作は必要であり繁雑
な操作と長い酵素反応時間が必要である。

一方、ＢＦ骨分離伴なわない操作の簡単な方法として免
疫比濁、ラテックス凝集比濁法や酵素の抗体による阻害
作用を利用するＥＭＩＴ法（Ｓｙｖａ礼、　Ｅｎｚｙｍ
ｅ　Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ
　Ｔｃｃｈｎｉｑｕｅ）や蛍光剤を使ったＦ　Ｐ　Ｔ　
Ａ　（Ｆｒｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ１’ａｌａｎｉｚａｔ
ｉｏｎ　ＩＩＩｌｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ）等が知られて
いる。

これらはＢＦ骨分離洗浄操作の不要な均一系であるが■
感度か弱い（免疫比濁法、ＥＭＩＴ法）、■血清検体中
の濁りの影響がある（ラテックス凝集法、免疫比濁法）
■血清検体中の螢光物やクエンチャ−により測定値が影
響をうける（ＦＰＩＡ法）等の欠点を有し、必ずしも満
足できる方法ではない。

ラテックスあるいは蛋白の凝集を利用する方法は（イ）
ラテックスを使用する場合、ラテックス表面に結合して
いる抗体又は抗原が抗原又は抗体と結合することにより
ラテックスが凝集し、ラテックスのみかけの粒径が大き
くなる現象（ロ）蛋白凝集促進剤を使用した場合抗原抗
体反応によりその抗原抗体結合物の凝集物が析出する現
象を利用するという原理に基いている。

従来（イ）、（ロ）の現象を利用して抗原又は抗体量を
測定するには、透過光の減少を吸光度変化として測定す
る方法（三菱化成製、　ＬＰＩＡ−１０００システム）
、径の大きくなった粒子による光の散乱の強度を測定す
る方法（レーザーネフエロメトリー）や積分球を使って
光の散乱と透過光の比を測定する方法（協和メデックス
製、　ＥＬ−１０００システム）等が知られている。こ
れらのシステムにおける光は凝集粒子に吸収されること
にはあまり意味がなく、散乱による吸光度減少あるいは
散乱光強度の強いことが測定感度を向上することは原理
上明らかである。この様な場合血清中に含まれる脂質、
蛋白などの濁りは光を散乱することが多く、これらの測
定系に大きな影響を与える。又血清中のビリルビンやヘ
モグロビン等の色素も波長によっては吸光度に大きな影
♂を与えることもあり特に微量の成分の測定にはこれら
の影響が問題になる。

口　占　ｐンｔ　るための二〜 近年のエレクトロニクスの発展に伴ない高怒度のマイク
ロホンや圧電素子が開発され、音波や振動の高窓度検出
が可能になったこと、光源として強力なレーザー光が容
易に利用できる様になったこと等により光音響分光法の
感度が著しく向上していることに着目し検討の結果、前
記（イ）、（ロ）の現象の際、凝集前のラテックスの径
より長く凝集あるいは析出後の粒子の見かけの径より短
い波長の光であって、結合している色素により吸収され
る波長の光のパルスを照射する時このパルスにより発生
する音波の強度あるいは位相が抗原−抗体反応前後で大
きく異ることがみい出された。

本発明によれば、カーボンブラック又は着色したもしく
は色素を結合したラテックスに抗体もしくは抗原を結合
させ、これを抗原せもしくは抗体を含有する試料に加え
て抗原−抗体反応を行わせ、反応液に光を照射して発生
する音波の強さを測定することにより試料中の抗原、抗
体を定量できる。

本発明の原理は抗原−抗体反応によってラテックスの凝
集が起り、これに光を照射すると凝集量に比例して凝集
による光の吸収量が増加し、これに比例して発生する音
波が発生することに基いており、音波の強さを測定する
ことによって試料中の抗原、抗体の量を知ることができ
る。

本発明の系では光パルスの吸収による音波の発生がその
原理であるためにごすなどの散乱は影響が小さいことは
もちろん、条件によっては検出する音波の位相を調節（
光パルスの位相より遅れて発生する音波を検出）するこ
とにより光を吸収する物質の影響もとり除くことができ
る。即ち溶解しているものの光パルス吸収による音波は
光パルスとの位相のずれは少いが凝集粒子の様なある大
きさをもったものの光パルス吸収による音波は位相がそ
の粒径に比例して遅れて発止するため血清中に溶解して
いるビリルビンやヘモグロビンはほとんど影響しないこ
とになる。

本発明に使用される抗体としては抗原を馬、牛、豚、ウ
サギ、羊、ラット、山羊、マウス、猿等の動物に注入し
て得られ、その抗原に特異性のあるポリクローナルな抗
体（ＩｇＧ、　Ｉ［？Ｉ、　ＩｇＡ、　ＩｇＥ等）又は
抗体を産生するマウス等の肺細胞とマウスミエローマ等
の癌細胞とをハイブリダイゼーションして得られるハイ
ブリドーマセルの産生ずるモノクローナル抗体（ＩｇＭ
、　ｒｇＧ、　ＩｇＡ、　ＩｇＥ等）又ＩｇＭやＩｇＧ
をペプシンやパパイン等蛋白分解酵素で分解して得られ
るＦ　（ａｂ）　ｚ　’又はＦａｂ’　、　Ｆａｂジチ
オスレイトール、システアミン等で分解して得られるＩ
ｇＭＳなど抗原と特異的に結合する能力のあるものはい
ずれも使用できる他１８ＧやＩｇＭと特異的に結合する
プロティンＡや、ビオチンと特異的に結合するアビジン
等に色素又は染色されたラテックス又はカーボンブラッ
クを結合した後抗体又はビチオン化された抗体と結合さ
せたものも使用できる。

本発明で用いられる光音響スペクトルの測定装置の概要
が第１図に示される。光源より出た光は分光器で分光さ
れ光チョッパーで光パルスになる。

ビームスプリッタ−により二方向に分けられた光は一方
は試料セル、他方は参照セルに導かれる。

試料セルには抗原を含む検体と抗原に特異性のある抗体
が外部より流入されセルの中で抗原−抗体反応が進行し
、光を吸収する能力のある凝集物が生成する。

光音響信号はセル中又はセルに接着しているマイクロホ
ン又は圧電素子によって検出されロックイン増幅器で増
幅され割算回路で試料セルと参照セルの差が検出され、
記録計に送られる。参照セルには抗原もしくは抗体に非
特異的な因子をとり除く為に必要な系の成分が導入され
ると同時に光源の強度のゆらぎを補正することも兼ねる
が非特異な因子の少ない試料の場合で光の安定性が良い
時は不要である。光源としてはキャノンランプ等アーク
放電ランプ類やＨｅ　−Ｎｅレーザー、ＹＡＧ　レーザ
ー、ルビーレーザー、Ａｒレーザー、炭酸ガスレーザー
、半導体レーザー、色素レーザー等も使用できる。

光パルスを発生させるデジツバ−は機械的なものあるい
は電気的なものいずれも使用できる。

セルは高性能マイクロホンの他近年とくに開発の進んで
いる圧電素子（チタン酸バリウム系、ジルコチタン酸鉛
、等のセラミック類又は鉛、ランタン、ジルコニウム、
チタンのそれぞれの酸化物をホットプレス法等により焼
成して作成するＰＬＺＴセラミックス等）を内部あるい
は外部に取りつけ系が発生する音波を効率よく電気信号
に変えるものはいずれも使用できる。父系は水が主成分
であるためマイクロホンや圧電素子の適当な防水処理や
外界の雑音をひろいにくくするための防音装置、外部の
電気的なノイズをカットする装置等を装着する方が好ま
しい。

ラテックス粒子の素材としてはポリスチレン、ポリアク
リル酸エステル、ポリアクリルアミドゲル及びこれらの
コポリマーゲルあるいは架橋のためジビニルベンゼンを
原料の一部にしたもの、あるいはポリアクリル酸エステ
ルを部分加水分解したものの他、ポリ塩化ビニル、ポリ
塩化ビニリデン、ポリアクリロニトリル等均質なラテッ
クス粒子を形成できるものはいずれも使用できる。

又これらラテックス粒子を系に分散させるための界面活
性剤が入っていてもさしつかえない。

抗体もしくはラテックスに吸着させられる色素としては
いったん抗体もしくはラテックスに吸着した後分離しな
い様なやや水不溶性のものが良く又強い光が当たること
になるので光によって分解しにくい色素が望ましい。

下記一般式で表わされる化合物が色源体とじて用いられ
る。

（ＸＶ） （ＸＶＩ） ＣＸＶｒｌ’Ｊ 式中Ｒ，，Ｒ，，Ｒ。

Ｒ２こは水素又は ｌ？“ 一５Ｏ３）１　　又はハロゲン を示し、 Ｒ３１Ｒ３’　＋　　Ｒ３＋　　Ｒ４１Ｒａ’　＋　　
Ｒ４’は水素もしくはＣＩ〜Ｃ４のアルキル、アルコキ
シ、アルキレン、アルキルアミノ、ヒドロキシアルキル
、スルホアルキル、アミノアルキル、フェニル、置換フ
ェニル、ニトロ、スルホ、ハロゲン、カルボキシル、ヒ
ドロキシル又は式中のベンゼン環に他のベンゼン環が結
合してナフタレン骨格を形成した基を示し、 Ｒ，、Ｒ，’は水素又はＣ，−ｃ４のアルキル、ヒドロ
キシアルキル、スルホアルキル、フェニル又は置換フェ
ニルを示す。

ｘ、ｘ’は同一もしくは異ってよく、−〇−−Ｓ−，−
ＮＨ−−Ｎ＝、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝を示し Ｙ、Ｙ’は水素、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシル又は
メルカプトを示し Ｍは（：ｕ、　Ｃｏ、　Ｎｉ＋　Ｆｅ又はＭｇを示す。

置換フェニルの置換基としてはＣ，−Ｃ，のアルキル、
ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、ＣｌＯ４のアルコキ
シ、アミノ等が例示される。

以下にその具体例を示す。［尚名称は染料化学（ａｌｌ
田豊著、技報堂）に準じた。１アゾ系染料：スプラミン
ブラックＢＲ，スプラミンブルーＲ、アミドブラック１
０Ｂ１クロモーゲンブラツクＥＡ等、 アントラキノン系染料：アンスラランバイオレット３Ｂ
、アシッドレッド８３、アンスラキノンバイオレット、
アリザリンピュアブルーＦＦＢ　、等インジゴイド染料
；インジゴｌ？Ｒ、インダスレンプリンテングブラック
ＢＬ等、 カルボニウム、キノンイミン系染料：クマシブリリアン
トプルーＲ：ナフタリングリーンＶ、アシッドバイオレ
ット６８Ｎ　、ベーシックブルー３、クロムオキサンピ
ュアブルーＢ フタロシアニン系；シリアスライトターコイスプルーＧ
Ｌ、　　シリアススープラグリーンＦＦＧＬ等以下に本
発明の態様を実施例によって説明する。

第２図はジルコチタン酸系セラミックスの圧電素子ピエ
ゾセラミックスＮＲ（東北金属■製）を使った光音響セ
ルである。石英ガラスの上面は開放になっておりここよ
り試液が注入される（３〜４１１１り石英ガラス部とＰ
ＺＴ素子部は中でつながっており液はＰＺＴ素子内側に
も満たされる。レーザー光は石英窓に垂直に入射し、石
英ガラス後方より出ていく。このレーザー光により発生
した音波は直接ＰＺＴ素子に到達し、径方向の振動変位
を与えるため高感度でｒ’ＡＳ信号を受信できる構造と
なっている。

実験に用いた条件としてレーザーは静゛イオンレーザ−
１４８８ｎｍ、５００ｍＷ、チョッパーによる光の変調
周波数は４．３ｋＨｚ、ロックインアンプは５ｍＶレン
ジ位相は＋４５°固定とした。

装置としては下記の機器が用いられた。

アルゴンレーザー ５ＰＥＣＴＲＡ　　Ｐ）ＩＩＳＩＣ３社製ＭｏｄｅＩ　
　１６４ チョッパー ＩＮＴＲＡ　　ＡＣＴＩＯＮ社製 ＡＯモジュレータ−ＡＯＭ−４０型 周波数カウンタ 岩通製ＬＩＣ−７６４１ プリアンプ ＮＦ回路設計ブ０７り製ＭｏｄｅｌＬＩ−７Ａ ロックインアンプ ＮＦ回路設計ブロック製ＭｏｄｅｌＬＩ−５実施例　１ 免疫比濁法１ｇＦＩ測定ＫｉｔであるデタミナーＪｇＭ
ＴＩＡ（協和メデックス■製）を使用した。ヒトＩｇＭ
に対する抗体（試薬Ａｚ）を緩衝液に溶解しこれを試薬
Ａとし試薬Ｂ１をそのまま試薬Ｂとした。

試薬３１２．５ｍｊｌ！を試験管に取り１８Ｍの標準液
（４４３ｍｇ／ａ）を２０ｕ１．添加して３７’Ｃで、
１０分間予備加温した。試薬へを４０ｃａｌ添加撹拌後
ただちに液をセルの中に入れて吸光度あるいはＰＡＳ信
号の変化を観察した。ＩｇＭ標Ｈｑ液（Ａ）、精製水（
［３）、ｒｇＭを約１３０＋ｎｇ／ｄ１含み、かなり乳
ビにより白濁している人血清検体を標準液の代りに添加
した場合（Ｃ）とその同血清検体を添加し試薬への代わ
りに５０■／Ｂの牛血清アルブミン溶液を使用した場合
（Ｄ）について行なった。

得られた信号強度及び吸光度は第１表に示される。吸光
度の測定には日立製　２００−２０型分光光度計を使用
した。アンプや光源の電気的ノイズをａとした。

第１表 感度としてＳ／Ｎ比（（Ａ、−Ｂ）／ａ）を計算すると
吸光度法の場合１３１と計算されＰＡＳでは７１２．５
でありＰＡＳによる測定法の方が感度的に５．４倍高い
ことがわかる。又血清検体のＩｇＭ　ｌを計算してもそ
れぞれ吸光度法で１２８．５■／ａ、ＰＡＳ　テ１２９
．０　ｌｌ１ｇ／ａとなり吸光度法、ＰＡＳ共ホホ同じ
値を得る。又血清検体自身から混入してくる検体盲検（
Ｄ）についても吸光度法で６７．６ｍｇ／ｄ、　ＰＡＳ
法で４６．９■／ａに相当するブランク値が出ている。

これは抗原抗体反応とは何も関係のない検体中の乳ビの
にごりに起因するものでありいかに高怒度なＰＡＳにあ
ってもこのままでは防ぐことの出来ないものである。

実施例２ 実施例１に於ける緩衝液にポリスチレンを燃焼させて得
られるカーボン＠　０．１　ｍｇ添加した後超音波で攪
拌し試薬Ａ２を溶解し５　”Ｃで３日間放置してカーボ
ンに抗体を吸着させた。これを試薬へとし位相を＋９０
°とした池は実施例１と同様の実験を行なった所、第２
表に示した結果であった。

第２表 カーボンが混入したことにより吸光度は底上げされた値
を示した。標準液を入れたことによる吸光度変化（Ａ−
Ｂ）は（１１２０、血清検体中のＩＢＭの反応による吸
光度変化（Ｃ−Ｄ）は０．０３１と実施例１とほぼ同じ
結果が得られたがＳ／Ｎ比は８０と悪くなった。これに
対しＰＡＳ信号は標準液の場合の変化も太き（Ｓ／Ｎ比
で１０４７と高くなった。

特に血清検体の盲検であるＤの値が感度［１１１された
にもかかわらず高くなく、吸光度法では１０３　ｍｇ／
み相当になるに反して１０．８■／ａＩｇＭ相当と相対
的な比特異反応はほとんどおさえられてしまった。この
様に抗体とカーボンが吸着することによりＰＡＳの感度
及び特異性がいちだんと良くなる事が判明した。

実施例３ 実施例１の試薬ＡにＣｏｏｍａｓｓｉｅ　　　Ｂｒ１ｌ
ｌｉａｎｔＢｌｕｅ　Ｒ（ＣＩ　４２６６０）の０．４
ｍｇ／ｎｕ溶液を２００μ２添加した後５°Ｃで３日間
放置して抗体に色素を吸着させた。これを試薬とし位相
を＋９０゜とした他は実施例１と同様の実験を行なった
所第３表に示す結果を得た。

第３表 この場合に於ても感度及び非特異因子は抗体無処理に比
較して良い事が確認された。

実施例４ 径０．２μｍのポリスチレンラテックス溶液（１０％）
　１ｍｊ２に抗ヒトＩｇＧ　（ウサギＩｇＧ　、カッペ
ル社製）　０．１　ｔｎｇ／ｍｌ溶液１ｍｆｆ１を加え
５°Ｃで３日間感作した。５００ｒｐｍで１０分間遠沈
し上清を捨てた後０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ２を含む０．
０５　Ｍリン酸緩衝液で数回洗浄した。洗浄した液と同
じ組成の液Ｌｍｌで再分散して３等分した。１つはその
まま（Ａ−１）２つ目には実施例２で使用したカーボン
を０．１■、界面活性剤エマルゲン８０７（花王アトラ
ス■製、商品名）を０．３　ｍｇ添加して分散させ５°
Ｃで３日間放置した（Ａ−２）、３つ目にはＣｏｏｍａ
ｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒｏ、　４　
■／ｍｆ！、溶液を０．３ｍｆ加え同様に５°Ｃで３日
間放置した（Ａ−３）。

Ａ−２、Ａ−３共さらに同緩衝液で数回遠沈洗浄し最終
的にＡ−１、Ａ−２、Ａ−３はラテックス濃度が０．０
１％となる様に希釈分散させて使用に供した。

Ｔｉｙｅｅｎ−２０（半井化学薬品■製）０．０２％、
ＮａＣ１を１００ｍＭ含有するｐＨ７，０の５０＋ｎＭ
　ＴｒｉＳ４１（、ｅ緩衝液を試薬Ｂとし次の操作を行
なった。

■　試薬Ｂ３．ＯｍＩ！、にＡ−１を５０ｔｔｌ添加攪
拌し３７°Ｃで１０分間予備加温した後（Ａ）ヒトＩｇ
Ｇ標準液（１０■／ｄ１含む）２０μｌ、（Ｉ３）精製
水２０μ！、又は（Ｃ）人血清検体の１０００倍希釈液
（ＩｇＧ約３　ｍｇ／ａ含む）２０ｕｌ、をそれぞれ添
加撹拌し、ただちに分光光度計又はＰＡＳのセル内に入
れて吸光度もしくはＩ”ＡＳ信号を測定した。ＰＡＳの
条件は実施例１と全く同じ条件である。

又別途Ａ−１の代りに精製水を５０μ！使い（Ｃ）の希
釈人血清検体を２０μ！添加した系も行なった。それぞ
れの信号の様子は第３図の様でありそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ
，Ｄ、ａを測定した。

（第４表） ■■のＡ−１の代わりにＡ−２を使用して■と同様の操
作を行なった。ただしＩ’ＡＳの位相は＋９０゜ ■■のＡ−１の代わりにＡ−２を使用して■と同様の操
作を行なった。ただしＩ”ＡＳの位相は＋９０゜ 第４表 第４表よりＳ／Ｎ比、血清値、非特異因子（ＩｇＧ相当
）を算出して第５表に示した。

第５表 吸光度法との比較においてＰＡＳ法はＳＮ比では■の系
で８．３倍、■の系で１８倍、■の系で１３倍となり又
非特異因子についても激減した値が得られた。

又カーボンあるいは色素による染色の効果も太きくＳＮ
比の上昇、非特異因子の減少となってあられれた。又別
途この系をＥＬ−１０００（ｔａ和メデンクス社製積分
球式濁度計）で測定した結果と比較しても有意なメリッ
トが見られた。

実施例５ 実施例３のＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　
Ｂｌｕｅ　Ｒの代りに（イ）　ＣＩ　Ｂａ５ｉｃ　Ｒｅ
ｄ　１３　（ＣＩ　４８０１５．式（イ））。

（ロ）　ＣＩ　Ｂａ５ｉｃ　Ｒｅｄ　６　（Ｃ１５０３
７５，式（ロ））。

（ハ）　Ａｎｔｉｎｏｌｏ　Ｂｒｏｈｎ　Ｇ　（ＣＩ　
５６０１７．式（ハ））　。

（−）　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｄ　８３　（ＣＩ　６８２２０
．式（ニ））。

（ホ）　５ｏｌｖｅｎｔ　Ｒｅｄ　１１４　（Ｃ１６８
４１５，式（ホ））。

（へ）　Ｃ１，Ｖａｔ　Ｂｒｏｗｎ　２２　（ＣＩ　７
１１１５．式（へ））、（ト）　Ｐｉｇｍｅｎｔ　Ｒｅ
ｄ　１９０　（ＣＩ　７１１４０．　　弐（１−）Ｌ（
チ）　ＣＩ、　Ｖａｔ　Ｂｌｕｅ　３５　（ＣＩ　７３
０６帆式（チ））。

（す）　ＣＩ、　Ｖａｔ　Ｂｌｕｅ　３５　（ＣＩ　７
３６６０．式（ワ））。

（ヌ）　Ｈｅ１ｉｄｏｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｂ　（Ｃ１７３
８３５＋式（ヌ））。

（ル）　Ａｎｉｌｉｎｅ　Ｂｌａｃｋ　（Ｃ１５０４４
０＋式（ル））。

（ヲ）　５ｉｒｉｕｓ　５ｕｐｒａ　Ｇｒｅｅｎ　ＦＦ
ＧＬ　（ＣＩ　７４３２０＋弐（ヲ）。

を使用した場合のＳＮ比、 示す。

（ハ） （ト） （チ） （す） 非特異因子を第６表に （ニ） （ホ） （へ） （ヌ） （ル） ｎは１〜５ 第６表 いずれの場合においても抗体無処理に比べて良い結果が
得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は光音響スペクトル測定装置の概要の１例を示す
。 第２図は光音響測定セルを示し、２−Ａは横面を示し、
２−Ｂは正面を示し、２−Ｃは上面を示す。 １：ＰＺＴ素子、２：石英ガラス、３：窓４：信号端子 第３図はＰＡＳ信号の変化を示す。 Ａ：標準液、Ｂ：盲検、Ｃ：血清、Ｄ：血清盲検。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. カーボンブラック又は、着色したもしくは色素を結合さ
   せたラテックスに抗体もしくは抗原を結合させ、これを
   抗原もしくは抗体を含有する試料に加えて抗原−抗体反
   応を行わせ、反応液に光を照射して発生する音波の強さ
   の変化を測定することによって生成したカーボンブラッ
   クもしくはラテックスの凝集量又は凝集速度を求めるこ
   とを特徴とする抗原−抗体反応の測定法。